PT95374B

PT95374B - Processo para a preparacao de anticorpos contra sequencias de aminoacidos altamente conservadas de substancias imunogenicas bem como de meios de ensaio imunologico que contenham esses anticorpos

Info

Publication number: PT95374B
Application number: PT95374A
Authority: PT
Inventors: Stefan Mullner
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1989-09-23
Filing date: 1990-09-20
Publication date: 1999-04-30
Also published as: FI102614B; PT95374A; NO179010C; NO904129D0; DK0420043T3; IL95738A; DK0420043T4; IE64593B1; ES2063223T5; AU6306390A; FI904636A0; EP0420043B2; AU639022B2; CA2025942A1; NO179010B; IL95738A0; ES2063223T3; KR910005887A; KR100188245B1; EP0420043A1

Description

DESCRIÇÃO

Sabe-se que, para a identificação qualã. ;; tativa e quantitativa de substâncias imunogénicas, como antige|i nes, se utilizam cada vez com maior frequência métodos imunoméh tricôs. Estes métodos baseiam-se na formação de um complexo da jj substância imunogénica com um ou mais anticorpos, em que um dos í reagentes se encontra marcado para possibilitar a detecção. É jj deste modo possível verificar se, e em que quantidade, se forI mou um complexo entre a substância imunogénica e um ou mais anI ticorpos. Obtiveram-se progressos decisivos nos métodos de dep terminação imunométrica com a introdução de anticorpos monocloi nais, segundo Milstein e Kohler, cuja utilização se encontra de talhadamente descrita no registo de patente alemão 31 30 834.

: Encontram-se também já descritos processos imunométricos para a

ί determinação de insulinas de determinadas espécies (J. Havranko i va et al., Journal of Immunoassay, 5 (182), 131 - 144 (1984)). ι Estes anticorpos obtiveram-se por imunização com as várias insu ; linas como imunogenes. 0 emprego de anticorpos antipeptídicos, ί obtidos por imunização com constituintes da proteína em causa i (antigenes), para a identificação de proteínas nativas, abriu ij novas perspectivas para uma maior aplicação dos métodos de de!, terminação imunométrica. Tais anticorpos antipeptídicos tornaii ram-se assim um importante instrumento para a identificação de \ péptidos e das respectivas sequências genéticas.

i Estes anticorpos são também particularÍj mente interessantes para a determinação de substâncias, contra í: as quais, em condições normais, não se podem gerar, ou só em ‘ sentido estrito, antigenes, uma vez que estes - injectadas como proteínas completas - são demasiado activas nas concentrações utilizadas, p. ex. hormonas peptídicas, neuropêptidos, ou são j demasiado tóxicas, p. ex. toxina da difteria, virus e outros mi : croorganismos. Na preparação de vacinas sintéticas (J. G. Sut ii cliff et al., Science, Vol. 219, 600 (1983)), podem também empregar-se com sucesso os referidos anticorpos antipeptídicos. Para a escolha da sequência peptídica contra a qual, por um pro 'i cesso conhecido da literatura, se podem obter anticorpos polii| : clonais ou monoclonais, parece ser vantajoso que pelo menos uma ' parte desta sequência esteja localizada à superfície da proteína nativa, isto é, exposta, contendo por isso vários grupos fun h cionais carregados ou fortemente polares. Sabe-se contudo, no j actual estado da técnica, que os elementos peptídicos que repre

I j sentam sequências de aminoácidos altamente conservadas na evolu i ção, são péssimos imunogenes (vide G. Walter, J. Immunol. Med.

88, (1986), 149 - 161). Por sequências de aminoácidos altamente , conservadas na evolução entendem-se neste âmbito as sequências de uma determinada proteína que, no decorrer da evolução, não se alteram ou apenas se alteram muito pouco. Deste modo, por i

j exemplo, o citocroma C de cavalo e de coelho distinguem-se por i algumas sequências de aminoácidos. Outras sequências desta proi ; teína das duas espécies animais são idênticas. Verificou-se que * o sistema imunológico de uma espécie animal não gere quaisquer

2' anticorpos contra estas regiões idênticas do citocroma C da ou2

,.7 | tra espécie, uma vez que esta sequência jã existe no citocroma ί C do próprio corpo. É uma regra geral que a resposta imunolõgica a um antigene é tanto melhor quanto maior a diferença evoluί cional entre a proteína imunizante e a proteína correspondente íi do próprio corpo.

) 0 objectivo da invenção foi pois o de ij descobrir anticorpos que sejam capazes de formar complexos imui! nológicos tanto com uma proteína nativa como com derivados, mui ' tantes, produtos desnaturados, fragmentos ou precursores sintéi' ' ticos.

Mais em particular, o objectivo da inί venção foi o de descobrir anticorpos que formem complexos imuno j lógicos com produtos preparados por engenharia genética, das '' mais variadas espécies, bem como com os seus derivados, precursores desnaturados e fragmentos. Especialmente interessantes [ neste caso são as proteínas preparadas por engenharia genética ] como a insulina.

j Um outro objectivo da invenção foi o de i l ’ — ~ — d senvolver um método de determinação imunométrica que permita a h

il quantificação do rendimento inicial de produtos preparados por | engenharia genética, que ocorrem nos microorganismos com Inclu ί sion bodies (corpos de inclusão) pouco solúveis - o que não i era possível através dos métodos de determinação imunométrica ií j até agora conhecidos - e, ao mesmo tempo, que seja capaz de deί terminar as concentrações de proteínas em cada um dos passos de

Η

Η preparaçao, pelo mesmo processo. Por rendimento inicial entende , -se o rendimento efectivo imediatamente após a fermentação. Este valor não é falseado pelas perdas na preparação da amostra e ι nos passos subsequentes.

; Descobriu-se então surpreendentemente,

I j que os anticorpos obtidos por imunização com unidades peptídi•I [ cas altamente conservadas da proteína nativa em causa, corresj pondem aos requisitos acima mencionados.

I A invenção refere-se deste modo a anticorpos obtidos por imunização com um elemento peptídico que represente uma sequência de aminoãcidos altamente conservada de ’! uma proteína nativa.

í ~

Em especial a invenção refere-se aos an ticorpos obtidos por imunização com elementos peptídicos altamente conservados da insulina.

A invenção refere-se ainda a um processo para a preparação dos anticorpos acima referidos, bem como â sua utilização em métodos de determinação imunométrica.

Tanto no que se referiu anteriormente como no que virá a seguir, entendem-se por sequências de aminoácidos altamente conservadas os fragmentos de proteína de uma determinada proteína, em várias espécies - mesmo mais ou menos ligeiramente modificada - que no decorrer da evolução não se al. teraram ou apenas se alteraram muito pouco. Como exemplo refere -se aqui o octapéptido (14-21) da cadeia A da insulina (Tyr-Glu -Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn), que existe inalterado em várias insu linas conhecidas, como a humana, de porco, de carneiro, de cava lo, de vaca, de galinha, de pato, de perú, de ganso, de crocodi^ lo, de cobra cascavel, de cobra Colubrit, de baleia, de elefante, de cabra, de cao, de macaco, de ratazana, de rato, de ha mster e de coelho.

Por proteína nativa entende-se uma proteína naturalmente ocorrente.

Por elementos peptídicos, fragmentos peptídicos, elementos proteicos e fragmentos proteicos entendem -se partes de um determinado péptido ou de uma determinada proteína, que sejam constituintes naturais desse péptido ou dessa proteína. Trata-se neste caso de aminoácidos de um conjunto (chamado sequência de aminoácidos) que representam uma parte ou um início ou um fim de um péptido ou de uma proteína.

Para a preparação dos anticorpos, de acordo com a invenção, contra sequências de aminoácidos altamen te conservadas de proteínas nativas, procede-se de preferência do seguinte modo:

1. Escolha da sequência de aminoácidos em causa, segundo os critérios seguintes:

a) A sequência em causa deve, de preferência, estar exposta isto ê, deve encontrar-se à superfície da proteína nativa, o que é de preferência o caso em que a sequência con tém vários grupos funcionais carregados ou fortemente po lares, ou quando a estrutura secundária da proteína apre senta nós, que de preferência sobressaem da molécula. E£ | ta condição é normalmente preenchida quando na sequência j em causa ocorrem, por exemplo, asparagina (Asn), ácido aspãrtico (Asp), prolina (Pro), glutamina (Gin), ácido glutâmico (Glu) e/ou glicina (Gly), várias vezes repetidos .

b) 0 número dos epitopos potenciais no elemento peptídico í escolhido deve, por um lado, ser tão pequeno quanto possível, e por outro lado, o elemento peptídico deve ser ί grande, para permitir uma resposta imunolõgica. A sequên cia escolhida não deve ultrapassar 20 aminoácidos, de preferência 12, em particular 10 e muito em especial 8, mas não deve ter menos do que 4, de preferência 5 e em especial 6 aminoácidos. Revelaram-se particularmente con venientes os elementos peptídicos com 6-13, de preferência 7-11, e em especial 8-10 aminoácidos.

I ; c) De preferência, a sequência escolhida não deve situar-se no terminal azotado ou no terminal carbonado da proteína nativa em causa, entendendo-se neste caso por terminal azotado e carbonado os terminais correspondentes da proteína nativa total. No caso da proteína total ser consti.

j tuída por várias proteínas ligadas entre si, a sequência ;i pode naturalmente situar-se num terminal azotado ou cari' bonado interno da proteína integrada.

I 2. Preparação da sequência de aminoácidos em causa !ί Para a preparação do elemento proteico escolhido utiliza-se ' por exemplo o método da síntese peptídica de Merryfield coí; nhecido da literatura. É contudo também possível obter fraçf !; mentos adequados a partir de uma cisão enzimática ou químiji ca da proteína nativa. Podem ainda sintetizar-se sequências ;; curtas por via puramente química.

3. Acoplamento de um suporte quando necessário

Especíalmente no caso de fragmentos proteicos curtos, que

I ji não são capazes por si só de provocar uma resposta imunolõ;j gica ou apenas o conseguem insuficientemente, e ainda no ca i so de fragmentos imunogénicos, é aconselhável acoplar um su ,i porte ao elemento proteico escolhido. Este acoplamento efec / tua-se por processos conhecidos do especialista, por exem5

pio através de reagentes de acoplamento como o glutaraldeí! do ou o sal de sódio do éster N-maleinimido-6-caproílico do

I ácido l-hidroxi-2-nitrobenzeno-4-sulfónico (mal-sac-HNSA).

Como suportes podem utilizar-se por exemplo: polímeros como polietilenoglicol, poliacrilamida ou poli-d-glutamina-d-lisina ou derivados de ácidos gordos como ΡΑΜ-3-Cys (PAM=pal_; mitoil) ou proteínas como albumina de soro de vaca (BSA) ou i Keyhole Limpet Hemocyanina (KLH).

) De preferência, acoplam-se várias moléí cuias do fragmento proteico ao suporte.

i 4. Imunização de uma espécie com o fragmento proteico ou com o i fragmento proteico ligado ao suporte ! A imunização de uma espécie com o elemento proteico ou com o elemento proteico ligado a um suporte efectua-se de acord do com processos conhecidos da literatura, por exemplo atra vês de injecção intramuscular do imunogene, eventualmente

I em conjunto com um adjuvante como KFA (adjuvante de Freund completo) ou IFA (adjuvante de Freund incompleto). Quando i necessário, após obtenção da resposta imunológica, pode rel· petir-se a dose uma ou mais vezes. A escolha da espécie não {I ![ e critica, sendo por exemplo adequados ratos, ratazanas, ! i h coelhos, carneiros ou cabras. A fim de se obterem maiores j quantidades de soros contendo anticorpos ê contudo vantajoso utilizar animais maiores, como carneiros ou cabras.

ί; 5. Isolamento dos anticorpos a partir dos soros

II

Em princípio, apos obtenção da primeira resposta imunolõgi:j ca pode recolher-se o anti-soro. Conforme a espécie de aniι mal utilizada obtêm-se maiores concentrações normalmente após uma ou várias imunizações com o imunogene corresponden ' te. Conforme o fim em vista para a utilização purifica-se e j concentra-se o soro ou utiliza-se directamente sem posteri! or purificação diluindo-se no meio do ensaio. Em especial i para a preparação de ensaios sanduíche é aconselhável a ! purificação e a concentração do soro. Tal pode efectuar-se j por exemplo através de precipitação com sulfato de amónio | seguida de separação numa coluna de afinidade na qual se en > i , I contra imobilizado um antigene adequado. Neste caso separam

L -se todas as proteínas que não têm qualquer efeito de troca i

com a proteína imobilizada. Os anticorpos que reconhecem a proteína em causa - ficando assim ligados à proteína imobilizada - podem eluir-se da coluna.

Em alternativa ao método acima descrito em 5. para o isolamento de anticorpos policlonais, podem também preparar-se naturalmente anticorpos monoclonais. Isto consegue-se por exemplo através da imunização de ratos, como acima descrito em 4., seguida da fusão das células do baço por exemplo com células de mieloma NS 1 e clonagem das células apropriadas. Conforme o caso, os anticorpos monoclo nais assim obtidos, podem multiplicar-se por exemplo através de injecção em ratos pelados. Em princípio, a preparação destes anticorpos monoclonais é conhecida do especialis^ ta e encontra-se descrita na literatura. A continuação do processo de preparação e a purificação podem então efectuar -se como acima descrito em 5.

Os anticorpos de acordo com a invenção podem utilizar-se para a preparação de ensaios imunológicos. Em tais ensaios imunológicos, por exemplo, os anticorpos de acordo com a invenção ou um antigene podem estar imobilizados sobre uma fase sólida. Os processos para a imobilização de antigenes e anticorpos sobre fases sólidas, como polímeros sintéticos ou naturais como poliestireno, polipropileno, PVC ou Latex em várias formas geométricas como tubos, esferas ou placas de microtitulação, são conhecidos do especialista. 0 ensaio imunológico pode ser por exemplo um ensaio competitivo ou um ensaio sanduiche. Em ambos os casos, marca-se um dos componentes - ou o antigene ou o anticorpo para fins de detecção. A marcação efectua-se na maioria dos casos através de um marcador (Label) radioactivo, quimiluminescente ou enzimático. Também estes processos de marcação de antigenes e anticorpos são conhecidos do especialista. Uma vez que os anticorpos de acordo com a invenção são capazes de reconhecer tanto as proteínas nativas de uma espécie como também as proteínas nativas correspondentes de outras espécies e mesmo derivados, fragmentos, precursores sintéticos e naturais ou produtos desnaturados destas proteínas - desde que estes contenham o elemento peptídico uti.

lizado para a imunização ou pelo menos um seu fragmento que corresponda pelo menos a 60-80% do elemento peptidico utili. zação para a imunização - é conveniente, para a preparação de um ensaio imunológico multi-espêcies, marcar os anticorpos de acordo com a invenção, construindo assim, de acordo com processos conhecidos da literatura, um RIA (ensaio radioimunológico), um CIA/LIA (ensaio imunológico quimi) lumi^ nescente) ou um EIA (ensaio enzimoimunolõgico).

Como particularmente vantajoso para a determinação de produtos preparados por engenharia genética, que ocorrem em microorganismos com inclusion bodies pouco solúveis, num ensaio RIA, revelou-se um sistema tampão, que para além dos sistemas tampão habituais como tampões de fojs fato (^2^0^, NaE^PO^) , tampão Tris (TRis hidroximetil) ami. nometano) ou tampão de barbiturato (por exemplo dietilbarbi turato de sódio), contém pelo menos uma proteína como albumina de soro de vaca (BSA), albumina láctea, ovalbumina, al. bumina de ovo, leite em pó ou gelatina e pelo menos um detergente iónico como dodecilsulfato de sódio (SDS), brometo de hexadeciltrimetilamõnio ou um sal galénico e/ou pelo menos um detergente não iónico como ^onidet P40, ^R Triton x 100 ou ^R Tween 20.

Numa forma de concretização especial a invenção refere-se a anticorpos que formam complexos imunolõgicos tanto com a insulina de várias espécies como com de rivados de insulina, fragmentos, precursores da insulina de naturados sintéticos e naturais e derivados destes precurso res da insulina desnaturados. Para a preparação destes anticorpos de insulina multi-espécies escolhe-se como imunogene um fragmento de insulina de acordo com os critérios 1 a - b acima mencionados. São por exemplo adequadas as sequências A^-A? ou ou ^ah^_A21 ^ca<3eia A da insulina bem como a região ã volta da cadeia B da cisteína. Revelou-se particularmente adequado o octapéptido (14-21) da ca deia A da insulina.

Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

Este octapéptido pode preparar-se de acordo com processos conhecidos da literatura (W. Kõnig, K.

.»·’

Kernebeck, Liebigs Ann. Chem. 1979, 227-247). 0 acoplamento do í suporte, a imunização e o isolamento dos anticorpos efectua-se , de acordo com os passos processuais 3-5 acima referidos. Os an: ticorpos de insulina obtidos podem também utilizar-se, sem pos' terior tratamento e purificação, para a preparação de um ensaio.

l· de insulina multi-espécies.

Um ensaio de insulina multi-espécies ij lj deste tipo pode efectuar-se na forma de um RIA, CIA/LIA ou EIA, ;í de acordo com processos conhecidos da literatura. Para tal, os anticorpos de insulina de acordo com a invenção podem encontrar í, -se em solução livre (por exemplo num RIA de precipitação) ou ligados a uma fase sólida (imobilizados). Para o RIA de precipi ;; tação são apropriados por exemplo insulinas, fragmentos de insu ' lina, derivados da insulina, precursores de insulinas naturais íj ou sintéticos radioactivos, de preferência marcados com iodo ra ι dioactivo, ou por exemplo o elemento peptídico marcado radioaci . . .

tivamente, utilizado para a geraçao dos anticorpos de insulina ! de acordo com a invenção, em especial o octapétido (14-21) da ;! cadeia A da insulina marcado com iodo radioactivo. Para a prepa ií ração de um ensaio imunológico sanduiche utilizam-se dois antiíj corpos, dos quais um - normalmente o que não estã ligado â fase jí sólida - se encontra marcado. Os dois anticorpos podem ser diri j! gidos contra o mesmo epitopo da insulina, contudo é preferível ί serem dirigidos contra epítopos da insulina diferentes. Para um i; ensaio imunológico sanduiche desse tipo, no qual os dois anti!; corpos utilizados estão dirigidos contra epítopos diferentes, ί- utilizam-se de preferência anticorpos policlonais ou monocloi nais, purificados por afinidade e marcados com iodo radioactivo. i A marcação dos anticorpos ou antigenes (insulina, fragmentos de insulina, derivados de insulina, precursores naturais ou sinté; ticos, efectua-se de acordo com processos conhecidos da litera; tura, por exemplo pode utilizar-se para a marcação com iodo raí dioactivo o método do iodogene.

ensaio de insulina multi-espécies apresenta em relação aos ensaios de insulina de acordo com o es í! tado da técnica, a vantagem de com ele ser possível determinar *' e quantificar tanto as insulinas de várias espécies, como ainda ij derivados de insulina, fragmentos de insulina, precursores de insulina sintéticos e naturais desnaturados e derivados destes precursores de insulina desnaturados.

Verificou-se que se podem mesmo identificar e quantificar proteínas que contêm sequências de aminoáci dos, que representam apenas 60-80% do elemento peptídico que se utilizou para a imunização (e desse modo para a geração de anti corpos. Podem deste modo, por exemplo, com o ensaio de insulina multi-espécies, contendo anticorpos obtidos por imunização com o octapéptido (14-21) da cadeia A da insulina, podem também determinar-se as proteínas que contêm apenas o hexapéptido (16-21) As seguintes insulinas, derivados de insulina ou proteínas resultantes da insulina, podem por exemplo determinar-se com o en saio de insulina multi-espécies de acordo com a invenção:

1. Fusões (3-galactosidase-insulina expressas em E. coli Pl,

P6, Pl-trímero-Des-Met-Des-Cys, Pl-trímero-Des-Met, Pl-Poli-Gly -Des-Met, Pl-poli-Gly-Des-Met-Des-Cys, P-Lz-gama;

2. Fusões interleucina 2-insulina expressas em E. coli pB40, pK52, pGFl2, pIKlO, pSW3, pSW2, pSW3*M

3. Fusões trp-insulina expressas em E. coli pB70, pINT 14, pINT 41, pINT 30, pSL 27, pINT 91

4. Insulinas de várias espécies: insulina humana, de porco, de carneiro, de cavalo, de vaca, de galinha, de pato, de perú, de ganso, de crocodilo, de cobra cascavel, de cobra colubrid, de baleia, de elefante, de cabra, de cão, de macaco, de ratazana, de hamster, de coelho

5. Derivados de insulina:

Insulina humana B31-mono-Arg, insulina humana B31, B32-di-Arg, insulina de porco Bl-des-Phe, insulina humana Al4-mono-iodo

6. Fragmentos de insulina:

Tetra-sulfonato da cadeia A da insulina (de vaca), tetra-sulfonato da cadeia A da insulina (humana), octapéptido (14-21) da cadeia A da insulina, hexapéptido (16-21) da cadeia A da insuli. na.

7. Precursores de insulina:

Pré-pró-insulina-S-sulfonato (Pl), pré-pró-insulina (Pl), pré-pró-insulina (pSW3), pró-insulina (de porco).

Além disso, o ensaio de insulina multi-espécies de acordo com a invenção, apresenta a vantagem de se

poder proceder a determinações na presença de detergentes iónií cos e não iónicos, proteínas auxiliares, misturas de detergen• tes bem como misturas de detergentes e proteínas auxiliares. Co : mo detergentes podem utilizar-se por exemplo dodecilsulfato de

Triton x 100 ou Nonidet P 40 e como proteínas j. auxiliares albumina de soro de vaca (BSA) , albumina de galinha, j- albumina de ovo ou proteínas de E. coli.. Os detergentes ióniíj

Ij cos podem aplicar-se de preferência na gama de 0-0,3%, os não !i iónicos de preferência na gama de 0-2% e as proteínas auxilia' res de preferência de 0-3% (dados percentuais em p/v = peso/volume) . A determinação na vantagem destas substâncias tem a van,i tagem de se poder aplicar também, por exemplo, a produtos pouco h solúveis preparados por engenharia genética, sem perturbarem ^! apreciavelmente o ensaio, o que não era até agora possível com os processos imunométricos de acordo com o estado da técnica, i Nem as proteínas auxiliares, nem as proteínas estranhas como a ! calcitonina ou o nonapéptido buserelina, ou ainda os sistemas tampão habituais, perturbam apreciavelmente o ensaio multi-espé : cies. Por exemplo, revelou-se particularmente adequado para a ί determinação radioimunológica (determinação RIA) de produtos h preparados por engenharia genéticas, que ocorrem nos microorgaj: nismos como inclusion bodies pouco solúveis, um sistema taml pao, que para alem das substancias tampao habituais como tampões ! de fosfato (Na2HPO^, NaE^PO^), tampão Tris (Tris(hidroximetil)ί aminometano) ou tampão de barbiturato (por exemplo dietilbarbij; turato de sódio) , contém pelo menos uma proteína como albumina j de soro de vaca (BSA), albumina de leite ou ovalbumina, e pelo !j menos um detergente iõnico como dodecilsulfato de sódio (SDS) ,

I

I brometo de hexadeciltrimetilamónio ou um sal galénico e/ou pelo ~ - (r) ÍR^ menos um detergente não iónico como Nonidet P40, Triton x ’ 100 ou ® Tween 2 0.

i j Uma vez que os anticorpos de insulina i de acordo com a invenção se podem utilizar para a determinação ^: simultânea de antigenes de insulina consideravelmente diferen; tes, são também adequados, em combinação com anticorpos de insu lina de alta especificidade até agora conhecidos, para a pesqui *: sa da estrutura terciária e da localização de pormenores estru•! turais essenciais e secundários da molécula de insulina.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 i I Acoplamento do octapêptido (14-21) da cadeia A da insulina ã BSA i;

Sintetiza-se o octapêptido (14-21) da

I cadeia A da insulina, protegido, de acordo com o método de W. Konig e K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem. 1979, 227-247. Para ! conjugação à BSA como molécula suporte removem-se todos os gruII ¹ pos protectores do octapêptido (14-21) da cadeia A da insulina protegido Ddz-Tyr(tBu)-Gln-Leu-Glu(OtBu)-Asn-Tyr(tBu)-Cys(Ttr)-AsnotBu, por tratamento com uma mistura de ácido trif luoroacéti.

H !' co e etanotiol (segundo W. Konig, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem., 1979, 227-247). 0 produto resultante liga-se então de ' forma covalente a BSA por meio do reagente de acoplamento bifun d cional éster N-maleinimido-6-caproílico do ácido l-hidroxi-2-ni trobenzeno-4-sulfónico (sal de sódio) (mal-sac-HNSA). Para tal, adicionam-se 55 mg de mal-sac-HNSA a uma solução de 111 mg de BSA (correspondente a 95 equivalentes de lisina) em 10 ml de ί tampão de fosfato 0,1 molar a pH 7,4. Após 60 minutos de agitação ã temperatura ambiente cromatografa-se a mistura reaccional

i]

Jj através de Sephadex G 25 em tampão de fosfato 0,1 molar a pH 6,2 i! e recolhe-se o pico eluído em primeiro lugar. A esta solução ί adicionam-se 67 mg (65 umol) de octapêptido (14-21) da cadeia A da insulina. Deixa-se em seguida em repouso durante a noite â temperatura ambiente. Dializa-se depois a mistura reaccional l· ί contra água e liofiliza-se a solução resultante.

s; Rendimento: 112 mg j Teor em proteína: 83% íj

P 15 moléculas de octapêptido por molécula de BSA (determinado por análise de aminoácidos).

• EXEMPLO 2 i

i Imunização

P Para a imunização utilizaram-se três ti.

i pos de animais, nomeadamente coelhos domésticos de raça mista

I *i (número de indivíduos =3) e um carneiro e uma cabra. Iniciou·; -se a imunização ao mesmo tempo em todos os animais, tendo-se

I

I aplicado a cada um dos coelhos 0,1 mg do conjugado octapéptido j /BSA do Exemplo 1 em KFA (adjuvante de Freund completo, Difco) e ao carneiro e à cabra 2,5 mg de conjugado octapéptido/BA em j KFA, como dose inicial, por via intramuscular. Na terceira sema i na após a primeira aplicação repetiu-se a imunização com a mesma quantidade de conjugado octapéptido/BSA em IFA (adjuvante de jj Freund incompleto Behring) e repetiu-se este processo na 4ã, 8§, íi 13ã, 18ã e 25ã semanas. Na 27ã, 32ã e 37ã semanas inoculou-se >í ii a mesma quantidade de octapéptido puro não conjugado com BSA em ’ IFA. A recolha dos anti-soros efectuou-se em todos os casos peh la primeira vez na 10§ semana e depois todos os 10 dias após as ,í inoculações. A determinação dos títulos efectuou-se como descri^ , to na literatura (T. Chard, An introduction to Radioimmunoas^; say and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1987), pag. 101-102). Para tal fez-se uma série de dií luições (1:10 - 1:10 ) do soro recolhido em tampão MSTB (compoj;

j' sição do tampão, ver Exemplo 3) e determinou-se a quantidade de 'i

I cada um dos traçadores ligados, nas condiçoes do ensaio (ver il Exemplo 3) . Deste modo, o título ê o valor ao qual o anticorpo do soro em causa, a uma determinada diluição, se liga a 50% do |j traçador utilizado. Regista-se o título como valor recíproco.

Ij Qs soros dos animais imunizados acima descritos tinham títulos ! de 1:500 - 1:10000.

i'

EXEMPLO 3 h

jj Preparação e execução de um ensaio radioimunolõgico |i j Materiais utilizados:

' Para a preparação de um ensaio radioimu nológico utilizou-se um anti-soro de carneiro (S 239) com um tí

I j tulo de 1:500. Utilizou-se directamente o anti-soro sem mais pu rificação. A diluição do soro foi de 1:20 (em tampão MSTB) e ar mazenou-se a -20SC. A diluição de trabalho foi de 1:500 (em tam j pão MSTB).

! Tampão MSTB:

’ O tampão MSTB utilizado tinha a seguin7 te constituição:

t
0,1 M 1	de ácido morfolinopropanosulfónico 7,5 com NaOH 1M
2,5%	(p/v)	de	albumina de soro	de vaca
\| 0,2%	(p/v)	de	dodecilsulfato de	sódio
0,2%	(p/v)	de	^RTriton x-100
? 0,04%	(p/v)	de	azida de sódio

.ti''

Solução de imunoglobulina:

li Para a execução do ensaio utilizou-se _; I uma solução de imunoglobulina numa concentração de 10/ml de

I; água bidestilada.

r h

ij Traçador:

i

Como traçador utilizou-se insulina de porco marcada com 125^odo (Behringwerke AG, Marburg, Prod.-NQ ,1 OCSM) (10 ng < 74 KBg, liofilizada) .

|) Por tubo de ensaio aplicou-se uma actividade total de 20.000-30.000 contagens.

' Padrões;

jl Testaram-se, em primeiro lugar, os palj drões em relação ao seu teor em proteína. Em seguida, determi| nou-se o teor da substância a determinar mais tarde num ensaio I RIA (insulinas de diferentes espécies, 16 derivados de insulili nas, precursoras de insulina, etc.). Depois ajustaram-se os pa| drões a uma concentração de 2000 ng/ml em tampão MSTB. Para o traçado das curvas de calibração faz-se uma série de diluições j em progressão geométrica, nas seguintes concentrações (dados em \ ng/ml de tampão MSTB); 3,71; 7,5; 15; 30; 60; 120; 240; 480;

I 960; 1920.

Traçado das curvas de calibração (condi ções de ensaio);

I Para o traçado das curvas de calibração pipetaram-se para um tubo de ensaio (da firma Sarstedt, nQ. 55-535) 100 pl de padrão, 100 pl de traçados e 100 pl de anti-soro. Misturou-se bem a amostra e deixou-se em repouso durante *1 a noite (18 horas) à temperatura ambiente (18-25QC). Antes da precipitação com 1000 pl de polietilenoglicol (peso molecular i Γ

cerca de 4000) adicionaram-se 50 μΐ de solução de imunoglobuli! na e misturou-se bem. Após 20 minutos centrifugou-se a 1500 x g e decantou-se a camada sobrenadante. Mediu-se o precipitado com ί um contador gama (Gamma Counter, 1277, Pharmacia LKB) durante 1 ! minuto. Para cada determinação fez-se um ensaio duplo.

i p Determinação do valor do ensaio em branco:

jl Para a determinação do ensaio em branco _H procedeu-se como acima descrito em traçado das curvas de calibração, mas em vez do padrão utilizaram-se neste caso 100 ul de tampão MSTB.

i

EXEMPLO 4

Determinação de várias insulinas e de proteínas delas derivadas j num ensaio RIA | Com base nos padrões de teor, previamen j te determinado, em insulina ou em proteína derivada de insulina ;! (vide Exemplo 3 : padrões) , traçaram-se curvas de calibração pa ; ra as seguintes insulinas:

j Insulina humana (Fig. 1), insulina de porco (Fig. 2), insulina de vaca (Fig. 3) , insulina de carneiro (Fig. 4) , insulina de ga linha (Fig. 5) e insulina de cavalo (Fig. 6), os derivados de insulina de porco Des-Phe-Bl (Fig. 7), insulina humana Di-ArgB31-B32 (Fig. 8), insulina humana Mono-Arg-B31 (Fig. 9), pro-in

I sulina de porco (Fig. 10), bem como tetra-sulfonato da cadeia A i de insulina (Fig. 11), octapéptido 14-21 (Fig. 12) e hoxapépti! do 16-21 (Fig. 13).

Os valores B/B_q indicados nas figuras

I representam os quocientes da actividade medida B e da actividade máxima Βθ (saturação completa do anticorpo com o traçador) . As curvas de calibração apresentadas nas Figuras 1-13 mostram claramente que, com os ensaios RIA de acordo com a invenção uti.

| lizando os anticorpos de acordo com a invenção, se obteve um

Ι processo de identificação sensível para um grande número de inί sulinas.

I i « Testou-se a influência de proteínas es-i tranhas e do sistema tampão sobre as determinações e verificou15 r

-se que elevadas concentrações de BSA ou de proteínas de E. coli não prejudicam o ensaio. Como controle negativo para a identificação da falta de reactividade cruzada com pequenas estrutu ras peptídicas, adicionaram-se à substância a testar calcitonina e buserelina em concentrações iguais ãs do octapéptido. Não se verificou qualquer reactividade cruzada (vide Fig. 14 e Fig.

Claims

REIVINDICAÇÕES i

- lã Processo para a preparação de anticorji pos que se obtêm através de imunização com um fragmento peptidi , I ·, co correspondente a uma sequência de aminoácidos altamente conI ι ; servada de uma proteína nativa, caracterizado por se imunizar

'.I '· uma espécie animal adequada com um fragmento peptídico correspondente a uma sequência de aminoácidos altamente conservada de uma proteína nativa, e se isolarem em seguida os anticorpos a partir do soro da espécie animal.

I i - 2ã i

I l! Processo para a preparação de anticorh pos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a seji j quência de aminoácidos se encontrar na superfície externa da

H í proteína nativa.

h j Processo para a preparação de anticori pos, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por |i a sequência de aminoácidos conter grupos funcionais carregados j e/ou fortemente polares.

I t

I

- 4S ι í

• ί

I • :

•; Processo para a preparação de anticor17 pos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracI terizado por a sequência de aminoácidos conter pelo menos um aminoácido escolhido de entre: Asn, Asp, Pro, Gly, Gin, Glu.

- 5ã Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a sequência de aminoácidos ter um comprimento de 6 a 13 aminoácidos.

- 6ã

Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a proteína nativa ser a insulina.

- 7§ Processo para a preparação de anticor! pos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6, carac' terizado por a sequência de aminoácidos se encontrar na cadeia

A ou na cadeia B da insulina.

- 8ã Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o fragmento peptídico ser octapéptido (14-21) da cadeia A da insulina.

- 93 Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 8, caracterizado por esses anticorpos apresentarem reactividade cruzada com proteínas que contêm sequências de aminoácidos que coincidem em pelo menos 60 a 80% com a sequência de aminoácidos do fragmento peptíco utilizado para a imunização.

- 103 Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 6 a 9, caracterizado por esses anticorpos apresentarem reactividade cruzada com proteínas que contêm o octapêptido (14-21) da cadeia A da insulina.

- 113 Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 6 a 10, carac terizado por esses anticorpos apresentarem reactividade cruzada com proteínas que contêm o hexapêptido (16-21) da cadeia A da insulina.

- 123 Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 11, carac terizado por os anticorpos serem policlonais.

Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 12, carac terizado por, após a imunização da espécie animal adequada, se

I fundirem as micelas desta espécie animal imunizada com células !i de mieloma NS1, e se seleccionarem os hibridomas assim prepara;·. dos em relação à secreção de anticorpos monoclonais contra o fragmento peptídico utilizado para a imunização, obtendo-se L assim anticorpos monoclonais.

14ã Processo para a preparação de anticorpos, de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 13, carac terizado por o fragmento peptídico utilizado para a imunização ί se encontrar acoplado a um suporte.

15ã j Processo para a preparação de um meio * de ensaio imunológico, caracterizado por nele se conter um ou ' mais anticorpos quando preparados por um processo de acordo com I uma ou mais das reivindicações 1 a 14.

Processo para a preparação de um meio ι de ensaio imunológico, de acordo com a reivindicação 15, carac*- terizado por conter um antigene marcado que forma com o(s) anti / corpo(s) um complexo imunológico.

ί - 17§ ι ¹ Processo para a preparação de um meio ' de ensaio imunológico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por pelo menos um anticorpo ser marcado.

I

I - 18ã η

1' ;^!

Processo para a preparação de um meio i de ensaio imunológico, de acordo com as reivindicações 16 ou 17, ' caracterizado por a marcação se efectuar com um agente (Label) jl ! radioactivo, quimilumirescente ou enzimático.

μ

- 19§ ! Processo para a preparação de um meio de teste imunológico, de acordo com uma ou mais das reivindica' ções 15 a 18, caracterizado por um anticorpo se encontrar imofcm h lizado sobre uma fase sólida.

I^I h - 20â , I

I |í

I, j Processo para a preparação de um meio ! de ensaio imunológico, de acordo com uma ou mais das reivindica I ções 15 a 19, caracterizado por conter um ou mais detergentes e/ou uma ou mais proteínas adicionais e/ou uma ou mais misturas de detergente - proteína adicional.

I

- 215 Processo para a preparação de um meio J de ensaio imunológico, de acordo com a reivindicação 20, caracj terizado por conter pelo menos um detergente iónico e pelo menos um detergente não iónico.

|i

- 22& Processo para a preparação de um meio de ensaio imunológico, de acordo com uma ou mais das reivindica ções 15 a 21, caracterizado por conter ainda um anticorpo altamente específico para a insulina.

j dos pedidos alemães jí 30 de Maio de 1990, j respectivamente.

A requerente reivindica as prioridades apresentados em 23 de Setembro de 1989 e em sob os N°s. P 39 31 787.0 e P 40 17 344.5,