JPH03152464A - 免疫原物質の高度に保存されたアミノ酸配列に対する抗体、これら抗体の製造方法およびイムノアツセイへのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗原など免疫原物質の定性的および定量的測定のために
免疫測定法がますます大規模に用いられていることは知
られている。これらの方法は免疫原物質と一以上の抗体
との複合体であってそれら結合相手の一方が検出の為に
標識されているものの形成に基づいている。これによっ
て、免疫原物質と一以上の抗体からの複合体が形成され
たかどうか、またどのような量で形成されたかを測定す
ることができる。免疫測定法の著しい改善がＭｉｌｓｔ
ｅｉｎおよびに６ｈｌｅｒによるモノクローナル抗体の
導入によりなされたが、それらの免疫測定アッセイへの
使用は西独特詐出願公開３．１３０．８３４に詳述され
ている。ある種の生物種のインスリンを測定するための
免疫測定法も既に報告されている（Ｊ、　　Ｈａｖｒａ
ｎｋｏｖａ　ａｔａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　５（１８２）、１３１〜１４
４　（１９８４））。これらの抗体は免疫原としての各
種インスリンで免疫することにより得られたものである
。関連タンパク質（抗原）の断片で免疫することにより
得られた抗ペプチド抗体を天然（ｎａｔｉｖｅ）タンパ
ク質の同定に用いることにより免疫測定の普遍性に関し
更なる改善可能性が生じた。かかる抗ペプチド抗体は現
在ペプチド従って遺伝子配列同定の重要なツールとなっ
ている。

これらの抗体は、常法によっては可能であつたとしても
限られた現摸でしか生産し得ない抗血清に対する物質の
測定にとっても特に重要である。何故ならば、これらを
完全タンパク質として注射すると、所要濃度において既
に活性が高過ぎたり（例えばペプチド−ホルモン、神経
ペプチド）あるいは毒性が強過ぎたり（ジフテリア毒素
、ウィルスおよび他の微生物）するからである。同様に
して、かかる抗ペプチド抗体を“合成ワクチン”　　（
Ｊ、Ｇ、　５ｕｔｃｌｉｆｆ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、　２１９．６６０（１９８
３））の開発に首尾よく用いることも可能となっている
。文献に知られる方法によりそれらに対するポリクロー
ナルまたはモノリフローナル抗体を得ることができるペ
プチド配列の選択にとっては、この配列の少くとも一部
が天然タンパク質の表面に位置（すなわち露出）してい
る、従って多重的に荷電しまたは極性の強い官能基を含
んでいることが有利であるように思われる。しかしなが
ら、これに関連して、進化において高度に保存されたア
ミノ酸配列を示すペプチド断片が極めて弱い免疫原であ
ることが従来技術に明記されている（Ｇ、　Ｗａｎｅｒ
、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｄ、　８８．　（１
９８６）＋１４９〜１６１参照）。この関連において、
進化において高度に保存されたアミノ酸配列とは、進化
の過程においてほんのわずかしかまたは全く変化してい
ない所与のタンパク質のアミノ酸配列であるとして理解
される。すなわち、例えばウマとウサギのチトクローム
Ｃはいくつかのアミノ酸配列において相違している。し
かしながら、それら２動物種よりのこのタンパク質の他
の配列は同じである。それら動物種の一方の免疫系は他
方の生物種のチトクロームＣのこれら同一領域に対し抗
体を形成しないことが認められている。何故ならこの配
列は結局のところ内生チトクロームＣにも存在している
からである。抗原に対する免疫応答は免疫タンパク質と
関連内生タンパク質の間の進化距離が大きい程向上する
というのが通則とされている。

従って本発明の基礎をなす目的は、天然タンパク質とも
、また誘導体、突然変異体、変性物、断片または（合成
）前駆体とも免疫複合体を形成できる抗体を提供するこ
とにある。

前記目的は、特に、広範囲にわたる様々な生物種の遺伝
子工学生成物、およびそれらの誘導体、変成前駆体およ
び断片と免疫複合体を形成する抗体を提供することにあ
る。遺伝子工学タンパク質例えばインスリンなどはこの
関連で特に環填の高いものであった。

もう一つの目的は、微生物中に難溶性封入体として生じ
る初期収量の遺伝子工学生成物を測定することができ（
このことは従来技術による免疫学的アッセイをもってし
ては今日まで不可能であった）、また同時に同じアッセ
イを用いて個々の処理工程におけるタンパク質濃度を測
定することができる免疫測定アッセイを開発することで
あった。初期収量とは発酵直後に有効に存在する収量の
ことである。それは検体処理中のロスおよび処理工程に
より歪曲されない。

驚くべきことに、今般、関連の天然タンパク質の高度に
保存されたペプチド断片で免疫することにより得られた
抗体により前記目的が達成されることを見出した。

従って、本発明は天然タンパク質の高度に保存されたア
ミノ酸配列を示すペプチド断片で免疫することにより得
られる抗体に関する。

本発明は特にインスリンの高度に保存されたペプチド断
片で免疫することにより得られる抗体に関する。

本発明は更に前記抗体の製造方法およびそれらの免疫測
定アッセイへの使用に関する。

以上および以下において、高度に保存されたアミノ酸配
列は、（たとえ程度の差はあれわずかに修飾されている
としても）進化の過程で変わったとしても非実質的にし
か変わっていないいくつかの生物種に存在する所与のタ
ンパク質のタンパク質断片のことである。ここで挙げる
ことのできる一例は、多くの既知インスリン例えばヒト
、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ニワトリ、アヒル、シチ
メンチョウ、ガチョウ、ワニ、ガラガラヘビ、フルブリ
ッドスネーク（ｃｏｌｕｂ−ｒｉｄ　５ｎａｋｅ）、イ
ワシクジラ、ゾウ、ヤギ、イヌ、サル、マツコラクジラ
、ナガスクジラ、ラット、マウス、ハムスターおよびウ
サギインスリンなどに無変化で存在するインスリンＡＤ
のオクタペプチド（１４−２１）　（Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ｄｙｓ−Ａｓｎ）で
ある。

天然タンパク質とは天然に存在するタンパク質のことで
ある。

ペプチド断片およびタンパク質断片とはこのペプチド／
タンパク質の天然成分である関連のペプチド／タンパク
質の部分のことである。これらの断片は前記ペプチド／
タンパク質の切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）　、開始部（ｂｅ
ｇｉｎｎｉｎｇ）または終端部（ｅｎｄ）を表わす接続
したアミノ酸（いわゆるアミノ酸配列）である。

天然タンパク質の高度に保存されたアミノ酸配列に対す
る本発明の抗体の製造は次のようにして行うのが最良で
ある： １、次の基準による関連アミノ酸配列の選択：ａ）関連
の配列は好ましくは露出しているべきである、すなわち
天然タンパクの表面に位置しているべきである。好まし
くは、当該配列が多重に荷電したまたは極性の強い官能
基を含んでいるかまたはタンパク質の二次構造が好まし
くは分子から突出しているループを含んでいる場合がそ
ういった場合にあたる。大抵の場合に、この条件は、例
えばアスパラギン（Ａｓｎ）　、アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）　、ズロリン（Ｐｒｏ）　、グルタミン（Ｇｉｎ）
　、グルタミン酸（Ｇｌｕ）および／またはグリシン（
Ｇｌｙ）が当該配列に多重的に存在していれば満たされ
る。

ｂ）選択されたペプチド断片上の潜在的エピトープの数
は可及的に僅少であるべきであるが、一方そのペプチド
断片は免疫応答に十分な大きさを有すべきである。選択
された配列は２０、好ましくは１２、特に好ましくはｌ
Ｏ１格別に好ましくは８、アミノ酸を超えるべきでなく
、また４、好ましくは５、特に好ましくは６、アミノ酸
を下回るべきでない。６〜１３、好ましくは７〜１１、
特に８〜１０．アミノ酸を有するペプチド断片が適して
いることがわかっている。

Ｃ）選択された配列は好ましくは関連の天然タンパク質
のＮまたはＣ末端におけるものとすべきでない。ここで
ＮおよびＣ末端とは完全な天然タンパク質の相当する末
端のことである。この完全なタンパク質が共に接続され
たいくつかのタンパク質より成る場合には、前記配列が
この融合（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）タンパク質の内側Ｎ
またはＣ末端におけるものであってよいことはもちろん
である。

２、関連アミノ酸配列の製造 選択されたタンパク質断片の製造に適しているのは、例
えば文献に知られるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄペプチド合成
である。しかしながら天然タンパク質の酵素的または化
学的分解から適当な断片を得ることも全く可能である。

短い配列は純粋に化学的方法により合成することもでき
る。

３、必要に応じ行われる担体の結合 特にそれ自体では免疫応答を全く起こさないかまたは不
十分な免疫応答しか起こさない短いタンパク質断片の場
合だけでなく免疫原性断片の場合にも、選択されたタン
パク質断片に担体を結合するのが望ましい。この結合は
当業者に知られた方法により、例えば結合試薬例えばゲ
ルタールアルデヒドまたはＮ−マレイミド−６−カブロ
イルｌ−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−４−スルホ
ネートナトリウム塩（ｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ）など
を用いて行われる。使用し侵る担体の例は次のとおりで
ある：ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリ
アクリルアミドまたはポリーｄ−グルタミンーｄ−リジ
ン、または脂肪酸誘導体例えばＰＡＭ−３−Ｃｙｓ（Ｐ
ＡＭ−バルミトイル）またはタンパク質例えば牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）またはスカシガイのヘモシアニン。

好ましくは、タンパク質断片のいくつかの分子を担体に
結合させる。

４、タンパク質断片または担体結合タンパク質断片によ
る生物種の免疫 タンパク質断片または担体結合タンパク質断片による生
物種の免疫は文献に知られる方法、例えば免疫原を適切
な場合にはアジュバント例えばＣＦＡ（フロイントの完
全アジュバント）またはＩＦＡ（７０インドの不完全ア
ジュバント）などと共に筋肉的注射することにより行わ
れる。必要に応じて、免疫応答が得られた後に一以上の
追加免疫（ブースター）用量を投与することができる。

生物種の選択は臨界的ではなく、例えばマウス、ラット
、ウサギ、ヒツジまたはヤギが適している。しかしなが
ら、多量の抗体含有血清の調製には大型の動物、例えば
ヒツジまたはヤギを用いるのが有利である。

５、血清からの抗体単離 抗血清は基本的には最初の免疫応答が得られた後で引き
出すことができる。しかしながら、使用した動物種にも
よるが、関連免疫原を用い一以上の追加免疫用量を投与
した後でのみより高い力価が得られる。使用目的に応じ
て、血清は精製され濃縮されるが、またはそれ以上精製
することなくアッセイ媒質で直接希釈され使用される。

血清を精製し濃縮することはサンドイッチアッセイを調
整する場合に特に望ましい。これは、例えば、硫黄アン
モニウム沈澱およびそれに続く関連抗原を固定しである
アフイニティ力ラムでの分画により行うことができる。

この過程で、固定タンパク質と何らの相互反応を示さな
いタンパク質はすべて分離される。次に関連タンパク質
を認識する、従って固定タンパク質に結合した抗体はカ
ラムから溶出させることができる。

前記５に記載のポリクローナル抗体取得方法とは別の選
択肢として、モノクローナル抗体を調製できることもも
ちろんである。これは、例えば前記４に記載の如くマウ
スを免疫し、次いでそのマウスの牌細胞を例えばＮＳＩ
ミエローマ細胞と融合しそして適当な細胞をクローニン
グすることによって行われる。適切な場合には、そのよ
うにして得られたモノクローナル抗体を９４Ｌばヌード
マウスに注射することにより増産することができる。か
かるモノクローナル抗体の調製は基本的に当業者に知ら
れており、また文献に記載されている。次いで前記５に
記載の如く後処理および精製を行うことができる。

本発明による抗体はイムノアッセイの調製に用いること
ができる。かかるイムノアッセイにおいて本発明による
抗体または抗原を例えば固相に固定することができる。

様々な幾何学的態様例えばチューブ、ビーズまたは微量
力価測定プレートなどの形をした固相例えば合成または
天然ポリマー例えばポリスチレン、ボリプロピレン、Ｐ
ＶＣまたはラテックスなどに抗原および抗体を固定する
方法は当業者に知られている。

イムノアッセイは、例えば拮抗的アッセイまたはサンド
イッチアッセイなどであってよい。いずれの場合にも、
一方の成分（抗原または抗体のいずれか）は検出のため
に標識される。標識は通常放射性、化学光または酵素標
識を用いて行われる。抗原および抗体を標識するための
これらのタイプの方法も当業者に知られている。

本発明による抗体は一生物種の天然タンパク質および他
生物種の相当する天然タンパク質のいずれも、およびこ
れらタンパク質の誘導体、断片、合成および天然前駆体
または変性物であっても（それらが免疫に用いられたペ
プチド断片を含んでいるかまたは免疫に用いられたペプ
チド断片の少くとも６０〜８０％に相当するその下位断
片（ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）を少くとも含んでいれば
）認識できるので、本発明による抗体を多生物種（ｍｕ
ｌｔｉ　５ｐｅｃｉｅｓ）イムノアッセイの調製のため
に標識し、また従ってＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）
　、ＣＩＡ／ＬＩＡ　（（化学）光イムノアッセイ）ま
たはＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）を文献に知られた方
法により設計するのが有利である。

ＲＩＡにおいて、微生物中に難溶性封入体として生じる
遺伝子工学生成物の測定に特に有益であることがわかっ
た緩衝系は、慣用の緩衝系例えばホスフェート緩衝剤（
ＮａｌＨＰＯ，、ＮａＪＰＯ，）、トリス（ｔｒｉｓ）
緩衝剤（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ま
たはパルピッレート緩衝剤（例えばナトリウムジエチル
ハルピッレート）などのほかに、少くとも一つのタンパ
ク質例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　、ラクトアル
ブミン、オバルプミン、エッグアルプミン、スキムミル
ク粉またはゼラチンおよび少くきも一つのイオン性洗剤
例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、ヘキサデ
シルトリメチルアンモニウムブロマイド又は胆汁酸塩、
および／または少くとも一つの非イオン性洗剤、例えば
＠　Ｎｏｎ１ｄｅｔＰ４０、＠　ＴｒｉＬｏｎ　Ｘ　１
００または＠　Ｔｗｅｅｎ２０などを含有するものであ
る。

特定の一態様において、異なる生物種のインスリンとも
、またインスリン誘導体、断片、合成および天然変性イ
ンスリン前駆体およびこれら変性インスリン前駆体の誘
導体とも免疫複合体を形成する抗体に関する。これら“
多生物種インスリン抗体”の調製にあたっては、インス
リン断片は前記基準１ａ−ｂにより免疫原として選択さ
れる。適当な例はインスリン抗体鎖のＡ、−Ａ、または
Ａ１１〜Ａｌ１または＾１ｌ−Ａｌｌ配列およびＢ鎖の
システィン周囲の領域である。インスリンＡ鎖（１４−
２１）オクタペプチド Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃ
ｙｓ−Ａｓｎは特に適切であることがわが７でいる。こ
のオクタペプチドは文献（Ｗ、　Ｋ５ｎｉｇ、　Ｋ、　
Ｋｅｒｎｅｂｅｃｋ。

Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ、　Ｃｈｅｍ、、　１９７９．
２２７〜２４７）に知られた方法により製造することが
できる。担体の結合、免疫および抗体単離は前記処理工
程３〜５により行われる。得られたインスリン抗体はそ
れ以上処理および精製しなくても多生物種インスリンア
ッセイの調製に用いることができる。

かかる多生物種インスリンアッセイは、例えば、文献に
知られた方法によりＲＩＡ、　ＣＩＡ／ＬＩＡまたはＥ
ＩＡとして設計することができる。本発明によるインス
リン抗体は溶解状態で遊離した形で（例えば沈降ＲＩＡ
の場合）または固相に結合された（固定された）形で存
在することができる。

沈降ＬＩＡの場合に適しているのは、例えば、（好まし
くは放射性沃素を用いて）放射性に標識されたインスリ
ン、インスリン断片、インスリン誘導体、天然または合
成インスリン前駆体、または例えば、本発明によるイン
スリン抗体を産生するために用いられた放射性に標識さ
れたペプチド断片、特に放射性沃素標識インスリンＡ鎖
（１４−２１）オクタペプチドなどである。サンドイッ
チイムノアッセイの調製には、二つの抗体を用い、その
一方（通常は固相に結合されていない方）を標識する。

それら二つの抗体はインスリンの同じエピトープに対す
るものであってよいが、インスリンの異なるエピトープ
に対するものであるのが好ましい。使用される前記二つ
の抗体を異なるエピトープに対するものとするこのタイ
プのサンドインチイムノアッセイには、アフイニティ精
製され放射性沃素で標識されたポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を用いるのが好ましい。抗体または抗
ｙＫ（インスリン、インスリン断片、インスリン誘導体
、天然または合成前駆体）は、文献に知られる方法に従
って標識され、例えば放射性沃素標識にはＩｏｄｏ−Ｇ
ｅｎ法を用いることができる。

本発明による多生物種インスリンは従来技術によるイン
スリンアッセイに比べ、様々な生物種のインスリンのほ
かインスリン誘導体、インスリン断片、合成および天然
変性インスリン前駆体およびこれら変性インスリン前駆
体の誘導体の測定および決定に用いることができる点で
有利である。

免疫に（従って抗体の産生に）用いられたペプチド断片
のわずか６０〜８０％にしか対応しないアミノ酸配列を
含むようなタンパク質でさえ検出し測定できることが見
出された。すなわち、例えばヘキサペプチド（１６−２
１）　Ｌか含まないようなタンパク質でさえ、インスリ
ンＡ鎖（１４−２１）オクタペプチドで免疫することに
より得られた抗体を含む多生物種インスリンアッセイで
測定することができる。例えば、次のインスリン、イン
スリン誘導体またはインスリンから誘導されるタンパク
質を本発明による多生物種インスリンアッセイで測定す
ることができる：１、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＰＩ、
　Ｐ６、Ｐｌ−トリマー−ｄｅ−ＭｅＬ−ｄｅ−Ｃｙｓ
ｓ　ＰＩ−トリマーｄｅ−Ｍｅｔｓ　ＰＩ−ポリ−Ｇｌ
ｙ−ｄｅ−Ｍｅｔ、ＰＬ−ポリ−Ｇｌｙ−ｄｅ−Ｍｅｔ
−ｄｅ−Ｃｙｓ。

Ｐ”Ｌｚ−ガンマで発現されたβ−ガラクトシダーゼ／
インスリン融合物： ２、大腸菌ｐＢ４０、ｐＫ５２、ｐＧＦ１２、ｐｌＫ１
０ＳｐｓＷ３、ｐｓＷ２、ｐｓＷ３本Ｍで発現されたイ
ンターロイキン−２／インスリン融合物： ３、　大腸菌ｐＢ７０、ｐｌＮＴ１４、ｐｌＮＴ３０、
ｐｌＮＴ４１゜ｐＳＬ２７、ｐｌＮＴ９１で発現された
ｔｒｐ／インスリン融合物； ４、様々な生物種からのインスリン ヒトインスリン、ブタインスリン、ヒツジインスリン、
ウマインスリン、ウサインスリン、ニワトリインスリン
、アヒルインスリン、シチメンチョウインスリン、ガラ
ョウインスリン、ワニインスリン、ガラガラヘビインス
リン、コルブリッドスネークインスリン、イワシクジラ
インスリン、ゾウインスリン、ヤギインスリン、イヌイ
ンスリン、サルインスリン、マツコラクジラインスリン
、ナガスクジラインスリン、ラットインスリン、ハムス
ターインスリン、ウサギインスリン； ５、　インスリン誘導体 Ｂ５１〜モノーＡｒｇ−ヒトインスリン、８３１％Ｂ５
２−ジーＡｒｇ−ヒトインスリン、Ｂｌ−ｄｅ−Ｐｈｅ
−ブタインスリン、Ａ１４−モノヨード−ヒトインスリ
ン；６、インスリン誘導体 インスリンＡ鎖テトラスルホネート（ウシ）、インスリ
ンＡ鎖テトラスルホネート（ヒト）、インスリンＡ鎖（
１４−２１）オクタペプチド、インスリンＡ鎖（１６−
２１）へキサペプチド；７、インスリン前駆体 プレプロインスリンＳ−スルホネート（ＰＩ）、プレプ
ロインスリン（ＰＩ）、グレプロインスリン（ｐＳＷ３
）　、フロインスリン（ブタ）。

更に、本発明による多生動程インスリンアッセイには、
イオン性および非イオン性洗剤、補助タンパク質、洗剤
混合物、および洗剤／補助タンパク質混合物の存在下に
おいてさえも測定が可能であるという長所がある。使用
できる洗剤の例はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
■ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００または＠Ｎｏｎ１ｄｅｔ　
Ｐ　４０であり、また補助タンパク質の例は牛血清アル
ブミン（ＢＳＡ）　、エラグアルブミン、オバルブミン
または大腸菌タンパク質である。イオン性洗剤は好まし
くは０〜０．３％の範囲で、非イオン性洗剤は好ましく
は０〜２％の範囲で、そして補助タンパク質は好ましく
は０〜３％の範囲で使用してもよい（％はｗ／ｖ（−重
／溶）基準）。これらの物質の存在下での測定には、例
えば遺伝子工学により調製された難容性生成物でさえも
本質的にアッセイの障害となることなく測定できる（こ
のことは従来技術による免疫測定法をもってしてはこれ
まで可能となっていなかった）という長所がある。補助
タンパク質または異タンパク質例えばカルシトニンまた
はノナペプチドのブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）　
、および慣用の緩衝系はいずれも本質的に多生動程アッ
セイの支障とならない。すなわち、例えば、微生物中に
難溶性封入体として生じる遺伝子工学生成物の放射免疫
学的測定（ＲＩＡ測定）に特に適していることのわかっ
た緩衝系は、慣用の緩衝物質例えばホスフェート緩衝剤
（ＮａＪＰＯ４，Ｎａ１（、ＰＯ４）、トリス緩衝剤（
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）またはパル
ピッレート緩衝剤（例えばナトリウムジエチルパルピッ
レート）に加えて、少くとも一つのタンパク質例えば牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）　、ラクトアルブミンまたは
オバルブミンおよび少くとも一つのイオン性洗剤例えば
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）　、ヘキサデシルト
リメチルアンモニウムブロマイドまたは胆汁酸塩および
／または少くとも一つの非イオン性洗剤例えば＠Ｎｏｎ
１ｄｅｔ　Ｐ２Ｏ、＠Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００または■
Ｔｗｅｅｎ　２０などを含有する。

本発明によるインスリン抗体は相当に異なる抗原性イン
スリン当量測定に用いることができるので、それらは、
従来より知られている高度に特異的なインスリン抗体と
組み合わせて、三次構造およびインスリン分子内の必須
およびさほど必須でない構造的特徴部の位置を調べるの
にも適している。

実施例 実施例　１ インスリンＡ鎖（１４−２１）オクタペプチドのＢＳＡ
への結合保護されたインスリンＡ鎖（１４−２１）オク
タペプチドをＷ、　　Ｋ５ｎｉｇ、　　Ｋ、　　Ｋｅｒ
ｎｅｂｅｃｋ。

Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ、　Ｃｈｅｌｌｌ、　　１９７
９．２２７〜２４７の方法により合成する。担体分子と
してのＢＳＡに接合するだめに、その保護されたインス
リンＡ鎖（１４−２１）オクタペプチドＤｄｚ−Ｔｙｒ
（ＬＢｕ）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（ＴｒＬ）−ＡｓｎＯ
ｔＢｕから（Ｗ、　Ｋ５ｎｉｇ、　Ｗ、　ｋｅｒｎｅｂ
ｅｃｋ、　Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ。

ＣｈｅＩＩｌ、、　１９７９．２２７〜２４７に従って
）トリフルオロ酢酸およびエタンチオールの混合物で処
理することによりすべての保護基をはずす。次いで得ら
れた生成物を二官能性結合剤Ｎ−マレイミド−６−カプ
ロイルｌ−ヒドロキシ−２−二トロベンゼン−４−スル
ホネートナトリウム塩（ｍａｔ−ｓａｃ−ＨＮＳＡ）を
用いてＢＳＡに共有結合させる。

このために、５５１ＩＩｇのｍａ　１〜ｓａｃ−ＨＮＳ
Ａを１１１１１９のＢＳＡ（リジン９５当量に相当する
）の０．１Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ７，４）　１０
ｉｆｆ中の溶液に添加する。室温で６０分間撹拌後、反
応混合物をＯ，１Ｍホスフェート緩衝液（ｐＨ６，２）
中５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　２５でのクロマトグラフィに
かけそして最初に溶出するピークを集める。この溶液に
６７＋＋＋ｙ（６５μｍｏｆｆ）のインスリンＡ鎖（１
４−２１）オクタペプチドを添加する。次いでその混合
物を室温で一夜放置する。

その混合物を今度は水に対して透析し、そして得られた
溶液を凍結乾燥する。

収量：　１２２１１９ タンパク質含有率＝８３％ ＢＳＡ　１分子あたり１５分子のオクタペプチド（アミ
ノ酸分析により測定） 実施例　２ 免疫 ３種類の動物種、すなわち交雑イエウサギ（固体数−３
）およびヒツジ１頭およびヤギ１頭を免疫に用いた。Ｃ
ＦＡ（フロントの完全アジュバント、Ｄｉｒｃｏ）中の
実施例１で得られたオクタペプチド／ＢＳＡ接合物ｏ、
ｔｍｇを各ウサギに、ＣＦＡ中の該オクタペグチド／Ｂ
ＳＡ接合物各２．５ｒｎｙをヒツジおよびヤギに初回免
疫用量として筋肉内投与することにより、すべての動物
に対する免疫を同時に開始した。初回投与後第３週に、
それら動物にＩＦＡ（７０インドの不完全アジュバント
、Ｂｅｈｒｉｎｇ）中の同一量のオクタペプチド／　Ｂ
ＳＡ接合物を追加免疫用量として投与し、そしてこのプ
ロセスを第４．８．１３．１８および２５週目に繰り返
した。第２７．３２および３７週目に、ＩＦＡ中の同一
量の純粋な非ＢＳＡ接合オクタペプチドを追加免疫用量
として投与した。各場合について第１０週日に、次いで
各追加免疫用量投与の１０日後に抗血清を取り出した。

文献（Ｔ、　Ｃｈａｒｄ、“Ａｎｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ　ＬＯＲａｄｉｏｉｍｎ＋ｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎ
ｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　、　Ｅｌｓ
ｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８７）、　ｐｐ−１０１〜１
０２）に記載の方法により力価を測定した。採取した血
清をＭＳＴＢ緩衝液（この緩衝液の組成については実施
例３を参照）で連続希釈（１：１０−１：１０”）Ｌ、
そして各場合についての、結合トレーサー量をアッセイ
条件下（実施例３参照）に測定した。その際の力価は所
与の希釈度の特定の血清の抗体が使用トレーサーの５０
％を結合する値である。力価は逆数として記録される。

前述の免疫動物の血清はｌ　：　５００−１　：　１０
．０００の力価を有した。

実施例　３ ラジオイムノアッセイの調製および実施使用材料 抗血清 ラジオイムノアッセイ調製のためｌ：５００の力価を有
するヒツジ抗血清（Ｓ２３９）を用いた。

使用抗血清はそれ以上精製することなく直接用いた。血
清希釈度はＩ　：　２０　（ＭＳＴＢ緩衝液中）とし、
またそれを−２０℃で貯蔵した。使用希釈度はｌ　：　
５００　（ＭＳＴＢ緩衝液中）とした。

ＭＳＴＢ緩衝液 使用されたＭＳＴＢ緩衝液の組成は次のとおりとした： Ｑ、ＩＭモルホリノプロパンスルボン酸（ＭＯＰＳ）を
ｌ　Ｍ　　ＮａＯＨでｐＨ７，５に調節２．５％（ｙ／
ｖ）牛血清アルブミン ０．２％（ｗ／ｖ＞　ドデシル硫酸ナトリウム０．２％
（ｗ／ｖ）■Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１０００，４％（ｗ
／ｖ）アジ化ナトリウム 免疫グロブリン溶液 二重蒸留水１ｍｆｆあたり１０ｍｇという濃度の免疫グ
ロブリン溶液をアッセイの実施に用いた。

トレーサー １１１　Ｉ−標識ブタインスリン（Ｂｅｈｒｉｎｇ　ｗ
ｅｒｋｅＡＧ、　マールプルク（Ｍａｒｂｕｒｇ）　、
製品番号ＯＣＳＭ）をトレーサーとして用いた（１０ｎ
ｇ＜　７４ＫＢｑ凍結乾燥物）。

試験管１本あたり２０，０００〜３０．０００カウント
の総括性を用いた。

スタンダード スタンダードのタンパク質含量をまず測定した。次に後
においてＲＩＡで測定すべき物質（様々な生物種のイン
スリン、１６種類のインスリン誘導体、インスリン前駆
体など）の含量を測定した。次にスタンダードをＭＳＴ
Ｂ緩衝液ｌｌｌＩ２あたり２　、０００ｎｇの濃度に調
整した。スタンダードのプロットを記録するために以下
の濃度（データはＭＳＴＢ緩衝液ｌｌｌ＋１２あたりの
ｎｇ値）による幾何希釈列を各場合について調製した： ３．７１；　７．５；　１５；　３０；　６０；　１２
０；　２４０；　４８０；９６０；　１．９２０スタン
ダードプロツトの記Ｉ＆（アッセイ条件） スタンダードプロットの測定のために、１００μａのス
タンダード、ｌＯＯμａのトレーナ−および１００μＱ
の抗血清を各試験管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ　、注文番号５
５〜５３５）にピペットでとった。試料を十分混合し、
室温（１８〜２５℃）に−夜（１８時間）放置した。

１．０００μａのポリエチレングリコール（分子量約４
．０００）で沈澱させる前に５０μｇの免疫グロブリン
溶液を添加し、そしてその混合物をよく混合シた。２０
分後に１．５００Ｘｇで遠心分離を行い、そして上溝を
傾瀉した。次に沈澱をガンマカウンター（ガンマカウン
ター２２７７、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ）で１分
間測定した。各場合につき二つずつの測定値を評価に用
いた。

ブランクの測定 前記・スタンダードプロットの記録″に記載の手順を用
いてブランクを測定した。しかしながらこの場合にはス
タンダードの代わりに１００μＱのＭＳＴＢ緩衝液を用
いた。

実施例　４ 各種インスリンおよびそれらより誘導されたタンパク質
のＲＩＡによる測定 既測定含量のインスリンまたはインスリンより誘導され
たタンパク質を含むスタンダードに基づき（実施例３の
スタンダード参照）、スタンダードプロットを次のイン
スリンについて記録した： ヒトインスリン（３１図）、ブタインスリン（第２図）
、ウシインスリン（第３図）、ヒツジインスリン（第４
図）、ニワトリインスリン（第５図）、およびウマイン
スリン（第６図）、誘導体であるｄｅ−Ｐｈｅ−Ｂｌ−
ブタインスリン（第７図）、ジーＡｒｇ−Ｂ３１〜Ｂ３
２−ヒトインスリンＣＭ８図）、モノーＡｒｇ−Ｂ３１
ヒトインスリン（第９図）、ブタプロインスリン（第１
θ図）およびインスリンＡ鎖テトラスルホネート（第１
１図）および（１４−２１）オクタペプチド（第１２図
）および（１６−２１）ヘキサペプチド（第１３図）。

回申に記載されるＢ／Ｂｏ値は測定された活性Ｂを最大
活性Ｂｏ（抗体をトレーサーで完全飽和）で徐した商で
ある。第１〜１３図に示されたスタンダードプロットは
、本発明による抗体を用いた本発明によるＲＩＡにより
多くのインスリン類に対して高感度検出法が提供される
ことをはっきりと実証している。

異タンパク質および緩衝系の測定に対する影響を調べた
ところ、高濃度のＢＳＡまたは大腸菌タンパク質はいず
れもアッセイの支障に全くならないことが見出された。

小さなペプチド構造との交叉反応性がないことを実証す
るために、カルシトニンおよびブセレリンをオクタペプ
チドと同一濃度でアッセイ混合物にネガティブコントロ
ールとして添加した。交叉反応性は全く認められなかっ
た（第１４図および第１５図参照）。

【図面の簡単な説明】

第１〜１３図は本発明による抗体を用いて検出および記
録された既測定含量のインスリン等を含むスタンダード
についてのプロット図である。 第１４および１５図は本発明による抗体を用いたアッセ
イに対する異タンパク質および緩衝系の影響をみた図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）天然タンパク質の高度に保存されたアミノ酸配列を
   示すペプチド断片で免疫することにより得られる抗体。 ２）アミノ酸配列が天然タンパク質の表面に位置してい
   る、請求項１記載の抗体。 ３）アミノ酸配列が荷電したおよび／または極性の強い
   官能基を含む、請求項１または２記載の抗体。 ４）アミノ酸配列がＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
   Ｇｌｎ、Ｇｌｕから選択される少くとも一つのアミノ酸
   を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。 ５）アミノ酸配列が６〜１３個のアミノ酸長を有する請
   求項１〜４のいずれかに記載の抗体。 ６）天然タンパク質がインスリンである、請求項１〜５
   のいずれかに記載の抗体。 ７）アミノ酸配列がインスリンＡまたはＢ鎖に存在する
   、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。 ８）ペプチド断片がインスリンＡ鎖（１４−２１）オク
   タペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載の抗
   体。 ９）免疫に用いられたペプチド断片のアミノ酸配列と少
   くとも６０〜８０％符号するアミノ酸配列を含むタンパ
   ク質と交叉反応する、請求項１〜８のいずれかに記載の
   抗体。 １０）インスリンＡ鎖（１４−２１）−オクタペプチド
   を含むタンパク質と交叉反応する、請求項６〜９のいず
   れかに記載の抗体。 １１）インスリンＡ鎖（１６−２１）ヘキサペプチドを
   含むタンパク質と交叉反応する、請求項６〜１０のいず
   れかに記載の抗体。 １２）ポリクローナル抗体である、請求項１〜１１のい
   ずれかに記載の抗体。 １３）モノクローナル抗体である請求項１〜１１のいず
   れかに記載の抗体。 １４）適当な動物種を天然タンパク質の高度に保存され
   たアミノ酸配列で免疫し、次いで該動物種の血清から抗
   体を単離することより成る、請求項１〜１２のいずれか
   に記載の抗体の製造方法。 １５）適当な動物種を天然タンパク質の高度に保存され
   たアミノ酸配列を示すペプチド断片で免疫し、次いでこ
   の免疫された動物種の牌細胞をＮＳ１ミエローマ細胞と
   融合させ、そしてそのようにして生成されたハイブリド
   ーマを免疫に用いられたペプチド断片に対するモノクロ
   ーナル抗体の分泌を指標に選択する、請求項１３に記載
   の抗体の製造方法。 １６）免疫に用いられたペプチド断片が担体に結合され
   る請求項１４または１５記載の方法。 １７）イムノアッセイを製造するための請求項１〜１３
   のいずれかに記載の抗体の使用。１８）請求項１〜１３
   のいずれかに記載の抗体を一以上含むイムノアッセイ。 １９）一以上の抗体と免疫複合体を形成する標識された
   抗原を含む、請求項１８記載のイムノアッセイ。 ２０）少くとも一つの抗体が標識される、請求項１８記
   載のイムノアッセイ。 ２１）標識が放射性、化学光または酵素標識を用いて行
   われる、請求項１９または２０記載のイムノアッセイ。 ２２）抗体が固相に固定される、請求項１８〜２１のい
   ずれかに記載のイムノアッセイ。２３）一以上の洗剤お
   よび／または一以上の補助タンパク質および／または一
   以上の洗剤／補助タンパク質混合物を含む、請求項１８
   〜２２のいずれかに記載のイムノアッセイ。２４）少く
   とも一つのイオン性および少くとも一つの非イオン性洗
   剤を含む、請求項２３記載のイムノアッセイ。 ２５）付加的に、一つの特異性の高いインスリン抗体を
   含む、請求項１８〜２４のいずれかに記載のイムノアッ
   セイ。