WO2022264539A1 - 情報処理システム、情報処理方法及び蛍光体構造体 - Google Patents

情報処理システム、情報処理方法及び蛍光体構造体 Download PDF

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WO2022264539A1
WO2022264539A1 PCT/JP2022/008547 JP2022008547W WO2022264539A1 WO 2022264539 A1 WO2022264539 A1 WO 2022264539A1 JP 2022008547 W JP2022008547 W JP 2022008547W WO 2022264539 A1 WO2022264539 A1 WO 2022264539A1
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WO
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luminance data
dye
information processing
acquisition unit
excitation light
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PCT/JP2022/008547
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English (en)
French (fr)
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寛和 辰田
歩 田口
Original Assignee
ソニーグループ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present disclosure relates to an information processing system, an information processing method, and a phosphor structure.
  • fluorescence immunostaining is used for the observation and evaluation of biological samples.
  • fluorescent immunostaining for example, fluorescence emitted by irradiating a biological sample stained with a fluorescent staining reagent with excitation light is observed, and based on the observed fluorescence intensity, the presence or absence of the expression of various markers can be determined. The number of expressed cells is counted, and the like.
  • the meaningful value in the observation and evaluation of biological samples is not the fluorescence intensity, but the amount of antibodies (number of antibodies) that reacted with antigens on the cell tissue or cell surface.
  • the present disclosure provides an information processing system, an information processing method, and a phosphor structure capable of improving the measurement accuracy of the number of antibodies.
  • An information processing system acquires first luminance data of fluorescence emitted from the first dye by irradiating a first dye having a known concentration with first excitation light.
  • a coefficient acquisition unit that acquires a conversion coefficient for converting the luminance data into the number of the first dye based on the first luminance data; and a second dye that is the same dye as the first dye.
  • a second luminance data acquisition unit that acquires second luminance data of fluorescence emitted from the stained sample by irradiating the second excitation light having the same wavelength as the first excitation light to the sample, and the first luminance data.
  • a coefficient correcting unit that corrects the conversion coefficient based on an instrumental difference between the obtaining unit and the second luminance data obtaining unit; and the number of the second dyes is calculated from the second luminance data based on the corrected conversion coefficient. and an antibody count calculation unit for calculation.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration example of an information processing system according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 1 is a block diagram showing a configuration example of a fluorescence microscope apparatus according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 4 is a flow chart showing an example of schematic operation of a fluorescence microscope apparatus according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a detectable range through an objective lens of a fluorescence microscope according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration example of a confocal optical system that can be mounted on a fluorescence microscope device according to a first example of an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a configuration example of a confocal optical system that can be mounted on a fluorescence microscope device according to a second example of an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of error factors in the confocal optical system illustrated in FIG. 5 or FIG. 6
  • FIG. 2 illustrates an example standard phosphor according to an embodiment of the present disclosure
  • 9 is an enlarged view of area A in FIG. 8.
  • FIG. 10 is a diagram showing a difference in acquired luminance with and without a cover glass of a standard phosphor according to an embodiment of the present disclosure
  • 4 is a graph showing fluorescence intensity obtained while moving an objective lens in the Z direction with respect to a fluorescent layer of a standard phosphor according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 4 is a diagram showing fluorescence intensity distribution for excitation line illumination when the thickness t of the fluorescent layer of the standard phosphor is 4 ⁇ m according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 5 is a diagram showing fluorescence intensity distribution for excitation line illumination when the thickness t of the fluorescent layer of the standard phosphor is 20 ⁇ m according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 5 is a diagram showing fluorescence intensity distribution for excitation line illumination when the thickness t of the fluorescent layer of the standard phosphor is 80 ⁇ m according to an embodiment of the present disclosure
  • 15A and 15B are graphs showing light intensity profiles of cross sections taken along lines A-A' of FIGS. 12 to 14;
  • 4 is a flow chart illustrating example operations performed at a vendor in accordance with an embodiment of the present disclosure; 4 is a flow chart illustrating an example of operations performed on the user side according to an embodiment of the present disclosure; [0014] FIG.
  • FIG. 4 illustrates an example of a spectral radiance spectrum obtained in a user-side sample measurement according to an embodiment of the present disclosure
  • 1 is a schematic diagram showing a first system configuration example of an information processing system according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a second system configuration example of an information processing system according to an embodiment of the present disclosure
  • FIG. 1 is a hardware configuration diagram showing an example of a computer that implements functions of an information processing apparatus according to the present disclosure
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration example of an information processing system according to this embodiment.
  • an information processing system 1 includes a fluorescence microscope device M1 on the vendor V1 side, fluorescence microscope devices C1, C2, . be.
  • the fluorescence microscope device on the vendor V1 side is called a master device, and the fluorescence microscope devices on the users U1, U2, . . . side are called copy devices.
  • Vendor V1 sends copy machines C1, C2, . is 'C') and/or provides a service to maintain and manage the copy machine C.
  • the master device M1 on the vendor V1 side includes a standard phosphor 11, a dye chamber 12, and a computing section 10, details of which will be described later.
  • a user U is a person who actually uses the copying machine C to perform fluorescence observation of a biological sample obtained from a subject.
  • the copy device C on the user U side which will be described later in detail, includes a standard phosphor 21 and a computing unit 20 and acquires quantitative value data 23 of a specimen 22 .
  • server 200 communicates with master device M1 and copy device C via, for example, the Internet, a mobile communication system (including 4G (4th Generation Mobile Communication System), 4G-LTE (Long Term Evolution), 5G, etc.), a dedicated line, or the like. It stores various information acquired from the connected master device M1 and transmits it to the copy device C as necessary.
  • the transmission of information from the server 200 to the copier C may be of the pull type or of the push type.
  • FIG. 1 exemplifies a case in which the master device M1 and the copy device C respectively include the calculation units 10/20, but the present invention is not limited to this. It may be implemented in another information processing device.
  • FIG. 2 is a block diagram showing a configuration example of a fluorescence microscope apparatus according to this embodiment.
  • inputs to the fluorescence microscope apparatus 100 include a fluorescent staining reagent 42, a specimen 50, and a fluorescently stained specimen 60.
  • the fluorescent staining reagent 42 is a chemical used for staining the specimen 50 .
  • the fluorescent staining reagent 42 is, for example, a fluorescent antibody, a fluorescent probe, or a nuclear staining reagent, but the type of the fluorescent staining reagent 42 is not particularly limited to these.
  • the fluorescent staining reagent 42 is managed with identification information (hereinafter referred to as “reagent identification information 41”) that can identify the fluorescent staining reagent 42 (and the manufacturing lot of the fluorescent staining reagent 42).
  • the reagent identification information 41 is, for example, barcode information (one-dimensional barcode information, two-dimensional barcode information, etc.), but is not limited to this.
  • the fluorescent staining reagent 42 has different properties for each production lot, even if the product is the same (same type) product, depending on the production method, the cells from which the antibody was obtained, and the like.
  • the fluorescent staining reagent 42 has different fading coefficients and fluorescent labeling rates (also called "F/P value: Fluorescein/Protein", which indicates the number of fluorescent molecules that label an antibody). Therefore, in the information processing system 1 according to the present embodiment, the fluorescent staining reagent 42 is assigned reagent identification information 41 to be managed for each production lot (in other words, the reagent information of each fluorescent staining reagent 42 is managed by lot).
  • the fluorescence microscope apparatus 100 can perform various processes in consideration of slight differences in properties that appear in each manufacturing lot. It should be noted that the management of the fluorescent staining reagent 42 in production lot units is merely an example, and the fluorescent staining reagent 42 may be managed in units smaller than the production lot.
  • the specimen 50 is a specimen slide or the like prepared for the purpose of pathological diagnosis from a specimen or tissue sample taken from a human body.
  • the type of tissue used such as an organ
  • the type of target disease such as an organ
  • the type of target disease such as age, sex, blood type, or race
  • the subject's lifestyle For example, eating habits, exercise habits, smoking habits, etc.
  • each specimen 50 can be identified. It may be managed with identification information attached.
  • the fluorescently stained specimen 60 is prepared by staining the specimen 50 with the fluorescently stained reagent 42 .
  • the fluorescence-stained specimen 60 is assumed to be stained with at least one fluorescent staining reagent 42, and the number of fluorescent staining reagents 42 used for staining is not particularly limited.
  • the staining method is determined by the combination of the specimen 50 and the fluorescent staining reagent 42, and is not particularly limited.
  • the fluorescence-stained specimen 60 is input to the fluorescence microscope device 100 and imaged.
  • the fluorescence microscope apparatus 100 includes an acquisition unit 110, a storage unit 120, a calculation unit 130, a display unit 140, a control unit 150, and an operation unit 160, as shown in FIG.
  • the acquisition unit 110 is configured to acquire information used for various processes of the fluorescence microscope apparatus 100 . As shown in FIG. 2 , the acquisition section 110 includes an information acquisition section 111 and an image acquisition section 112 . This acquisition unit 110 can be an example of the first/second luminance data acquisition unit in the claims, for example.
  • the information acquisition unit 111 is configured to acquire various types of information such as reagent information. More specifically, the information acquisition unit 111 acquires the reagent identification information 41 attached to the fluorescent staining reagent 42 used to generate the fluorescently stained specimen 60 . For example, the information acquisition unit 111 acquires the reagent identification information 41 using a barcode reader or the like. Then, the information acquisition unit 111 acquires reagent information from the server 200 based on the reagent identification information 41 . The information acquisition unit 111 also acquires the excitation power density actually measured separately (the entity that actually measures the excitation power density is not particularly limited). Information acquired by the information acquiring unit 111 is not limited to these. The information acquisition unit 111 stores the acquired information in the information storage unit 121, which will be described later.
  • the image acquisition unit 112 is configured to acquire captured image information of the fluorescently stained specimen 60 (the specimen 50 stained with the fluorescent staining reagent 42). More specifically, the image acquisition unit 112 includes an arbitrary imaging device (for example, a CCD (Charged Coupled Device), a CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor), etc.), and performs fluorescence staining using the imaging device. Captured image information is acquired by capturing an image of the specimen 60 . “Captured image information” is a concept that includes the captured image itself of the fluorescence-stained specimen 60 as well as measured values that are not visualized as images (for example, measured values of luminance). The image acquisition unit 112 stores captured image information in an image information storage unit 122, which will be described later.
  • an image information storage unit 122 which will be described later.
  • the storage unit 120 is configured to store (store) information used for various processes of the fluorescence microscope apparatus 100 or information output by various processes. As shown in FIG. 2 , the storage section 120 includes an information storage section 121 and an image information storage section 122 .
  • the information storage unit 121 stores various types of information such as the reagent information acquired by the information acquisition unit 111 (as described above, the fading coefficient, absorption cross section (or molar extinction coefficient), quantum yield, fluorescence labeling rate, etc.). It is a configuration that Note that fading correction processing by the correction unit 131, which will be described later, calculation processing of the number of fluorescent molecules (or the number of antibodies bound to the fluorescent molecules, that is, the quantitative value data 23 in FIG. 1) by the calculation unit 132, and the image generation unit 133 , the information storage unit 121 may increase the free space by deleting the information used in the process.
  • the image information storage unit 122 is configured to store (store) captured image information of the fluorescence-stained specimen 60 acquired by the image acquisition unit 112 .
  • the correction unit 131 performs fading correction processing
  • the calculation unit 132 performs calculation processing of the number of fluorescent molecules (or the number of antibodies bound to the fluorescent molecules)
  • the image generation unit 133 performs image generation processing.
  • the image information storage unit 122 may increase the free space by deleting the captured image information used for the processing.
  • the calculation unit 130 uses information such as captured image information, reagent information (as described above, fading coefficient, absorption cross section (or molar extinction coefficient), quantum yield, fluorescence labeling rate, etc.), excitation power density, etc. It is a functional configuration for performing various processes. As shown in FIG. 2 , the calculator 130 includes a corrector 131 , a calculator 132 and an image generator 133 .
  • This computing unit 130 corresponds to the computing unit 10 in the master device M1 and the computing unit 20 in the copy device C.
  • the calculation unit 130 can be an example of the coefficient acquisition unit in the claims.
  • the calculation unit 130 can be an example of the coefficient correction unit/brightness data correction unit and the antibody number calculation unit in the scope of claims.
  • the correction unit 131 is configured to perform color fading correction processing on captured image information. More specifically, the correction unit 131 corrects the luminance in the captured image information to the luminance before fading using the fading coefficient, absorption cross section, excitation power density, and the like. The fading correction processing performed by the correction unit 131 will be described in detail later.
  • the calculation unit 132 is configured to calculate information (for example, the number of fluorescent molecules or the number of antibodies) corresponding to the fluorescent molecules in the captured image information using the luminance of the captured image information corrected by the correcting unit 131 . More specifically, the calculator 132 converts the corrected brightness of each pixel into the number of fluorescent molecules or the number of antibodies using the absorption cross section, quantum yield, fluorescence labeling rate, excitation power density, and the like. Calculation processing of the number of fluorescent molecules and the number of antibodies performed by the calculation unit 132 will be described in detail later.
  • the calculation unit 132 may implement calculation processing of a fading coefficient, a quantum yield, and the like.
  • the image generator 133 is configured to generate image information based on the information corresponding to the fluorescent molecules calculated by the calculator 132 (for example, the number of fluorescent molecules or the number of antibodies). “Image information” is a concept that includes the image itself and numerical values not visualized as images (for example, the number of fluorescent molecules or the number of antibodies, etc.), similar to the captured image information described above. The image information generation processing performed by the image generation unit 133 will be described in detail later.
  • the display unit 140 presents the image information generated by the image generation unit 133 (image information generated based on the information corresponding to the fluorescent molecules) to the user.
  • the type of display used as display unit 140 is not particularly limited. Further, although not described in detail in this embodiment, the image information generated by the image generation unit 133 may be presented to the user by being projected by a projector or printed by a printer (in other words, image information is not particularly limited).
  • control unit 150 The control unit 150 is configured to centrally control the overall processing performed by the fluorescence microscope apparatus 100 .
  • the control unit 150 performs various processes such as those described above (for example, the imaging process of the fluorescently stained specimen 60, the fading correction process, the number of fluorescent molecules ( or the number of antibodies bound to fluorescent molecules), the generation of image information, and the display of image information).
  • the control contents of the control unit 150 are not limited to these processes.
  • the control unit 150 may control processing (for example, processing related to an OS (Operating System)) generally performed in general-purpose computers, PCs, tablet PCs, and the like.
  • OS Operating System
  • the operation unit 160 is configured to receive an operation input from the user. More specifically, the operation unit 160 includes various input means such as a keyboard, mouse, buttons, touch panel, or microphone. input can be performed. Information regarding the operation input performed via the operation unit 160 is provided to the control unit 150 .
  • the server 200 is a device that manages information such as the fading coefficient, absorption cross section (or molar extinction coefficient), quantum yield, and fluorescence labeling rate of the fluorescent staining reagent 42 . More specifically, the server 200 associates and manages the reagent identification information 41 and information such as the fading coefficient, absorption cross section (or molar extinction coefficient), quantum yield, and fluorescence labeling rate. Accordingly, the information acquisition unit 111 can acquire these pieces of information from the server 200 based on the reagent identification information 41 of the fluorescent staining reagent 42 . Note that the server 200 may manage various types of information about the specimen 50 using identification information that can identify the specimen 50 . The server 200 may also manage other information including measured excitation power density.
  • the configuration example of the information processing system according to the present embodiment has been described above. Note that the above configuration described with reference to FIG. 2 is merely an example, and the configuration of the information processing system according to this embodiment is not limited to this example.
  • the fluorescence microscope device 100 does not necessarily have to include all of the configurations shown in FIG.
  • the configuration of the fluorescence microscope apparatus 100 can be flexibly modified according to specifications and operations.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a schematic operation example of the fluorescence microscope apparatus according to this embodiment.
  • step S1000 the user determines the fluorescent staining reagent 42 and specimen 50 to be used for analysis.
  • step S ⁇ b>1004 the user prepares a fluorescently stained specimen 60 by staining the specimen 50 using the fluorescent staining reagent 42 .
  • step S1008 the image acquisition unit 112 of the fluorescence microscope device 100 acquires captured image information by capturing an image of the fluorescence-stained specimen 60.
  • the information acquisition unit 111 obtains the fading coefficient, absorption cross section, quantum yield, fluorescence labeling rate, etc. based on the reagent identification information 41 attached to the fluorescent staining reagent 42 used to generate the fluorescent staining specimen 60. of reagent information from the server 200 .
  • the information acquisition unit 111 acquires the excitation power density measured separately.
  • step S1016 the correction unit 131 corrects the luminance of each pixel in the captured image information using the fading coefficient, absorption cross section, excitation power density, etc. (fading correction processing is performed).
  • step S1020 the calculation unit 132 converts the luminance of each pixel after correction into the number of photons.
  • step S1024 the calculation unit 132 converts the number of photons into the number of fluorescent molecules or the number of antibodies bound to fluorescent molecules (hereinafter collectively referred to simply as the number of antibodies).
  • step S1028 the image generation unit 133 generates image information reflecting the number of fluorescent molecules or the number of antibodies bound to the fluorescent molecules.
  • step S1032 the display unit 140 displays the image information on the display, and the series of processing ends.
  • the image acquisition unit 112 also captures an image of the sample into which only the mounting medium is injected, using the imaging device, in addition to the fluorescently stained specimen 60 . Then, the calculation unit 132 cancels the background noise of the measurement system by subtracting the measurement result of the sample into which only the mounting medium was injected from the measurement result of the fluorescence-stained specimen 60 subjected to the fading correction process in step S1016. be able to.
  • the calculation unit 132 can calculate the brightness of each pixel in the captured image information on which the fading correction process has been performed. Assuming that a certain pixel is pixel A, the calculation unit 132 calculates the number of electrons in pixel A using the following equation (1). Here, it is assumed that the gradation in the captured image information is 16 [bit] (that is, the luminance takes values from 0 to 65536). In equation (1), the brightness of pixel A in the captured image information of the fluorescently stained specimen 60 after the fading correction process is indicated as "brightness 1", and the captured image information of the sample in which only the mounting medium is injected is The luminance of pixel A is indicated as "luminance 2".
  • the calculation unit 132 can calculate the number of photons in the pixel A by dividing the number of electrons in the pixel A by the quantum yield of the image sensor, as shown in the following equation (2).
  • the luminance in the captured image information is a value related to fluorescence detected through the objective lens of the fluorescence microscope, and the fluorescence emitted by the fluorescent substance is emitted in all directions.
  • the fluorescence detectable range 30 through the objective lens is a conical portion of a sphere centered at the fluorescence emission point 32, and the half apex angle of the cone is ⁇ .
  • the ratio of the fluorescence detectable range 30 through the objective lens to all directions from the fluorescence emission point 32 is expressed by the numerical aperture NA of the objective lens as shown in Equation (3) below.
  • the omnidirectional conversion of the number of photons detected by pixel A is represented by the following equation (4).
  • the calculation unit 132 converts the fluorescence intensity of each pixel into the number of photons by performing the above processing on all pixels including the pixel A.
  • the number of fluorescent molecules in a certain pixel A is represented by the following equations (5) and (6).
  • the calculation unit 132 calculates the number of emitted photons per molecule by inputting Abs_photon calculated by the following formula (7) and the quantum yield of the fluorescent material obtained from the server 200 into the formula (6). . After that, the calculation unit 132 inputs the number of photons (converted in all directions) detected by the pixel A calculated by the above formula (4) and the number of emitted photons per molecule into the formula (5), thereby calculating the pixel Calculate the number of fluorescent molecules detected in A.
  • the calculation unit 132 can convert the number of photons for each pixel into the number of fluorescent molecules by performing the above processing on all pixels including the pixel A.
  • the calculation unit 132 converts the number of fluorescent molecules detected in the pixel A into the number of antibodies by performing the calculation of the following formula (8) using the fluorescence labeling rate of the fluorescent substance acquired from the server 200. can do. Then, the calculation unit 132 can calculate the number of antibodies for each pixel by performing the calculation of Expression (8) on all pixels including the pixel A.
  • steps S1020 and S1024 in FIG. 3 that is, the process of converting the brightness into the number of photons and then into the number of antibodies
  • the brightness can be simplified to the process of directly converting (however, correction to absorb instrumental differences is necessary) to the number of antibodies.
  • the imaging conditions are not changed in steps S641 and S651 of , the number of antibodies can be obtained directly from the luminance by using the conversion coefficient corrected using the standard phosphors 11 and 21 so as to absorb the instrumental difference. is possible.
  • the fluorescence intensity measurement performed by the copying machine C on the side of each user U depends on factors such as the power of the excitation light and the coupling efficiency of the detector. It can be difficult to quantify fluorescence intensity and obtain an accurate antibody count due to various instrumental differences. Therefore, a method for reducing errors due to such machine difference factors will be described below.
  • the machine difference between the master device M1 and the copy device C in this description mainly refers to individual factors such as the power of the excitation light and the coupling efficiency of the detector in the acquisition unit 110 of the fluorescence microscope apparatus 100 illustrated in FIG. It may be a difference that can be caused by a difference.
  • the copy device C on the user U side in FIG. 1 Before explaining the error reduction method due to machine difference factors, first, the copy device C on the user U side in FIG. 1 will be explained.
  • the copier C uses a sequence for measuring the mounted standard phosphor 21 and a standard phosphor attached to the dye spectrum data. 11 fluorescence values are read out, compared and corrected, and color separation calculation is performed in the calculation unit 20 .
  • This copying device C is mainly used for the purpose of measuring a specimen 50 stained with a fluorescent staining reagent 42 (hereinafter simply referred to as a dye).
  • a captured image obtained by measurement is converted into image data in which pixel values are absolute luminance values.
  • the absolute value luminance is a value obtained by converting the fluorescent signal detected by the copy machine C into an absolute value.
  • the number of antibodies cannot be obtained directly from image data of absolute luminance. This is because a conversion coefficient (corresponding to, for example, a spillover matrix or standard spectrum, which will be described later) is required for converting the detected fluorescence intensity to the number of antibodies.
  • the conversion factor is obtained, for example, by encapsulating a solution sample with a known antibody concentration and a known average number of dye molecules conjugated to the antibody in a glass chamber with a known thickness and measuring the fluorescence. can be obtained with However, this work needs to be performed for each dye, and density management, imaging condition management, etc. are complicated.
  • the vendor V1 side creates conversion coefficients using the master device M1.
  • the conversion coefficient for each dye created by the master device M1 is provided to each copy device C via the server 200.
  • FIG. if the conversion coefficients created by the master device M1 are simply provided to the copy device C, the conversion coefficients suitable for the copy device C are provided due to the influence of the machine difference between the copy device C and the master device M1. Therefore, the number of antibodies obtained from the captured image of the fluorescence-stained specimen 60 is not necessarily the correct number of antibodies.
  • this embodiment provides a method of obtaining an appropriate conversion coefficient in each copy device C by intervening the standard phosphors 11 and 21 mounted in the master device M1 and the copy device, respectively.
  • the standard phosphors 11 and 21 are phosphors that emit light with the same detection luminance when excited under the same conditions. Therefore, by using measurement results obtained by exciting the standard phosphors 11 and 21 under the same conditions in the master device M1 and the copy device, respectively, the machine difference between the master device M1 and the copy device C is used as a factor. It is possible to reduce the error and improve the measurement accuracy of the number of antibodies.
  • the vendor V1 side also measures the brightness information of the standard phosphor 11 when acquiring the conversion coefficients to be provided to the copying machine C.
  • the measurement of the standard phosphor 11 is performed for all the excitation illuminations mounted on the master device M1, and the fluorescence brightness detected by each excitation illumination is recorded as an absolute value.
  • the absolute value may be, for example, spectral radiance [w/(sr*m2* ⁇ )] or the number of photons.
  • the master device M1 generates a data set in which the conversion coefficient for each dye and the luminance information of the standard phosphor 11 are linked.
  • the conversion coefficient is a spectrum-like form obtained by multiplying the standard spectrum used for color separation calculation (here, the element vector of the least squares method is called the standard spectrum) by the conversion coefficient.
  • the standard phosphor 21 incorporated in the copy machine C is measured once a day as part of daily quality control (daily QC) when the copy machine C is started up. Measurement of the standard phosphor 21 is performed for all the excitation illuminations mounted on the copy device C in the same manner as the master device M1, and the fluorescence luminance detected by each excitation illumination is measured as an absolute value. It is desirable that the conditions for measuring the standard phosphors 11 and 21, such as the set intensity of the excitation illumination, match between the master device M1 and the copy device C.
  • the standard phosphors 11 and 21 are phosphors that emit light with the same detection brightness when excited under the same conditions. Therefore, under the same conditions, the measurement result of the standard phosphor 21 obtained by the copy device C and the measurement result of the standard phosphor 11 obtained by the master device M1 (specifically, the By comparing the absolute value luminance information) in the calculation unit 130, for example, it becomes possible to specify the degree of influence due to the machine difference between the master device M1 and the copy device C. FIG. Then, by correcting the conversion coefficient in the copying machine C based on the degree, the influence of machine difference can be reduced, so it is possible to improve the measurement accuracy of the number of antibodies. Various correction methods such as simple ratio correction based on the ratio of the measurement results may be used to correct the conversion coefficients.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a configuration example of a confocal optical system that can be mounted on the fluorescence microscope apparatus according to the first example of the present embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing a configuration example of a confocal optical system that can be mounted on a fluorescence microscope apparatus according to a second example of the present embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of error factors in the confocal optical system illustrated in FIG. 5 or FIG.
  • the fluorescence L32 that has passed through the dichroic mirror 314 is imaged on the primary imaging plane through the condenser lens 316 .
  • the fluorescence image of the fluorescence L32 formed on the primary imaging plane is a point or line.
  • a diaphragm 317 consisting of a pinhole or a slit having an aperture shape matching the condensing shape of the laser beam L31 (and the shape of the fluorescent image of the fluorescent light L32) is arranged on the primary imaging plane.
  • fluorescence emitted from other than the focal position (point or line) of the laser light L31 (for example, from a position shifted in the X direction and/or the Y direction and/or the Z direction from the focal position of the laser light L31) (background fluorescence) is eliminated by the diaphragm 317, so that the imaging device 319 can acquire a high-contrast fluorescence image.
  • the fluorescence L32 that has passed through the diaphragm 317 is imaged on the light receiving surface of the imaging element 319 after passing through the relay optical systems 318a and 318b, and the imaging element 319 detects the fluorescence luminance.
  • the sample P1 is scanned with the laser beam L31 having the point or line condensed shape as described above, thereby generating a luminance image of the entire or a part of the sample P1.
  • a stage 420 for supporting a pathological specimen a stage 420 for supporting a pathological specimen, a spectroscopic imaging section 430 for acquiring the fluorescence spectrum (spectral data) of the linearly excited pathological specimen, an observation optical system 440, and a non-fluorescence observation section 470.
  • different axis parallel means that a plurality of line illuminations are different axis and parallel.
  • Different axes mean not coaxial, and the distance between the axes is not particularly limited.
  • Parallel is not limited to being parallel in a strict sense, but also includes a state of being substantially parallel. For example, there may be distortion derived from an optical system such as a lens, or deviation from a parallel state due to manufacturing tolerances, and such cases are also regarded as parallel.
  • the excitation unit 410 has a plurality of (four in this example) excitation light sources 401 , 402 , 403 and 404 .
  • Each of the excitation light sources 401 to 404 is composed of a laser light source that outputs laser light with wavelengths of 405 nm, 488 nm, 561 nm and 645 nm, respectively.
  • the excitation unit 410 includes a plurality of collimator lenses 411 and laser line filters 412, dichroic mirrors 413a, 413b, and 413c, a homogenizer 414, a condenser lens 415, and an entrance slit 416 so as to correspond to the excitation light sources 401 to 404. further has
  • the laser light emitted from the excitation light source 401 and the laser light emitted from the excitation light source 403 are collimated by a collimator lens 411, respectively, and then transmitted through a laser line filter 412 for cutting the tail of each wavelength band. and are made coaxial by dichroic mirror 413a.
  • the two coaxial laser beams are further beam-shaped by a homogenizer 414 such as a fly-eye lens and a condenser lens 415 to form line illumination Ex1.
  • the laser light emitted from the excitation light source 402 and the laser light emitted from the excitation light source 404 are similarly coaxially coaxial by dichroic mirrors 413b and 413c, and are line-illuminated to form line illumination Ex2 having a different axis from the line illumination Ex1. be done.
  • the line illuminations Ex1 and Ex2 form off-axis line illuminations (primary images) separated by .DELTA.y at an entrance slit 416 (slit conjugate) having a plurality of slit portions each passable.
  • the observation optical system 440 has a condenser lens 441 , dichroic mirrors 442 and 443 , an objective lens 444 , a bandpass filter 445 and a condenser lens 446 .
  • the line illuminations Ex1 and Ex2 are collimated by a condenser lens 441 paired with an objective lens 444, reflected by dichroic mirrors 442 and 443, transmitted through the objective lens 444, and irradiated onto the sample P2.
  • Fluorescence excited by the line illuminations Ex1 and Ex2 is collected by the objective lens 444, reflected by the dichroic mirror 443, transmitted through the dichroic mirror 442 and the bandpass filter 445 that cuts the excitation light, and collected again by the condenser lens 446. It is illuminated and enters the spectral imaging section 430 .
  • the spectral imaging unit 430 has an observation slit 431 , imaging elements 432 ( 432 a and 432 b ), a first prism 433 , a mirror 434 , a diffraction grating 435 (wavelength dispersion element), and a second prism 436 .
  • the observation slit 431 is arranged at the condensing point of the condenser lens 446 and has the same number of slit parts as the number of excitation lines.
  • the fluorescence spectra derived from the two excitation lines that have passed through the observation slit 431 are separated by the first prism 433 and reflected by the grating surface of the diffraction grating 435 via the mirrors 434, respectively, thereby further dividing the fluorescence spectra of the respective excitation wavelengths. separated.
  • the four fluorescence spectra thus separated are incident on the imaging elements 432a and 432b via the mirror 434 and the second prism 436, and developed into (x, ⁇ ) information as spectral data.
  • the pixel size (nm/Pixel) of the imaging elements 432a and 432b is not particularly limited, and is set to 2 nm or more and 20 nm or less, for example.
  • This dispersion value may be realized by the pitch of the diffraction grating 435 or optically, or by hardware binning of the imaging elements 432a and 432b.
  • the stage 420 constitutes an XY stage, and moves the sample P2 in the X-axis direction and the Y-axis direction in order to acquire a fluorescence image of the sample P2.
  • WSI whole slide imaging
  • the non-fluorescent observation unit 470 is composed of a light source 471, a dichroic mirror 443, an objective lens 444, a condenser lens 472, an imaging device 473, and the like.
  • FIG. 6 shows an observation system using dark field illumination.
  • the light source 471 is arranged below the stage 420 and irradiates the sample P2 on the stage 420 with illumination light from the side opposite to the line illuminations Ex1 and Ex2.
  • the light source 471 illuminates from the outside of the NA (numerical aperture) of the objective lens 444, and the light (dark field image) diffracted by the sample P2 passes through the objective lens 444, the dichroic mirror 443, and the condenser lens 472. Then, the image sensor 473 captures the image.
  • dark field illumination even seemingly transparent samples such as fluorescently stained samples can be observed with contrast.
  • the non-fluorescent observation unit 470 is not limited to an observation system that acquires a dark field image, but is an observation system capable of acquiring non-fluorescent images such as bright field images, phase contrast images, phase images, and in-line hologram images. may consist of For example, various observation methods such as the Schlieren method, the phase contrast method, the polarizing observation method, and the epi-illumination method can be employed as methods for obtaining non-fluorescent images.
  • the position of the illumination light source is not limited to below the stage, and may be above the stage or around the objective lens. In addition to the method of performing focus control in real time, other methods such as a pre-focus map method in which focus coordinates (Z coordinates) are recorded in advance may be employed.
  • the luminance image acquired by the image acquisition unit 112 is the efficiency of the detection optical system for detecting the fluorescence emitted from the sample (lens transmittance, etc., and in the case of a spectroscopic optical system, the filter transmittance and the diffraction efficiency of the diffraction grating). etc.), light collection efficiency (numerical aperture NA of detection objective lens, lens aberration performance, relay magnification, lens vignetting, etc.), sensor spectral sensitivity characteristics (physical characteristics, set exposure time, gain, etc.).
  • parameters such as the power density of the excitation light (focus and aberration for each excitation light, etc.), the coordinates of the laser illumination and the positional deviation of the installed pinhole affect the detected fluorescence brightness. It cannot be calibrated with a self-luminous standard light source that is not fluorescence.
  • the value of the above-mentioned positional deviation may fluctuate on a daily basis due to factors such as variations in the manufacturing of individual parts, assembly errors, and part drift due to the temperature of the installation environment.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the standard phosphor according to the present embodiment. b) shows a side view of the standard phosphor from the side; 9 is an enlarged view of area A in FIG. Note that the standard phosphor 500 described below may be applied to both the standard phosphors 11 and 21 .
  • the standard phosphor 500 has a laminated structure in which the phosphor layer 501 is evenly sealed between the cover glass layer 502 and the holding glass layer 503 .
  • the thickness of the cover glass layer 502 is, for example, 170 ⁇ m (micrometers)
  • the thickness of the holding glass layer 503 is, for example, 1000 ⁇ m.
  • the thickness of the fluorescent layer 501 is 20 ⁇ m in FIG. 9, it is not limited to this.
  • the fluorescent layer 501 it is possible to use, for example, a stable fluorescent glass or other solid material that emits light uniformly with respect to excitation light of the same intensity and that has little color fading.
  • the thickness of the fluorescent layer 501 is defined by polishing the front and back surfaces thereof, for example.
  • a material sensitive to the excitation wavelength used may be appropriately selected.
  • FIG. 10 is a diagram showing a difference in acquired luminance depending on the presence or absence of a cover glass.
  • FIG. 11 is a graph showing fluorescence intensity acquired while moving the objective lens in the Z direction with respect to the fluorescent layer. As shown in FIGS. 10 and 11, both the brightness and its characteristics differ depending on the presence or absence of the cover glass, and it can be seen that the images with the cover glass are photographed under conditions closer to the actual sample photographing environment.
  • the fluorescent layer 501 have a thickness similar to the thickness of the sample to be measured, to the extent that the characteristics are not lost. For example, if the thickness of a sample slide formed by slicing with a microtome is 4 ⁇ m, the thickness of the fluorescent layer 501 is preferably about 20 ⁇ m or less.
  • 12 to 14 are diagrams showing fluorescence intensity distributions for excitation line illumination when the thickness t of the fluorescent layer 501 is 4 ⁇ m, 20 ⁇ m, and 80 ⁇ m.
  • FIG. 15 is a graph showing the light intensity profile of the AA' section of each of FIGS. The same laser light source with a wavelength of 405 nm (nanometers) was used as the excitation light source.
  • the observed fluorescence intensity distribution varies depending on the thickness of the fluorescent layer 501.
  • the standard spectrum is created by a method in which the user U side prepares a sample slide stained with a single dye and measures it with the copying device C.
  • this preparation process by using a dye sample with a known concentration, it becomes possible to convert the fluorescence intensity into the number of antibodies.
  • this operation must be performed for each dye, and density management, imaging condition management, etc. are complicated, so there is a problem that it is difficult for the user U to perform this operation.
  • the vendor V1 side uses the master device M1 to create a spillover matrix and/or standard spectrum, and each user U side creates a spillover matrix and/or standard spectrum created by the vendor V1 side is corrected according to the machine difference.
  • FIG. 16 is a flow chart showing an operation example executed on the vendor side according to the present embodiment. Incidentally, as described above, the standard spectrum is created on the vendor V1 side.
  • the creation of the spillover matrix and/or standard spectrum on the vendor V1 side includes dye chamber measurement S600, background (BG) measurement S610, standard fluorophore measurement S620, and dye information generation S630. executed.
  • Spectral radiance spectrum 603 of the pigment used for staining on the user U side is obtained by the calculation unit 10 performing spectral calibration (step S602) on the luminance image.
  • Spatial averaging processing (S604) is performed on the acquired spectral radiance spectrum 603 in the computing unit 10.
  • Step S610 In the background measurement S610, similarly in the master device M1, a sample containing no pigment (background sample) is photographed (step S611), and the calculation unit 10 performs spectral calibration on the luminance image obtained thereby. By executing (step S612), a spectral radiance spectrum 613 of the background sample is obtained. Spatial averaging processing (S614) is performed on the acquired spectral radiance spectrum 613 in the computing unit 10.
  • the brightness is adjusted by focusing on the Z-axis so that the acquired brightness for the standard phosphor 11 becomes the maximum (the peak in the graph shown in FIG. 11). luminance) is obtained. At least one luminance image is acquired for each excitation in this standard phosphor measurement S620. Thus, for example, in the case of 3 excitations, 3 or more intensity images are acquired.
  • dye information generation S630 In dye information generation S630, the calculation unit 10 subtracts the spectral radiance spectrum 613 obtained in the background measurement S610 from the spectral radiance spectrum 603 obtained in the dye chamber measurement S600 (step S631). A more accurate spectral radiance spectrum 603 of the dye used for staining on the user U side is generated.
  • the background subtraction process (step S631) may be performed before or after the spatial averaging process (S603, S613).
  • the computing unit 10 obtains the final standard spectrum 633 by multiplying the spectral radiance spectrum 603 by the antibody quantification coefficient (step S632).
  • the antibody quantification coefficient can be expressed by the following equation (9).
  • the thickness correction system is a correction value for correcting the difference in luminance value caused by the difference between the thickness of the dye chamber 12 and the thickness of the actual sample (specimen 50 or fluorescence-stained specimen 60). be.
  • This antibody quantification coefficient may be calculated in advance by, for example, actual measurement, theoretical calculation, or the like.
  • the standard spectrum 633 obtained in this way is used for color separation (least squares method) of the spectral radiance spectrum of the pigment (fluorescently stained specimen 60) obtained on the copier C side.
  • color separation by performing color separation using the standard spectrum 633, it is possible to convert the spectral radiance spectrum of the dye actually used by user U into the dimension of antibody number concentration.
  • the computing unit 10 creates a data set that summarizes the standard spectrum 633 acquired in step S632 and the spectral radiance spectrum 623 of the standard phosphor 11 acquired in the standard phosphor measurement S620.
  • the created data set is uploaded to the server 200 as dye information and provided to the copier C as appropriate.
  • the data format may include parameters such as the intensity of the excitation light used in the master device M1 and imaging parameters (exposure time, gain).
  • FIG. 17 is a flowchart showing an operation example executed on the user side according to the present embodiment.
  • standard fluorescence measurement S640 As shown in FIG. 17, on the user U side, standard fluorescence measurement S640, sample measurement S650, and antibody number calculation S660 are executed.
  • the copying machine C performs the daily QC by taking an image of the standard phosphor 21 (step S641), and the luminance image obtained thereby.
  • the spectral radiance spectrum 643 of the standard phosphor 21 is obtained by performing the spectral calibration (step S642) by the computing unit 20.
  • the spectral radiance spectrum 643 obtained is subjected to wavelength averaging processing and spatial averaging processing (S644) in the computing unit 20.
  • the spectral radiance spectrum 643 of the standard phosphor 21 is three-dimensional data in the XY ⁇ space.
  • the spectral radiance spectrum 643 is first averaged (two-dimensionalized) in the ⁇ direction, and then further averaged (one-dimensionalized) in the Y direction. Convert to one-dimensional data.
  • luminance data at the center of one-dimensional data for example, if the number of pixels in the luminance image is 2000 pixels, the 1000th pixel
  • the shading correction coefficient 645 can be obtained by normalizing the one-dimensional data and reciprocating it.
  • a shading correction coefficient 645 for correcting luminance unevenness for each excitation light in the spectral radiance spectrum 654 obtained by sample measurement S650, which will be described later, may be obtained.
  • the shading correction coefficient may be a coefficient for correcting luminance unevenness caused by a drop in the illumination luminance of the excitation light from the image center toward the outer periphery.
  • sample measurement S650 In the sample measurement S650, the specimen 50 (fluorescently stained specimen 60 (sample )) is performed (step S651), and the calculation unit 20 performs spectral calibration (step S652) on the luminance image obtained thereby, thereby obtaining spectral radiance spectra of dyes #1 to #n. 653 is obtained.
  • the spectral radiance spectrum obtained by the sample measurement S650 is a series of multispectral data in which the spectral radiance spectrum for each excitation light is connected in the wavelength direction as shown in FIG. Note that FIG. 18 shows spectral radiance spectra obtained when three types of excitation light L11 to L13 are used.
  • Antibody number calculation S660 In antibody number calculation S660, first, packing correction S661 and shading correction S663 are performed.
  • the calculation unit 20 acquires from the server 200 the dye information of the dyes #1 to #n used for staining the specimen 50 (referred to as dye information #1 to #n for simplicity of explanation). . Subsequently, the calculation unit 20 calculates the spectral radiance spectrum 624 of the standard phosphor 11 in each of the acquired dye information #1 to #n and the spectral radiance spectrum of the standard phosphor 21 acquired by the standard phosphor measurement S640. 643, and if the values of both are different, based on the ratio of the spectral radiance spectrum 624 and the spectral radiance spectrum 643, using the following formula (10), the standard of each of the dye information #1 to #n Correct the spectrum 633 .
  • the standard spectrum 633 after correction is referred to as a standard spectrum after correction
  • the spectral radiance spectrum 643 of the standard phosphor 21 obtained by the standard phosphor measurement S640 on the user U side is
  • the spectral radiance spectrum 623 of the standard phosphor 11 obtained by the vendor V1 side standard phosphor measurement S620 is referred to as the master device side spectral radiance spectrum.
  • the shading correction S663 the spectral radiance spectra 653 of each of the dyes #1 to #n obtained by the sample measurement S650 are corrected using the shading correction coefficients obtained by the standard phosphor measurement S640. Note that the shading correction S663 is not essential and may be omitted. In that case, acquisition of the shading correction coefficient 645 in the spatial averaging process S644 may be omitted.
  • the computing unit 20 color-separates the spectral radiance spectrum 653 of each of the dyes #1 to #n, for example, by the least-squares method using the corrected standard spectrum 662 (step S664).
  • image data also referred to as a coefficient image or antibody number density image
  • output data 665 (corresponding to quantitative value data 23 in FIG. 1) ).
  • the standard spectrum 633 created using the master device M1 on the vendor V1 side is the spectral radiance measured from the standard phosphor 11 using the master device M1. It is corrected based on the spectrum 623 and the spectral radiance spectrum 643 measured from the standard phosphor 21 using the copier C on the user U side. This correction may be performed daily at user U as a daily QC. In this way, by performing a sequence of measuring the standard phosphor 21 and correcting the standard spectrum 633633 as daily QC, it is possible to suppress deterioration in measurement accuracy due to device differences and changes over time. As a result, it becomes possible to correctly obtain the number of antibodies from the fluorescence intensity of the sample measured by the copier C. FIG. As a result, the user U side can quantitatively evaluate the amount of markers expressed in the tissue from the coefficient image (antibody number concentration image). It becomes possible to make a choice of law.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-11527 discloses a fluorescence microscope system that acquires a fluorescence image of a measurement specimen using a fluorescence microscope and quantifies a fluorescent substance using a calibration curve from the acquired fluorescence image.
  • this is a method of performing quantification from calibration curve measurement of fluorescent substances, and is different from the present method of identifying the number of fluorescent molecules from the absolute value of fluorescence luminance.
  • the user needs to obtain a plurality of samples for the calibration curve measurement, which is highly reliable but takes a lot of time and effort.
  • the present embodiment is convenient because it is possible to directly convert the imaging data into the number of molecules by managing the measured values of the apparatus using the quantitative phosphor.
  • Japanese Patent No. 3706367 discloses a method of evaluating the performance of a confocal laser scanning microscope using a reference device in which a dissolved phosphor is enclosed.
  • the user needs to prepare and measure the sample immediately before use, but since the phosphor used itself is a material that causes fading, simple quantification that reduces the user's work is possible. cannot be realized.
  • the fluorescent standard of this embodiment differs in that it uses fluorescent glass, which is an inorganic material. Also, this embodiment is different in that it is preliminarily incorporated into the apparatus.
  • the standard phosphor of the present embodiment is characterized by being extremely resistant to fading, being stable, and having little unevenness. images can be acquired.
  • the master device M1 based on the ratio between the spectral radiance spectrum 623 acquired by the master device M1 and the spectral radiance spectrum 643 acquired by the copy device C, the master device M1
  • the dyes #1 to #n obtained using the copy device C Each spectral radiance spectrum 653 may be corrected. Even in that case, as in the above-described embodiment, it is possible to suppress deterioration in measurement accuracy due to device differences and changes over time. It becomes possible to quantitatively evaluate the amount of markers that have been detected.
  • the vendor V1 side by storing the spectral radiance spectrum 643 obtained in the standard phosphor measurement S640 on the user U side, for example, in the server 200 or the like, and monitoring daily measurement values, This makes it possible to detect abnormalities such as misalignment and deterioration of the image sensor. In this case, it is possible for the vendor V1 side to proactively provide after-sales services such as maintenance to the user U of the copier C whose abnormality has been detected.
  • FIG. 19 is a schematic diagram showing a first system configuration example of the information processing system according to the embodiment described above.
  • the server 200, the master device M1 on the side of the vendor V1, and the copy device C on the side of each user U can communicate with each other via a network 210 such as the Internet, a mobile communication system, or a dedicated line. connected to a network 210 such as the Internet, a mobile communication system, or a dedicated line. connected to
  • a server 200A on the side of each user U may be used instead of the server 200, as shown in FIG. In that case, the dye information stored in the server 200 may be downloaded to the server 200A on the side of each user U as needed.
  • a plurality of servers 200-1 and 200-2 functioning as servers 200 are arranged on a network 210, and the server 200-1 operates as a primary server.
  • the other server 200-2 operates as a secondary server to transmit coloring matter information in response to a request from the copier C. It may be configured to transmit information.
  • FIG. 21 is a hardware configuration diagram showing an example of a computer 1000 that implements the functions of at least part of the fluorescence microscope apparatus 100 (for example, the computing units 10/20).
  • the computer 1000 has a CPU 1100 , a RAM 1200 , a ROM (Read Only Memory) 1300 , a HDD (Hard Disk Drive) 1400 , a communication interface 1500 and an input/output interface 1600 .
  • Each part of computer 1000 is connected by bus 1050 .
  • the CPU 1100 operates based on programs stored in the ROM 1300 or HDD 1400 and controls each section. For example, the CPU 1100 loads programs stored in the ROM 1300 or HDD 1400 into the RAM 1200 and executes processes corresponding to various programs.
  • the ROM 1300 stores a boot program such as BIOS (Basic Input Output System) executed by the CPU 1100 when the computer 1000 is started, and programs dependent on the hardware of the computer 1000.
  • BIOS Basic Input Output System
  • the HDD 1400 is a computer-readable recording medium that non-temporarily records programs executed by the CPU 1100 and data used by such programs.
  • HDD 1400 is a recording medium that records a program for executing each operation according to the present disclosure, which is an example of program data 1450 .
  • a communication interface 1500 is an interface for connecting the computer 1000 to an external network 1550 (for example, the Internet).
  • the CPU 1100 receives data from another device via the communication interface 1500, and transmits data generated by the CPU 1100 to another device.
  • the input/output interface 1600 includes the I/F section 18 described above, and is an interface for connecting the input/output device 1650 and the computer 1000 .
  • the CPU 1100 receives data from input devices such as a keyboard and mouse via the input/output interface 1600 .
  • the CPU 1100 transmits data to an output device such as a display, a speaker, or a printer via the input/output interface 1600 .
  • the input/output interface 1600 may function as a media interface for reading a program or the like recorded on a predetermined recording medium.
  • Media include, for example, optical recording media such as DVD (Digital Versatile Disc) and PD (Phase change rewritable disk), magneto-optical recording media such as MO (Magneto-Optical disk), tape media, magnetic recording media, semiconductor memories, etc. is.
  • optical recording media such as DVD (Digital Versatile Disc) and PD (Phase change rewritable disk)
  • magneto-optical recording media such as MO (Magneto-Optical disk)
  • tape media magnetic recording media
  • magnetic recording media semiconductor memories, etc. is.
  • the computer 1000 functions as at least part of the fluorescence microscope apparatus 100 according to the above-described embodiments (for example, the calculation unit 10/20)
  • the CPU 1100 of the computer 1000 executes the program loaded on the RAM 1200.
  • the functions of at least part of the fluorescence microscope apparatus 100 are realized.
  • the HDD 1400 also stores programs and the like according to the present disclosure.
  • CPU 1100 reads and executes program data 1450 from HDD 1400 , as another example, these programs may be obtained from another device via external network 1550 .
  • a first luminance data acquisition unit that acquires first luminance data of fluorescence emitted from the first dye by irradiating the first dye with a known concentration with the first excitation light
  • a coefficient obtaining unit that obtains a conversion coefficient for converting the luminance data into the number of the first dye based on the first luminance data
  • Second luminance data of fluorescence emitted from the sample is obtained by irradiating a sample stained with a second dye that is the same dye as the first dye with second excitation light having the same wavelength as the first excitation light.
  • the first luminance data acquisition unit acquires third luminance data of fluorescence emitted from the first phosphor by irradiating the first phosphor with third excitation light
  • the second luminance data acquisition unit irradiates a second phosphor having the same structure as the first phosphor with fourth excitation light having the same wavelength as the third excitation light, thereby obtaining fluorescence emitted from the second phosphor.
  • the information processing system acquires fourth luminance data of The information processing system according to (1), wherein the coefficient correction unit corrects the conversion coefficient based on a ratio between the third luminance data and the fourth luminance data.
  • the first luminance data acquisition unit acquires fifth luminance data by irradiating the first excitation light in a state where no dye is arranged, The information according to (1) or (2), wherein the coefficient obtaining unit calculates the conversion coefficient based on sixth luminance data obtained by subtracting the fifth luminance data from the first luminance data. processing system.
  • the transform coefficients are spillover matrices or standard spectra.
  • a first information processing device comprising the first luminance data acquisition unit and the coefficient acquisition unit; a second information processing device comprising the second luminance data acquisition unit, the coefficient correction unit, and the antibody number calculation unit; with The information processing system according to any one of (1) to (4), wherein the first information processing device and the second information processing device are connected via a predetermined network.
  • a server that holds the first luminance data and the conversion coefficient for each of the one or more first dyes obtained by the first information processing device, The first information processing device transmits the first luminance data and the conversion coefficient for each of the one or more first dyes to the server;
  • the coefficient correction unit corrects the conversion coefficient based on the machine difference when the second information processing device is started.
  • the first information processing device includes a first receiver that converges the first excitation light on the first dye and converges the fluorescence emitted from the first dye on a light receiving surface of the first luminance data acquisition unit. further equipped with focusing optics,
  • the second information processing device includes a second confocal optical system for condensing the second excitation light onto the sample and condensing the fluorescence emitted from the sample onto a light receiving surface of the second luminance data acquisition unit. further prepared, The information processing system according to any one of (5) to (7), wherein the first confocal optical system and the second confocal optical system are optical systems having the same configuration.
  • a first luminance data acquisition unit that acquires first luminance data of fluorescence emitted from the first dye by irradiating the first dye with a known concentration with the first excitation light; a coefficient obtaining unit that obtains a conversion coefficient for converting the luminance data into the number of the first dye based on the first luminance data; Second luminance data of fluorescence emitted from the sample is obtained by irradiating a sample stained with a second dye that is the same dye as the first dye with second excitation light having the same wavelength as the first excitation light.
  • a second luminance data acquisition unit to acquire; a luminance data correcting unit that corrects the second luminance data based on an instrumental difference between the first luminance data obtaining unit and the second luminance data obtaining unit; an antibody number calculation unit that calculates the number of the second dye based on the conversion coefficient from the corrected second luminance data;
  • An information processing system comprising (10) An information processing method executed in a master device connected to a copy device via a predetermined network, Obtaining first luminance data of fluorescence emitted from the first dye by irradiating the first dye with a known concentration with the first excitation light, An information processing method comprising: obtaining conversion coefficients for converting luminance data into the number of the first dyes based on the first luminance data.
  • Second luminance data of fluorescence emitted from the sample is obtained by irradiating a sample stained with a second dye that is the same dye as the first dye with a second excitation light having the same wavelength as the first excitation light. Acquired, correcting the conversion coefficient based on the difference between the master device and the copy device; calculating the number of the second dyes from the second luminance data based on the corrected conversion coefficients.
  • a phosphor structure comprising:

Abstract

抗体数の測定精度を向上する。実施形態に係る情報処理システムは、濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得する第１輝度データ取得部（１１０）と、前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する係数取得部（１３０）と、前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得する第２輝度データ取得部（１１０）と、前記第１輝度データ取得部と前記第２輝度データ取得部との機差に基づいて前記変換係数を補正する係数補正部（１３０）と、補正後の前記変換係数に基づいて前記第２輝度データから前記第２色素の数を算出する抗体数算出部（１３０）と、を備える。

Description

情報処理システム、情報処理方法及び蛍光体構造体
　本開示は、情報処理システム、情報処理方法及び蛍光体構造体に関する。
　一般的に、生体試料の観察や評価には、蛍光免疫染色が用いられる。蛍光免疫染色では、例えば、蛍光染色試薬によって染色された生体試料に励起光を照射することで放射された蛍光を観察し、この観察された蛍光輝度に基づくことで、各種マーカの発現の有無や発現した細胞数のカウントなどが行われる。
国際公開第２０２０／０２２０３８号
　しかしながら、生体試料の観察や評価において意味のある値は、蛍光輝度ではなく、細胞組織や細胞表面の抗原に反応した抗体の量（抗体数）であるが、蛍光強度測定は、励起光のパワーや検出器のカップリング効率などの様々な機差要因を受けるため、蛍光輝度を定量化して正確な抗体数を得ることが困難であるという課題が存在する。
　そこで本開示は、上記課題を解決するために、抗体数の測定精度を向上することが可能な情報処理システム、情報処理方法及び蛍光体構造体を提供する。
　本開示の実施形態に係る情報処理システムは、濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得する第１輝度データ取得部と、前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する係数取得部と、前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得する第２輝度データ取得部と、前記第１輝度データ取得部と前記第２輝度データ取得部との機差に基づいて前記変換係数を補正する係数補正部と、補正後の前記変換係数に基づいて前記第２輝度データから前記第２色素の数を算出する抗体数算出部と、を備える。
本開示の一実施形態に係る情報処理システムの概略構成例を示すブロック図である。 本開示の一実施形態に係る蛍光顕微鏡装置の構成例を示すブロック図である。 本開示の一実施形態に係る蛍光顕微鏡装置の概略動作例を示すフローチャートである。 本開示の一実施形態に係る蛍光顕微鏡の対物レンズを通して検出可能な範囲について説明するための図である。 本開示の一実施形態の第１例に係る蛍光顕微鏡装置に搭載され得る共焦点光学系の構成例を示す模式図である。 本開示の一実施形態の第２例に係る蛍光顕微鏡装置に搭載され得る共焦点光学系の構成例を示す模式図である。 図５又は図６に例示する共焦点光学系における誤差要因の例を示す図である。 本開示の一実施形態に係る標準蛍光体の一例を示す図である。 図８における領域Ａの拡大図である。 本開示の一実施形態に係る標準蛍光体のカバーガラスの有無による取得輝度の違いを示す図である。 本開示の一実施形態に係る標準蛍光体の蛍光層に対して対物レンズをＺ方向に移動させながら取得した蛍光輝度を示すグラフである。 本開示の一実施形態に係る標準蛍光体の蛍光層の厚さｔを４μｍとした場合の励起ライン照明に対する蛍光強度分布を示す図である。 本開示の一実施形態に係る標準蛍光体の蛍光層の厚さｔを２０μｍとした場合の励起ライン照明に対する蛍光強度分布を示す図である。 本開示の一実施形態に係る標準蛍光体の蛍光層の厚さｔを８０μｍとした場合の励起ライン照明に対する蛍光強度分布を示す図である。 図１２～図１４それぞれのＡ－Ａ’断面の光強度プロファイルを示すグラフである。 本開示の一実施形態に係るベンダ側において実行される動作例を示すフローチャートである。 本開示の一実施形態に係るユーザ側において実行される動作例を示すフローチャートである。 本開示の一実施形態に係るユーザ側のサンプル測定において取得される分光放射輝度スペクトルの一例を示す図である。 本開示の一実施形態に係る情報処理システムの第１のシステム構成例を示す模式図である。 本開示の一実施形態に係る情報処理システムの第２のシステム構成例を示す模式図である。 本開示に係る情報処理装置の機能を実現するコンピュータの一例を示すハードウエア構成図である。
　以下に添付図面を参照しながら、本開示の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書及び図面において、実質的に同一の機能構成を有する構成要素については、同一の符号を付することにより重複説明を省略する。
　なお、説明は以下の順序で行うものとする。
　　１．一実施形態
　　　１．１　システム構成例
　　　１．２　蛍光顕微鏡装置の構成例
　　　１．３　蛍光顕微鏡装置の動作例
　　　　１．３．１　輝度のフォトン数への変換処理
　　　　１．３．２　フォトン数の蛍光分子数または抗体数への変換処理
　　　１．４　機差要因による誤差の低減方法
　　　１．５　誤差要因について
　　　　１．５．１　共焦点光学系の第１例
　　　　１．５．２　共焦点光学系の第２例
　　　　１．５．３　誤差要因の例
　　　１．６　標準蛍光体の例
　　　１．７　動作例
　　　　１．７．１　ベンダＶ１側の動作例
　　　　１．７．２　ユーザＵ側の動作例
　　　１．８　まとめ
　　　１．９　変形例
　　２．システム構成例
　　３．ハードウエア構成
　１．一実施形態
　以下、本開示の一実施形態に係る情報処理システム、情報処理方法及び蛍光体構造体について、図面を参照して詳細に説明する。
　１．１　システム構成例
　図１は、本実施形態に係る情報処理システムの概略構成例を示すブロック図である。図１に示すように、情報処理システム１は、ベンダＶ１側の蛍光顕微鏡装置Ｍ１と、１以上のユーザＵ１、Ｕ２、…側の蛍光顕微鏡装置Ｃ１、Ｃ２、…と、サーバ２００とから構成される。以下の説明において、ベンダＶ１側の蛍光顕微鏡装置をマスタ機器と称し、ユーザＵ１、Ｕ２、…側の蛍光顕微鏡装置をコピー機器と称する。
　（ベンダ側）
　ベンダＶ１は、例えば、顧客であるユーザＵ１、Ｕ２、…（以下、ユーザを区別しない場合、その符号を‘Ｕ’とする）へコピー機器Ｃ１、Ｃ２、…（ユーザを区別しない場合、その符号を‘Ｃ’とする）及び／又はコピー機器Ｃを保守管理するサービスを提供する者である。ベンダＶ１側のマスタ機器Ｍ１は、その詳細については後述するが、標準蛍光体１１と、色素チャンバ１２と、演算部１０とを備える。
　（ユーザ側）
　ユーザＵは、コピー機器Ｃを実際に使用して被験者から取得した生体試料等を蛍光観察する者である。ユーザＵ側のコピー機器Ｃは、その詳細については後述するが、標準蛍光体２１及び演算部２０を備え、標本２２の定量値データ２３を取得する。
　（サーバ）
　サーバ２００は、例えば、インターネットや移動通信システム（４Ｇ（4th　Generation　Mobile　Communication　System）、４Ｇ－ＬＴＥ（Long　Term　Evolution）、５Ｇ等を含む）や専用回線等を介してマスタ機器Ｍ１及びコピー機器Ｃに接続され、マスタ機器Ｍ１から取得した各種情報を保管し、必要に応じてコピー機器Ｃへ送信する。なお、サーバ２００からコピー機器Ｃへの情報の送信は、プル型であってもよいし、プッシュ型であってもよい。
　なお、図１には、マスタ機器Ｍ１及びコピー機器Ｃそれぞれが演算部１０／２０を実装している場合が例示されているが、これに限定されず、演算部１０は、蛍光顕微鏡装置とは別の情報処理装置内に実装されてもよい。
　１．２　蛍光顕微鏡装置の構成例
　次に、マスタ機器Ｍ１及びコピー機器Ｃとして使用される蛍光顕微鏡装置の構成例について説明する。図２は、本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置の構成例を示すブロック図である。
　図２に示すように、本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置１００への入力としては、蛍光染色試薬４２、標本５０と、蛍光染色標本６０と、が存在する。
　（蛍光染色試薬４２）
　蛍光染色試薬４２は、標本５０の染色に使用される薬品である。蛍光染色試薬４２は、例えば、蛍光抗体、蛍光プローブ、または核染色試薬などであるが、蛍光染色試薬４２の種類はこれらに特に限定されない。また、蛍光染色試薬４２は、蛍光染色試薬４２（および蛍光染色試薬４２の製造ロット）を識別可能な識別情報（以降「試薬識別情報４１」と呼称する）を付されて管理される。試薬識別情報４１は、例えばバーコード情報など（一次元バーコード情報や二次元バーコード情報など）であるが、これに限定されない。蛍光染色試薬４２は、同一（同種類）の製品であっても、製造方法や抗体が取得された細胞などに応じて製造ロット毎にその性質が異なる。例えば、蛍光染色試薬４２において、褪色係数や蛍光標識率（「F/P値：Fluorescein/Protein」とも呼称される。抗体を標識する蛍光分子数を指す）などが異なる。そこで、本実施形態に係る情報処理システム１において、蛍光染色試薬４２は、試薬識別情報４１を付されることによって製造ロット毎に管理される（換言すると、各蛍光染色試薬４２の試薬情報は製造ロット毎に管理される）。これによって、蛍光顕微鏡装置１００は、製造ロット毎に現れる僅かな性質の違いも考慮した上で各種処理を行うことができる。なお、蛍光染色試薬４２が製造ロット単位で管理されることはあくまで一例であり、蛍光染色試薬４２は製造ロットよりも細かい単位で管理されてもよい。
　（標本５０）
　標本５０は、人体から採取された検体または組織サンプルから病理診断などを目的に作製された試料スライドなどである。標本５０について、使用される組織（例えば臓器など）の種類、対象となる疾病の種類、対象者の属性（例えば、年齢、性別、血液型、または人種など）、または対象者の生活習慣（例えば、食生活、運動習慣、または喫煙習慣など）は特に限定されない。標本５０は、使用される組織の種類、対象となる疾病の種類、対象者の属性、または対象者の生活習慣などに応じてその性質が異なるため、標本５０は、各標本５０を識別可能な識別情報を付されて管理されてもよい。
　（蛍光染色標本６０）
　蛍光染色標本６０は、標本５０が蛍光染色試薬４２によって染色されることで作成されたものである。本実施形態において、蛍光染色標本６０は、標本５０が少なくとも一つの蛍光染色試薬４２によって染色されることを想定しているところ、染色に用いられる蛍光染色試薬４２の数は特に限定されない。また、染色方法は、標本５０および蛍光染色試薬４２それぞれの組み合わせなどによって決まり、特に限定されるものではない。蛍光染色標本６０は、蛍光顕微鏡装置１００に対して入力され、撮像される。
　（蛍光顕微鏡装置１００）
　蛍光顕微鏡装置１００は、図２に示すように、取得部１１０と、保存部１２０と、演算部１３０と、表示部１４０と、制御部１５０と、操作部１６０と、を備える。
　（取得部１１０）
　取得部１１０は、蛍光顕微鏡装置１００の各種処理に使用される情報を取得する構成である。図２に示すように、取得部１１０は、情報取得部１１１と、画像取得部１１２と、を備える。この取得部１１０は、例えば、請求の範囲における第１／第２輝度データ取得部の一例となり得る。
　（情報取得部１１１）
　情報取得部１１１は、試薬情報などの各種情報を取得する構成である。より具体的には、情報取得部１１１は、蛍光染色標本６０の生成に使用された蛍光染色試薬４２に付された試薬識別情報４１を取得する。例えば、情報取得部１１１は、バーコードリーダーなどを用いて試薬識別情報４１を取得する。そして、情報取得部１１１は、試薬識別情報４１に基づいて試薬情報をサーバ２００から取得する。また、情報取得部１１１は、別途実測された励起パワー密度も取得する（励起パワー密度を実測する主体は特に限定されない）。なお、情報取得部１１１が取得する情報はこれらに限定されない。情報取得部１１１は、取得したこれらの情報を後述する情報保存部１２１に保存する。
　（画像取得部１１２）
　画像取得部１１２は、蛍光染色標本６０（蛍光染色試薬４２で染色された標本５０）の撮像画像情報を取得する構成である。より具体的には、画像取得部１１２は、任意の撮像素子（例えば、ＣＣＤ（Charged　Coupled　Device）やＣＭＯＳ（Complementary　Metal-Oxide-Semiconductor）など）を備えており、当該撮像素子を用いて蛍光染色標本６０を撮像することで撮像画像情報を取得する。「撮像画像情報」とは、蛍光染色標本６０の撮像画像自体、および像として視覚化されていない測定値など（例えば、輝度の測定値など）を含む概念である。画像取得部１１２は、撮像画像情報を後述する画像情報保存部１２２に保存する。
　（保存部１２０）
　保存部１２０は、蛍光顕微鏡装置１００の各種処理に使用される情報、または各種処理によって出力された情報を保存（記憶）する構成である。図２に示すように、保存部１２０は、情報保存部１２１と、画像情報保存部１２２と、を備える。
　（情報保存部１２１）
　情報保存部１２１は、情報取得部１１１によって取得された試薬情報など（上記のとおり、褪色係数、吸収断面積（またはモル吸光係数）、量子収率、および蛍光標識率など）の各種情報を保存する構成である。なお、後述する補正部１３１による褪色補正処理、算出部１３２による蛍光分子数（または蛍光分子に結合している抗体数。すなわち、図１における定量値データ２３）の算出処理、および画像生成部１３３による画像生成処理などが終了した後には、情報保存部１２１は、処理に用いられたこれらの情報を削除することで空き容量を増やしてもよい。
　（画像情報保存部１２２）
　画像情報保存部１２２は、画像取得部１１２によって取得された蛍光染色標本６０の撮像画像情報を保存（記憶）する構成である。なお、情報保存部１２１と同様に、補正部１３１による褪色補正処理、算出部１３２による蛍光分子数（または蛍光分子に結合している抗体数）の算出処理、および画像生成部１３３による画像生成処理などが終了した後には、画像情報保存部１２２は、処理に用いられた撮像画像情報を削除することで空き容量を増やしてもよい。
　（演算部１３０）
　演算部１３０は、撮像画像情報、試薬情報（上記のとおり、褪色係数、吸収断面積（またはモル吸光係数）、量子収率、および蛍光標識率など）、および励起パワー密度などの情報を用いて各種処理を行う機能構成である。図２に示すように、演算部１３０は、補正部１３１と、算出部１３２と、画像生成部１３３と、を備える。
　この演算部１３０は、マスタ機器Ｍ１における演算部１０、コピー機器Ｃにおける演算部２０に相当する。例えば、演算部１３０がマスタ機器Ｍ１における演算部１０に相当する場合、演算部１３０は、請求の範囲における係数取得部の一例となり得る。また、例えば、演算部１３０がコピー機器Ｃにおける演算部２０に相当する場合、演算部１３０は、請求の範囲における係数補正部／輝度データ補正部、抗体数算出部の一例となり得る。
　（補正部１３１）
　補正部１３１は、撮像画像情報の褪色補正処理を行う構成である。より具体的には、補正部１３１は、褪色係数、吸収断面積、および励起パワー密度などを用いて、撮像画像情報における輝度を褪色前の輝度に補正する。補正部１３１によって行われる褪色補正処理については後段にて詳述する。
　（算出部１３２）
　算出部１３２は、補正部１３１によって補正された撮像画像情報の輝度を用いて、撮像画像情報における蛍光分子に対応する情報（例えば、蛍光分子数または抗体数など）を算出する構成である。より具体的には、算出部１３２は、吸収断面積、量子収率、蛍光標識率、および励起パワー密度などを用いて、補正後の画素毎の輝度を蛍光分子数や抗体数へ変換する。算出部１３２によって行われる蛍光分子数や抗体数の算出処理については後段にて詳述する。
　なお、本実施形態においては、蛍光物質の褪色係数および量子収率などの算出は、蛍光分子数などの算出とは別に行われることを想定している（もちろん、これに限定されない）。その際、算出部１３２は、褪色係数および量子収率などの算出処理を実現してもよい。
　（画像生成部１３３）
　画像生成部１３３は、算出部１３２によって算出された蛍光分子に対応する情報（例えば、蛍光分子数または抗体数など）に基づいて画像情報を生成する構成である。「画像情報」とは、上記で説明した撮像画像情報と同様に、画像自体、および像として視覚化されていない数値など（例えば、蛍光分子数または抗体数など）を含む概念である。画像生成部１３３によって行われる画像情報の生成処理については後段にて詳述する。
　（表示部１４０）
　表示部１４０は、画像生成部１３３によって生成された画像情報（蛍光分子に対応する情報に基づいて生成された画像情報）をディスプレイに表示することでユーザへ提示する構成である。なお、表示部１４０として用いられるディスプレイの種類は特に限定されない。また、本実施形態では詳細に説明しないが、画像生成部１３３によって生成された画像情報がプロジェクターによって投影されたり、プリンタによってプリントされたりすることでユーザへ提示されてもよい（換言すると、画像情報の出力方法は特に限定されない）。
　（制御部１５０）
　制御部１５０は、蛍光顕微鏡装置１００が行う処理全般を統括的に制御する構成である。例えば、制御部１５０は、操作部１６０を介して行われるユーザによる操作入力に基づいて、上記で説明したような各種処理（例えば、蛍光染色標本６０の撮像処理、褪色補正処理、蛍光分子数（または蛍光分子に結合している抗体数）の算出処理、画像情報の生成処理、および画像情報の表示処理など）の開始や終了などを制御する。なお、制御部１５０の制御内容はこれらの処理に限定されない。例えば、制御部１５０は、汎用コンピュータ、PC、タブレットPCなどにおいて一般的に行われる処理（例えば、OS(Operating　System)に関する処理）を制御してもよい。
　（操作部１６０）
　操作部１６０は、ユーザからの操作入力を受ける構成である。より具体的には、操作部１６０は、キーボード、マウス、ボタン、タッチパネル、またはマイクロホンなどの各種入力手段を備えており、ユーザはこれらの入力手段を操作することで蛍光顕微鏡装置１００に対して様々な入力を行うことができる。操作部１６０を介して行われた操作入力に関する情報は制御部１５０へ提供される。
　（サーバ２００）
　サーバ２００は、蛍光染色試薬４２に関する褪色係数、吸収断面積（またはモル吸光係数）、量子収率、および蛍光標識率などの情報を管理する装置である。より具体的に説明すると、サーバ２００は、試薬識別情報４１と、褪色係数、吸収断面積（またはモル吸光係数）、量子収率、および蛍光標識率などの情報を紐づけて管理する。これによって、情報取得部１１１は、蛍光染色試薬４２の試薬識別情報４１に基づいてこれらの情報をサーバ２００から取得することができる。なお、サーバ２００は、標本５０を識別可能な識別情報を用いて標本５０に関する各種情報を管理してもよい。また、サーバ２００は、実測された励起パワー密度などを含む他の情報も併せて管理してもよい。
　以上、本実施形態に係る情報処理システムの構成例について説明した。なお、図２を参照して説明した上記の構成はあくまで一例であり、本実施形態に係る情報処理システムの構成は係る例に限定されない。例えば、蛍光顕微鏡装置１００は、図２に示す構成の全てを必ずしも備えなくてもよい。また、蛍光顕微鏡装置１００の構成は、仕様や運用に応じて柔軟に変形可能である。
　１．３　蛍光顕微鏡装置の動作例
　次に、本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置の概略動作例について説明する。図３は、本実施形態に係る蛍光顕微鏡装置の概略動作例を示すフローチャートである。
　図３に示すように、本実施形態において、ステップＳ１０００では、ユーザが解析に用いる蛍光染色試薬４２および標本５０を決定する。ステップＳ１００４では、ユーザが蛍光染色試薬４２を用いて標本５０を染色することで蛍光染色標本６０を作成する。
　ステップＳ１００８では、蛍光顕微鏡装置１００の画像取得部１１２が蛍光染色標本６０を撮像することで撮像画像情報を取得する。ステップＳ１０１２では、情報取得部１１１が蛍光染色標本６０の生成に使用された蛍光染色試薬４２に付された試薬識別情報４１に基づいて褪色係数、吸収断面積、量子収率、および蛍光標識率などの試薬情報をサーバ２００から取得する。また、情報取得部１１１は、別途実測された励起パワー密度を取得する。
　ステップＳ１０１６では、補正部１３１が褪色係数、吸収断面積、および励起パワー密度などを用いて撮像画像情報における各画素の輝度を補正する（褪色補正処理が行われる）。ステップＳ１０２０では、算出部１３２が、補正後の画素毎の輝度をフォトン数に変換する。ステップＳ１０２４では、算出部１３２が、フォトン数を蛍光分子数または蛍光分子に結合している抗体数（以下、まとめて単に抗体数とも称する）に変換する。
　ステップＳ１０２８では、画像生成部１３３が蛍光分子数または蛍光分子に結合している抗体数を反映させた画像情報を生成する。ステップＳ１０３２では、表示部１４０が画像情報をディスプレイに表示することで一連の処理が終了する。
　１．３．１　輝度のフォトン数への変換処理
　ここで、図３のステップＳ１０２０にて行われる、画素毎の輝度のフォトン数への変換処理について詳細に説明する。
　画像取得部１１２は、蛍光染色標本６０の他、封入剤のみが注入されたサンプルも撮像素子によって撮像する。そして、算出部１３２は、ステップＳ１０１６において褪色補正処理が行われた蛍光染色標本６０の測定結果から、封入剤のみが注入されたサンプルの測定結果を差し引くことで測定系のバックグラウンドノイズをキャンセルすることができる。
　算出部１３２は、任意の画像処理ソフトウェアを用いることで、褪色補正処理が行われた撮像画像情報における画素毎の輝度を算出することができる。ある画素を画素Ａとすると、算出部１３２は、以下の式（１）によって画素Ａのエレクトロン数を算出する。ここで、撮像画像情報における階調は１６［ｂｉｔ］であるとする（すなわち、輝度は０～６５５３６の値をとる）。なお、式（１）では、褪色補正処理後の蛍光染色標本６０の撮像画像情報における画素Ａの輝度が「輝度１」と示されており、封入剤のみが注入されたサンプルの撮像画像情報における画素Ａの輝度が「輝度２」と示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　算出部１３２は、以下の式（２）に示すように、画素Ａのエレクトロン数を撮像素子の量子収率で除算することによって、画素Ａのフォトン数を算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、撮像画像情報における輝度は、蛍光顕微鏡の対物レンズを通して検出された蛍光に関する値であるところ、蛍光物質が発する蛍光は全方位に放出される。図４に示すように、対物レンズを通して蛍光を検出可能な範囲３０が、蛍光の放出点３２を中心とする球における円錐部分であるとし、円錐の半頂角をθとした場合について考える。空気中での対物レンズの開口数ＮＡはＮＡ＝ｓｉｎθと表される。そして、蛍光の放出点３２からの全方位に対する、対物レンズを通して蛍光を検出可能な範囲３０の割合は、対物レンズの開口数ＮＡによって以下の式（３）のように表される。そして、画素Ａで検出されたフォトン数の全方位換算は、以下の式（４）のように表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　算出部１３２は、画素Ａを含む全画素に対して以上の処理を行うことで、画素毎の蛍光強度をフォトン数へ変換する。
　１．３．２　フォトン数の蛍光分子数または抗体数への変換処理
　続いて、図３のステップＳ１０２４にて行われる、画素毎のフォトン数の蛍光分子数または抗体数への変換処理について詳細に説明する。まず、フォトン数の蛍光分子数への変換処理について説明する。
　撮像素子によって蛍光染色標本６０の撮像処理が行われる場合、ある画素Ａの蛍光分子数は、以下の式（５）および式（６）によって表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　算出部１３２は、下記の式（７）によって算出したAbs＿photon、およびサーバ２００から取得された蛍光物質の量子収率を式（６）へ入力することによって、１分子当りの放出フォトン数を算出する。その後、算出部１３２は、上記の式（４）によって算出した画素Ａで検出されたフォトン数（全方位換算）、および１分子当りの放出フォトン数を式（５）へ入力することによって、画素Ａにて検出された蛍光分子数を算出する。算出部１３２は、画素Ａを含む全画素に対して以上の処理を行うことで、画素毎のフォトン数を蛍光分子数へ変換することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　また、算出部１３２は、サーバ２００から取得された、蛍光物質の蛍光標識率を用いて以下の式（８）の演算を行うことで画素Ａにて検出された蛍光分子数を抗体数へ変換することができる。そして、算出部１３２は、画素Ａを含む全画素に対して式（８）の演算を行うことで、画素毎の抗体数を算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　ただし、図３のステップＳ１０２０及びＳ１０２４に示す工程、すなわち輝度をフォトン数へ変換した後に抗体数へ変換する処理は、例えば、励起パワーや対物レンズの開口数等の撮影条件を変化させない場合には、輝度を直接的（ただし、機差を吸収するための補正は必要）に抗体数へ変換する処理に簡略化することができる。例えば、後述において図１６及び図１７を用いて説明する動作フローのうち、図１６に示すベンダＶ１側のステップＳ６０１、Ｓ６１１及びＳ６２１で撮影条件を変化させず、且つ、図１７に示すユーザＵ側のステップＳ６４１及びＳ６５１でも撮影条件を変化させない場合、機差を吸収するように標準蛍光体１１及び２１を用いて補正された変換係数を用いることで、輝度から抗体数を直接的に取得することが可能である。
　１．４　機差要因による誤差の低減方法
　以上のような情報処理システム１では、各ユーザＵ側のコピー機器Ｃで行われる蛍光強度測定が、励起光のパワーや検出器のカップリング効率などの様々な機差要因を受けるため、蛍光輝度を定量化して正確な抗体数を得ることが難しい場合がある。そこで、以下では、このような機差要因による誤差の低減方法について説明する。なお、本説明におけるマスタ機器Ｍ１とコピー機器Ｃとの機差とは、主に、図２に例示した蛍光顕微鏡装置１００の取得部１１０における励起光のパワーや検出器のカップリング効率などの個体差により生じ得る差であってよい。
　機差要因による誤差の低減方法を説明するにあたり、まず、図１のユーザＵ側のコピー機器Ｃについて説明する。コピー機器Ｃは、蛍光輝度を正確に定量化した値（以下、定量値ともいう）を出力するために、搭載した標準蛍光体２１を測定するシーケンスと、色素スペクトルデータに付帯された標準蛍光体１１の蛍光値とを読み出し、それぞれを比較して補正して、演算部２０において色分離計算を行う。
　このコピー機器Ｃは主に、蛍光染色試薬４２（以下、単に色素ともいう）で染色された標本５０を測定する目的で使用される。測定により取得された撮像画像は、画素値を絶対値輝度とした画像データに変換される。絶対値輝度とは、コピー機器Ｃで検出できた蛍光信号を絶対値化した値である。絶対値輝度の画像データから直接的に抗体数を取得することはできない。これは、検出した蛍光輝度から抗体数へ変換するための変換係数（例えば、後述するスピルオーバ行列又は標準スペクトルに相当）が必要となるからである。
　変換係数は、例えば、抗体濃度が既知であって且つ抗体にコンジュゲートされた色素分子の平均数が既知の溶液試料を、厚さが既知のガラスチャンバ内に封入し、これを蛍光測定することで得ることができる。しかしながら、この作業は色素毎に実行する必要があり、濃度管理、撮影条件管理などが複雑であるため、ユーザＵ側がこの作業を行うのにはハードルが高いという課題がある。
　そこで、本実施形態では、ベンダＶ１側でマスタ機器Ｍ１を用いて変換係数を作成する。マスタ機器Ｍ１で作成された色素毎の変換係数は、サーバ２００を介して各コピー機器Ｃへ提供される。ただし、マスタ機器Ｍ１で作成された変換係数を単にコピー機器Ｃへ提供するだけでは、コピー機器Ｃとマスタ機器Ｍ１との機差の影響から、コピー機器Ｃにとって適切な変換係数が提供されているとは限られないため、蛍光染色標本６０の撮像画像から得られた抗体数が正しい抗体数であるとは限られない。
　そこで、本実施形態では、マスタ機器Ｍ１及びコピー機器それぞれに搭載された標準蛍光体１１及び２１を仲介することで、各コピー機器Ｃにおいて適切な変換係数を得る方法を提供する。
　なお、標準蛍光体１１及び２１は、同一の条件で励起された場合に同一の検出輝度で発光する蛍光体である。そのため、マスタ機器Ｍ１及びコピー機器それぞれにおいて同一の条件で標準蛍光体１１及び２１を励起することで測定された測定結果を用いることで、マスタ機器Ｍ１とコピー機器Ｃとの機差を要因とした誤差を低減して、抗体数の測定精度を向上することが可能となる。
　本実施形態において、ベンダＶ１側では、コピー機器Ｃに提供する変換係数を取得する際に、標準蛍光体１１の輝度情報も合わせて測定する。標準蛍光体１１の測定は、マスタ機器Ｍ１に搭載されたすべての励起照明について実施され、それぞれの励起照明で検出される蛍光輝度が絶対値で記録される。絶対値とは、例えば、分光放射輝度［ｗ／（ｓｒ＊ｍ２＊λ）］やフォトン数などであってよい。
　マスタ機器Ｍ１では、色素ごとの変換係数と標準蛍光体１１の輝度情報とが紐づけられたデータセットが生成される。変換係数は、例えば、マルチスペクトラム計測で色分離計算を行う場合は、色分離計算に用いる標準スペクトル（ここでは最小二乗法の要素ベクトルを標準スペクトルと言う）に変換係数を乗算したスペクトル様の形態で与えられてよい。
　一方、コピー機器Ｃでは、日々の品質管理（デイリーＱＣ）として１日に一回、コピー機器Ｃの立ち上げ時に、コピー機器Ｃ内に組み込まれた標準蛍光体２１が測定される。標準蛍光体２１の測定は、マスタ機器Ｍ１と同様に、コピー機器Ｃに搭載されたすべての励起照明について実施され、それぞれの励起照明で検出される蛍光輝度が絶対値で測定される。励起照明の設定強度など、標準蛍光体１１及び２１それぞれを測定する際の条件は、マスタ機器Ｍ１とコピー機器Ｃとで一致していることが望ましい。
　上述したように、標準蛍光体１１及び２１は、同一の条件で励起された場合に同一の検出輝度で発光する蛍光体である。したがって、同一条件の下で、コピー機器Ｃで取得された標準蛍光体２１の測定結果と、マスタ機器Ｍ１で取得された標準蛍光体１１の測定結果（具体的には、サーバ２００から提供された絶対値輝度情報）を例えば演算部１３０において比較することで、マスタ機器Ｍ１とコピー機器Ｃとの機差による影響の度合いを特定することが可能となる。そして、その度合いに基づいてコピー機器Ｃにおける変換係数を補正することで、機差による影響を低減させ得るため、抗体数の測定精度を向上させることが可能となる。なお、変換係数の補正は、例えば、測定結果同士の比に基づく単純な比率補正など、種々の補正手法が用いられてよい。
　１．５　誤差要因について
　ここで、マスタ機器Ｍ１とコピー機器Ｃとで誤差が生じる要因を図５～図７を用いてより詳細に説明する。図５は、本実施形態の第１例に係る蛍光顕微鏡装置に搭載され得る共焦点光学系の構成例を示す模式図である。図６は、本実施形態の第２例に係る蛍光顕微鏡装置に搭載され得る共焦点光学系の構成例を示す模式図である。図７は、図５又は図６に例示する共焦点光学系における誤差要因の例を示す図である。
　１．５．１　共焦点光学系の第１例
　図５に例示する共焦点光学系では、複数の波長の点光源３１１ａ～３１１ｃから出力されたレーザ光がダイクロイックミラー３１２ａ及び３１２ｂにより同一光軸のレーザ光Ｌ３１に合波される。レーザ光Ｌ３１は、コリメートレンズ３１３により平行光に変換された後、ダイクロイックミラー３１４でサンプルＰ１の方向へ反射される。反射されたレーザ光Ｌ３１は、対物レンズ３１５によりサンプルＰ１に点又は線で集光される。レーザ光Ｌ３１が点又は線で集光されたサンプルＰ１は励起され、蛍光Ｌ３２を放射する。サンプルＰ１から放射された蛍光Ｌ３２は、対物レンズ３１５を介することで平行光に変換された後、ダイクロイックミラー３１４を透過する。その際、サンプルＰ１で散乱して蛍光Ｌ３２と同じ方向へ進行するレーザ光Ｌ３１は、ダイクロイックミラー３１４で反射される。それにより、撮像素子３１９に入射する光からレーザ光Ｌ３１が除外される。
　ダイクロイックミラー３１４を透過した蛍光Ｌ３２は、集光レンズ３１６を介することで、１次結像面に結像される。上述のように、レーザ光Ｌ３１はサンプルＰ１に点又は線で結像されるため、１次結像面に結像される蛍光Ｌ３２の蛍光像は点又は線となる。共焦点光学系では、レーザ光Ｌ３１の集光形状（及び蛍光Ｌ３２の蛍光像の形状）に合わせた開口形状のピンホール又はスリットよりなる絞り３１７が１次結像面に配置される。それにより、レーザ光Ｌ３１の集光位置（点又は線）以外から放射した蛍光（例えば、レーザ光Ｌ３１の集光位置に対してＸ方向及び／又はＹ方向及び／又はＺ方向にずれた位置からの背景蛍光）が絞り３１７で排除されるため、撮像素子３１９においてコントラストの高い蛍光像を取得することができる。
　絞り３１７を通過した蛍光Ｌ３２は、リレー光学系３１８ａ及び３１８ｂを介した後、撮像素子３１９の受光面に結像され、撮像素子３１９によりその蛍光輝度が検出される。蛍光顕微鏡装置では、以上のような集光形状が点又は線のレーザ光Ｌ３１でサンプルＰ１が走査されることで、サンプルＰ１の全体又は一部の領域の輝度画像が生成される。
　１．５．２　共焦点光学系の第２例
　一方、図６に例示する共焦点光学系では、異軸平行に配置された波長の異なる複数のライン照明をサンプルＰ２に照射する励起部４１０と、病理標本を支持するステージ４２０と、ライン状に励起された病理標本の蛍光スペクトル（分光データ）を取得する分光イメージング部４３０と、観察光学系４４０と、非蛍光観察部４７０とを有する。ここで、異軸平行とは、複数のライン照明が異軸かつ平行であることをいう。異軸とは、同軸上にないことをいい、軸間の距離は特に限定されない。平行とは、厳密な意味での平行に限られず、ほぼ平行である状態も含む。例えば、レンズ等の光学系由来のディストーションや製造公差による平行状態からの逸脱があってもよく、この場合も平行とみなす。
　励起部４１０は、複数（本例では４つ）の励起光源４０１，４０２，４０３，４０４を有する。各励起光源４０１～４０４は、波長がそれぞれ４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ及び６４５ｎｍのレーザ光を出力するレーザ光源で構成される。
　励起部４１０は、各励起光源４０１～４０４に対応するように複数のコリメータレンズ４１１及びレーザラインフィルタ４１２と、ダイクロイックミラー４１３ａ，４１３ｂ，４１３ｃと、ホモジナイザ４１４と、コンデンサレンズ４１５と、入射スリット４１６とをさらに有する。
　励起光源４０１から出射されるレーザ光と励起光源４０３から出射されるレーザ光は、それぞれコリメータレンズ４１１によって平行光になった後、各々の波長帯域の裾野をカットするためのレーザラインフィルタ４１２を透過し、ダイクロイックミラー４１３ａによって同軸にされる。同軸化された２つのレーザ光は、さらに、ライン照明Ｅｘ１となるべくフライアイレンズなどのホモジナイザ４１４とコンデンサレンズ４１５によってビーム成形される。
　励起光源４０２から出射されるレーザ光と励起光源４０４から出射されるレーザ光も同様にダイクロイックミラー４１３ｂ，４１３ｃによって同軸化され、ライン照明Ｅｘ１とは異軸のライン照明Ｅｘ２となるようにライン照明化される。ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２は、各々が通過可能な複数のスリット部を有する入射スリット４１６（スリット共役）においてΔｙだけ離れた異軸ライン照明（１次像）を形成する。
　この１次像は、観察光学系４４０を介してステージ４２０上のサンプルＰ２に照射される。観察光学系４４０は、コンデンサレンズ４４１と、ダイクロイックミラー４４２，４４３と、対物レンズ４４４と、バンドパスフィルタ４４５と、コンデンサレンズ４４６とを有する。ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２は、対物レンズ４４４と対になったコンデンサレンズ４４１で平行光にされ、ダイクロイックミラー４４２，４４３を反射して対物レンズ４４４を透過し、サンプルＰ２に照射される。
　ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２によって励起された蛍光は、対物レンズ４４４によって集光され、ダイクロイックミラー４４３を反射し、ダイクロイックミラー４４２及び励起光をカットするバンドパスフィルタ４４５を透過し、コンデンサレンズ４４６で再び集光されて、分光イメージング部４３０へ入射する。
　分光イメージング部４３０は、観測スリット４３１と、撮像素子４３２（４３２ａ，４３２ｂ）と、第１プリズム４３３と、ミラー４３４と、回折格子４３５（波長分散素子）と、第２プリズム４３６とを有する。
　観測スリット４３１は、コンデンサレンズ４４６の集光点に配置され、励起ライン数と同じ数のスリット部を有する。観測スリット４３１を通過した２つの励起ライン由来の蛍光スペクトルは、第１プリズム４３３で分離され、それぞれミラー４３４を介して回折格子４３５の格子面で反射することにより、励起波長各々の蛍光スペクトルにさらに分離される。このようにして分離された４つの蛍光スペクトルは、ミラー４３４及び第２プリズム４３６を介して撮像素子４３２ａ，４３２ｂに入射し、分光データとして（ｘ、λ）情報に展開される。
　撮像素子４３２ａ，４３２ｂの画素サイズ（ｎｍ／Pixel）は特に限定されず、例えば、２ｎｍ以上２０ｎｍ以下に設定される。この分散値は、回折格子４３５のピッチや光学的に実現しても良いし、撮像素子４３２ａ，４３２ｂのハードウェアビニングをつかって実現しても良い。
　ステージ４２０は、Ｘ－Ｙステージを構成し、サンプルＰ２の蛍光画像を取得するため、サンプルＰ２をＸ軸方向及びＹ軸方向へ移動させる。サンプルＰ２の全体像を撮像するＷＳＩ（Whole　slide　imaging）では、Ｙ軸方向にサンプルＰ２をスキャンし、その後、Ｘ軸方向に移動し、さらにＹ軸方向へのスキャンを行うといった動作が繰り返される。
　非蛍光観察部４７０は、光源４７１、ダイクロイックミラー４４３、対物レンズ４４４、コンデンサレンズ４７２、撮像素子４７３などにより構成される。非蛍光観察系においては、図６では、暗視野照明による観察系を示している。
　光源４７１は、ステージ４２０の下方に配置され、ステージ４２０上のサンプルＰ２に対して、ライン照明Ｅｘ１，Ｅｘ２とは反対側から照明光を照射する。暗視野照明の場合、光源４７１は、対物レンズ４４４のＮＡ（開口数）の外側から照明し、サンプルＰ２で回折した光（暗視野像）を対物レンズ４４４、ダイクロイックミラー４４３及びコンデンサレンズ４７２を介して撮像素子４７３で撮影する。暗視野照明を用いることで、蛍光染色サンプルのような一見透明なサンプルであってもコントラストを付けて観察することができる。
　なお、この暗視野像を蛍光と同時に観察して、リアルタイムのフォーカスに使ってもよい。この場合、照明波長は、蛍光観察に影響のない波長を選択すればよい。非蛍光観察部４７０は、暗視野画像を取得する観察系に限られず、明視野画像、位相差画像、位相像、インラインホログラム（In-line　hologram）画像などの非蛍光画像を取得可能な観察系で構成されてもよい。例えば、非蛍光画像の取得方法として、シュリーレン法、位相差コントラスト法、偏光観察法、落射照明法などの種々の観察法が採用可能である。照明用光源の位置もステージの下方に限られず、ステージの上方や対物レンズの周りにあってもよい。また、リアルタイムでフォーカス制御を行う方式だけでなく、あらかじめフォーカス座標（Ｚ座標）を記録しておくプレフォーカスマップ方式等の他の方式が採用されてもよい。
　１．５．３　誤差要因の例
　以上のような、第１例又は第２例に係る共焦点光学系で定量値を取得することを考えた場合、図７に例示するような誤差要因が考えられる。まず、画像取得部１１２で取得される輝度画像は、サンプルから放射した蛍光を検出するための検出光学系の効率（レンズ透過率など、分光光学系の場合はフィルタ透過率や回折格子の回折効率など）、集光効率（検出対物レンズの開口数ＮＡやレンズ収差性能、リレー倍率、レンズビネッティングなど）、センサ分光感度特性（物理特性、設定露光時間、ゲインなど）などのパラメータで変化する。
　しかしながら、励起光の状態とは独立に考えることができるので、サンプル面にサンプルの代わりに分光放射輝度が既知の標準光源（ハロゲンランプなどに値付けされた光源）を設置することで、上記のパラメータは校正が可能である。
　しかしながら、励起光のパワー密度（励起光毎のフォーカスや収差など）、レーザ照明の座標と設置したピンホールの位置ズレなどのパラメータは、検出される蛍光輝度に影響を与えるが、ハロゲンランプなどのような蛍光ではない自発光の標準光源では校正することができない。先に述べた位置ズレは部品個々の製造バラつき、組立誤差、設置環境温度による部品ドリフトなどの影響を受け日々値が変動する可能性がある。
　そこで本実施形態では、以上のような標準光源では構成することができないパラメータを構成するために、以下に詳述する標準蛍光体１１，２１を導入することとした。
　１．６　標準蛍光体の例
　図８は、本実施形態に係る標準蛍光体の一例を示す図であり、（ａ）は標準蛍光体を光の入射方向から見た上視図を示し、（ｂ）は標準蛍光体を側方から見た側視図を示す。また、図９は、図８における領域Ａの拡大図である。なお、以下で説明する標準蛍光体５００は、標準蛍光体１１及び２１の双方に適用されてよい。
　図８及び図９に示すように、標準蛍光体５００は、カバーガラス層５０２と保持ガラス層５０３との間に均一に蛍光層５０１が封止された積層構造を備える。本例では、カバーガラス層５０２の厚さを例えば１７０μｍ（マイクロメートル）とし、保持ガラス層５０３の厚さを例えば１０００μｍとしているが、これらに限定されず、種々変形されてよい。また、図９では、蛍光層５０１の厚さを２０μｍとしているが、これに限定されるものではない。
　蛍光層５０１には、例えば、同一強度の励起光に対して均一に発光し且つ退色の少ない安定した蛍光ガラス等の固体材料を用いることが可能である。この蛍光層５０１は、例えば表裏面が研磨されることで、その厚さが規定されている。また、蛍光層５０１の材料には、使用する励起波長に対して感度のある材料が適宜選択されてよい。
　ここで、一般的には、生物顕微鏡用の対物レンズはカバーガラスを考慮した設計がなされており、特に開口数ＮＡが高い対物レンズにおいてはカバーガラスの有無で照明の集光性能に大きな差が生じる。図１０は、カバーガラスの有無による取得輝度の違いを示す図である。図１１は、蛍光層に対して対物レンズをＺ方向に移動させながら取得した蛍光輝度を示すグラフである。図１０及び図１１に示すように、輝度及びその特性ともにカバーガラスの有無で差が生じ、カバーガラス有りの方が実際のサンプル撮影環境に近い条件で撮影されていることが分かる。
　また、蛍光層５０１は、実測するサンプル厚に対して、その特性を失わない程度に類似の厚さとすることが望ましい。例えば、ミクロトームによる薄切で成形される試料スライドの厚さが４μｍであるとすると、蛍光層５０１の厚さは２０μｍ程度以下であることが好ましい。図１２～図１４は、蛍光層５０１の厚さｔを４μｍ、２０μｍ、８０μｍとした場合の励起ライン照明に対する蛍光強度分布を示す図である。また、図１５は、図１２～図１４それぞれのＡ－Ａ’断面の光強度プロファイルを示すグラフである。なお、励起光源には、波長４０５ｎｍ（ナノメートル）の同じレーザ光源を使用した。
　図１２～図１５を参照すると分かるように、蛍光層５０１の厚さの違いによって観察される蛍光強度分布が異なることが分かる。例えば、図１２に示す厚さｔ＝４μｍの場合に対し、図１４に示す厚さｔ＝８０μｍの場合は、蛍光の線幅が明らかに太くなっている。これは、試料スライドの厚さを４μｍとする場合に蛍光層５０１の厚さが８０μｍの標準蛍光体５００を用いて変換係数を取得すると、厚さの違いを考慮した補正後の誤差が大きくなり、正しい抗体数を求めることができない可能性があることを示している。
　１．７　動作例
　次に、本実施形態に係る情報処理システム１の動作例について説明する。本説明では、複数の励起波長があり、マルチ蛍光スペクトル撮影を実施する場合を想定する。なお、標本５０が複数の色素で染色されている場合などでは、測定された輝度画像を各励起光や検出フィルタの検出特性等を記録したスピルオーバ行列又は標準スペクトル（以下、これらをまとめて標準スペクトルと称する）を用いて色分離することで、色素の分別性能を向上できることが知られている。そこで、以下の説明では、測定された輝度画像を最小二乗法などを用いた色分離計算により色分離した上で抗体数を出力する場合について例を挙げて説明する。
　通常、標準スペクトルは、ユーザＵ側において単一の色素で染色した試料スライドを作成し、これをコピー機器Ｃで測定する方法にて作成される。この作成過程において、濃度既知の色素試料などを用いることで、蛍光輝度から抗体数へ変換することが可能になる。しかしながら、この作業は色素毎に実行する必要があり、濃度管理、撮影条件管理などが複雑であるため、ユーザＵ側において実行するのにはハードルが高いという課題がある。
　そこで、本実施形態では、ベンダＶ１側において、マスタ機器Ｍ１を用いて、スピルオーバ行列及び／又は標準スペクトルを作成し、各ユーザＵ側において、ベンダＶ１側で作成されたスピルオーバ行列及び／又は標準スペクトルを機差に応じて補正して使用する。
　１．７．１　ベンダＶ１側の動作例
　図１６は、本実施形態に係るベンダ側において実行される動作例を示すフローチャートである。なお、上述したように、ベンダＶ１側では、標準スペクトルの作成が実行される。
　図１６に示すように、ベンダＶ１側におけるスピルオーバ行列及び／又は標準スペクトルの作成では、色素チャンバ測定Ｓ６００と、バックグラウンド（ＢＧ）測定Ｓ６１０と、標準蛍光体測定Ｓ６２０と、色素情報生成Ｓ６３０とが実行される。
　（色素チャンバ測定Ｓ６００）
　色素チャンバ測定Ｓ６００では、まず、マスタ機器Ｍ１において、ユーザＵ側で染色に使用する色素が濃度をコントロールした状態で封入された色素チャンバ１２の撮影（ステップＳ６０１）が実行され、それにより取得された輝度画像に対して演算部１０がスペクトル校正（ステップＳ６０２）を実行することで、ユーザＵ側で染色に使用する色素の分光放射輝度スペクトル（輝度データともいう）６０３が取得される。なお、取得された分光放射輝度スペクトル６０３には、演算部１０において空間平均処理（Ｓ６０４）が実行される。
　（バックグラウンド測定Ｓ６１０）
　バックグラウンド測定Ｓ６１０では、同じくマスタ機器Ｍ１において、色素の入っていないサンプル（バックグラウンド用サンプル）の撮影（ステップＳ６１１）が実行され、それにより取得された輝度画像に対して演算部１０がスペクトル校正（ステップＳ６１２）を実行することで、バックグラウンド用サンプルの分光放射輝度スペクトル６１３が取得される。なお、取得された分光放射輝度スペクトル６１３には、演算部１０において空間平均処理（Ｓ６１４）が実行される。
　（標準蛍光体測定Ｓ６２０）
　標準蛍光体測定Ｓ６２０では、同じくマスタ機器Ｍ１において、標準蛍光体１１の撮影（ステップＳ６２１）が実行され、それにより取得された輝度画像に対して演算部１０がスペクトル校正（ステップＳ６２２）を実行することで、標準蛍光体１１の分光放射輝度スペクトル６２３が取得される。なお、取得された分光放射輝度スペクトル６２３には、演算部１０において空間平均処理（Ｓ６２４）が実行される。
　また、標準蛍光体１１の撮影（ステップＳ６２１）では、標準蛍光体１１に対して取得輝度が最大（図１１に示すグラフにおけるピーク）となるように、Ｚ軸のフォーカスを合わせて輝度（分光放射輝度）が取得される。この標準蛍光体測定Ｓ６２０で取得される輝度画像は、１励起につき少なくとも１つである。したがって、例えば３励起の場合では、３つ以上の輝度画像が取得される。
　（色素情報生成Ｓ６３０）
　色素情報生成Ｓ６３０では、演算部１０が、色素チャンバ測定Ｓ６００で取得された分光放射輝度スペクトル６０３からバックグラウンド測定Ｓ６１０で取得された分光放射輝度スペクトル６１３の減算（ステップＳ６３１）を実行することで、ユーザＵ側で染色に使用する色素のより正確な分光放射輝度スペクトル６０３が生成される。なお、このバックグランドの減算処理（ステップＳ６３１）は、空間平均処理（Ｓ６０３、Ｓ６１３）の実行前であってもよいし後であってもよい。
　次に、演算部１０が、分光放射輝度スペクトル６０３に抗体数化係数を乗算することで、最終的な標準スペクトル６３３を取得する（ステップＳ６３２）。
　ここで、抗体数化係数は、次の式（９）で表すことができる。式（９）において、厚さ補正系素は、色素チャンバ１２の厚さと実際のサンプル（標本５０又は蛍光染色標本６０）の厚さとの違いにより生じる輝度値の差を補正するための補正値である。この抗体数化係数は、例えば、実測や理論計算等により予め算出されてよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　このようにして得られた標準スペクトル６３３は、コピー機器Ｃ側において取得された色素（蛍光染色標本６０）の分光放射輝度スペクトルの色分離（最小二乗法）に使用される。標準スペクトル６３３を用いて色分離を実行することで、ユーザＵが実際に使用した色素の分光放射輝度スペクトルを抗体数濃度の次元に変換することが可能となる。
　次に、演算部１０は、ステップＳ６３２で取得した標準スペクトル６３３と、標準蛍光体測定Ｓ６２０で取得した標準蛍光体１１の分光放射輝度スペクトル６２３とをまとめたデータセットを作成する。作成されたデータセットは、色素情報としてサーバ２００にアップロードされ、適宜、コピー機器Ｃへ提供される。なお、データフォーマットには、マスタ機器Ｍ１において使用した励起光の強度や撮影パラメータ（露光時間、ゲイン）などのパラメータが含まれてもよい。
　１．７．２　ユーザＵ側の動作例
　図１７は、本実施形態に係るユーザ側において実行される動作例を示すフローチャートである。
　図１７に示すように、ユーザＵ側では、標準蛍光体測定Ｓ６４０と、サンプル測定Ｓ６５０と、抗体数算出Ｓ６６０とが実行される。
　（標準蛍光体測定Ｓ６４０）
　標準蛍光体測定Ｓ６４０では、ベンダＶ１側の標準蛍光体測定Ｓ６２０と同様に、コピー機器Ｃにおいて、デイリーＱＣとして、標準蛍光体２１の撮影（ステップＳ６４１）が実行され、それにより取得された輝度画像に対して演算部２０がスペクトル校正（ステップＳ６４２）を実行することで、標準蛍光体２１の分光放射輝度スペクトル６４３が取得される。なお、取得された分光放射輝度スペクトル６４３には、演算部２０において波長平均処理及び空間平均処理（Ｓ６４４）が実行される。
　標準蛍光体２１の分光放射輝度スペクトル６４３は、ＸＹλ空間の３次元データである。Ｙ方向にスキャンした場合では、シェーディングはＸ方向の１次元データとなる。そこで、ステップＳ６４４の波長平均処理及び空間平均処理では、まず、分光放射輝度スペクトル６４３をλ方向に平均化（２次元化）した後、さらにＹ方向に平均化（１次元化）することで、１次元のデータに変換する。例えば、１次元データの中心（例えば輝度画像の画素数が２０００画素である場合には、１０００番目の画素）の輝度データは、ステップＳ６６１のパッキング補正で使用される係数として用いられてよい。また、シェーディング補正係数６４５は、上記１次元データを正規化して、逆数にすることで求めることができる。後述するサンプル測定Ｓ６５０により取得される分光放射輝度スペクトル６５４の励起光ごとの輝度ムラを補正するためのシェーディング補正係数６４５が取得されてもよい。なお、シェーディング補正係数とは、像中心から外周部に向かって励起光の照明輝度が落ちることで生じる輝度ムラを補正するための係数であってよい。
　（サンプル測定Ｓ６５０）
　サンプル測定Ｓ６５０では、コピー機器Ｃにおいて、例えば、蛍光染色試薬４２として使用する１以上の色素（これを色素＃１～＃ｎとする）を用いて染色された標本５０（蛍光染色標本６０（サンプル））の撮影（ステップＳ６５１）が実行され、それにより取得された輝度画像に対して演算部２０がスペクトル校正（ステップＳ６５２）を実行することで、色素＃１～＃ｎそれぞれの分光放射輝度スペクトル６５３が取得される。
　ステップＳ６５１のサンプル撮影では、全励起光を用いて撮影が行われる。したがって、サンプル測定Ｓ６５０により得られる分光放射輝度スペクトルは、図１８に示すような、励起光ごとの分光放射輝度スペクトルが波長方向に連結され一連のマルチスペクトルデータとなる。なお、図１８には、励起光Ｌ１１～Ｌ１３の３種類の励起光を用いた場合に取得される分光放射輝度スペクトルが示されている。
　（抗体数算出Ｓ６６０）
　抗体数算出Ｓ６６０では、まず、パッキング補正Ｓ６６１と、シェーディング補正Ｓ６６３とが実行される。
　パッキング補正Ｓ６６１では、演算部２０は、標本５０の染色に使用した色素＃１～＃ｎの色素情報（説明の簡略化のため、色素情報＃１～＃ｎとする）をサーバ２００から取得する。つづいて、演算部２０は、取得された色素情報＃１～＃ｎそれぞれにおける標準蛍光体１１の分光放射輝度スペクトル６２４と、標準蛍光体測定Ｓ６４０により取得された標準蛍光体２１の分光放射輝度スペクトル６４３とを比較し、両者の値が異なる場合、分光放射輝度スペクトル６２４と分光放射輝度スペクトル６４３との比に基づき、以下の式（１０）を用いて、色素情報＃１～＃ｎそれぞれの標準スペクトル６３３を補正する。なお、式（１０）において、補正後の標準スペクトル６３３を補正後標準スペクトルと称し、ユーザＵ側の標準蛍光体測定Ｓ６４０により取得された標準蛍光体２１の分光放射輝度スペクトル６４３をコピー機器側分光放射輝度スペクトルと称し、ベンダＶ１側の標準蛍光体測定Ｓ６２０により取得された標準蛍光体１１の分光放射輝度スペクトル６２３をマスタ機器側分光放射輝度スペクトルと称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　一方、シェーディング補正Ｓ６６３では、サンプル測定Ｓ６５０により取得された色素＃１～＃ｎそれぞれの分光放射輝度スペクトル６５３が、標準蛍光体測定Ｓ６４０により取得されたシェーディング補正係数を用いて補正される。なお、シェーディング補正Ｓ６６３は必須ではなく、省略されてもよい。その場合、空間平均処理Ｓ６４４におけるシェーディング補正係数６４５の取得が省略されてよい。
　以上のように、ベンダＶ１側で取得された色素＃１～＃ｎごとの標準スペクトル６３３の補正（及び色素＃１～＃ｎそれぞれの分光放射輝度スペクトル６５３のシェーディング補正）が完了すると、次に、演算部２０は、色素＃１～＃ｎごとの分光放射輝度スペクトル６５３を、例えば補正後標準スペクトル６６２を用いた最小二乗法により色分離する（ステップＳ６６４）。それにより、ユーザＵ側において、実際に使用した色素＃１～＃Ｎごとの抗体数のイメージデータ（係数画像又は抗体数濃度イメージともいう）が出力データ６６５（図１における定量値データ２３に相当）として生成される。
　１．８　まとめ
　以上のように、本実施形態では、ベンダＶ１側においてマスタ機器Ｍ１を用いて作成された標準スペクトル６３３が、同じくマスタ機器Ｍ１を用いて標準蛍光体１１から測定された分光放射輝度スペクトル６２３と、ユーザＵ側においてコピー機器Ｃを用いて標準蛍光体２１から測定された分光放射輝度スペクトル６４３とに基づいて補正される。この補正は、デイリーＱＣとして、ユーザＵにおいて毎日実行されてよい。このように、デイリーＱＣとして、標準蛍光体２１を測定して標準スペクトル６３３６３３を補正するシーケンスを行うことで、装置機差、経時変化による測定精度の低下を抑制することが可能となる。それにより、コピー機器Ｃにおいて測定されたサンプルの蛍光輝度から正しく抗体数を取得することが可能となる。その結果、ユーザＵ側では、係数画像（抗体数濃度イメージ）から組織に発現したマーカの量を定量的に評価することが可能となるため、より高精度な病理診断、強いてはより適した治療法の選択を行うことが可能となる。
　例えば、特開２０１３－１１５２７号公報には、蛍光顕微鏡により計測標本の蛍光画像を取得し、その取得した蛍光画像から検量線を用いて蛍光物質を定量する蛍光顕微鏡システムが開示されている。しかしながら、これは蛍光物質の検量線測定から定量を行う方法であり、蛍光輝度の絶対値から蛍光分子数を同定する本手法とは異なる。また、検量線測定のために複数のサンプル取得をユーザが行う必要があり、信頼性は高いが手間が多い点が問題である。一方、本実施形態は、定量蛍光体を用いて装置の測定値を管理することで、撮影データを直接的に分子数に変換することが可能であるので、簡便である。
　また、例えば、特許第３７０６３６７号公報には、溶解蛍光体を封入した基準デバイスを用いて、共焦点レーザ走査顕微鏡の性能を評価する方法が開示されている。しかしながら、本従来技術では、ユーザが使用の直前にサンプルを準備して測定する必要があるが、使用する蛍光体自体は退色を生じる材料であることから、ユーザの作業を減らした簡便な定量化を実現できない。一方の本実施形態の蛍光標準体は、無機物質である蛍光ガラスを用いる点が異なる。また本実施形態は予め装置に組み込まれている点が異なる。また、本実施形態の標準蛍光体は、退色が極めて発生し難く安定であり、ムラが少ないことを特徴としており、装置に組み込まれていることから、ユーザは特に意識せず、抗体数に変換した画像を取得可能である。
　１．９　変形例
　上述した実施形態では、マスタ機器Ｍ１で取得された分光放射輝度スペクトル６２３と、コピー機器Ｃで取得された分光放射輝度スペクトル６４３との比に基づいて、マスタ機器Ｍ１を用いて作成された標準スペクトル６３３が補正される場合を例示したが、これに限定されない。例えば、マスタ機器Ｍ１で取得された分光放射輝度スペクトル６２３と、コピー機器Ｃで取得された分光放射輝度スペクトル６４３との比に基づいて、コピー機器Ｃを用いて取得された色素＃１～＃ｎごとの分光放射輝度スペクトル６５３が補正されてもよい。その場合でも、上述した実施形態と同様に、装置機差、経時変化による測定精度の低下を抑制することが可能となため、ユーザＵ側において、係数画像（抗体数濃度イメージ）から組織に発現したマーカの量を定量的に評価することが可能となる。
　また、ユーザＵ側の標準蛍光体測定Ｓ６４０で取得された分光放射輝度スペクトル６４３を例えばサーバ２００等で蓄積しておき、日々の測定値を監視することで、ユーザＵ側のコピー機器Ｃにおいて生じたアライメントずれやイメージセンサの劣化などの異常を検知することが可能となる。その場合、異常が検知されたコピー機器ＣのユーザＵに対して、メンテナンスなどのアフターサービスをベンダＶ１側から積極的に提供することが可能となる。
　２．システム構成例
　次に、上述した実施形態に係る情報処理システム１の構成例について説明する。図１９は、上述した実施形態に係る情報処理システムの第１のシステム構成例を示す模式図である。
　図１９に示すように、サーバ２００と、ベンダＶ１側のマスタ機器Ｍ１と、各ユーザＵ側のコピー機器Ｃとは、インターネットや移動通信システムや専用回線等のネットワーク２１０を介して相互に通信可能に接続される。
　このようなシステム構成では、全てのコピー機器Ｃから単一のサーバ２００に一斉にアクセスした場合、アップロードやダウンロードのコストが大きくなり、サーバ２００にかかる負荷やネットワークトラフィックが膨大になってしまう場合がある。そこで、同図に示すように、各ユーザＵ側にあるサーバ２００Ａがサーバ２００の代わりとして用いられてもよい。その場合、サーバ２００に保管される色素情報は、必要に応じて各ユーザＵ側のサーバ２００Ａにダウンロードされてよい。
　また、図２０に示すように、ネットワーク２１０上にサーバ２００として機能する複数のサーバ２００－１、２００－２を配置し、サーバ２００－１がプライマリサーバとして動作することで、コピー機器Ｃからの要求に応じて色素情報を送信し、プライマリサーバ２００－１に過剰の負荷がかかった場合に、他のサーバ２００－２がセカンダリサーバとして動作することで、コピー機器Ｃからの要求に応じて色素情報を送信するように構成されてもよい。
　３．ハードウエア構成
　上述してきた実施形態及びその変形例並びに応用例に係る蛍光顕微鏡装置１００の少なくとも一部（例えば、演算部１０／２０）は、例えば図２１に示すような構成のコンピュータ１０００によって実現され得る。図２１は、蛍光顕微鏡装置１００の少なくとも一部（例えば、演算部１０／２０）の機能を実現するコンピュータ１０００の一例を示すハードウエア構成図である。コンピュータ１０００は、ＣＰＵ１１００、ＲＡＭ１２００、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）１３００、ＨＤＤ（Hard　Disk　Drive）１４００、通信インタフェース１５００、及び入出力インタフェース１６００を有する。コンピュータ１０００の各部は、バス１０５０によって接続される。
　ＣＰＵ１１００は、ＲＯＭ１３００又はＨＤＤ１４００に格納されたプログラムに基づいて動作し、各部の制御を行う。例えば、ＣＰＵ１１００は、ＲＯＭ１３００又はＨＤＤ１４００に格納されたプログラムをＲＡＭ１２００に展開し、各種プログラムに対応した処理を実行する。
　ＲＯＭ１３００は、コンピュータ１０００の起動時にＣＰＵ１１００によって実行されるＢＩＯＳ（Basic　Input　Output　System）等のブートプログラムや、コンピュータ１０００のハードウエアに依存するプログラム等を格納する。
　ＨＤＤ１４００は、ＣＰＵ１１００によって実行されるプログラム、及び、かかるプログラムによって使用されるデータ等を非一時的に記録する、コンピュータが読み取り可能な記録媒体である。具体的には、ＨＤＤ１４００は、プログラムデータ１４５０の一例である本開示に係る各動作を実行するためのプログラムを記録する記録媒体である。
　通信インタフェース１５００は、コンピュータ１０００が外部ネットワーク１５５０（例えばインターネット）と接続するためのインタフェースである。例えば、ＣＰＵ１１００は、通信インタフェース１５００を介して、他の機器からデータを受信したり、ＣＰＵ１１００が生成したデータを他の機器へ送信したりする。
　入出力インタフェース１６００は、上述したＩ／Ｆ部１８を含む構成であり、入出力デバイス１６５０とコンピュータ１０００とを接続するためのインタフェースである。例えば、ＣＰＵ１１００は、入出力インタフェース１６００を介して、キーボードやマウス等の入力デバイスからデータを受信する。また、ＣＰＵ１１００は、入出力インタフェース１６００を介して、ディスプレイやスピーカやプリンタ等の出力デバイスにデータを送信する。また、入出力インタフェース１６００は、所定の記録媒体（メディア）に記録されたプログラム等を読み取るメディアインタフェースとして機能してもよい。メディアとは、例えばＤＶＤ（Digital　Versatile　Disc）、ＰＤ（Phase　change　rewritable　Disk）等の光学記録媒体、ＭＯ（Magneto-Optical　disk）等の光磁気記録媒体、テープ媒体、磁気記録媒体、または半導体メモリ等である。
　例えば、コンピュータ１０００が上述の実施形態に係る蛍光顕微鏡装置１００の少なくとも一部（例えば、演算部１０／２０）として機能する場合、コンピュータ１０００のＣＰＵ１１００は、ＲＡＭ１２００上にロードされたプログラムを実行することにより、蛍光顕微鏡装置１００の少なくとも一部（例えば、演算部１０／２０）の機能を実現する。また、ＨＤＤ１４００には、本開示に係るプログラム等が格納される。なお、ＣＰＵ１１００は、プログラムデータ１４５０をＨＤＤ１４００から読み取って実行するが、他の例として、外部ネットワーク１５５０を介して、他の装置からこれらのプログラムを取得してもよい。
　以上、添付図面を参照しながら本開示の好適な実施形態について詳細に説明したが、本開示の技術的範囲はかかる例に限定されない。本開示の技術分野における通常の知識を有する者であれば、請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において、各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、これらについても、当然に本開示の技術的範囲に属するものと了解される。
　また、本明細書に記載された効果は、あくまで説明的または例示的なものであって限定的ではない。つまり、本開示に係る技術は、上記の効果とともに、または上記の効果に代えて、本明細書の記載から当業者には明らかな他の効果を奏しうる。
　なお、以下のような構成も本開示の技術的範囲に属する。
（１）
　濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得する第１輝度データ取得部と、
　前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する係数取得部と、
　前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得する第２輝度データ取得部と、
　前記第１輝度データ取得部と前記第２輝度データ取得部との機差に基づいて前記変換係数を補正する係数補正部と、
　補正後の前記変換係数に基づいて前記第２輝度データから前記第２色素の数を算出する抗体数算出部と、
　を備える情報処理システム。
（２）
　前記第１輝度データ取得部は、第１蛍光体に第３励起光を照射することで前記第１蛍光体から放射した蛍光の第３輝度データを取得し、
　前記第２輝度データ取得部は、前記第１蛍光体と同じ構造の第２蛍光体に前記第３励起光と同じ波長の第４励起光を照射することで前記第２蛍光体から放射した蛍光の第４輝度データを取得し、
　前記係数補正部は、前記第３輝度データと前記第４輝度データとの比に基づいて前記変換係数を補正する
　前記（１）に記載の情報処理システム。
（３）
　前記第１輝度データ取得部は、色素を配置しない状態で前記第１励起光を照射することで第５輝度データを取得し、
　前記係数取得部は、前記第１輝度データから前記第５輝度データを減算することで得られた第６輝度データに基づいて前記変換係数を算出する
　前記（１）又は（２）に記載の情報処理システム。
（４）
　前記変換係数は、スピルオーバ行列又は標準スペクトルである前記（１）～（３）の何れか１つに記載の情報処理システム。
（５）
　前記第１輝度データ取得部と、前記係数取得部と、を備える第１情報処理装置と、
　前記第２輝度データ取得部と、前記係数補正部と、前記抗体数算出部と、を備える第２情報処理装置と、
　を備え、
　前記第１情報処理装置と、前記第２情報処理装置とは、所定のネットワークを介して接続されている
　前記（１）～（４）の何れか１つに記載の情報処理システム。
（６）
　前記第１情報処理装置で取得された１以上の前記第１色素ごとの前記第１輝度データ及び前記変換係数を保持するサーバをさらに備え、
　前記第１情報処理装置は、１以上の前記第１色素ごとの前記第１輝度データ及び前記変換係数を前記サーバへ送信し、
　前記第２情報処理装置は、前記サンプルの染色に使用される１以上の前記第１色素の前記第１輝度データ及び前記変換係数を前記サーバから取得する
　前記（５）に記載の情報処理システム。
（７）
　前記係数補正部は、前記第２情報処理装置の立ち上げ時に前記機差に基づいて前記変換係数を補正する前記（６）に記載の情報処理システム。
（８）
　前記第１情報処理装置は、前記第１励起光を前記第１色素に集光するとともに前記第１色素から放射した前記蛍光を前記第１輝度データ取得部の受光面に集光させる第１共焦点光学系をさらに備え、
　前記第２情報処理装置は、前記第２励起光を前記サンプルに集光するとともに前記サンプルから放射した前記蛍光を前記第２輝度データ取得部の受光面に集光させる第２共焦点光学系をさらに備え、
　前記第１共焦点光学系と前記第２共焦点光学系とは、同一構成の光学系である
　前記（５）～（７）の何れか１つに記載の情報処理システム。
（９）
　濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得する第１輝度データ取得部と、
　前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する係数取得部と、
　前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得する第２輝度データ取得部と、
　前記第１輝度データ取得部と前記第２輝度データ取得部との機差に基づいて前記第２輝度データを補正する輝度データ補正部と、
　補正後の前記第２輝度データから前記変換係数に基づいて前記第２色素の数を算出する抗体数算出部と、
　を備える情報処理システム。
（１０）
　コピー機器と所定のネットワークを介して接続されたマスタ機器において実行される情報処理方法であって、
　濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得し、
　前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する
　ことを含む情報処理方法。
（１１）
　前記（１０）に記載のマスタ機器と所定のネットワークを介して接続されたコピー機器において実行される情報処理方法であって、
　前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得し、
　前記マスタ機器と前記コピー機器との機差に基づいて前記変換係数を補正し、
　補正後の前記変換係数に基づいて前記第２輝度データから前記第２色素の数を算出する
　ことを含む情報処理方法。
（１２）
　前記（１）に記載の前記第１輝度データ取得部及び前記第２輝度データ取得部にそれぞれ搭載される蛍光体構造体であって、
　カバーガラス層と、
　保持ガラス層と、
　前記カバーガラス層と前記保持ガラス層との間に均一に封止された蛍光層と、
　を備える蛍光体構造体。
　１　情報処理システム
　１０、２０　演算部
　１１、２１　標準蛍光体
　１２　色素チャンバ
　２２　標本
　２３　定量値データ
　４１　試薬識別情報
　４２　蛍光染色試薬
　５０　標本
　６０　蛍光染色標本
　１００　蛍光顕微鏡装置
　１１０　取得部
　１１１　情報取得部
　１１２　画像取得部
　１２０　保存部
　１２１　情報保存部
　１２２　画像情報保存部
　１３０　演算部
　１３１　補正部
　１３２　算出部
　１３３　画像生成部
　１４０　表示部
　１５０　制御部
　１６０　操作部
　２００，２００Ａ　サーバ
　２００－１　プライマリサーバ
　２００－２　セカンダリサーバ
　２１０　ネットワーク
　Ｃ１、Ｃ２、…　コピー機器
　Ｍ１　マスタ機器

Claims (12)

  1. 　濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得する第１輝度データ取得部と、
    　前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する係数取得部と、
    　前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得する第２輝度データ取得部と、
    　前記第１輝度データ取得部と前記第２輝度データ取得部との機差に基づいて前記変換係数を補正する係数補正部と、
    　補正後の前記変換係数に基づいて前記第２輝度データから前記第２色素の数を算出する抗体数算出部と、
    　を備える情報処理システム。
  2. 　前記第１輝度データ取得部は、第１蛍光体に第３励起光を照射することで前記第１蛍光体から放射した蛍光の第３輝度データを取得し、
    　前記第２輝度データ取得部は、前記第１蛍光体と同じ構造の第２蛍光体に前記第３励起光と同じ波長の第４励起光を照射することで前記第２蛍光体から放射した蛍光の第４輝度データを取得し、
    　前記係数補正部は、前記第３輝度データと前記第４輝度データとの比に基づいて前記変換係数を補正する
    　請求項１に記載の情報処理システム。
  3. 　前記第１輝度データ取得部は、色素を配置しない状態で前記第１励起光を照射することで第５輝度データを取得し、
    　前記係数取得部は、前記第１輝度データから前記第５輝度データを減算することで得られた第６輝度データに基づいて前記変換係数を算出する
    　請求項１に記載の情報処理システム。
  4. 　前記変換係数は、スピルオーバ行列又は標準スペクトルである請求項１に記載の情報処理システム。
  5. 　前記第１輝度データ取得部と、前記係数取得部と、を備える第１情報処理装置と、
    　前記第２輝度データ取得部と、前記係数補正部と、前記抗体数算出部と、を備える第２情報処理装置と、
    　を備え、
    　前記第１情報処理装置と、前記第２情報処理装置とは、所定のネットワークを介して接続されている
    　請求項１に記載の情報処理システム。
  6. 　前記第１情報処理装置で取得された１以上の前記第１色素ごとの前記第１輝度データ及び前記変換係数を保持するサーバをさらに備え、
    　前記第１情報処理装置は、１以上の前記第１色素ごとの前記第１輝度データ及び前記変換係数を前記サーバへ送信し、
    　前記第２情報処理装置は、前記サンプルの染色に使用される１以上の前記第１色素の前記第１輝度データ及び前記変換係数を前記サーバから取得する
    　請求項５に記載の情報処理システム。
  7. 　前記係数補正部は、前記第２情報処理装置の立ち上げ時に前記機差に基づいて前記変換係数を補正する請求項６に記載の情報処理システム。
  8. 　前記第１情報処理装置は、前記第１励起光を前記第１色素に集光するとともに前記第１色素から放射した前記蛍光を前記第１輝度データ取得部の受光面に集光させる第１共焦点光学系をさらに備え、
    　前記第２情報処理装置は、前記第２励起光を前記サンプルに集光するとともに前記サンプルから放射した前記蛍光を前記第２輝度データ取得部の受光面に集光させる第２共焦点光学系をさらに備え、
    　前記第１共焦点光学系と前記第２共焦点光学系とは、同一構成の光学系である
    　請求項５に記載の情報処理システム。
  9. 　濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得する第１輝度データ取得部と、
    　前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する係数取得部と、
    　前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得する第２輝度データ取得部と、
    　前記第１輝度データ取得部と前記第２輝度データ取得部との機差に基づいて前記第２輝度データを補正する輝度データ補正部と、
    　補正後の前記第２輝度データから前記変換係数に基づいて前記第２色素の数を算出する抗体数算出部と、
    　を備える情報処理システム。
  10. 　コピー機器と所定のネットワークを介して接続されたマスタ機器において実行される情報処理方法であって、
    　濃度が既知の第１色素に第１励起光を照射することで前記第１色素から放射した蛍光の第１輝度データを取得し、
    　前記第１輝度データに基づいて輝度データを前記第１色素の数に変換するための変換係数を取得する
    　ことを含む情報処理方法。
  11. 　請求項１０に記載のマスタ機器と所定のネットワークを介して接続されたコピー機器において実行される情報処理方法であって、
    　前記第１色素と同じ色素である第２色素を用いて染色されたサンプルに前記第１励起光と同じ波長の第２励起光を照射することで前記サンプルから放射した蛍光の第２輝度データを取得し、
    　前記マスタ機器と前記コピー機器との機差に基づいて前記変換係数を補正し、
    　補正後の前記変換係数に基づいて前記第２輝度データから前記第２色素の数を算出する
    　ことを含む情報処理方法。
  12. 　請求項１に記載の前記第１輝度データ取得部及び前記第２輝度データ取得部にそれぞれ搭載される蛍光体構造体であって、
    　カバーガラス層と、
    　保持ガラス層と、
    　前記カバーガラス層と前記保持ガラス層との間に均一に封止された蛍光層と、
    　を備える蛍光体構造体。
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