JPH1180198A - ジヒドロピリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体、ハイブリッド細胞およびモノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特異的認識部位が分子構造レベルで特定され
ており、生体内酸化ストレスに相関する物質を確実に認
識することができるモノクローナル抗体であって、臨床
診断、分析等において有用なモノクローナル抗体、該モ
ノクローナル抗体を産生することができるハイブリッド
細胞、および該モノクローナル抗体の製造方法を提供す
る。 【解決手段】 ジヒドロピリジン構造を特異的に認識す
るモノクローナル抗体である。該モノクローナル抗体の
調製は、マロンジアルデヒドで修飾した蛋白質、好まし
くはマロンジアルデヒドで修飾したカギアナカサガイの
ヘモシアニンからなる蛋白質を抗原として免疫した恒温
動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融
合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッド細胞か
らジヒドロピリジン構造を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体およびその製造方法、特にマロンジアルデヒド（略
語：ＭＤＡ）と蛋白質との反応物に対する高い特異性を
有するモノクローナル抗体とその製造方法に関する。さ
らに詳しくは、ジヒドロピリジン構造を特異的に認識す
るモノクローナル抗体とその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内の脂質成分としては、トリグリセ
リド、リン脂質、コレステロールエステルあるいは遊離
型脂肪酸などが知られている。これらの化合物が高度不
飽和脂肪酸残基を有する場合、生体に作用する様々な酸
化ストレスによって、この高度不飽和脂肪酸残基が過酸
化を受け、更に、過酸化分解して、脂質の過酸化分解物
が生成され、様々な病態に関与していることが明らかに
されつつある。

【０００３】高度不飽和脂肪酸残基を有する化合物とし
ては、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコ
サペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが代表的なも
のである。脂質の過酸化分解物の中でマロンジアルデヒ
ド（略語：ＭＤＡ）は、生体内酸化ストレスとの相関が
高いことが報告されている。高度不飽和脂肪酸残基が過
酸化を受け、さらに脂質過酸化分解によって生じたＭＤ
Ａは、血液中では蛋白質のアミノ基と結合し、ＭＤＡ化
蛋白質（略語：ＭＤＡ−Ｐｒｏ．）を生じることが知ら
れている。

【０００４】ＭＤＡと蛋白質の結合について、更に詳し
く研究されており｛例えば、（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９６３：２０８−２１４，１９８
８、（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ６５：２６５
−２７２，１９８７）、（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｃ
ｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎｓ ＆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ
ａｌｓ ２：４，４６１−４７１，１９９１）｝、ＭＤ
Ａは、蛋白質に含有される蛋白質の構成アミノ酸の一つ
であるリジン残基と反応している可能性が高いとされて
いる。ＭＤＡと蛋白質、特に、ＭＤＡとリジン残基の反
応についてはＮ−ε−プロペナールリジン構造を有する
化合物を生じる反応が知られている（日本農芸化学会誌
７０：１９４，１９９６）。

【０００５】ところで、生体内酸化ストレスに相関する
物質を認識する抗体であって、特異的認識部位が分子構
造レベルで特定された抗体は、該抗体を抗原物質の測定
に使用した場合に正確、且つ精密に検出することができ
るので、臨床診断、分析等において有用なものである。
抗原物質の検出方法としては、免疫化学的な検出方法な
らばいずれの方法でも使用することが可能であるが、具
体的には免疫組織学的方法、酵素免疫学的測定法等が挙
げられる。従って、このような特定分子構造を特異的に
認識する抗体の出現が強く要望されている。

【０００６】このような状況下において、ヒトマロンジ
アルデヒド化低比重リポタンパク（以下、ＭＤＡ−ＬＤ
Ｌと略す。）を抗原として得たＭＤＡ−ＬＤＬを認識す
るモノクローナル抗体あるいは該モノクローナル抗体を
用いたＭＤＡ−ＬＤＬの測定方法が従来知られていた
（Science 241:215-218,1988、特開平４−１７３０９６
号公報）。しかしながら、前記従来のＭＤＡ−ＬＤＬを
抗原として得たモノクローナル抗体は、抗体を調製する
ための抗原の調製法が明確ではなく、しかもＭＤＡ−Ｌ
ＤＬの具体的にどの部位を特異的に認識するかについて
も明らかにされていない。

【０００７】さらには、ＭＤＡが反応する蛋白質は低比
重リポ蛋白質（以下、ＬＤＬと略す。）だけではなく、
ヒト血清中にはＭＤＡ−ＬＤＬ以外のＭＤＡ化蛋白質が
存在することが示唆されている（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ７１：１２１−
１２４，１９８８）。したがって、生体内酸化ストレス
の指標としてＭＤＡを用いる場合、ＭＤＡと結合される
蛋白質の種類によってはＭＤＡ化された蛋白質であって
も上記公知のモノクローナル抗体に認識されないことが
考えられるので、ＭＤＡと結合される蛋白質の種類に影
響されない、即ち、生体内酸化ストレスに相関する物質
を確実に認識することができるモノクローナル抗体を得
なければならない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、Ｌｉｐ
ｉｄｓ １９：６００−６０８，１９８４によれば、Ｍ
ＤＡがリジン残基と反応する場合、前記Ｎ−ε−プロペ
ナールリジン構造を有する化合物だけでなく、ＭＤＡ２
分子とアセトアルデヒドから成る、下記の式（１）に示
されるジヒドロピリジン構造を有する化合物をも生じる
可能性が指摘されている。従って、生体内の酸化ストレ
スを検出もしくは予測するためには、生体内のジヒドロ
ピリジン構造を有する物質あるいは部位を特異的に検出
することができるモノクローナル抗体を提供することは
有用であると考えられる。

【０００９】

【化１】

【００１０】そこで本発明は、特異的認識部位が分子構
造レベルで特定されており、生体内酸化ストレスに相関
する物質であるジヒドロピリジン構造を有する物質ある
いは部位を確実に認識することができるモノクローナル
抗体であって、且つ臨床診断、分析等において有用なモ
ノクローナル抗体を提供すること、該モノクローナル抗
体を産生することができるハイブリッド細胞を提供する
こと、および該モノクローナル抗体の製造方法を提供す
ることを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に鑑み、検討した結果、マロンジアルデヒド（略語：
ＭＤＡ）で修飾したカギアナカサガイのヘモシアニン
（略語：ＫＬＨ）を抗原として調製し、該抗原で免疫し
たマウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエローマ
細胞とのハイブリッド細胞が、ジヒドロピリジン構造を
特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することを
見出し、本発明を完成した。

【００１２】すなわち、本発明のモノクローナル抗体
は、ジヒドロピリジン構造を特異的に認識することを特
徴とする。

【００１３】本発明のハイブリッド細胞は、次式（１）
で示されるジヒドロピリジン構造を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体を産生することを特徴とする。

【００１４】

【化２】

【００１５】本発明のモノクローナル抗体の製造方法
は、（１）ＭＤＡで修飾した蛋白質を抗原として調製
し、（２）該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体
産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド
細胞とし、（３）該ハイブリッド細胞を培養して培養物
中からジヒドロピリジン構造を特異的に認識するモノク
ローナル抗体を取得することを特徴とする。

【００１６】本発明の前記モノクローナル抗体およびそ
の製造方法においては、ＭＤＡで修飾されるべき蛋白質
がカギアナカサガイのヘモシアニン（略語：ＫＬＨ）で
あることが望ましい。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は、
ＭＤＡで修飾した蛋白質を調製し、これを抗原として免
疫された哺乳類動物から得られる抗体産生細胞と、得ら
れた抗体産生細胞を継代培養可能なマウスミエローマ細
胞とのハイブリッド細胞を創出し、このハイブリッド細
胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生するハ
イブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド
細胞が抗体を産生する環境下で大量培養し、培養物から
取得することにより、製造される。

【００１８】本発明のモノクローナル抗体の製造に用い
ることができる抗原は、蛋白質とＭＤＡの反応物であれ
ば良い。蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン
（略語：ＢＳＡ）、卵白アルブミン、カギアナカサガイ
のヘモシアニン（略語：ＫＬＨ）などが挙げられ、特に
ＫＬＨが好ましく使用できる。

【００１９】ＭＤＡと蛋白質の反応を行うための具体的
方法は、例えば、前記に列挙した蛋白質と１，１，３，
３−テトラメトキシプロパンの酸加水分解物を緩衝液中
で混合攪拌して反応させる方法を挙げることができる。
用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩など
の緩衝液が挙げられ、好ましくは、リン酸緩衝液が用い
られる。緩衝液のｐＨは該反応が進行するｐＨであれば
特に限定されないが、ｐＨ６〜１１、好ましくはｐＨ７
〜９である。緩衝液の濃度は、該反応が進行する濃度で
あれば特に限定されないが、１ｍＭから０．５Ｍ、好ま
しくは、１０〜１００ｍＭの緩衝液である。

【００２０】この反応過程は、蛋白質中のアミノ酸の減
少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率
は、例えば、反応前後の試料のＭＤＡと反応していない
アミノ酸をアミノ酸自動分析装置で測定することにより
求めることができる。アミノ酸減少率としては、使用す
る蛋白質により異なるが、リジン減少率が１０％以上、
好ましくは２０％以上であることが望ましい。このよう
なアミノ酸減少率となる反応条件は、例えば、２５〜４
５℃で１〜７２時間が好ましく、さらに好ましくは３０
〜４０℃で５〜４０時間である。

【００２１】本発明で免疫される動物は恒温動物が使用
できる。該免疫動物としては、例えば、マウス、ハムス
ター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ等であれば特
に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ
細胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウス
が使用される。

【００２２】免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を
用いて、例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６
日間隔で２または３回の投与が好ましい。抗原投与量は
１回につき、免疫される動物により異なるが、例えば、
約０．０５から２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は、
皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉
内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜
腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態であ
る。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み
合わせた投与経路、例えば、腹膜腔注射、皮下注射およ
び筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせるのが好まし
い。

【００２３】なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例
えば、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不
完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いら
れるアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩
衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、
上記のようなアジュバントを使用しなくてもよい。ここ
でアジュバントとは抗原とともに投与した時、非特異的
にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味す
る。

【００２４】上記の抗原を免疫した恒温動物を７〜３０
日間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清を少量採
取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免
疫測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法
により測定することができる。より簡便には酵素免疫測
定法により測定することができる。抗体価が上昇してき
たら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例
えば、０．０１〜１ｍｇ、特に０．０５〜０．５ｍｇの
抗原の投与量で１もしくは２回の追加投与が行われる。
最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７
日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を
含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生する
リンパ球を含む抹消リンパ系組織ならどこでもよいが、
好ましくは脾臓である。

【００２５】得られた組織は、例えば、「単クローン抗
体実験操作入門」（講談社サイエンティフィック 安藤
民衛ら １９９１）等に記載されている方法により、継
代培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルス
やポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と
細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができ
る。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同
種の恒温動物のガン細胞を用いることが望ましく、例え
ばマウスを免疫動物として得られた脾細胞と融合させる
場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。

【００２６】実際に用いられる細胞融合の方法として
は、公知の技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
３９：２８５−３０８，１９８０）を用いることができ
る。例えば、免疫されたマウスから得られた脾細胞とマ
ウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で
融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨ
ＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン
添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖さ
せ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上
清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産
生するハイブリッド細胞を得ることができる。

【００２７】スクリーニングする方法としては、例え
ば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定
法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブ
リッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的
に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらに
は、これら目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は抗
体を産生する環境下で大量培養することにより製造する
ことができる。さらに、これらの目的とする抗体を産生
するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分
離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを
用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質の一般
的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法
を組み合わせて使用することにより精製することができ
る。

【００２８】本発明のモノクローナル抗体はヒトのＭＤ
Ａ化蛋白質の検出だけではなく、ヒト以外の異種の哺乳
類、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イ
ヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒトなどの生体中に存在するＭ
ＤＡ化蛋白質の検出にも応用することができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、本発明は本実施例に限定されるものではな
い。

【００３０】〔実施例１〕 １．抗原の調製 １，１，３，３−テトラメトキシプロパン（略語：ＴＭ
Ｐ）１６５μｌに９８３５μｌの１．０Ｍ塩酸を加えて
室温で１時間撹拌した。この溶液１ｍｌを１．０Ｍ水酸
化ナトリウム溶液で即座にｐＨを６〜８に調整した液に
カギアナカサガイのヘモシアニン（略語：ＫＬＨ）１ｍ
ｇ（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）で溶解した溶液を即座に加え、３７℃、２４
時間反応させてＭＤＡとＫＬＨのコンジュゲート（略
語：ＭＤＡ−ＫＬＨ）を得て、これを抗原とした。自動
アミノ酸分析装置〔ＪＥＯＬ ＪＬＣ−３００、日本分
光（株）製〕でＭＤＡ修飾ＫＬＨ中の減少したアミノ酸
を調べたところ、リジン（以下、Ｌｙｓと略す。）が２
９．０％減少していた。

【００３１】２．免疫方法 ＭＤＡ修飾ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイント
の完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、
これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹
腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日
後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合
してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫
から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（以下、Ｐ
ＢＳと略す。）を混合して最終免疫を行った。なお、抗
体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液
を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で
抗原に対する抗体が産生していることを確認した。酵素
免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清
と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間
に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が
確認された。

【００３２】３．抗体価の確認方法 抗体価はＭＤＡとウシ血清アルブミンを固相とした酵素
免疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記
載した方法と同様にウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ
と略す。）とＭＤＡを反応させて、ＭＤＡとＢＳＡのコ
ンジュゲート（以下、ＭＤＡ−ＢＳＡと略す。）を得
た。これを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）
（以下、ＴＴＢＳと略す。）で３回洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ブロッ
キング液と略す。）でブロッキングを行った。このプレ
ートのウエルにマウスから得られた血清（１００μｌ／
ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエル
を洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されてい
るマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００
倍希釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、酵素標識
抗体溶液と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させ
た。ウエルを洗浄後、ο−フェニレンジアミン（０．４
ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μ
ｌ／ウエル）（以下、発色液と略す。）を入れて室温で
１５−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５
０μｌ／ウエル）（以下、反応停止液と略す。）を入れ
ることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎ
ｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。

【００３３】４．細胞融合 免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして
脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培
地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−
１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウ
ス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・
１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和
し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコー
ル１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これに
ＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、
５分間遠心分離して上清を廃棄した。この操作を２回繰
り返して細胞を洗浄し、細胞を得た。

【００３４】５．クローニング 前述の得られた細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を加えて細
胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１０
０μｌずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリ
ッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエ
ル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜
３回繰り返した。培養上清については酵素免疫化学的方
法により抗体価の確認方法と同様であるが、試験に用い
る試料を血清の代わりに得られた培養上清を用いた。ス
クリーニングにより抗体活性の確認されたウエルの細胞
は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと
限界希釈を繰り返すことによりＭＤＡ修飾蛋白質に対し
て高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクロー
ン８株を得た。得られた８株のクローンの内、抗体活性
の強かった１Ｆ８３株のモノクローナル抗体について、
マウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試
料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：
Mouse momoclonal antibody isotyping kit RPN29、ア
マシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったとこ
ろ、ＩｇＧ_2a、λ鎖であった。この培養上清の一部を用
いて抗体の精製について検討したところ、硫酸アンモニ
ウムによる塩析、あるいはプロテインＡをリガンドとす
るアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うこ
とにより本発明のモノクローナル抗体を精製することが
できた。

【００３５】〔実施例２〕前記実施例１で得た８株クロ
ーンから得られたＭＤＡ修飾蛋白質を認識するモノクロ
ーナル抗体の内、１Ｆ８３株のモノクローナル抗体の反
応特異性について確認を行った。該１Ｆ８３株は、通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年９
月４日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６４０３）として
寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗
体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。

【００３６】１．モノクローナル抗体の反応特異性の評
価法−１ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ウエル当たり１００μｌの蛋白質あるいはアルデヒド修
飾蛋白質（４μｇ／ｍｌ）を加え、４℃で一昼夜静置し
てプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μｌの
ＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢもし
くは蒸留水で４倍希釈したブロックエースをウエル当た
り３００μｌ加えてブロッキングした。このプレートを
上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり
１００μｌのＴＴＢＳで希釈した本モノクローナル抗体
溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で３時間インキ
ュベートした。なお、コントロールとしてはＴＴＢＳの
みを加えた。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３
回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの酵素標識抗体
溶液を加えて３７℃で１時間インキュベートした。この
プレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１
００μｌの発色液を加えて室温で１５〜２０分間インキ
ュベートした。ウエル当たり５０μｌの反応停止液を加
えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光
度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性
を評価した。

【００３７】２．モノクローナル抗体の反応特異性評価
法−２ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ＭＤＡ修飾ＢＳＡを加えてプレートに物理吸着させたプ
レートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体
（１μｇ／ｍｌ）に各種濃度のＭＤＡ誘導体を加えたも
のを試料とする以外は前項に記載の方法と同様にして吸
光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異
性を評価した。

【００３８】３．モノクローナル抗体の反応特異性−１ 前記実施例１のモノクローナル抗体に関して各種蛋白質
に対する反応特異性を評価した。すなわち、ＭＤＡ、４
−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）、ヘキサナール、グ
リオキサールなどの図１に記載されるアルデヒドを修飾
したＢＳＡを用い、前記のモノクローナル抗体の反応特
異性評価法−１により測定した。その結果を縦軸は各種
アルデヒド、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示したグラフ
として図１に示した。図１に示すようにＭＤＡで修飾し
たＢＳＡは認識されるものの、他のアルデヒドで修飾さ
れたＢＳＡは全く認識されなかった。

【００３９】４．モノクローナル抗体の反応性−２ 前記実施例１のモノクローナル抗体に関して種々のＭＤ
Ａ誘導体に対する反応特異性を評価した。すなわち、Ｎ
−α−アセチルリジン、Ｎ−α−アセチル−ε−プロペ
ナール−リジン、Ｎ−α−アセチルリジン１分子にＭＤ
Ａ２分子、アセトアルデヒド２分子からなるジヒドロピ
リジン構造を有する誘導体（ＬＭ２Ａ）およびＮ−α−
アセチルリジン２分子とＭＤＡ４分子からなる誘導体
（ＬＭ４Ａ）を競合物質として前記のモノクローナル抗
体の反応特異性評価法−２により測定した。その結果を
縦軸は競合物質の阻害率（Ｂ／Ｂ₀ ：なお、Ｂ、Ｂ₀ は
それぞれ競合物質の存在下、非存在下における吸光度を
示す。）、横軸は競合物質の濃度を示したグラフとして
図２に示した。図２から明らかなように、ＭＤＡ誘導体
中Ｎ−α−アセチルリジン１分子にＭＤＡ２分子、アセ
トアルデヒド２分子からなるジヒドロピリジン構造を有
する誘導体（ＬＭ２Ａ）のみが、本発明によるモノクロ
ーナル抗体と固相化されたＭＤＡ−ＢＳＡとの反応を阻
害した。

【００４０】〔実施例３〕前記実施例１で得た８株クロ
ーンから得られたＭＤＡ修飾蛋白質を認識するモノクロ
ーナル抗体のうち、１Ｆ８３株のモノクローナル抗体を
免疫組織染色応用にした。なお、検討に用いるモノクロ
ーナル抗体は、培養上清を硫酸アンモニウムによる塩析
で精製したものを用いた。染色に使用する組織として
は、ヒト粥状動脈硬化病巣を用い、一般的に免疫組織染
色に用いられる方法、例えば、「染色法のすべて」（医
歯薬出版株式会社 １５５−１６５ １９８８）、Ｍａ
ｎｕａｌｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｉｎ
ｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆｔｈｅ Ａｒｍｅｄ Ｆ
ｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ（ＭｃＧｒｏｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
３ｒｄ．，Ｅｄ．，ｐ５．）に記載の方法に従って免
疫組織染色を行った。すなわち、常法によりＢｏｕｓｉ
ｎ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｈｉ
ｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＭｃＧｒ
ｏｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ３ｒｄ．Ｅ
ｄ．，ｐ５．））、５０％エタノール、７０％エタノー
ルで連続処理し、パラフィン包埋した組織から３．５μ
ｍの組織切片を得た後、非特異的な反応を防止するため
に、リン酸緩衝生理食塩水で希釈したウサギ正常血清で
ブロッキングを行った。この切片に、本発明によるモノ
クローナル抗体を０．５〜２．０μｇ／ｍｌの濃度で含
むリン酸緩衝生理食塩水を室温で１時間反応させ、洗浄
を行い、続いて、アルカリフォスファターゼを標識酵素
とするＡＢＣ法（アビジン−ビオチン複合体法）によ
り、組織切片中に存在する本発明による抗体と反応する
部位を観察した。なお、アルカリフォスファターゼの検
出にはＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕ
ｂｓｔｒａｔｅ ＫＩＴII（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。本発明のモノクローナル抗
体を生体組織、粥状動脈硬化病巣に対して免疫組織染色
した結果を示す顕微鏡写真（オリンパスＡ×８０；４０
０倍）を図３として示す。図３より明らかなようにヒト
粥状動脈硬化病巣には本モノクローナル抗体で染色され
る部位（黒色に染色）が存在することが示された。

【００４１】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば生体内酸化ストレスによって生じる高度不飽和
脂肪酸の過酸化分解物の一つであるマロンジアルデヒド
と蛋白質の反応生成物が結合したときに生じるジヒドロ
ピリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体を
提供することができる。また、上記実施例から明らかな
ように、本発明のモノクローナル抗体は、認識部位該分
子構造レベルで限定されているので、生体低酸化ストレ
スの解明、臨床診断、分析等において有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】種々のアルデヒドをＢＳＡに修飾させた修飾物
に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性につい
て、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラ
フである。

【図２】本発明のモノクローナル抗体の認識部位につい
て、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラ
フである。

【図３】本発明のモノクローナル抗体を生体組織、粥状
動脈硬化病巣に対して免疫組織染色した結果を示す顕微
鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ジヒドロピリジン構造を特異的に認識す
   るモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 前記モノクローナル抗体は、マロンジア
   ルデヒドで修飾した蛋白質を抗原とし、該抗原で免疫さ
   れた恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細
   胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、該ハイブリッ
   ド細胞から得られたものである請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体。
3. 【請求項３】 前記抗原は、マロンジアルデヒドで修飾
   したカギアナカサガイのヘモシアニンである請求項２記
   載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 請求項１、２又は３記載のモノクローナ
   ル抗体を産生することができるハイブリッド細胞。
5. 【請求項５】 （１）マロンジアルデヒドで修飾した蛋
   白質を抗原として調製し、 （２）該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生
   細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞
   とし、 （３）該ハイブリッド細胞を培養して培養物中からジヒ
   ドロピリジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗
   体を取得することを特徴とするモノクローナル抗体の製
   造方法。
6. 【請求項６】 前記抗原は、マロンジアルデヒドで修飾
   したカギアナカサガイのヘモシアニンであることを特徴
   とする請求項５記載のモノクローナル抗体の製造方法。