FI102614B - Immunogeenisten aineiden hyvin säilyneiden aminohapposekvenssien vasta -aineita, menetelmä näiden vasta-aineiden valmistamiseksi ja niiden kä yttö immuunimäärityksissä - Google Patents

Description

102614

Immunogeenisten aineiden hyvin säilyneiden aminohapposekvenssien vasta-aineita, menetelmä näiden vasta-aineiden valmistamiseksi ja niiden käyttö immuunimääritykeissä 5 Immunogeenisten aineiden, kuten antigeenien, kvali tatiiviseen ja kvantitatiiviseen määrittämiseen käytetään tunnetusti kasvavassa määrin immunometrisiä menetelmiä. Nämä menetelmät perustuvat siihen, että muodostetaan immu-nogeenisen aineen kompleksi yhden tai useamman vasta-ai-10 neen kanssa, jolloin yksi sitoutumiskumppaneista leimataan detektointia varten. Siten on mahdollista todeta, onko kompleksi muodostunut immunogeenisesta aineesta ja yhdestä tai useammasta vasta-aineesta ja missä määrin tällaista muodostumista on tapahtunut. Immunometriset määritysmene-15 telmät paranivat huomattavasti Milsteinin ja Köhlerin tuodessa käyttöön monoklonaaliset vasta-aineet, joiden käyttöä immunometrisissa määrityksissä kuvataan perusteellisesti DE-hakemusjulkaisussa 3 130 834. Myös immunometrisiä menetelmiä määrättyjen lajien insuliinien määrittämiseksi 20 on jo kuvattu [J. Havrakova et ai., Journal of Immunoassay 5 (1984) 131 - 144]. Näitä vasta-aineita on saatu tekemällä immunisointi käyttäen immunogeenina erilaisia insuliineja. Antipeptidivasta-aineiden käyttö, joita on valmis- , .·, tettu immunisoimalla kyseisen proteiinin (antigeenin) 25 fragmenteilla, luontaisten proteiinien identifiointiin on • · * tarjonnut lisää parannusmahdollisuuksia immunometristen • « · *···* määritysten yleispätevyyden suhteen. Tällaiset antipepti- • · · divasta-aineet ovat nykyisin tärkeä väline peptidien ja • · ·...* siten geenisekvenssien identifioinnissa.

• · I

·.· ’ 3 0 Erityisen kiintoisia nämä vasta-aineet ovat myös määritettäessä aineita, joille ei pystytä muodostamaan antiseerumeja tai niitä saadaan vain rajoitetussa määrin, • · koska ne täydellisinä proteiineina injektoituina ovat tar-vittavina pitoisuuksina joko liian tehokkaita, kuten esi- ' 35 merkiksi peptidihormonit ja neuropeptidit, tai liian tok- 102614 2 sisia, kuten esimerkiksi difteriatoksiini, virukset ja muut mikro-organismit. Tällaisia antipeptidivasta-aineita on pystytty käyttämään menestyksellisesti myös "synteettisten rokotteiden" kehittämisessä [J. G. Sutcliff et ai., 5 Science 219 (1983) 660] . Valittaessa peptidisekvenssiä, jota vastaan on määrä muodostaa kirjallisuudessa kuvatuin menetelmin polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita, on osoittautunut edulliseksi, että ainakin osa tästä sekvenssistä on luontaisen proteiinin pinnalla, toisin 10 sanoen paljaana, ja sisältää siten enemmän varautuneita tai voimakkaasti polaarisia funktionaalisia ryhmiä. Tässä yhteydessä viitataan alan kirjallisuudessa kuitenkin selvästi siihen, että peptidifragmentit, joissa on evoluutiossa hyvin säilyneitä aminohapposekvenssejä, ovat sangen 15 huonoja immunogeeneja [G. Walter, J. Immunol. Med. 88 (1986) 14 9 - 161] . Evoluutiossa hyvin säilyneillä amino happosekvensseillä tarkoitetaan tällöin sellaisia kyseessä olevan proteiinin sekvenssejä, jotka eivät ole muuttuneet tai jotka ovat muuttuneet vain vähän evoluution aikana. 20 Niinpä esimerkiksi hevosen ja kaniinin sytokromi C:t eroavat toisistaan muutamien aminohapposekvenssien suhteen. Tämän proteiinin muut sekvenssit ovat sitä vastoin identtisiä näillä kahdella eläinlajilla. On havaittu, että toi-, sen eläinlajin immuunijärjestelmä ei kehitä vasta-aineita 25 näille identtisille toisen lajin sytokromi C:n alueille, ’ * koska tämä sekvenssi esiintyy myös elimistön omassa syto- • · · *··;’ kromi C:ssä. Sääntönä on, että immuunivaste antigeeniin on • · · sitä parempi, mitä etäämpänä immunisoiva proteiini ja vas-taava elimistön oma proteiini ovat evolutiivisesti toisis- • · · V · 30 taan.

Tämän keksinnön päämääränä oli tarjota käyttöön vasta-aineita, joilla on kyky muodostaa immuunikomplekseja • · ' sekä luontaisen proteiinin että johdannaisten, mutanttien, denaturoituneiden tuotteiden, fragmenttien tai (synteet-'· ·‘ 35 tisten) esiasteiden kanssa.

102614 3 Päämääränä oli erityisesti tarjota käyttöön vasta-aineita, jotka muodostavat immuunikomplekseja mitä erilaisimpien lajien geeniteknisesti valmistettujen tuotteiden samoin kuin niiden johdannaisten, denaturoituneiden esias-5 teiden ja fragmenttien kanssa. Erityisen kiinnostuksen kohteena olivat tällöin geeniteknisesti valmistetut proteiinit, kuten insuliini.

Yhtenä lisäpäämääränä oli kehittää immunometrinen menetelmä, joka mahdollistaa mikro-organismeissa vaikea-10 liukoisina "sulkeumakappaleina" syntyvien geeniteknisesti valmistettujen tuotteiden alkusaannon mittaamisen - mikä ei tekniikan tasoa vastaavilla immunologisilla mittausmenetelmillä tähän asti ole ollut mahdollista - ja joka samalla mahdollistaa proteiinipitoisuuksien mittaamisen yk-15 sittäisissä käsittelyvaiheissa käyttämällä samaa mittausmenetelmää. Alkusaannolla tarkoitetaan kulloistakin saantoa, joka todellisuudessa on läsnä heti fermentoinnin jälkeen. Sitä eivät heikennä näytteenvalmistuksen eivätkä jälkikäsittelyvaiheiden aiheuttamat häviöt.

20 Nyt on yllättävästi havaittu, että vasta-aineet, jotka on saatu tekemällä immunisointi kyseisen alkuperäisen luonnollisen proteiinin hyvin säilyneillä peptidifrag-menteilla, täyttävät edellä mainitun tehtävän.

. .·. Keksintö koskee siten vasta-aineita, joita saadaan 25 tekemällä immunisointi peptidifragmentilla, jossa on luon- • · I täisen proteiinin hyvin säilynyt aminohapposekvenssi.

• · · *** Keksintö koskee erityisesti sellaisia vasta-ainei- • · · •“j ta, joita saadaan tekemällä immunisointi insuliinin hyvin • · '···* säilyneillä peptidifragmenteilla.

• · · V * 30 Lisäksi keksintö koskee menetelmää edellä mainittu jen vasta-aineiden valmistamiseksi samoin kuin niiden :V: käyttöä immunometrisissä mittausmenetelmissä.

: Edellä ja jäljempänä tarkoitetaan hyvin säilyneillä . aminohapposekvensseillä kyseessä olevan, useammassa lajis- 35 sa - vaikkakin enemmän tai vähemmän muuntuneena - esiinty- » » · 102614 4 vän proteiinin sellaisia fragmentteja, jotka eivät ole muuttuneet tai ovat muuttuneet vain epäolennaisesti evoluution aikana. Esimerkkinä mainittakoon insuliinin A-ket-jun oktapeptidi (14 - 21) (Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys- 5 Asn), joka esiintyy muuttumattomana monissa tunnetuissa insuliineissa, kuten ihmisen, sian, lampaan, hevosen, naudan, kanan, ankan, kalkkunan, hanhen, alligaattorin, kalkkarokäärmeen, nuolikäärmeen, seitivalaan, norsun, vuohen, koiran, apinan, kaskelotin, uurteisvalaan, rotan, hiiren, 10 hamsterin ja kaniinin insuliineissa.

Luontaisella proteiinilla tarkoitetaan luonnossa esiintyvää proteiinia.

Peptidinpaloilla, peptidifragmenteilla, proteiinin-paloilla ja proteiinifragmenteilla tarkoitetaan kyseessä 15 olevan peptidin/proteiinin osia, jotka ovat tämän pepti-din/proteiinin luonnollisia rakenneosia. Tällöin on kyse toisiinsa liittyneistä aminohapoista (niin kutsuttu aminohapposekvenssi) , jotka muodostavat peptidin/proteiinin keskeltä tai alku- tai loppupäästä peräisin olevan palan.

20 Keksinnön mukaisten vasta-aineiden valmistamiseksi luontaisten proteiinien hyvin säilyneille aminohapposekvensseille on paras menettely seuraava: 1. Kyseisen aminohapposekvenssin valinta seuraavin perustein: .. ! 25 a) Kyseisen sekvenssin tulisi olla edullisesti « 4 · » * * * esillä, ts. sen tulisi esiintyä luontaisen proteiinin pin- • i » ’···* nalla, mikä toteutuu edullisesti, kun sekvenssi sisältää • · · ...ί runsaasti varautuneita tai voimakkaasti polaarisia ryhmiä • · · ·...'· tai kun proteiinin sekundaarirakenteessa esiintyy silmu- • · < ·* 30 koita, jotka edullisesti suuntautuvat ulospäin molekyyl istä. Tämä ehto toteutuu useimmiten, kun kyseisessä sek- ·*·': venssissä esiintyy runsaasti esimerkiksi asparagiinia • · . (Asn), asparagiinihappoa (Asp), proliinia (Pro), glutamii- nia (Gin), glutamiinihappoa (Glu) ja/tai glysiiniä (Gly).

102614 5 b) Potentiaalisten epitooppien lukumäärän valitulla peptidifragmentilla tulisi olla mahdollisimman pieni; toisaalta peptidifragmentin tulee kuitenkin olla kyllin suuri immuunivasteen aikaansaamiseksi. Valittu sekvenssi ei sai- 5 si olla suurempi kuin 20, edullisesti 12, erityisen edullisesti 10 ja aivan erityisen edullisesti 8 aminohappoa eikä pienempi kuin 4, edullisesti 5 ja erityisen edullisesti 6 aminohappoa. Sopiviksi ovat osoittautuneet peptidi fragmentit, jotka sisältävät 6-13, edullisesti 7 -10 11, erityisesti 8-10 aminohappoa.

c) Valitun sekvenssin ei pitäisi mielellään olla kyseisen luontaisen proteiinin N- tai C-päässä, jolloin N-ja C-päällä tarkoitetaan koko luontaisen proteiinin vastaavia päitä. Jos tämä koko proteiini koostuu useista toi- 15 siinsa kytkeytyneistä proteiineista, voi sekvenssi luonnollisesti olla tämän integroituneen proteiinin sisäisessä N- tai C-päässä.

2. Kyseisen aminohapposekvenssin valmistaminen

Valitun proteiinifragmentin valmistamiseksi on tar-20 jolla esimerkiksi kirjallisuudessa kuvattu Merryfieldin peptidisynteesi. On kuitenkin täysin mahdollista hankkia sopivia fragmentteja myös pilkkomalla luontaista proteiinia entsymaattisesti tai kemiallisesti. Lyhyitä sekvensse-: jä voidaan syntetisoida myös puhtaasti kemiallisesti.

25 3. Kantajan kytkeminen tarvittaessa t * . .·. Erityisesti lyhyiden proteiinifragmentien kohdalla, • · · • · · jotka eivät herätä minkäänlaista tai herättävät riittämät- "IV. t tömän immuunivasteen, mutta myös immunogeenisten fragment- • · *” tien ollessa kyseessä on suositeltavaa kytkeä kantaja va- • · « *·* * 30 littuun proteiinifragmenttiin. Tämä kytkeminen tapahtuu ammattimiehelle tutuin menetelmin, esimerkiksi kytkentä- • · ·.·.* reagenssien, kuten glutaarialdehydin tai l-hydroksi-2-nit- robentseeni-4-sulfonihappo-N-maleimido-6-kaprolyyliesterin natriumsuolan (mal-sac-HSNA), avulla. Kantajana voidaan 35 käyttää esimerkiksi polymeerejä, kuten polyetyleeniglyko-

I

102614 6 lia, polyakryyliamidia tai poly-d-glutamiini-d-lysiiniä, tai rasvahappojohdannaisia, kuten PAM-2-Cys:ä (PAM = pal-mitoyyli), tai proteiineja kuten naudan seerumialbumiinia (BSA) tai tulivuorikotilon hemosyaniinia (KLH).

5 On edullista kytkeä useita proteiinifragmenttimole- kyylejä kantajaan.

4. Lajin immunisointi proteiinifragmentilla tai kantajaan sidotulla proteiinifragmentilla

Lajin immunisointi proteiinifragmentilla tai kan-10 tajaan sidotulla proteiinifragmentilla tapahtuu kirjallisuudessa kuvatuin menetelmin, esimerkiksi injektoimalla lihaksensisäisesti immunogeenia, mahdollisesti yhdessä apuaineen, kuten KFA:n (täydellinen Freundin apuaine) tai IFA:n (epätäydellinen Freundin apuaine), kanssa. Tarvit-15 taessa voidaan antaa yksi tai useampia "tehosteita" immuunivasteen aikaansaannin jälkeen. Lajin valinta ei ole ratkaisevaa, soveltuvia ovat esimerkiksi hiiri, rotta, kaniini, lammas tai vuohi. Vasta-aineita sisältävien seerumien valmistamiseksi suurehkoina määrinä on kuitenkin edullista 20 käyttää suurehkoja eläimiä, kuten lampaita tai vuohia.

5. Vasta-aineiden talteenotto seerumeista Antiseerumi voidaan periaatteessa ottaa talteen ensimmäisen immuunivasteen aikaansaannin jälkeen. Käyte- : tystä eläinlajista riippuen saadaan vasta-aineita suurem- ;·.·. 25 pia määriä vasta, kun on annettu yksi tai useampia tehos- • » ..·. teannoksia vastaavaa immunogeenia. Käyttötarkoituksen mu- • · · kaan seerumi puhdistetaan ja rikastetaan tai laimennetaan *”* suoraan ilman lisäpuhdistusta määritysväliaineella ja käy- • · *···' tetään. Erityisesti kerrosmääritysten yhteydessä on seeru- • « « * 30 min puhdistus ja rikastus suositeltavaa. Tämä voidaan teh dä esimerkiksi ammoniumsulfaattisaostuksella ja sitä seu- • · raavalla erotuksella af f initeettipylväässä, johon on immo-bilisoitu vastaavaa antigeeniä. Tällöin erottuvat kaikki proteiinit, jotka eivät ole vuorovaikutuksessa immobili-35 soidun proteiinin kanssa. Vasta-aineet, jotka tunnistavat I · « · * 102614 7 kyseisen proteiinin ja sitoutuvat siten immubolisoituun proteiinin, voidaan sitten eluoida pylväästä.

Vaihtoehtona edellä kohdassa 5 kuvatuille polyklo-naalisten vasta-aineiden tuotantomenetelmille voidaan 5 luonnollisesti valmistaa myös monoklonaalisia vasta-aineita. Tämä tehdään esimerkiksi immunisoimalla hiiriä edellä kohdassa 4 kuvatulla tavalla ja fuusioimalla sitten hiiren pernasolut esimerkiksi myeloomasolujen NS 1 kanssa ja kloonaamalla sopivia soluja. Siten saatuja monoklonaalisia 10 vasta-aineita voidaan mahdollisesti lisätä esimerkiksi karvattomille hiirille annettavilla injektioilla. Tällaisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen on periaatteessa tuttua ammattimiehelle, ja sitä kuvataan kirjallisuudessa. Jatkokäsittely ja puhdistus voidaan tehdä sit-15 ten edellä kohdassa 5 kuvatulla tavalla.

Keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan käyttää immuunimääritysvälineiden valmistukseen. Tällaisten im-muunimääritysvälineiden ollessa kyseessä voidaan immobili-soida kiinteälle kantajalle esimerkiksi keksinnön mukaisia 20 vasta-aineita tai antigeeniä. Menetelmät antigeenien ja vasta-aineiden immobilisoimiseksi kiinteille kantajille, kuten polystyreenille, polypropeenille, PVC:lie tai lateksille, jotka voivat olla erilaisissa geometrisissa muo-: doissa, kuten putkina, helminä tai mikromaljoina, ovat . 25 ammattimiehelle tuttuja. Immuunimääritys voi olla esimer- • · ..·. kiksi kompetetiivinen määritys tai kerrosmääritys. Kummas- • t * sakin tapauksessa jokin aineosa - joko antigeeni tai vas- '11*. ta-aine - leimataan detektoinnin mahdollistamiseksi. Lei- • ♦ • · “* maus tehdään useimmiten radioaktiivisella, kemiluminesoi- • · · *·’ * 30 valla tai entsymaattisella merkkiaineella. Myös tällaiset menetelmät antigeenien ja vasta-aineiden leimaamiseksi • · ·.·.· ovat ammattimiehelle tuttuja. Koska keksinnön mukaisilla • · · 1,: · vasta-aineilla on kyky tunnistaa sekä jonkin lajin luon- .··. täisiä proteiineja että myös muiden lajien vastaavia luon- 35 täisiä proteiineja ja jopa näiden proteiinien johdannai- 4 * I · 102614 8 siä, fragmentteja, synteettisiä ja luonnollisia esiasteita tai denaturoituneita tuotteita - kunhan niissä on immunisointiin käytetty peptidifragmentti tai vähintään sen osa, joka vastaa vähintään 60 - 80 %:a immunisointiin käytetys-5 tä peptidifragmentista, on monilaji-immuunimääritysväli-neiden valmistamiseksi edullista leimata keksinnön mukaiset vasta-aineet ja muodostaa niiden avulla kirjallisuudessa kuvatuin menetelmin välineet RIA:ta (radioimmuuni-määritys), CIA/LIA:ta [ (kerni)luminesenssi-immuunimääritys] 10 tai EIA:ta (entsyymi-immuunimääritys) varten.

Geeniteknisesti valmistettujen tuotteiden, jotka syntyvät mikro-organismeissa vaikealiukoisina "sulkeuma-kappaleina", määrittämiseksi RIA:lla on erityisen edulliseksi osoittautunut puskurijärjestelmä, joka tavanomaisten 15 puskurijärjestelmien, kuten fosfaattipuskurin (Na2HP04,

NaH2P04), tris-puskurin [tris(hydroksimetyyli)aminometaani] tai barbituraattipuskurin (esimerkiksi natriumdietyylibar-bituraatti), ohella sisältävät ainakin yhtä proteiinia, kuten naudan seerumialbumiinia (BSA), maitoproteiinia, 20 ovalbumiinia, munanvalkuaisproteiinia, maitojauhetta tai gelatiinia, ja vähintään yhtä ionista pinta-aktiivista ainetta, kuten natriumdodekyylisulfaattia (SDS), heksade-kyylitrimetyyliammoniumbromidia tai Gallen-suolaa ja/tai : : : vähintään yhtä ionitonta pinta-aktiivista ainetta, kuten 25 NonidetR P40:ä, TritonR X100:a tai TweenR 20 :ä.

• · . Keksinnön eräs erityissuoritusmuoto koskee vasta- • · · aineita, jotka muodostavat immuunikomplekseja eri lajien insuliinien samoin kuin insuliinijohdannaisten, fragment- • « tien, synteettisten tai luonnollisten denaturoituneiden • · · 30 insuliinin esiasteiden ja näiden denaturoituneiden insuliinin esiasteiden johdannaisten kanssa. Näiden "monilaji- • · *.V insuliinivasta-aineiden" valmistamiseksi valitaan immuno- ♦ # · · geeninä käytettävä insuliinifragmentti edellä mainittujen ,··. perusteiden la ja Ib mukaisesti. Soveltuvia ovat esimer- 3 5 kiksi insuliinin A-ketjun sekvenssit A1-A7, A11-A17 tai I « • « 102614 9 aii"A2i samoin kuin B-ketjun kysteiiniryhmän ympärillä olevat alueet. Erityisen sopivaksi on osoittautunut insuliinin A-ketjun oktapeptidi (14-21) Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn. Tämä oktapeptidi voidaan valmistaa kirjallisuu-5 dessa kuvatuin menetelmin (W. König, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem. 1979, 227 - 247) . Kytkeminen kantajaan, immunisointi ja vasta-aineiden talteenotto tapahtuvat edellä esitettyjen menettelyvaiheiden 3-5 mukaisesti. Saatuja insuliinin vasta-aineita voidaan käyttää myös ilman lisä-10 käsittelyä ja puhdistusta monilaji-insuliinimääritysten tekemiseen.

Tällainen monilaji-insuliinimääritys voidaan toteuttaa kirjallisuudessa kuvatuin menetelmin esimerkiksi RIA-, CIA/LIA- tai EIA-määrityksenä. Tällöin keksinnön 15 mukaiset insuliinin vasta-aineet voivat olla joko vapaasti liuoksessa (esimerkiksi saostus-RIA:n yhteydessä) tai sidottuina kiinteään faasiin (immobilisoituina). Saostus-RIA:han soveltuvat esimerkiksi radionuklideilla, edullisesti radiojodilla leimatut insuliinit, insuliinifragmen-20 tit, insuliinijohdannaiset, luonnon tai synteettiset insuliinin esiasteet tai esimerkiksi radioaktiiviseksi leimattu peptidifragmentti, jota käytettiin keksinnön mukaisten insuliinin vasta-aineiden muodostamiseen, erityisesti ra-: diojodilla leimattu insuliinin A-ketjun oktapeptidi ·'·*: 25 (14-21) . Kerrosimmuunimääritykseen käytetään kahta vasta- • · . ainetta, joista toinen - useimmiten kiinteään faasiin • · · • · « .·. sitomaton - leimataan. Molemmat vasta-aineet voivat sitou- tua insuliinin samaan epitooppiin, edullisesti ne sitoutu- • · vat kuitenkin insuliinin eri epitooppeihin. Mainitunlai- • · · 30 seen kerrosmääritykseen, jossa käytetyt kaksi vasta-ainetta sitoutuvat eri epitooppeihin, käytetään edullisesti • · V.: polyklonaalisia tai monoklonaalisia, affiniteettimenetel- • · « V ' mällä puhdistettuja, radiojodilla leimattuja vasta-ainei- .··. ta. Vasta-aineiden tai antigeenien (insuliinin, insuliini- 35 fragmenttien, insuliini johdannaisten tai luonnon tai syn-

« I

102614 10 teettisten esiasteiden) leimaus tapahtuu kirjallisuudessa kuvatuin menetelmin; radiojodileimaukseen voidaan esimerkiksi käyttää jodogeenimenetelmää.

Keksinnön mukaisella monilaji-insuliinimäärityksel-5 lä on tekniikan tasoa vastaavaan insuliinimääritykseen nähden se etu, että sillä voidaan mitata ja määrittää sekä eri lajien insuliineja että insuliinijohdannaisia, insu-liinifragmentteja, synteettisiä ja luonnon denaturoituneita insuliiniesiasteita ja näiden denaturoituneiden insu-10 liiniesiasteiden johdannaisia.

On osoittautunut, että voidaan osoittaa ja määrittää jopa sellaisia proteiineja, jotka sisältävät aminohapposekvenssejä, joissa on vain 60 - 80 % peptidifragmentis-ta, jota käytettiin immunisointiin (ja siten vasta-aineen 15 muodostamiseen). Niinpä esimerkiksi monilaji-insuliinimää- rityksellä, joka sisältää vasta-aineita, jotka on saatu immunisoimalla insuliinin A-ketjun oktapeptidillä (14-21), voidaan määrittää myös sellaisia proteiineja, jotka sisältävät vain heksapeptidin (16-21). Keksinnön mukaisella 20 monilaji-insuliinimäärityksellä voidaan määrittää esimer kiksi seuraavia insuliineja, insuliinijohdannaisia tai insuliiniperäisiä proteiineja: 1. β-galaktosidaasi-insuliinifuusioproteiinit, joita tuot-: tavat E. coli PI, P6, Pl-trimeeri-de-Met-de-Cys, Pl-tri- 25 meeri-de-Met, Pl-poly-Gly-de-Met, Pl-poly-Gly-de-Met-de- • · . .·. Cys ja P-Lz-gamma; • · · ”5. 2. (interleukiini-2)-insuliinifuusioproteiinit, joita tuottavat E. coli pB40, pK52, pGF12, pIKlO, pSW2 ja • · psw3*m; • · · ’·* 30 3. trp-insuliinifuusioproteiinit, joita tuottavat E. coli pB70, pINT 30, pINT 41, pSL 27 ja pINT 91; • · V.: 4. eri lajien insuliinit: ihmisen, sian, lampaan, hevosen, • · · : : : naudan, kanan, ankan, kalkkunan, hanhen, alligaattorin, _<·. kalkkarokäärmeen, nuolikäärmeen, seitivalaan, norsun, vuo- I · | · < t < « · 102614 11 hen, koiran, apinan, kaskelotin, uurteisvalaan, rotan, hiiren, hamsterin ja kaniinin insuliini; 5. insuliinijohdannaiset: B31-mono-Arg-(ihmisen insuliini), B31,B32-di-Arg-(ihmisen insuliini), Bl-de-Phe-(sian 5 insuliini), A14-monojodi-(ihmisen insuliini); 6. insuliinifragmentit; (insuliinin A-ketju)tetrasulfo-naatti (nauta), (insuliinin A-ketju)tetrasulfonaatti (ihminen) , insuliinin A-ketjun oktapeptidi (14-21), insuliinin A-ketjun heksapeptidi (16-21); 10 7. insuliiniesiasteet: preproinsuliini-S-sulfonaatti (Pl) , preproinsuliini (Pl), preproinsuliini (pSW 3) , proinsulii-ni (sika);

Keksinnön mukaisella monilaji-insuliinimäärityksel-lä on lisäksi se etu, että mittaus voidaan tehdä myös io-15 nisten ja ionittomien pinta-aktiivisten aineiden, apupro-teiinien, pinta-aktiivisten aineiden seosten samoin kuin pinta-aktiivisten aineiden ja apuproteiinien seosten läsnä ollessa. Pinta-aktiivisina aineina voidaan käyttää esimerkiksi natriumdodekyylisulfaattia (SDS), TritonR X100:a tai 20 NonidetR P40:ä ja apuproteiineina naudan seerumialbumiinia (BSA), kanan proteiinia, ovalbumiinia tai E. coli -proteiineja. Ionisia pinta-aktiivisia aineita voidaan edullisesti käyttää pitoisuusalueella 0 - 0,3 %, ionittomia pin-: ta-aktiivisia aineita edullisesti pitoisuusalueella 0 - 25 2 % ja apuproteiineja edullisesti pitoisuusalueella 0 - 4 · . 3 % [prosenttiluvut massa/tilavuus-prosentteja (m/V) ] .

• · · Näiden aineiden läsnä ollessa tehtävästä mittauksesta on *111^ se etu, että voidaan mitata myös esimerkiksi geenitekni- • 9 sesti valmistettuja vaikealiukoisia yhdisteitä häiritse- • · · *·* * 30 mättä olennaisesti määritystä, mikä ei tähän asti ole ol lut mahdollista käytettäessä tekniikan tasoa vastaavia • · •.V immunometrisiä mittauksia. Monilajimääritystä eivät häi- • · · ·/· : ritse olennaisesti apuproteiinit tai vierasproteiinit, .···. kuten kalsitoniini tai nonapeptidi busereliini, eivätkä 35 tavanomaiset puskurijärjestelmät. Niinpä esimerkiksi mik- • · ♦ < · · • · 102614 12 ro-organisraeissa niukkaliukoisina "sulkeumakappaleina" muodostuvien geeniteknisesti valmistettujen tuotteiden radioimmunologiseen määrittämiseen (RIA-määritykseen) on osoittautunut sangen hyvin sopivaksi puskurijärjestelmä, 5 joka tavanomaisten puskurlaineiden, kuten fosfaattipuskurin (Na2HP04, NaH2P04) , tris-puskurin [tris(hydroksime-tyyli)aminometaani] tai barbituraattipuskurin (esimerkiksi natriumdietyylibarbituraatti) , ohella sisältää ainakin yhtä proteiinia, kuten naudan seerumialbumiinia (BSA) , 10 maitoproteiinia tai ovalbumiinia ja vähintään yhtä ionista pinta-aktiivista ainetta, kuten natriumdodekyylisulfaattia (SDS), heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidia tai Gallen-suolaa ja/tai vähintään yhtä ionitonta pinta-aktiivista ainetta, kuten NonidetR P40:ä, TritonR X100:a tai TweenR 15 2 0:ä.

Koska keksinnön mukaisia insuliinin vasta-aineita voidaan käyttää huomattavan erilaisten antigeenisten insuliinien tutkimiseen, soveltuvat ne myös yhdessä tähän asti tunnettujen hyvin spesifisten insuliinin vasta-aineiden 20 kanssa tertiaarirakenteen ja insuliinimolekyylin olennais ten ja vähemmän olennaisten rakenneosien sijainnin tutkimiseen.

Esimerkki 1

Insuliinin A-ketjun oktapeptidin (14-21) kytkeminen • ·'; 25 BSA:hän • · . .·. Syntetisoidaan suojattu insuliinin A-ketjun okta- .·. peptidi (14-21) W. Königin ja K. Kernebeckin menetelmällä [1!*^ (Liebigs Ann. Chem. 1979, 227 - 247) . Kantajamolekyylinä • · ".* toimivaan BSA:hän kytkemiseksi poistetaan suojatusta insu- « i i *·* 30 liinin A-ketjun oktapeptidistä (14-21) Ddz-Tyr(tBu)-Gln-

Leu-Glu(OtBu)-Asn-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-AsnOtBu kaikki suo- • » ·,·,· jausryhmät käsittelemällä trifluorietikkahapon ja etaani- • t » V : tiolin seoksella (W. König ja K. Kernebeck, Liebigs Ann.

,··. Chem. 1979, 227 - 247) . Saatu tuote kytketään sitten bi- > · 35 funktionaalisen kytkentäreagenssin, l-hydroksi-2-nitro- 102614 13 bentseeni-4-sulfonihappo-N-maleimido-6-kaproyyliesterin natriumsuolan (mal-sac-HNSA), avulla BSA:han. Tämän tekemiseksi lisätään 55 mg mal-sac-HNSA:ta liuokseen, joka sisältää 111 mg BSA:ta (vastaa 95:ä ekvivalenttia lysii-5 niä) 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4 (10 ml). Kun reak-tioseosta on sekoitettu 60 min huoneenlämpötilassa, se käsitellään kromatografisesti Sephadex G 25:llä käyttämällä eluenttina 0,1 M fosfaattipuskuria, pH 6,2, ja otetaan talteen ensimmäisenä eluoituva piikki. Tähän liuokseen 10 lisätään 67 mg (65 μπιοί) insuliinin A-ketjun oktapeptidiä (14-21). Sen jälkeen seoksen annetaan seistä yön yli huoneenlämpötilassa. Sitten reaktioseos dialysoidaan vettä vastaan ja kylmäkuivataan tuloksena oleva liuos.

Saanto: 122 mg 15 Proteiinipitoisuus: 83 % 15 molekyyliä oktapeptidiä yhtä molekyyliä kohden BSA:ta (määritetty aminohappoanalyysillä)

Esimerkki 2 Immunisointi 20 Immunisointiin käytetään kolmea eläinlajia, sekaro tuisia kotikaniineja (yksilöiden lukumäärä 3) ja yhtä lammasta ja yhtä vuohta. Kaikkien eläinten immunisointi aloitettiin samanaikaisesti, jolloin kullekin kaniinille an-: : : nettiin alkuannoksena lihaksensisäisesti 0,1 mg esimerkin 25 1 mukaista oktapeptidi-BSA-konjugaattia KFA:ssa (täydelli- • · . nen Freundin apuaine, Difco) ja lampaalle ja vuohelle kum- « · · mallekin 2,5 mg oktapeptidi-BSA-konjugaattia KFA:ssa. Koi-mannella viikolla ensimmäisestä annosta lukien annettiin • · • · tehosteeksi sama määrä oktapeptidi-BSA-konjugaattia ♦ Φ · 30 IFA:ssa (epätäydellinen Freundin apuaine, Behring) ja toistettiin tämä toimenpide 4., 8., 13., 18. ja 25. vii- « · \V kolia. 27., 32. ja 37. viikolla annettiin tehosteeksi sama • 1 f V : määrä pelkkää, BSA:han sitomatonta oktapeptidiä IFA:ssa.

Antiseerumia otettiin kussakin tapauksessa ensimmäisen • 1 35 kerran 10. viikolla ja sitten aina 10 päivän kuluttua te- • 4 tl « < « 102614 14 hosteannoksen annosta. Tiitterit määritettiin kirjallisuudessa kuvatulla tavalla (T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam 1987, s. 101 - 102) . Tällöin valmis-5 tettiin otetusta seeruminäytteestä laimennussarja (1:10 -1:106) MSTB-puskuriin (puskurin koostumus, katso esimerkki 3) ja määritettiin kulloinkin sitoutuneen merkkiaineen määrä määritysolosuhteissa (katso esimerkki 3) . Tiitteri on arvo, jolla kyseisessä suhteessa laimennetun seerumin 10 vasta-aineet sitovat 50 % käytetystä merkkiaineesta. Tit-teri ilmoitetaan käänteislukuna. Edellä kuvattujen immunisoitujen eläinten seerumien titterit olivat alueella 1:500 - 1:10 000.

Esimerkki 3 15 Radioimmuunimääritysjärjestelmän valmistus ja mää rityksen toteuttaminen Käytetyt materiaalit:

Antiseerumi: Radioimmuunimääritysjärjestelmän valmistamiseen käytettiin lampaan antiseerumia (S239), jonka 20 titteri oli 1:500. Antiseerumi käytettiin suoraan ilman lisäpuhdistusta. Seerumi laimennettiin suhteessa 1:20 (MSTB-puskurilla) ja säilytettiin lämpötilassa -20 °C.

: ft: Käyttöliuoksen laimennussuhde oli 1:500 (MSTB-puskuri) .

MSTB-puskuri: Käytetyn MSTB-puskurin koostumus oli ; 25 seuraava: « i «

0,1 mol/l morfoliinipropaanisulfonihappoa (MOPS), jonka pH

• · · · .···. oli säädetty arvoon 7,5 IM NaOH:lla • « '.V. 2,5 % (m/V) naudan seerumialbumiinia • · · • · · * 0,2 % (m/V) natriumdodekyylisulfaattia 30 0,2 % (m/V) TritonR X-100:a • · i *·’.* 0,05 % (m/V) natriumatsidia • · · ’.· · Immunoglobuliiniliuos: Määrityksen tekemiseen käy- tettiin liuosta, joka sisälsi 10 mg/ml immunoglobuliinia ,,, kahdesti tislatussa vedessä.

• 3 5 Merkkiaine: Merkkiaineena käytettiin 125I-leimattua sian insuliinia (Behringwerke AG, Marburg, tuotenumero 102614 15 OCSM) (10 ng < 74 kBq, kylmäkuivattu tuote) . Kokonaisak-tiivisuus koeputkea kohden oli 20 000 - 30 000 pulssia.

Standardit: Standardeista tutkittiin ensin niiden proteiinipitoisuus. Sen jälkeen määritettiin pitoisuus 5 aineessa (eri lajien insuliinit, 16 insuliinijohdannaista, insuliiniesiastetta jne.), jolle on määrä tehdä RIA-määri-tys. Sitten standardien pitoisuudet säädettiin arvoon 2000 ng/ml MSTB-puskurissa. Standardikäyrien määrittämistä varten valmistettiin kussakin tapauksessa geometrinen lai-10 mennussarja, jossa pitoisuudet (ng/ml MSTB-puskurissa) olivat seuraavat: 3,71; 7,5; 15; 30; 60; 120; 240; 480; 960 ja 1920.

Standardikäyrien määritys (määritysolosuhteet): Standardikäyrien määrittämiseksi pipetoitiin kuhunkin koe-15 putkeen (valmistaja Sarstedt, tilausnumero 55-535) 100 μΐ standardia, 100 μΐ merkkiainetta ja 100 μΐ antiseerumia. Näytteet sekoitettiin hyvin ja niiden annettiin seistä yön yli (18 tuntia) huoneenlämpötilassa (18 - 25 °C) . Lisättiin 50 μΐ immunoglobuliiniliuosta, sekoitettiin hyvin ja 20 saostettiin polyetyleeniglykolilla (1000 μΐ, moolimassa noin 4000). Sentrifugoitiin 20 min:n kuluttua kiihtyvyydellä 1500 x g ja dekantoitiin supernatantti. Sakalle teh-!,·/ tiin sitten 1 min kestävä mittaus gammalaskurissa (Gamma- :1·': Counter 1277, Pharmacia LKB). Kukin arvo mitattiin kahtena 25 rinnakkaismäärityksenä.

Tausta-arvon määritys ·«·« .···, Tausta-arvon määrittämiseksi meneteltiin edellä • · ("Standardikäyrien määritys") kuvatulla tavalla. Standar- • I · • din sijasta käytettiin kuitenkin 100 μΐ MSTB-puskuria.

30 Esimerkki 4 • a • · · ’·1·' Erilaisten insuliinien ja niistä johdettujen pro- • · · • · · *.1 ’ teiinien määrittäminen RIA:lla Käyttämällä standardeja, joiden insuliinipitoisuu-det ja insuliiniperäisten proteiinien pitoisuudet oli en-; 35 naita määritetty (katso esimerkki 3, standardit), määri- 102614 16 tettiin standardikäyrät seuraaville insuliineille: ihmisen insuliini (kuvio 1), sian insuliini (kuvio 2), naudan insuliini (kuvio 3), lampaan insuliini (kuvio 4), kanan insuliini (kuvio 5) ja hevosen insuliini (kuvio 6) ja joh-5 dannaisille de-Phe-Bl-(sian insuliini) (kuvio 7), di-Arg- B31-B32-(ihmisen insuliini) (kuvio 8), mono-Arg-B31-(ihmisen insuliini) (kuvio 9), pro(sian insuliini) (kuvio 10) sekä insuliinin A ketjun tetrasulfonaatti (kuvio 11), ok-tapeptidi (14-21) (kuvio 12) ja heksapeptidi (16-21) (ku-10 vio 13).

Kuvioissa annetut luvut B/B0 ovat mitatun aktiivisuuden ja maksimiaktiivisuuden B0 (vasta-aineen täydellinen kyllästyminen merkkiaineella) suhteita. Kuvioissa 1 -13 esitetyt standardikäyrät osoittavat selvästi, että kek-15 sinnön mukainen RIA, jossa käytetään keksinnön mukaisia vasta-aineita, tarjoaa herkän menetelmän lukuisten insuliinien määrittämiseksi.

Tutkittiin vieraiden proteiinien ja puskurijärjestelmän vaikutusta mittauksiin ja todettiin, etteivät suu-20 ret pitoisuudet BSA:ta ja E. coli -proteiineja häiritse määritystä. Jotta voitaisiin osoittaa ristireaktiivisuuden puuttuminen pienten peptidirakenteiden kanssa, lisättiin ·,!,· tutkittavaan seokseen negatiivisiksi vertailunäytteiksi kalsitoniinia ja busereliinia samaksi pitoisuudeksi kuin : 25 oktapeptidiä. Minkäänlaista ristireaktiivisuutta ei ilmen- « « « • j. nyt (katso kuviot 14 ja 15) .

• « · · • · · • · • · ··· • « · • · · • · » 1 • I < < • · · • · « • · «M • · · ♦ · ·

Claims (16)

102614

1. Vasta-aineet, tunnetut siitä, että niitä saadaan immunisoimalla sopiva eläinlaji peptidifragmen- 5 tiliä, joka sisältää luontaisen proteiinin hyvin säilyneen aminohapposekvenssin, joka on insuliinin A-ketjun ryhmä Ai A7, An - A17, A21 - A21, A14 - A21 tai A16 - A21.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset vasta-aineet, tunnetut siitä, että peptidifragmentti on insulii- 10 nin A-ketjun oktapeptidi (14-21).

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne ovat ristireaktiivisia proteiinien kanssa, jotka sisältävät insuliinin A-ketjun oktapeptidin (14-21).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset vasta-aineet, tunnetut siitä, että ne ovat ristireaktiivisia proteiinien kanssa, jotka sisältävät insuliinin A-ketjun heksapeptidin (16-21).

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaiset vasta-20 aineet, tunnetut siitä, että vasta-aineet ovat polyklonaalisia.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten vasta-aineiden käyttö insuliinin tai insuliini johdannaisten osoitta- '· ·’ miseen.

7. Menetelmä insuliinin tai insuliini johdannaisten .,)·* osoittamiseen tarkoitettujen vasta-aineiden valmistamisek- si, tunnettu siitä, että sopiva eläinlaji immuni- :*·*: soidaan peptidifragmentilla, joka on insuliinin A-ketjun • ryhmä Ax - A7, An - A17, An - A21, A14 - A21 tai A16 - A21, ja 30 eristetään sitten vasta-aineet eläimen seerumista. • · ·

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, • · tunnettu siitä, että immunisointiin käytetty pep- « | « tidifragmentti kytketään kantajaan.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten vasta-aineiden 35 käyttö immunoanalyysisysteemin valmistuksessa. 102614

10. Immunotestiväline, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista yhtä tai useampaa vasta-ainetta.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen im-5 munotestiväline, tunnettu siitä, että se sisältää leimattua antigeeniä, joka muodostaa immuunikompleksin mainittujen yhden tai useamman vasta-aineen kanssa.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen im-munotestiväline, tunnettu siitä, että vähintään 10 yksi vasta-aine on leimattu.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen im-munotestiväline, tunnettu siitä, että leimaus tehdään radioaktiivisella, kemiluminesoivalla tai entsy-maattisella merkkiaineella.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 10 - 12 mukainen im- munotestiväline, tunnettu siitä, että vasta-aine immobilisoidaan kiinteälle faasille.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 10 - 14 mukainen im-munotestiväline, tunnettu siitä, että se sisältää 20 yhtä tai useampaa pinta-aktiivista ainetta ja/tai yhtä tai useampaa apuproteiinia ja/tai yhtä tai useampaa pinta-ak-. tiivisten aineiden ja apuproteiinien seosta.

’ 16. Jonkin patenttivaatimuksen 10 - 15 mukainen im- ' ·* munotestiväline, tunnettu siitä, että se sisältää 25 lisäksi hyvin spesifistä vasta-ainetta insuliinille. • · · • · · • · • · ·«· ··· • · · • · · • m « · · • · · • · • · · • · · • · · « « « « i • · • « · 4 102614