NO179010B

NO179010B - Antistoffer mot höyt konserverte aminosyresekvenser fra immunogene forbindelser og anvendelse derav i immunoanalyser

Info

Publication number: NO179010B
Application number: NO904129A
Authority: NO
Inventors: Stefan Mullner
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1989-09-23
Filing date: 1990-09-21
Publication date: 1996-04-09
Also published as: FI102614B; PT95374A; IE903421A1; EP0420043A1; FI904636A0; NO904129L; IL95738A; DK0420043T3; KR910005887A; FI102614B1; NO179010C; IE64593B1; DK0420043T4; EP0420043B2; CA2025942A1; ATE103341T1; ES2063223T3; DE59005082D1; JPH03152464A; NO904129D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører antistoffer mot høyt konserverte aminosyresekvenser fra immunogene forbindelser og anvendelser derav i immunoanalyser.

Det er kjent at for kvalitativ og kvantitativ påvisning av immunogene forbindelser som antigener, blir det alltid i større grad anvendt immunometriske metoder.

Disse metodene beror på dannelse av et kompleks av den immunogene forbindelsen med et eller flere antistoffer, idet en av bindingspartnerene på grunn av deteksjon er merket. Dermed er det mulig å fastslå om, og i hvilken mengde, det er blitt dannet et kompleks av den immunogene forbindelsen og §n eller flere antistoff. Bestemte forbedringer av den immunometriske bestemmelsesfremgangsmåten var mulig med innførelse av monoklonale antistoff gjennom Milstein og Kohler, anvendelse derav i immunometriske analyser er beskrevet i det tyske offentliggjøringsskriftet 31 30 834. Også immunometriske fremgangsmåter for bestemmelse av insuliner fra bestemte arter er beskrevet (J. Havrankova et al., Journal of Immunoassay, 5 (182), 131-144 (1984)). Disse antistoffene ble oppnådd gjennom immunisering med de forskjellige insuliner som immunogen. Anvendelse av antipeptidantistoff, som gjennom immunisering med bruddstykker av det gjeldende proteinet (antigenet) ble oppnådd for identifi-sering av native proteiner, tilveiebragte ytterligere forbedringsmuligheter med hensyn på den universalitets-immunometriske bestemmelsen. Slike antipeptidantistoff er imidlertid et viktig verktøy ved identifikasjon av peptider og dermed gensekvenser.

Av spesiell interesse er disse antistoffene også for bestemmelse av forbindelser, som det mot disse på vanlig måte ikke kan bli dannet, eller bare i begrenset omfang antisera, på grunn av at disse innjisert som fullstendige proteiner enten er for meget virksomme i de nødvendige konsentrasjon-ene, for eksempel peptidhormoner, neuropeptider eller virker for toksiske, for eksempel Diphteria Toxin, vira og andre mikroorganismer. Ved utvikling av "Synthetischen Impf-stoffen" J.G. Sutcliff et al., Science, Vol. 219, 660 (1983), kunne slike antipeptidantistoffer bli tilsatt. For utvalget av peptidsekvensen som det ifølge litteraturkjent teknikk kan bli dannet polyklonale eller monoklonale antistoff, er det fordelaktig at minst én del av denne sekvensen er lokalisert på overflaten av det native proteinet, dvs. er eksponert, og som dermed inneholder ladede eller sterkt polare funksjonelle grupper. Det er ifølge teknikkens stand uttrykkelig bevist at peptidfragment som utgjør evolusjonære høykonserverte aminosyresekvenser er meget dårlig immunogene (se G. Walter, J. Immunol. Med. 88, (1986), 149-161). Med evolusjonære høy-konserverte aminosyresekvenser forstås heri slike sekvenser av et angitt protein som i løpet av evolusjonen ikke har forandret seg, eller bare meget lite. Heste- og kanin-cytokrom C er dermed for eksempel forskjellige i noen aminosyresekvenser. Andre sekvenser av dette proteinet fra begge dyrearter er derimot identiske. Det ble oppdaget at immunsystemet til den ene dyrearten ikke dannet antistoff mot denne identiske regionen til Cytochrom C til den andre arten, på grunn av at denne sekvensen jo også forekommer i det kroppsegne Cytochrom C. Det gjelder som regel at immunresponsen på et antigen er desto bedre jo større den evolusjonære avstanden er mellom immunisert protein og det tilsvarende kroppsegne proteinet.

Gjenstand for oppfinnelsen er følgelig å stille antistoffer til rådighet som er istand til å danne immunkomplekser med både et nativt protein og også med derivater mutanter denaturerte produkter, fragmenter eller (syntetiske) forløpere.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig antistoffer, kjennetegnet ved at de gjenkjenner og binder seg til epitoper i sekvensene A^-Ay, A^^-<A>^y, A-^-Agi, °§ ^16~-^21 ^ra A-kjeden i insulin.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av ovennevnte antistoff for påvisning av insulin in vitro i en immunoanalyse.

Antistoffene kan danne immunkomplekser med genteknologisk fremstilte produkter fra forskjellige arter samt derivatene derav, denaturerte forløpere og fragmenter. Av spesiell interesse er herved den gentekniske fremstillingen av proteiner som insulin.

En immunometrisk målefremgangsmåte som muliggjør måling av initialutbytte av genteknologisk fremstilte produkter som i mikroorganismer dannes som tungtløselige "inklusjonslegemer", som med immunologiske målefremgangsmåter ifølge teknikkens stand ikke tidligere var mulig, og som samtidig er istand til å måle proteinkonsentrasjonene i de enkelte opparbeidings-trinnene med den samme målefremgangsmåten kan anvendes. Med initialutbyttet forstås de utbyttene som er effektivt tilstedeværende direkte etter fermentasjon. De påvirkes ikke gjennom tap i prøveopparbeidingen og gjennom opparbeidings-trinnene.

Det ble nå overraskende oppdaget at antistoff som ble oppnådd gjennom immunisering med høykonserverte peptidfragmenter av det vedrørende native proteinet, oppfylte ovennevnte oppgave.

Med høykonserverte aminosyresekvenser av proteinfragmenter menes proteiner som i løpet av evolusjonen ikke har forandret seg eller eventuelt bare har forandret seg uvesentlig. Som eksempel kan nevnes oktapeptidet (14-21) av insulin-A-kjede (Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn), som i mange kjente insuliner som human-, svine-, saue-, heste-, okse-, hønse-, ande-, kalkunhane-, gåse-, aligator-, klapperslange-, kolubritslange-, seihval-, elefant-, gjeite-, hunde-, ape-, spermhval-, finnhval-, rotte-, muse-, hamster- og kanininsulin forekommer uforandret.

Med et nativt protein forstås et naturlig forekommende protein.

Med peptidfragmenter, peptidfragmenter, proteinbruddstykker og proteinfragmenter, forstås deler av et vedrørende peptid/protein som er naturlige bestanddeler av dette peptidet/proteinet. Det dreier seg her om sammenhengende aminosyrer (en såkalt aminosyresekvens), som utgjør et avsnitt eller en begynnelse eller en ende av peptidet/- proteinet.

For fremstilling av antistoffene mot høykonserverte aminosyresekvenser fra native proteiner ifølge oppfinnelsen gjør man som følger: 1. Valg av vedrørende aminosyresekvens ifølge følgende kriterier: a) Den gjeldende sekvensen skal fortrinnsvis være eksponert, dvs. skal befinne seg på overflaten til

det native proteinet, som fortrinnsvis gjelder når sekvensen inneholder flerladede eller sterkt polare funksjonelle grupper eller når sekundærstrukturen til proteinet oppviser sløyfer, som fortrinnsvis rager ut av molekylet. Denne betingelsen blir mest oppfylt når eksempelvis asparagin (Asn), Asparaginsyre(Asp), prolin (Pro), glutamin (Gin), glutaminsyre (Glu) og/eller glycin (Gly) flere ganger forekommer i den betraktede sekvensen.

b) Tallet på potensielle epitoper på det utvalgte peptidf ragmenter skal på den ene siden være så lite

som mulig, og på den andre siden skal peptidfragmenter være stort nok for en immunrespons. Den utvalgte sekvensen bør 20, fortrinnsvis 2, spesielt foretrukket 10, helt spesielt foretrukket ikke overskride 8 aminosyrer og ikke være mindre enn 4, fortrinnsvis 5, spesielt foretrukket 6 aminosyrer. Egnede er

peptidfragmenter med 6-13, fortrinnsvis 7-11, spesielt 8-10 aminosyrer.

c) Fortrinnsvis skal den utvalgte sekvensen ikke ligge på N- eller C-terminus til det gjeldende native

proteinet, idet det med N- og C-terminus her forstås de tilsvarende termini til alle native proteinene. Dersom dette totalproteinet er bygget opp av flere med hverandre koblede proteiner, kan sekvensen selvfølgelig ligge på en innliggende N- eller C-terminus til dette integrerte proteinet.

2. Fremstilling av g. ieldende aminosyresekvens.

For fremstilling av det utvalgte proteinbruddstykket kan eksempelvis den litteraturkjente peptidsyntesen ifølge Merryfield anvendes. Det er derimot også mulig å oppnå egnede fragmenter fra en enzymatisk eller kjemisk spaltning av det native proteinet. Korte sekvenser kan derimot også bli syntetisert kjemisk.

3. Nødvendig påkobling av en bærer

Spesielt for korte proteinfragmenter som selv ikke eller bare i utilstrekkelig grad produserer immunsvar, men også for immunogene fragmenter, er det anbefalt å koble en bærer på det utvalgte proteinbrostykke. Denne koblingen skjer ifølge fremgangsmåter som er kjent for fagfolk, eksempelvis over koblingsreagenser som glutaraldehyd eller l-hydroksy-2-nitrobenzol-4sulfonsyre-N-maleinimido-6-kaproyl-ester-natriumsalt (mal-sac-ENSA). Som bærer kan eksempelvis tilsettes: Polymerer som polyetylenglykol, polyakrylamid eller poly-d-glutamin-d-lysin eller fettsyrederivater som PAM-3-Cys (PAM=palmitoyl) eller protein som bovint serumalbumin (BSA) eller Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH).

Fortrinnsvis blir flere molekyler av proteinfragmentet koblet på bæreren.

4. Immunisering av en art med proteinfragmentet henholdsvis

med basrer- bundet proteinfragment.

Immunisering av en art med proteinbruddstykke, henholdsvis med baerer-bundet proteinbruddstykke, foregår ifølge litteraturkjent fremgangsmåte, eksempelvis gjennom intramuskulær injeksjon av immunogenet, eventuelt sammen med et adjuvants som KFA (komplett Freundsches Adjuvans) eller IFA (ufullstendig Freundsches Adjuvants). Dersom det er nødvendig kan etter oppnåelse av immunsvaret bli "boostret" én eller flere ganger. Valg av art er ikke kritisk, eksempelvis er mus, rotter, kaniner, sauer eller gjeiter egnede. For fremstilling av større mengde antistoffinneholdende sera, er det derimot fordelaktig å anvende større dyr som sauer eller gjeiter.

5. Isolering av antistoff fra sera.

Prinsipielt kan antiserumet bli isolert etter oppnåelse av den første immunresponsen. Alt etter anvendt dyreart oppnår man høyere titere, derimot etter én- eller flere gangers boostring med det tilsvarende immunogenet. Alt etter anvendelsesformål blir serumet renset og anriket eller direkte uten ytterligere rensning fortynnet i analysemedium og tilsatt. Spesielt for fremstilling av Sandwich-analyser er rensing og anrikning av serum foretrukket. Det kan eksempelvis foregå gjennom ammoniumsulfatfelling og påfølgende separering på en affinitetssøyle der et tilsvarende antigen er immobilisert. Da blir alle proteiner separert som med det immobiliserte proteinet ikke oppviser noen vekselvirkning. De antistoff som erkjenner det gjeldende proteinet og som dermed er bundet på det immobiliserte proteinet, kan deretter bli eluert fra kolonnen.

Alternativt til den ovenfor under 5. beskrevne metoden for isolering av polyklonale antistoff, kan det naturligvis også fremstilles monoklonale antistoff. Dette foregår eksempelvis gjennom immunisering av mus som beskrevet ovenfor under 4. og påfølgende fusjon av musemiltceller, eksempelvis med NS 1 myelomceller og kloning av egnede celler. Eventuelt kan de på denne måten isolerte monoklonale antistoffene eksempelvis gjennom injeksjon i nakne mus bli formert. Prinsipielt er fremstilling av slike monoklonale antistoff kjent for fagfolk og beskrevet i litteraturen. Opparbeidningen og rensningen kan deretter foregå som beskrevet ovenfor under 5.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for fremstilling av immunanalyser. I slike immunoanalyser kan antistoffene ifølge oppfinnelsen eller et antigen bli immobilisert på en fastfase. Fremgangsmåter for immobili-sering av antigener og antistoffer på fastfaser som syntetiske eller naturlige polymerer som polystyrol, polypropylen, PVC eller lateks i forskjellige geometriske utførelsesformer som rør, kuler eller mikrotiterplater, er kjent for fagfolk. Immunoanalysen kan eksempelvis være en kompetitiv analyse eller en Sandwich-analyse. I begge tilfeller er en be-standdel, enten antigenet eller antistoffet, markert for deteksjon. Merkingen foregår for det meste over en radioaktiv, kjemiluminisens eller enzymatisk markør. Også slike fremgangsmåter for merking av antigener og antistoffer er kjent for fagfolk. Da antistoffene ifølge oppfinnelsen er istand til å erkjenne både de native proteinene til en art og også de tilsvarende native proteinene til andre arter, og til og med derivater, fragmenter, syntetiske og naturlige forløpere og denaturerte produkter til disse proteinene, dersom de oppviser de for immunisering anvendte peptidfragmenter, eller i det minste underbruddstykker derav, som minst tilsvarer 60-80$ av det for immunisering anvendte peptidfragmenter, er det fordelaktig å fremstille en multiart-immunoanalyse og markere antistoffene ifølge oppfinnelsen og dermed ifølge litteraturkjente fremgangsmåter å bygge opp en RIA (radioimmunoanalyse) CIA/LIA ((kjemi)-luminiscensimmunoanalyse ) eller EIA (enzymimmunanalyse).

Som spesielt fordelaktig for bestemmelse av genteknologisk fremstilte produkter som' opptrer i mikroorganismer som tungt løselige "inklusjons legemer" i en RIA, er det fremkommet et buffersystem som ved siden av vanlige buffersystemer som fosfatbuffer (Na2HP04, NaE^PC^). Tris-buffer (tris(hydroksymetyl)aminometan) eller barbituratbuffer, (eksempelvis natriumdietylbarbiturat), minst inneholder et protein som bovint serumaalbumin (BSA), melkeeggehvite, ovalbumin, eggehvite, tørrmelkspulver eller gelatin og minst én ionisk detergent som natriumdodecylsulfat (SDS), heksade-cyltrimetylammoniumbromid eller et gallesalt og/eller minst ett ikke-ionisk detergent som ®Nonidet P40, ®Triton X100 eller ®Tween 20.

I en spesiell utførelsesform vedrører oppfinnelsen antistoff som både med insulin med forskjellige arter og også med insulinderivater, fragmenter, syntetiske og naturlig denaturerte insulinforløpere og derivater av disse denaturerte insulinforløpere danner immunkomplekser. For fremstilling av disse "multi-arter-insulin-antistoff" blir et insulin-fragment ifølge ovennevnte kriterier la-b valgt som immunogen. Egnet er eksempelvis sekvensen A^- Aj eller A^-A^ eller A11"A21 "til insulin-A-kjeden samt regionene om cysteinene til B-kjeden. Også spesielt egnet er insulin-A-kjeden-(14-21 )-oktapeptidet

Dette oktapeptidet blir fremstilt ifølge litteaturkjente fremgangsmåter (W. K6nig, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem., 1979, 227-247 ). Baererkobl ingen, immuniser ingen og antistoff isoleringen foregår ifølge ovennevnte fremgangsmåtetrinn 3-5. Også uten ytterligere opparbeidning og rensning,kan de oppnådde insulinantistoffene anvendes for fremstilling av en multi-art-insulin-analyse.

En slik multi-art-insulinanalyse kan eksempelvis bli bygget opp som RIA, CIA/LIA eller EIA ifølge litteraturkjente fremgangsmåter. Her kan insulinantistoffene ifølge oppfinnelsen foreligge både i fri oppløsning (eksempelvis i en fellings-RIA) eller være bundet på en fastfase (immobilisert). For fellings-RIA egner det seg da eksempelvis radioaktiv, fortrinnsvis radiojod-markerte insuliner, insulinfragmenter, insulinderivater, naturlige eller syntetiske insulinforløpere eller eksempelvis det radioaktivt merkede peptidfragment som ble anvendt for dannelse av insulinantistoffene ifølge oppfinnelsen, spesielt det radiojodmarkerte insulin-A-kjede (14-21 )-oktapeptidet. For fremstilling av en sandwich-immunoanalyse blir to antistoff anvendt, der den ene, for det meste den som er ikke-fastfase-bundet blir merket. Begge antistoffene kan være rettet mot samme epitope til insulinet, men de er fortrinnsvis rettet mot forskjellige epitoper til insulin. I en slik sandwich immunoanalyse, der de begge anvendte antistoffene er rettet mot forskjellige epitoper, anvender man fortrinnsvis polyklonale eller monoklonale affinitetsrensede, radiojod-merkede antistoffer. Merking av antistoffene, henholdsvis antigenene (insulin), insulinfragmenter, insulinderivater, naturlige eller syntetiske forløpere) foregår ifølge litteraturkjente fremgangsmåter, eksempelvis kan jodogen-metoden bli anvendt for radiojodmerking.

Multiart-insulinanalysen oppviser ifølge insulinanalyser ifølge teknikkens stand den fordelen at i både insulin fra forskjellige arter og også insulinderivater, insulinfragmenter, syntetiske og naturlig denaturerte insulinforløpere og derivater av disse denaturerte insulinforløperne, kan bli målt og bestemt.

Det er til og med blitt vist at proteiner som inneholder aminosyresekvenser som bare utviser 60-80$ av tidbruddstykket som ble anvendt for immunisering, og dermed for antistoff-dannelse kan bli bevist og bestemt. Dermed lar det seg eksempelvis med multi-art-insulin-analysen, som inneholder antistoffer som er blitt oppnådd gjennom immunisering med insulin med-A-kjede (14-21 )-oktapeptid, også bestemme slike proteiner som bare inneholder heksapeptidet (16-21). Følgende insulin, insulinderivater eller fra insulinavledede proteiner kan eksempelvis bli bestemt med multi-art insulinanalyse: 1. p<->galaktosidase-insulin-fusjoner uttrykt i E.coli Pl, P6, Pl-trimer-Des-Met-Des-Cys, Pl-trimer-Des-Met, Pl-poly-Gly-Des-Met, Pl-poly-Gly-Des-Met-Des-Cys, P-Lz-gamma; 2. Interleukin-2 insulin-fusjoner uttrykt i E. coli pB40, pK52, pGF12, pIKlO, pSW3, pSV/2; pSW3<*>M 3. trp-insulin-fusjoner uttrykt i E. coli pB70, pINT 14, pINT 30, pINT 41, pSL 27; pINT 91 4. Insulin fra forskjellige arter humaninsulin, svineinsulin, saueinsulin, hesteinsulin, bovint insulin, hønseinsu-lin, andeinsulin, kalkuninsulin, gjessinsulin, alliga-torinsulin, klapperslangeinsulin, kolubridslangeinsulin, seihvatinsulin, elefantinsulin, gjeiteinsulin, hundeinsu-lin, apeinsulin, spermhvalinsulin, finnhvalinsulin, rotteinsulin, hamsterinsulin, kanininsulin;

5. Insulinderivat

B31-mono-Arg-humaninsulin, B31,B32-Di-Arg-humaunsulin, Bl-Des-Phe-svineinsulin, A14-monojodhumaninsulin

6. Insulinfragmenter

Insulin-A-kjede-tetrasulfonat (bovint), insulin-A-kjede-tetrasulfonat (humant), insulin-A-kjede-(14-21)oktapeptid, insulin-A-kjede-(16-21)-heksapeptid.

7. Insulinforløpere

Pre-Pro-insulin-S-sulfonat (Pl), Pre-Pro-insulin (Pl), Pre-Pro-insulin (pSW 3), pro-insulin (svin).

Videre utviser multi-arts-insulin-analysen den fordelen at også i nærvær av ioniske og ikke-ioniske detergenter, hjelpeproteiner, detergentblandinger samt detergent hjelpeproteinblandinger kan det bli målt. Som detergenter kan eksempelvis natriumdodecylsulfat (SDS), ®Triton X 100 eller ©Nonidet P 40 og som hjelpeproteiner kan bovint serumalbumin (BSA), hønseeggehvite, ovalbumin eller E. coli-proteiner bli tilsatt. Ioniske detergenter kan fortrinnsvis bli tilsatt i området 0-0,3$, ikke-ioniske detergenter foretrukket i området 0-2$ og hjelpeproteiner fortrinnsvis i området 0-3$ (prosentangivelser i v/v = vekt/volum). Måling i nærvær av disse forbindelsene har den fordelen at også eksempelvis tungtløselige produkter fra genteknologisk fremstilling er tilgjengelig for måling uten å forstyrre analysen, som med den immunometriske fremgangsmåten ifølge teknikkens stand tidligere ikke var mulig. Hverken hjelpeproteiner eller fremmede proteiner som kalsitonin eller nonapeptidet buserilin, eller vanlige buffersystemer, forstyrrer multi-art analysen vesentlig. Det har dermed eksempelvis for radioimmunologisk bestemmelse (RIA-bestemmelse) av genteknologisk fremstilte produkter, som i mikroorganismer fremkommer som tungt, løselige "inklusjonslegemer", fremkommet et buffersystem som meget egnet, som ved siden av de vanlige buffer-forbindelsene som fosfatbuffer (Na2HP04, Nal^PCU). tris-buffer (tris(hydroksymetyl)aminometan) eller barbituratbuffer (eksempelvis natriumdietylbarbiturat), minst inneholder et protein som bovint serumalbumin (BSA), melkeeggehvite eller ovalbumin om minst en ionisk detergent som natriumdodecylsulfat (SDS), heksadecyltri-metylammoniumbromid eller et gallesalt og/eller minst en ikke-ionisk detergent som ®Nonidet P40, ®Triton X100 eller ®Tween 20.

Idet insulinantistoffet ifølge oppfinnelsen kan anvendes for likeverdige bestemmelser av betydelig forskjellige antigene insuliner, egner de seg også i kombinasjon med tidligere kjente høyspesifikke insulinantistoff for undersøkelse av tertiærstrukturen og lokalisering av essensielle og mindre essensielle strukturkjennetegn i insulinmolekylet.

Eksempler:

EKSEMPEL 1

Kobling av insulin- A- k. iede ( 14- 21 )- oktapeptid til BSA

Det beskyttede insulin-A-kjede (14-21 )-oktapeptidet blir syntetisert ifølge W. Konig, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem. 1979, 227-247. For konjugasjon til BSA som bærermolekyl blir det beskyttede insulin-A-kjede (14-21 )-oktapeptid Ddz-Tyr(tBu)-Gln-Leu-Glu(OtBu)-Asn-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-AnsOtBu gjennom behandling med en blanding av trifluoreddiksyre og etantiol befridd for alle beskyttelsesgrupper (ifølge W. Konig, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem., 1979, 227-247). Det resulterende produktet blir deretter kovalent bundet ved hjelp av det bifunksjonelle koblingsreagenset 1-hydroksy-2n i t robenzol-4-sulf onsyre-N-maleinimido-6-kaproyl-ester-natriumsalt (mal-sac-HNSA) til BSA. Her blir 55 mg mal-sac-HNSA tilsatt til en oppløsning av 111 mg BSA (tilsvarer 95 ekvivalenter lysin) i 10 ml 0,1 molar fosfatbuffer ved pH 7,4. Etter 60 minutters røring ved romtemperatur blir reaksjonsblandingen kromatografert over Sephadex G 25 i 0,1 molart fosfatbuffer ved pH 6,2 og den først eluerte toppen blir samlet. Til denne oppløsningen blir 67 mg (65 jjmol) insulin-A-kjede (14-21)-oktapeptid tilsatt. Dette lar man stå ved romtemperatur over natt. Reaksjonsblandingen blir nå dialysert mot vann og den resulterende oppløsningen lyofili-sert.

Utbytte: 122 mg

Proteininnhold: 83$

15 molekyler oktapeptid pr. molekyl BSA ("bestemt gjennom aminosyreanalyse)

EKSEMPEL 2

Immunisering

For immunisering blir det anvendt tre dyrearter, deriblant huskaniner av blandingsrase (tall på individer = 3) en sau og en geit. Immuniseringen ble påbegynt samtidig' i alle dyr, der kaninen fikk injisert intramuskulaert 0,1 mg oktapeptid/- BSA-konjugatet ifølge eksempel 1 i KFA (fullstendig Freundsches Adjuvants, Difco) og sau og gjeit 2,5 mg oktapeptid/- BSA-konjugat i KFA som initialdose. I den tredje uken etter første applikasjon ble det boostret med samme mengde oktapeptid/BSA-konjugat i IFA (ufullstendig Freundsches Adjuvants, Behring) og dette forløpet ble gjentatt i 4., 8., 13., 18., og 25. uke. I den 27., 32. og 37. uken ble det boostret med samme mengde rent ikke-BSA konjugert oktapeptid i IFA. Uttak av ant i sera foregår første gang i 10. uke, og deretter ti dager etter boosterne. Titerbestemmelsen foregår som beskrevet i litteraturen (T. Chard, "An introduction to Sadioimmunoassay and Eelated Techniques", Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1987), s. 101-102). Dertil ble en fortynningsrekke (1:10 - 1:10^) av det uttatte serumet i MSTB-buffer (sammensetning av bufferet, se eksempel 3) oppsatt, og mengden bundet tracer under analysebetingelsene (s. eksempel 3) bestemt. Titere er da den verdien hvor antistoffene til serumet ved en angitt fortynning binder 50$ av tilsatt tracer. Titeret blir angitt som resiprok verdi. Sera til ovenfor beskrevne immuniserte dyr hadde titere på 1:500-1:10.000.

EKSEMPEL 3

Fremstilling og gjennomføring av en radioimmunanalyse

Anvendte materialer

Antiserum

For fremstilling av en radioimmunanalyse ble det anvendt et saueantiserum (S 239) med et titer på 1:500. Det tilsatte antiserumet ble uten ytterligere rensing direkte anvendt. Fortynning av serumet utgjorde 1:20 (i MSTB-buffer); som ble lagret ved -20°C. Bruksfortynningen utgjorde 1:500 (i MSTB-buf f er ).

MSTB-buffer.

Den anvendte MSTB- bufferen bestod av:

0,1 M morfolinopropansulfonsyre (MOPS) innstilt på pH

7,5 med IM NaOH

2,5$ (v/v) bovint serumalubin

0,2$ (v/v) natriumdodecylsulfat

0,04 (v/v) natriumazid

Immunoglobulinoppløsning

For analysegjennomføring ble en immunglobulinoppløsning i en konsentrasjon på 10 mg/ml bidest. vann anvendt.

Markør

Som maricOT ble <125>J-merket svineinsulin (Behringwerke AG, Marburg, Prod.-nr. OCSM) anvendt (10 ng <74 KBq lyofilisat). Pr. testrør ble det en totalaktlvitet på 20.000-30.000 tellinger tilsatt.

Standarder

Standardene ble dernest undersøkt med hensyn på deres proteininnhold. Deretter ble innholdet i senere RIA for bestemmende forbindelser (insulin fra forskjellige arter, 16 insulinderivater, insulinforløpere osv.) bestemt. Deretter ble standardene innstilt på en konsentrasjon på 2000 ng/ml i MSTB-buffer. For opptak avstandardkurven ble en geometrisk fortynningsrekke i følgende konsentrasjoner (angivelser i ng/ml MSTB-buffer) fremstilt: 3,71; 7,5; 15; 30; 60; 120; 240; 480; 690; 1920.

Opptak av standardkurven ( analysebetingelser)

For formidling av standardkurven ble 100 pl standard, 100 pl tracer og 100 pl antiserum pipettert i et reagensrør (fa. Sarstedt, Best.-nr. 55-535). Proben ble grundig gjennomblandet og latt stå overnatt (10 timer) ved romtemperatur (18-25°C). Før utfelling med 1000 pl polyetylenglykol (molekylvekt ca. 4000) ble det omsatt med 50 pl immunglobu-linoppløsning og grundig gjennomblandet. Etter 20 minutter ble det sentrifugert med 1500 x g og supernatanten ble avdekantert. Presipitatet ble deretter målt i gamma-teller (Gamma-Counter 1277, Pharmacia LKB) i 1 minutt. Det fremkom en dobbeltbestemmelse for vurdering.

Formidling av nullverdier

For formidling av nullverdiene ble det som ovenfor under "opptak av standardkurven" beskrevet. I steden for standarder ble det her anvendt 100 pl MSTB-buffer.

EKSEMPEL 4

Måling av forskjellige insuliner og derav avledede proteiner i RIA

I steden for standardene med før bestemt innhold av insulin henholdsvis insulinavledet protein (se eksempel 3: standarder), ble for følgende insulinstandardkurver tatt opp: Humaninsulin (fig.l), svineinsulin (fig. 2), bovint insulin (fig. 3), saueinsulin (fig. 4), hønseinsulin (fig. 5) og hesteinsulin (fig. 6), derivatene Des-Phe-Bl-svineinsulin (fig.7), Di-Arg-B31-B32-humaninsulin (fig. 8), mono-Arg-B31humaninsulin (fig. 9), pro-svineinsulin (fig. 10) samt insulin-A-kjede-tetra-sulfonat (fig. 11) og 14-21-oktapeptid (fig. 12) og 16-21-heksapeptid (fig. 13).

De i figurene angitte verdiene B/Bq angir kvosienten av målt aktivitet B og maksimal aktivitet Bq (fullstendig metning av antistoffet med markør). De i figurene 1-13 angitte standard-kurver angir tydelig at med RIA ifølge oppfinnelsen under anvendelse av antistoffene ifølge oppfinnelsen, tilveie-bringes en følsom deteksjonsmetode for et antall insuliner.

Innvirkning av fremmedproteiner og buffersystemet på målingene ble undersøkt, og det ble fastslått at hverken høye konsentrasjoner av BSA eller E. coli-proteiner forstyrrer analysen. Som negative kontroller for å tilveiebringe bevis for en manglende kryssreaktivitet med små peptidstrukturer, ble kalsitonin og buserelin tilsatt testoppsettet i likekon-sentrasjoner som oktapeptidet. Ingen kryssreaktivitet blir oppvist (se fig. 14 og fig. 15).

Claims

1. Antistoffer, karakterisert ved at de ■ gjenkjenner og binder seg til epitoper i sekvensene A^-Ay, <A>11~<A>17» <A>11~<A>21'<A>14"<A>21°S <A>16"A21 fra A_kjeden i insulin.

2. Anvendelse av antistoff ifølge krav 1 for påvisning av insulin in vitro i en immunoanalyse.