WO2022030032A1 - 質量分析装置の機差補正方法 - Google Patents

質量分析装置の機差補正方法 Download PDF

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WO2022030032A1
WO2022030032A1 PCT/JP2021/000235 JP2021000235W WO2022030032A1 WO 2022030032 A1 WO2022030032 A1 WO 2022030032A1 JP 2021000235 W JP2021000235 W JP 2021000235W WO 2022030032 A1 WO2022030032 A1 WO 2022030032A1
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WO
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correction
peak intensity
intensity ratio
signal peak
value
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PCT/JP2021/000235
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English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 金子
達樹 大久保
倫憲 押川
裕子 小林
善樹 田井中
晃平 鈴木
隆司 西風
Original Assignee
株式会社 島津製作所
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Publication date
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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0009—Calibration of the apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a method using a peptide ratio obtained by mass spectrometry.
  • the present invention relates to a method for correcting a machine difference of a mass spectrometer and a system for correcting a machine difference of a mass spectrometer.
  • Non-Patent Documents 1, 2, and 3 the method that uses the intensity ratio of the two signal peaks is most often used. For example, a certain amount of internal standard substance is added to the sample to be compared, pretreatment is performed if necessary, and then mass spectrometry is performed on the sample to determine the intensity ratio of the peak to be measured to the peak of the internal standard substance. The calculated values are compared (Non-Patent Documents 1, 2, and 3).
  • patent documents include international publication WO2015 / 178398 (US publication US 2017/0184573), international publication WO2017 / 047529 (US publication US 2018/02389909), and the like.
  • a calibration curve of the peak intensity ratio of the standard product to the standard product is prepared by measuring a sample in which a standard product having a constant concentration and a standard product shaken to different concentrations are measured. Absolute quantification of the target substance can be performed by this calibration curve. Therefore, if a calibration curve is created for each device and each measurement, even if there is a difference in the peak intensity ratio between different devices, the unknown target substance existing in the biological sample can be quantified without being affected by it.
  • this calibration curve method requires a standard product. If it is not possible to easily synthesize a standard product, or if it is difficult in terms of time and cost to prepare and control the quality of all standard products due to the huge variety of target substances, or if the standard product is unstable, It is not possible to create a calibration curve. As mentioned above, since the peak intensity ratio changes between aircraft in the mass spectrometer, if it is not possible to create a calibration curve, it is necessary to measure the sample to be compared with one aircraft, but it is still detected by using the aircraft. It is difficult to obtain consistent data because the peak intensity ratio fluctuates due to deterioration of the device.
  • An object of the present invention is to provide a method for correcting a difference in mass spectrometry data depending on the body of the mass spectrometer, and a system for correcting the difference in the mass spectrometer.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for correcting the difference in signal intensity ratio in mass spectrometry including.
  • the present invention further includes the following inventions.
  • a measurement method creation unit that creates a calibrant measurement method for calculating correction values in a mass spectrometer, and a measurement method creation unit.
  • a correction value calculation unit that analyzes the mass spectrometry data acquired using the measurement method and calculates the correction value,
  • the machine difference correction system of the mass spectrometer including.
  • the peak intensity ratio of the substance to be analyzed can be corrected by using the correction formula obtained from the measurement result of the calibrated substance. As a result, even if the same sample is measured by different aircraft, it is possible to obtain the same peak intensity ratio.
  • IP immunoprecipitation
  • Sample No. 1 After immunoprecipitation (IP) of a plasma sample (Sample No. 1) spiked with an internal standard peptide (SIL-A ⁇ 1-38), A ⁇ and A ⁇ -related peptides were subjected to three mass spectrometers (Performance 1, 2 and 3). The result measured in is shown.
  • the vertical axis of FIG. 1 (A) shows the peak intensity ratio of each of A ⁇ or A ⁇ -related peptides to SIL-A ⁇ 1-38.
  • the vertical axis of FIG. 1B shows the peak intensity ratio of each of A ⁇ , A ⁇ -related peptide, or SIL-A ⁇ 1-38 to APP669-711.
  • the coefficient of variation (CV) between the devices of each peak intensity ratio measured by three mass spectrometers (Performance 1, 2 and 3) after IP of the plasma sample (Sample No. 1) is shown on the vertical axis.
  • the horizontal axis shows the average value measured by three mass spectrometers.
  • the vertical axis shows the logarithmic conversion value of each peak intensity ratio measured by Performance 1 (standard device) after IP of the plasma sample (Sample No. 1).
  • the value obtained by logarithmically converting each peak intensity ratio measured by Performance 2 or 3 of the same sample is shown on the horizontal axis.
  • the linear regression equation of the measured value of Performance 2 or 3 with respect to the measured value of Performance 1 (standard instrument) and the coefficient of determination (R 2 ) are shown in the figure.
  • the vertical axis shows each peak intensity ratio measured by Performance 1 (standard device) after IP of a plasma sample (Sample No. 1).
  • each peak intensity ratio of the same sample measured by Performance 2 or 3 is shown on the horizontal axis.
  • the power approximation formula of the measured value of Performance 2 or 3 with respect to the measured value of Performance 1 (standard device) and the coefficient of determination (R 2 ) are shown in the figure.
  • the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to the internal standard peptide (SIL-A ⁇ 1-38) measured by Performance 2 and Performance 3 was set to the same peak intensity ratio as Performance 1 (standard device).
  • the corrected value is shown in.
  • the vertical axis of FIG. 5 shows the peak intensity ratio of each of A ⁇ or A ⁇ -related peptides to SIL-A ⁇ 1-38.
  • the numerical value (%) in FIG. 5 indicates the coefficient of variation (CV) of the peak intensity ratio in Performance 1 (standard device), Performance 2 (Cal.) And Performance 3 (Cal.).
  • FIG. 6A shows the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to SIL-A ⁇ 1-38 measured by Performance 2 and Performance 3 before correction using the correction formula, and is shown in FIG. 6 (A).
  • B) shows the corrected peak intensity ratio.
  • Performance 2 (Cal.) And Performance 3 (Cal.) Mean the calibrated value.
  • the numerical values (%) in FIGS. 6 (A) and 6 (B) indicate the coefficient of variation (CV) of the peak intensity ratio in Performance 1 (standard device), Performance 2 (Cal.) And Performance 3 (Cal.).
  • FIG. 7A shows the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to SIL-A ⁇ 1-38 measured by Performance 2 and Performance 3 before correction using the correction formula, and is shown in FIG. 7 (A).
  • B) shows the corrected peak intensity ratio.
  • Performance 2 (Cal.) And Performance 3 (Cal.) Mean the calibrated value.
  • the numerical values (%) in FIGS. 7 (A) and 7 (B) indicate the coefficient of variation (CV) of the peak intensity ratio in Performance 1 (standard device), Performance 2 (Cal.) And Performance 3 (Cal.).
  • the results of performing IP-MS on plasma samples (Sample No. 1) divided into two days (Day 1 and Day 2) are shown.
  • the vertical axis shows the logarithmically converted value of each peak intensity ratio measured by Performance 1 (standard instrument) on each day.
  • the value obtained by logarithmically converting each peak intensity ratio measured by Performance 2 is shown on the horizontal axis.
  • the linear regression equation of the measured value of Performance 2 with respect to the measured value of Performance 1 and the coefficient of determination (R 2 ) are shown in the figure.
  • the results of performing IP-MS on plasma samples (Sample No. 1) divided into two days (Day 1 and Day 2) are shown.
  • the vertical axis shows the logarithmically converted value of each peak intensity ratio measured by Performance 1 (standard instrument) on each day.
  • FIG. 10A shows the results of Performance Unit 1 (before the detector is replaced), FIG.
  • FIG. 10B shows the results of Performance Unit 1 (after the detector is replaced), and FIG. 10C shows the results of Performance Unit 3.
  • the peak intensity ratio of each of A ⁇ or A ⁇ -related peptides to SIL-A ⁇ 1-38 acquired by IP-MS under the three conditions of Performance No. 1 and Performance No. 3 before and after the detection of the detector is shown.
  • FIG. 11A shows the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to SIL-A ⁇ 1-38 before the correction formula is used
  • FIG. 12A shows the peak intensity ratio before the correction formula is used to correct the peak intensity ratio of the biomarker
  • FIG. 12B shows the peak intensity ratio after the correction.
  • the peak intensity ratio of each of A ⁇ or A ⁇ -related peptides to SIL-A ⁇ 1-38 acquired by IP-MS under the three conditions of Performance No. 1 and Performance No. 3 before and after the detection of the detector is shown.
  • FIG. 13 (A) shows the peak intensity ratio before correcting the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to SIL-A ⁇ 1-38 using the correction formula
  • FIG. 13 (B) shows the peak intensity ratio after correction. Is shown. It was corrected by a method using a value and b value.
  • FIG. 14A shows the peak intensity ratio before the correction using the correction formula
  • FIG. 14B shows the peak intensity ratio after the correction. It was corrected by a method using a value and b value.
  • One embodiment of the method of the present invention is a method for correcting a difference in signal intensity ratio in mass spectrometry.
  • the substance to be analyzed is not particularly limited, and may include, for example, peptides, glycopeptides, sugar chains, proteins, lipids, glycolipids and the like. Peptides, glycopeptides, sugar chains, proteins, lipids and glycolipids can include various. More specifically, it may be A ⁇ and A ⁇ -related peptides. "A ⁇ and A ⁇ -related peptides” may be simply collectively referred to as "A ⁇ -related peptides”. "A ⁇ and A ⁇ -related peptides" include peptides containing at least a part of the sequences of A ⁇ and A ⁇ produced by cleavage of amyloid precursor protein (APP). In the examples, examples using A ⁇ and A ⁇ -related peptides are shown.
  • APP amyloid precursor protein
  • the peptide may be a peptide obtained by immunoprecipitation (IP).
  • IP immunoprecipitation
  • it may be a peptide produced by digestion of a protein with an enzyme such as peptidase, or a peptide fractionated by chromatography.
  • the substance to be analyzed may include an internal standard substance.
  • the internal standard substance can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • stable isotope-labeled substances may be used.
  • a stable isotope-labeled substance may be used for one of the substances to be analyzed.
  • a ⁇ 1-38 (SIL-A ⁇ 1-38) labeled with a stable isotope as an internal standard substance is shown.
  • SIL is stable isotope-labeled.
  • a sample containing the substance to be analyzed is subjected to mass spectrometry.
  • the sample to be subjected to mass spectrometry is not particularly limited, but may be, for example, a biological sample.
  • Biogenic samples include blood, cerebrospinal fluid (CSF), urine, body fluids such as saliva, and sputum; and feces.
  • Blood samples include whole blood, plasma, serum and the like. Blood samples can be prepared by appropriately treating whole blood collected from an individual. The treatment performed when preparing a blood sample from the collected whole blood is not particularly limited, and any clinically acceptable treatment may be performed. For example, centrifugation can be performed.
  • the blood sample to be subjected to mass spectrometry may be one that has been appropriately stored at a low temperature such as freezing in the middle stage of the preparation step or the post-step of the preparation step.
  • a biological sample such as a blood sample is subjected to mass spectrometry
  • the biological sample is discarded without being returned to the original subject.
  • the sample to be subjected to mass spectrometry may be a sample after various pretreatments have been performed. For example, it may be after performing an immunoprecipitation method (IP). It may be after digestion of the protein by an enzyme such as peptidase. It may be after chromatography. As the sample to be subjected to mass spectrometry, a sample to which a certain amount of an internal standard substance is added may be used.
  • IP immunoprecipitation method
  • the eluate obtained by the immunoprecipitation method may be subjected to mass spectrometry (immunoprecipitation-mass spectrometry; IP-MS).
  • the immunoprecipitation method is performed using an antibody-immobilized carrier prepared using an immunoglobulin having an antigen-binding site that can recognize the substance to be analyzed or an immunoglobulin fragment containing an antigen-binding site that can recognize the substance to be analyzed. You may.
  • immunoprecipitation may be continuously performed, and then the peptide in the sample may be detected by a mass spectrometer (cIP-MS).
  • cIP-MS mass spectrometer
  • the mass spectrometric method is not particularly limited, and includes a mass spectrometric method such as a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) mass spectrometric method and an electrospray ionization (ESI) mass spectrometric method.
  • a mass spectrometric method such as a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) mass spectrometric method and an electrospray ionization (ESI) mass spectrometric method.
  • MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption / ionization-flying time
  • MALDI-IT matrix-assisted laser desorption / ionization-ion trap
  • MALDI-IT-TOF matrix-assisted laser desorption / ionization
  • Deionization-ion trap-flight time type mass analyzer MALDI-FTICR (matrix-assisted laser desorption ionization-Fourier conversion ion cyclotron resonance) type mass analyzer, ESI-QqQ (electrospray ionization-triple quadrupole) Use a type mass analyzer, ESI-Qq-TOF (electrospray ionization-tandem quadrupole-flight time) type mass analyzer, ESI-FTICR (electrospray ionization-Fourier conversion ion cyclotron resonance) type mass analyzer, etc. Can be done.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the matrix and the matrix solvent according to the substance to be analyzed.
  • ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid CHCA
  • 2,5-dihydroxybenzoic acid 2,5-DHB
  • sinapic acid 3-aminoquinoline (3-AQ) and the like are used. Can be done.
  • the matrix solvent for example, it can be selected from the group consisting of acetonitrile (ACN), trifluoroacetic acid (TFA), methanol, ethanol and water. More specifically, an ACN-TFA aqueous solution, an ACN aqueous solution, a methanol-TFA aqueous solution, a methanol aqueous solution, an ethanol-TFA aqueous solution, an ethanol solution and the like can be used.
  • the concentration of ACN in the ACN-TFA aqueous solution can be, for example, 10 to 90% by volume, and the concentration of TFA can be, for example, 0.05 to 1% by volume, preferably 0.05 to 0.1% by volume.
  • the matrix concentration can be, for example, 0.1-50 mg / mL, preferably 0.1-20 mg / mL, or 0.3-20 mg / mL, more preferably 0.5-10 mg / mL.
  • a matrix additive (comatrix) in combination.
  • the matrix additive can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the analysis target (polypeptide) and / or the matrix.
  • a phosphonic acid group-containing compound can be used as the matrix additive.
  • phosphonic acid Phosphonic acid
  • methylphosphonic acid Metalphosphonic acid
  • phenylphosphonic acid Phenylphosphonic acid
  • 1-naphthylmethylphosphonic acid (1-Naphthylmethylphosphonic acid
  • a compound containing two or more phosphonic acid groups methylenediphosphonic acid (MDPNA), Ethylenediphosphonic acid, ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid (Ethane-1-). Hydroxy-1,1-diphosphonic acid), Nitrilotriphosphonic acid, Ethylenediaminetetraphosphonic acid and the like.
  • MDPNA methylenediphosphonic acid
  • Ethane-1- ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid
  • Hydroxy-1,1-diphosphonic acid Hydroxy-1,1-diphosphonic acid
  • Nitrilotriphosphonic acid Nitrilotriphosphonic acid
  • Ethylenediaminetetraphosphonic acid Ethylenediaminetetraphosphonic acid and the like.
  • phosphonic acid group-containing compounds a compound having 2 or more, preferably 2 to 4 phosphonic acid groups in one molecule is preferable.
  • the use of the phosphonic acid group-containing compound is useful, for example, when the metal ions of the washing solution remaining on the surface of the antibody-immobilized carrier are mixed in the eluate after the dissociation step. This metal ion adversely affects the background in mass spectrometry.
  • the use of a phosphonic acid group-containing compound has the effect of suppressing such adverse effects.
  • additives for example, substances selected from the group consisting of ammonium salts and organic bases may be used.
  • the matrix additive can be prepared in water or in a matrix solvent in a solution of 0.1 to 10 w / v%, preferably 0.2 to 4 w / v%.
  • the matrix additive solution and the matrix solution can be mixed, for example, in a volume ratio of 1: 100 to 100: 1, preferably 1:10 to 10: 1.
  • calibration substance In this embodiment, two or more calibration substances are measured by a mass spectrometer. The correction formula in the mass spectrometer is calculated using the measurement result of the calibration substance.
  • the calibration substance can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the substance to be analyzed may be used itself, or a substance different from the substance to be analyzed may be used.
  • a stable isotope-labeled substance may be used.
  • Stable isotope-labeled substances and non-stable isotope-labeled substances may be used.
  • a ⁇ and A ⁇ -related peptides may be used as the calibration substance.
  • a ⁇ 1-38 SIL-A ⁇ 1-38 labeled with a stable isotope may be used as one of the calibration substances.
  • the calibration substance may contain one compound and a compound labeled with a stable isotope.
  • a compound is ionized and detected.
  • the ionization efficiency differs depending on the compound, and the difference in the ionization efficiency affects the mass spectrometric measurement result.
  • a compound and a compound labeled with a stable isotope have the same ionization efficiency. Therefore, by using these as a calibration substance, a more accurate correction formula can be obtained.
  • a ⁇ 1-38 and A ⁇ 1-38 (SIL-A ⁇ 1-38) labeled with a stable isotope are used as calibration substances.
  • Calibrant is a solution containing a calibration substance.
  • the calibrant is a solution containing two or more calibration substances.
  • the sample itself containing the substance to be analyzed can be used. Further, it is also possible to use a sample in which the calibration substance is added to the sample itself containing the substance to be analyzed. A solution containing two or more calibration substances may be prepared and used separately from the sample itself containing the substance to be analyzed.
  • the correction formula in the mass spectrometer is calculated. Multiple data are required to calculate the correction formula. For example, when calculating the correction formula using the signal peak intensity ratio, a plurality of data having different signal peak intensity ratios are required.
  • the ratio of the signal peak intensities of the other two or more calibration substances to the signal peak intensities of one calibration substance may be calculated respectively to obtain two or more signal peak intensity ratios.
  • the peak intensity ratios of C2 / C1 and C3 / C1 are calculated with reference to C1.
  • a plurality of calibrants having different concentrations of the calibration substance for which the signal peak intensity ratio should be obtained may be used.
  • the ratio of the signal peak intensity of one calibration substance to the signal peak intensity of another calibration substance may be calculated for each calibrant to obtain two or more signal peak intensity ratios.
  • the peak intensity ratio of C2 / C1 is calculated for each of a plurality of calibrants having different concentrations.
  • a plurality of calibrants may be used in which the concentration of one calibration substance is constant and the concentration of another calibration substance is changed.
  • the concentration ratio of the calibration substance for which the signal peak intensity ratio should be calculated in the plurality of calibrants may be, for example, in the range of 1/4 to 4.
  • five types of calibrant solutions adjusted to have a concentration ratio of 1/4, 1/2, 1, 2, and 4 can also be used.
  • the correction formula in the mass spectrometer is calculated using the results of measuring two or more calibration substances with the mass spectrometer. Then, the calculated correction formula is used to correct the measurement result of the substance to be analyzed.
  • the method of correction in the present invention includes a method of correction using a correction formula with a standard device. It also includes a method of standardizing measurement results in mass spectrometry using a calibration material whose abundance is known.
  • the correction formula is calculated for each mass spectrometer. Even with the same mass spectrometer, it is preferable to calculate a new correction formula when parts such as the detector are replaced or when the device settings such as the detector voltage are changed. Further, the correction formula may be calculated periodically. As a result, it is possible to detect deterioration or failure of the detector or the like of the mass spectrometer and obtain a measurement result excluding the influence thereof. Therefore, regardless of the body and conditions of the mass spectrometer, it is possible to accurately compare and evaluate the abundance ratio of the substance to be analyzed among a plurality of samples.
  • the calibration substance is measured under the same device conditions as the device condition for the measurement, and the correction formula is calculated.
  • the correction formula under the same conditions as the measurement of the substance to be analyzed can be used, and the accuracy of the correction is further improved. Therefore, regardless of the body and conditions of the mass spectrometer, it is possible to more accurately compare and evaluate the abundance ratio of the substance to be analyzed among a plurality of samples.
  • the calibrant solution containing the two or more calibration substances is measured, and the signal peak intensity of each calibration substance is obtained.
  • the ratio of the signal peak intensity of one or more other calibration substances to the signal peak intensity of one calibration substance is calculated respectively.
  • a known method such as the least squares method may be appropriately used for calculating the regression equation.
  • the logarithm of the signal peak intensity ratio may be used to calculate the regression equation.
  • the regression equation may be appropriately selected from linear, polynomial, exponential, logarithmic, or exponentiation.
  • a linear regression equation can be calculated using a value obtained by logarithmically transforming the signal peak intensity ratio.
  • a power regression equation can be calculated using the signal peak intensity ratio. The calculated regression equation is used as the correction equation of the mass spectrometer.
  • the signal peak intensity ratio in the mass spectrometer for which the correction formula should be calculated is x
  • the signal peak intensity ratio in the standard is y.
  • the sample containing the substance to be analyzed is measured, and the signal peak intensity of the substance to be analyzed is obtained.
  • the ratio of the signal peak intensity of the other substance to be analyzed to the signal peak intensity of the substance to be analyzed as the reference is calculated.
  • the calculated signal peak intensity ratio is shown in 5-1-1. Correct using the correction formula calculated in.
  • the corrected signal peak intensity ratio is the value at which the difference between the standard and the aircraft is cancelled. That is, the value is equivalent to the signal peak intensity ratio obtained when measured with a standard device. Therefore, if the corrected signal peak intensity ratio is used, the signal peak intensity ratio of the substance to be analyzed, that is, the abundance ratio of the substance to be analyzed can be compared and evaluated among a plurality of samples regardless of the body of the mass spectrometer. It is possible.
  • a correction formula for normalizing the signal peak intensity ratio can be calculated using a plurality of calibrant solutions in which the concentration ratios of the two calibration substances are known.
  • a plurality of calibrant solutions for which the concentration ratios of the two calibration substances are known.
  • a plurality of solutions in which one calibration substance is present at a constant concentration and the concentration of the other calibration substance is different may be used.
  • SIL-A ⁇ 1-38 has a constant concentration and A ⁇ 1-38 has a concentration ratio of 1 / 4,1 / 2,1,2,4 to SIL-A ⁇ 1-38. May be good.
  • IC intensity ratio calibrant
  • a regression equation is calculated between the known concentration ratios of the two calibration substances in each calibrant solution and the signal peak intensity ratio calculated above.
  • a known method such as the least squares method may be appropriately used for calculating the regression equation.
  • the logarithm of the signal peak intensity ratio may be used to calculate the regression equation.
  • the regression equation may be appropriately selected from linear, polynomial, exponential, logarithmic, or exponentiation.
  • a linear regression equation can be calculated using the logarithm of the signal peak intensity ratio.
  • a power regression equation can be calculated using the signal peak intensity ratio. The calculated regression equation is used as the correction equation of the mass spectrometer.
  • the calculated signal peak intensity ratio is shown in the above 5-2-1. Correct using the correction formula calculated in.
  • the signal peak intensity ratio of the substance to be analyzed is converted into the signal peak intensity ratio standardized by the calibration substance.
  • the difference in the obtained standardized signal peak intensity due to the aircraft is canceled by the correction formula. Therefore, it is possible to compare and evaluate the abundance ratio of the substance to be analyzed among a plurality of samples regardless of the body of the mass spectrometer. That is, it will be possible to directly compare the mass spectrometric measurement results not only in Japan but also in the United States, France and other countries.
  • this correction can be applied to research and inspection using various mass spectrometry, and is a highly versatile technique.
  • the correction formula differs depending on the mass spectrometer. Even with the same mass spectrometer, if parts such as the detector are replaced or if the device settings such as the detector voltage are changed, the state of the mass spectrometer will be different, so it depends on the state of the device. , Each correction formula is different. Further, the correction formula may change even when the state of the device changes due to deterioration of the detector or the like.
  • the signal peak intensity ratio detected by the mass spectrometer becomes large when the same sample is measured. It is considered that this is because the signal peak of the calibrant substance having a small abundance becomes smaller due to the influence of the device conditions such as deterioration of the detector.
  • the signal peak intensity becomes too small, the measurement accuracy generally decreases from the viewpoint of the S / N ratio. Therefore, in the mass spectrometer, it is preferable that the signal peak intensity does not become too small.
  • the correction value b value in the correction equation becomes large when the signal peak intensity detected by the mass spectrometer becomes small due to the influence of some device condition. Therefore, if the b value is set to a certain range, the signal peak intensity does not become too small, the measurement accuracy by the mass spectrometer is further improved, and the correction accuracy is further improved.
  • the b value can be changed by changing the detection sensitivity of the mass spectrometer.
  • the b value can be controlled, for example, by changing the detector voltage. Further, for example, the b value can be changed by changing the baseline level of the Analog digital (AD) converter.
  • AD Analog digital
  • the abundance ratio of the substance to be analyzed among a plurality of samples can be determined regardless of the body of the mass spectrometer or the device conditions. It is possible to make a comparative evaluation. Further, by adjusting the device conditions so that the value of the correction coefficient in the correction formula is within a certain range, the signal peak intensity ratio of the substance to be analyzed can be corrected more accurately.
  • the machine difference correction system of the mass spectrometer is A measurement method creation unit that creates a calibrant measurement method for calculating correction values in a mass spectrometer, and a measurement method creation unit.
  • a correction value calculation unit that analyzes the mass spectrometry data acquired using the measurement method and calculates the correction value, including.
  • the program for correcting the difference in the mass spectrometer can be applied to the computer.
  • a measurement method creation step to create a measurement method for measuring a sample for calculating a correction value in a mass spectrometer, and a measurement method creation step.
  • FIG. 20 is a schematic block diagram of the correction value calculation system of the mass spectrometer of the present embodiment.
  • a mass spectrometry unit 1 that executes measurement on a sample
  • a data processing unit 2 that performs data processing before and after measurement execution
  • an input unit 3 and a display unit 4 that are user interfaces
  • the data processing unit 2 analyzes the measurement method creation unit 20 that creates a measurement method for measuring the sample for calculating the correction value in the mass spectrometry unit 1 and the mass spectrum data obtained by the mass spectrometry unit 1.
  • the correction value calculation unit 21 for calculating the correction value is included.
  • the mass spectrometric unit 1 is not particularly limited, but includes a mass spectrometric method such as a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) mass spectrometric method and an electrospray ionization (ESI) mass spectrometric method.
  • a mass spectrometric method such as a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) mass spectrometric method and an electrospray ionization (ESI) mass spectrometric method.
  • MALDI-TOF matrix-assisted laser desorption / ionization-flying time
  • MALDI-IT matrix-assisted laser desorption / ionization-ion trap
  • MALDI-IT-TOF matrix-assisted laser desorption / ionization
  • Deionization-ion trap-flight time type mass analyzer MALDI-FTICR (matrix-assisted laser desorption ionization-Fourier conversion ion cyclotron resonance) type mass analyzer, ESI-QqQ (electrospray ionization-triple quadrupole) Use a type mass analyzer, ESI-Qq-TOF (electrospray ionization-tandem quadrupole-flight time) type mass analyzer, ESI-FTICR (electrospray ionization-Fourier conversion ion cyclotron resonance) type mass analyzer, etc. Can be done.
  • the actual state of the data processing unit 2 is, for example, a general-purpose personal computer or a higher-performance workstation. It may be a single unit or a computer system consisting of a plurality of units. The present embodiment is achieved by installing a dedicated data processing program on such a computer and operating the computer. Further, usually, the input unit 3 is a pointing device such as a keyboard and a mouse attached to the computer. Further, the display unit 4 is usually a monitor attached to a computer.
  • the mass spectrometer may have different measurement results depending on the aircraft and device conditions, even if the same sample is measured. In order to cancel the difference due to the aircraft and equipment conditions, 5-2. Make corrections as described in.
  • the measurement method creation unit 20 automatically creates a calibrant measurement method for calculating a correction value. According to the measurement method created by the measurement method creation unit 20, the mass spectrometry unit 1 measures the sample.
  • the measurement method creation unit 20 further includes a setting unit 201.
  • the setting unit 201 sets the laser power value used for the measurement of the calibrant.
  • the correction value calculation unit 21 analyzes the mass spectrum data measured by the mass spectrometry unit 1 and calculates the correction value using the signal peak intensity ratio.
  • FIG. 21 is a flowchart showing a procedure for calculating a correction value of the mass spectrometer.
  • the user prepares a sample to be used for calculating the correction value of the mass spectrometer.
  • a sample five types of samples (IC1 to IC5) in which the ratio of the concentration of the internal standard substance and the concentration of the target substance are gradually different are used.
  • the concentration ratio concentration of internal standard substance: concentration of target substance
  • IC-2 1 2, IC-3 1: 1, IC-4 1 : 0.5
  • IC-5 is 1: 0.25.
  • FIG. 22 shows an example of the graphical user interface (GUI) displayed on the display unit 4 when the measurement method is created.
  • GUI graphical user interface
  • the GUI includes a data set name input unit and a sample plate display unit. The user inputs the data set name by the operation through the input unit 5 and presses the file creation button (S1).
  • the measurement method creation unit 20 creates a measurement method for the input data set name (S2, measurement method creation step). Specifically, the laser power value is calculated in advance in order to set the laser power value of the mass spectrometer used in the measurement method. Further, the sample dropping position of each sample IC 1 to 5 is determined. The measurement method creation unit 20 displays the laser power on the GUI displayed on the display unit 4, and displays the sample dropping positions of the ICs 1 to 5 on the sample plate display unit of the GUI.
  • the laser power can be calculated by various known methods.
  • n is an integer of 3 or more
  • a straight line connecting two plot points adjacent to each other in the laser power axis direction For each plot point, the index value that reflects the ratio of the forward tilt value, which is the slope of the straight line on the front side, to the backward tilt value, which is the slope of the straight line on the rear side, is calculated, and the index value is obtained.
  • a method of adjusting the laser power can be used, which has a processing step of selecting an appropriate laser power using the above.
  • the calculated laser power may have a different value depending on the well of the sample plate.
  • the laser power calculated for the wells (calibrant wells) into which the sample ICs 1 to 5 measured by this measurement method and used for calculating the correction value are dropped is the wells (samples) used for measuring the actual sample to be analyzed.
  • the value may be different from the laser power used in the well).
  • the laser power used in the calibrant well may be 10 lower than the laser power used in the sample well.
  • the sample dropping position can be determined by various known methods.
  • the determined sample dropping position is displayed on the sample plate display unit as illustrated in FIG. 22.
  • it can be determined to drop IC-1, IC-2, IC-3, IC-4, and IC-5 from the right end of the uppermost stage.
  • the user drops each calibrant IC 1 to 5 at the sample dropping position indicated on the display unit 4, and starts the measurement.
  • the mass spectrometric unit 1 measures each calibrant under predetermined conditions (S3).
  • FIG. 23 shows an example of the graphical user interface (GUI) displayed on the display unit 4 when the correction value is calculated.
  • GUI graphical user interface
  • the correction value calculation unit 21 analyzes the mass spectrum data measured by the mass spectrometry unit 1 under the selected data set name (S4), and calculates the correction value (S5).
  • the correction value calculation step includes S4 and S5.
  • S4 and S5. For the calculation of the correction value, for example, the above-mentioned [5. Correction of measurement results in a mass spectrometer] can be used.
  • the ratio of the signal peak intensity of the target substance to the signal peak intensity of the internal standard substance in each of the sample ICs 1 to 5 is calculated.
  • the calculated correction coefficient b of the regression equation is output as the correction value b value.
  • the correction value b value is displayed on the GUI of the display unit 4.
  • the user measures the sample to be analyzed by the mass spectrometry unit 1 and obtains the measurement result corrected by using the b value.
  • the peak intensity ratio obtained for each aircraft was corrected using the regression equation. With this correction, it became possible to obtain the same peak intensity ratio even if the same sample was measured on different aircraft. It also has the effect of correcting the peak intensity ratio that fluctuates due to replacement of the detector, voltage change, and deterioration. It is not necessary to prepare a stable isotope substance for each target substance, and it is possible to compare and evaluate the amount of the target substance with one type of stable isotope substance.
  • This method can be used not only for peptides obtained by IP, but also for peptides produced by digestion of proteins with enzymes such as peptidase, and peptides fractionated by chromatography. It can also be used not only for peptides but also for glycopeptides, sugar chains, and lipids.
  • Example 1 Correction method for aligning the peak intensity ratio in one device]
  • Example 1-1 Measurement of plasma A ⁇ and A ⁇ -related peptides]
  • the A ⁇ and A ⁇ -related peptides to be analyzed in this example were prepared as follows.
  • IP-MS Immunoprecipitation-mass spectrometry
  • the IP was carried out as follows. Antibodies immobilized with anti-A ⁇ monoclonal antibodies (clones 6E10 and 4G8) immobilized on magnetic beads with OTG-glycine buffer (1% n-Octyl- ⁇ -D-thioglucoside (OTG), 50 mM glycine, pH 2.8). Washed twice and washed 3 times with 100 ⁇ L of wash buffer. Binding buffer containing 10 pM SIL-A ⁇ 1-38 (AnaSpec, San Jose, CA, USA) in 250 ⁇ L of plasma sample (0.2% (w / v) n-Dodecyl- ⁇ -D-maltoside (DDM), 0.
  • OTG-glycine buffer 1% n-Octyl- ⁇ -D-thioglucoside (OTG), 50 mM glycine, pH 2.8. Washed twice and washed 3 times with 100 ⁇ L of wash buffer. Binding buffer containing 10 pM SIL-A ⁇ 1-38 (
  • n-Nonyl- ⁇ -D-thiomaltoside 800 mM GlcNAc, 100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7.4
  • NTM n-Nonyl- ⁇ -D-thiomaltoside
  • a ⁇ and A ⁇ -related peptides were captured by incubation at 4 ° C. for 1 hour. Then, it was washed once with a washing buffer (500 ⁇ L or 100 ⁇ L), washed four times with a washing buffer of 100 ⁇ L, and then washed twice with 50 mM ammonium acetate (50 ⁇ L or 20 ⁇ L).
  • a ⁇ and A ⁇ -related peptides trapped in the antibody-immobilized beads were eluted with 5 ⁇ L of 70% acetonitrile containing 5 mM hydrochloric acid. 1 ⁇ L of the eluate was added dropwise to 4 wells on the ⁇ Focus MALDI plate TM 900 ⁇ m to which the matrix was added. It was measured with a Linear TOF in positive ion mode using three AXIMA Performances (Shimadzu / KRATOS, Manchester, UK). The mass spectrum was acquired by accumulating 40 shots at each of the 400 points in the raster mode.
  • the quantitative value the value obtained by averaging the peak intensity ratios of each A ⁇ and A ⁇ -related peptide to the internal standard peptide (SIL-A ⁇ 1-38) in the spectrum measured at 4 well was used.
  • the amino acid sequences of the measured A ⁇ and A ⁇ -related peptides are shown in Table 1.
  • FIG. 1 A Comparative analysis of peak intensity ratios between devices.
  • the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to the internal standard peptide (SIL-A ⁇ 1-38) obtained by IP-MS of plasma sample (Sample 1) is shown in FIG. 1 (A).
  • the same sample was measured using three mass spectrometers (Performances 1 to 3) of the same model, and the peak intensity ratios of most A ⁇ and A ⁇ -related peptides were different in all three.
  • the coefficient of variation (CV) of A ⁇ 1-40 was 48.7%, and the CV of A ⁇ 1-42 was 54.0%, confirming that the difference between the three units was particularly large.
  • the CV of A ⁇ 6-40 was 3.8%, and almost the same result was obtained among the three units.
  • a ⁇ 6-40 has a peak intensity ratio close to 1, but A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 have a peak intensity ratio far from 1. From this, the closer the peak intensity ratio is to 1, the smaller the difference between the three units, and the farther away from 1 (that is, the smaller or larger than 1), the larger the difference between the three units tends to be. It was suggested that there was.
  • Peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to internal standard peptide measured by three mass spectrometers, and A ⁇ , A ⁇ -related peptide, or SIL-A ⁇ 1-38 to APP669-711.
  • the average value of the peak intensity ratio and CV are shown in FIG. As is clear from this figure, the closer the peak intensity ratio is to 1, the smaller the CV between the three units, and the farther the peak intensity ratio is from 1, the larger the CV between the three units.
  • Performance 1 When Performance 1 is used as a standard, the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to the internal standard peptide (SIL-A ⁇ 1-38) measured by Performance 2 and Performance 3 by using these regression equations can be determined. I decided to investigate whether it can be corrected to the same peak intensity ratio as the standard device (Performance 1).
  • the peak intensity ratio measured by Performance 2 and Performance 3 was substituted into x in the above linear regression equation, and correction was performed by obtaining y (FIG. 5).
  • the corrected values are represented as Performance 2 (Cal.) And Performance 3 (Cal.), Respectively. As a result, the difference between the three peptides was small for all peptides, and the CV was also low.
  • the corrected values were the same regardless of whether the linear regression equation of the logarithmic transformation value was used or the exponentiation equation was used.
  • this result shows that the same peak intensity ratio can be obtained by correcting the peak intensity ratio by the correction formula even if the same sample is measured by different mass spectrometers.
  • this correction formula shows that it is possible to eliminate the error (machine difference) of the peak intensity ratio caused by the difference in the body of the mass spectrometer.
  • the reason why the logarithmic of the peak intensity ratio has a linear relationship between each aircraft is that the secondary electron multiplier (SEM) used in the detector of mass spectrometry exponentially converts the electrical signal of ions. It is considered that a large signal is obtained by amplifying the signal.
  • SEM secondary electron multiplier
  • Example 2 Method of standardizing and correcting the peak intensity ratio] [2-1 Measurement of plasma A ⁇ and A ⁇ -related peptides]
  • the A ⁇ and A ⁇ -related peptides to be analyzed in this example were prepared as follows.
  • IP-MS immunoprecipitation
  • MS mass spectrometry
  • the antibody beads were washed and the A ⁇ -related peptide was eluted using the 1st IP eluate (glycine buffer containing DDM (pH 2.8)). After returning to neutrality with a Tris buffer containing DDM, the antibody beads are once again subjected to an antigen-antibody reaction with the A ⁇ -related peptide (2nd IP), and after washing, the A ⁇ -related peptide is mixed with the 2nd IP eluate (5 mM HCl, 0.1 mM). Elution with Methionine, 70% (v / v) acetonitrile).
  • Mass spectrum data was acquired by Linear TOF in positive ion mode using AXIMA Performance (Shimadzu / KRATOS, Manchester, UK).
  • the m / z value of Linear TOF is displayed by the average mass of the peak.
  • the m / z value was calibrated using human angiotensin II, human ACTH fragment 18-39, bovine insulin oxidized beta-chain, and bovine insulin as external standards.
  • the mass spectrum was acquired by accumulating 40 shots at each of the 400 points in the raster mode.
  • As the quantitative value the value obtained by averaging the peak intensity ratios of each A ⁇ and A ⁇ -related peptide to the internal standard peptide (SIL-A ⁇ 1-38) in the spectrum measured at 4 well was used.
  • IC-1-5 concentrates dilute 10-fold with 2-1 2nd IP eluate (5 mM HCl, 0.1 mM Matrixine, 70% (v / v) acetonitrile) and IC- 1 to 5 were prepared, 0.5 mg / mL CHCA / 0.2% (w / v) MDPNA 0.5 ⁇ L was added dropwise in advance, and 1 ⁇ L of IC-1 to 5 was added onto 900 ⁇ m of dried ⁇ Focus MALDI plate TM . It was dropped into 4 wells and dried.
  • the protein / peptide compositions of ICs-1 to 5 are shown in Table 5.
  • the amount ratios of A ⁇ 1-38 to SIL-A ⁇ 1-38 in IC-1 to 5 were 4, 2, 1, 1/2, and 1/4, respectively.
  • the mass spectrum data of each of IC-1 to 5 was acquired by the same means as in 2-1.
  • IP-MS and IC-1-5 measurements of human plasma were performed under the three conditions of Performance Unit 1 and Performance Unit 3 before and after the detection of the detector.
  • the a value of the exponentiation equation does not change depending on the state of the airframe, but the b value is greatly affected by the conditions of the airframe, so the a value and b value obtained by IC measurement
  • the difference in the peak intensity ratio of A ⁇ or A ⁇ -related peptide to SIL-A ⁇ 1-38 between the three conditions is reduced by the correction by the power approximation formula, and the coefficient of variation (CV) is from 16.8 to 21.5% before correction. After correction, it decreased to 3.9 to 13.6%.
  • the difference between the two peak intensities was small and the intensity ratio was close to 1, so no effect was observed for APP669-711 / A ⁇ 1-42, which has a sufficiently small CV, but A ⁇ 1-40, which has a large intensity ratio.
  • the CV was 41.1% before the correction and was 8.0% after the correction (FIG. 12).
  • this correction method has the effect of reducing the variation in the peak intensity ratio between the devices. Further, since the a value does not change depending on the state of the airframe, it was shown that even when only the b value is used as the correction value, the effect of reducing the variation in the peak intensity ratio between the devices can be obtained. Since the method of the second embodiment is standardized by the power approximation formula, the peak intensity ratio can be applied without the need to use a specific airframe as a standard.
  • the b value can be adjusted by the detector voltage.
  • the biomarker (APP669-711 / A ⁇ 1) is used when the intensity ratios of A ⁇ 1-40, A ⁇ 1-42, and APP669-766 to the internal standard are read from the obtained mass spectrum and this intensity ratio is not corrected by the b value. -42 and A ⁇ 1-40 / A ⁇ 1-42) were compared.
  • FIG. 15 is a comparison before and after the correction of the A ⁇ 1-40 / A ⁇ 1-42 ratio.
  • the data before correction has a large variation among three units, and even when the detector voltage is changed by one unit, the variation is large.
  • the b value By performing the correction using the b value, it was confirmed that the variation of the three units was suppressed and the peptide ratio was kept constant even when the detector voltage was changed by one unit.
  • FIG. 16 is a comparison before and after the correction of the APP669-711 / A ⁇ 1-42 ratio.
  • the APP669-711 / A ⁇ 1-42 ratio has a small difference in intensity, and even before the correction, the variation between the three units and the variation when the detector voltage is changed by one unit are small. However, it was confirmed that the variation can be suppressed to be lower by performing the correction using the b value.
  • Table 7 shows the CV of each A ⁇ peptide ratio calculated by classifying the data focusing on the b value.
  • “Overall” is the CV calculated for all 6 condition measurements.
  • “Change detector voltage in one aircraft” is a CV with three conditions acquired by changing the detector voltage in P1 unit.
  • "Small variation in b value for 3 aircraft” is the CV obtained by the measurement result under the condition that the b value is close to 0.95 for 3 aircraft.
  • “Large variation in b value for 3 aircraft” is the CV obtained from the measurement results under 3 conditions where the b value is different for 3 aircraft.
  • the CV was originally low for "small variation in b value among the three aircraft", and there was no big difference before and after the correction, but in other cases, it can be seen that the CV was greatly reduced by the correction by the b value. This indicates that the correction by the b value is effective even when the device setting is changed between one unit or when the device state is different between different aircraft.
  • Example 3 Adjustment of correction value b value 1
  • the b value can be adjusted by the detector voltage. The following shows the results of investigating the relationship between the b value and the detector voltage.
  • IC measurement was performed using normal A ⁇ 1-38 having the same ionization efficiency and SIL-A ⁇ 1-38 labeled with a stable isotope.
  • ICs 1 to 5 the same ones used in 2-2 of Example 2 were used.
  • FIG. 17 is a diagram showing the relationship between the detector voltage and the correction type b value. The vertical axis is the b value, and the horizontal axis is the detector voltage (V).
  • FIG. 18 is a diagram showing the relationship between the detector voltage and the correction type b value. The vertical axis is the b value, and the horizontal axis is the detector voltage.
  • the b value tends to decrease when the detector voltage is increased.
  • the b value is 1.1 or more
  • the b value changes by about 0.15 when the detector voltage is increased by 25 V
  • the b value changes by about 0 when the detector voltage is increased by 25 V. It changed from 0.03 to 0.07.
  • the detector voltage and the b value it is possible to increase the detector voltage and adjust the b value to a certain range when the b value rises due to deterioration of the detector or the like. ..
  • the signal peak intensity ratio of the substance to be analyzed can be corrected more accurately.
  • the range of the b value may be adjusted to 0.9 to 1.1.
  • IC measurement was performed using normal A ⁇ 1-38 having the same ionization efficiency and SIL-A ⁇ 1-38 labeled with a stable isotope.
  • ICs 1 to 5 the same ones used in 2-2 of Example 2 were used.
  • FIG. 19 is a diagram showing the relationship between the detector voltage and the correction type b value.
  • the vertical axis is the b value, and the horizontal axis is the detector voltage (V).
  • the circled data points are the baseline setting 181 and the square data points are the baseline setting 179.
  • the b value tends to decrease by lowering the baseline level setting.
  • lowering the baseline setting by 2 lowers the b value by about 0.2 to 0.35, and when the b value is 1.1 or less, lowering the baseline setting by 2 causes b.
  • the value decreased by about 0.15.
  • the baseline setting of the AD converter Using the relationship between the baseline setting of the AD converter and the b value, it is possible to lower the baseline setting and adjust the b value to a certain range when the b value rises due to deterioration of the detector or the like. Is. By adjusting the b value to a certain range, the signal peak intensity ratio of the substance to be analyzed can be corrected more accurately.
  • the range of the b value may be adjusted to 0.9 to 1.1.
  • the present invention includes, for example, the following forms.
  • a method for correcting the difference in signal intensity ratio in mass spectrometry including.
  • x a reference signal peak intensity ratio or concentration ratio
  • y a signal peak intensity ratio obtained in a mass spectrometer for which a correction formula should be obtained
  • a is a coefficient in the approximate formula.
  • b is a coefficient in the approximate expression and is a correction value
  • a measurement method creation unit that creates a calibrant measurement method for calculating correction values in a mass spectrometer, and a measurement method creation unit.
  • a correction value calculation unit that analyzes the mass spectrometry data acquired using the measurement method and calculates the correction value, The machine difference correction system of the mass spectrometer including.
  • the measurement method creating unit includes a setting unit for setting a laser power value used for measuring the calibrant to a pre-calculated laser power value.
  • the machine error correction system according to (14) or (15) above, which includes a sample plate display unit that displays a sample plate of the mass spectrometer.
  • the sample plate display unit indicates a sample dropping position in the measurement method.
  • the setting unit sets different laser power values for the sample well and the calibrator well.
  • the machine difference correction system according to any one of (15) to (17) above.
  • a measurement method creation step to create a measurement method for measuring a sample for calculating a correction value in a mass spectrometer, and a measurement method creation step.
  • Mass spectrometry unit 2 Data processing unit 20 Measurement method creation unit 201 Setting unit 21 Correction value calculation unit 3 Input unit 4 Display unit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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Abstract

質量分析装置で、２つ以上のキャリブレーション物質を含むキャリブラントを測定し、前記キャリブレーション物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、前記２つ以上のキャリブレーション物質のうちの１つのキャリブレーション物質のシグナルピークの強度に対する他のキャリブレーション物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、前記シグナルピーク強度比から補正式を求める工程と、前記質量分析装置で、２以上の分析対象物質を含む試料を測定し、前記分析対象物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、前記２つ以上の分析対象物質のうちの１つの分析対象物質のシグナルピークの強度に対する他の分析対象物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、前記補正式を用いて前記分析対象物質の前記シグナルピーク強度比を補正する工程と、を含む質量分析におけるシグナル強度比の機差補正方法。

Description

質量分析装置の機差補正方法
　本発明は質量分析で取得されたペプチド比を用いる方法に関する。本発明は質量分析装置の機差を補正する方法、及び、質量分析装置の機差を補正するシステムに関する。
　質量分析装置を用いて物質の存在量を比較解析したい場合、二つのシグナルピークの強度比率を利用する方法が最も多く用いられている。例えば、比較したい試料に一定量の内部標準物質を添加し、必要であれば前処理を行った後に、その試料に対して質量分析を行い、内部標準物質のピークに対する測定対象ピークの強度比を算出した値を比較する（非特許文献１、２、３）。
　特許文献としては、国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８（米国公開ＵＳ　２０１７／０１８４５７３）、国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９（米国公開ＵＳ　２０１８／０２３８９０９）等が挙げられる。
　他にも、安定同位体元素を用いることより異なる質量をもたせた標識化合物を、それぞれ異なる試料由来の対象物質に標識し、質量分析にて質量の異なる対象物質のピーク同士の強度比率を算出することで半定量的な比較解析をすることができる。プロテオミクス分野で使用されているＩＣＡＴ（登録商標）法やｉＴＲＡＱ（登録商標）法がこの手法に当たる（非特許文献４、５）。
国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８ 米国公開ＵＳ　２０１７／０１８４５７３ 国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９ 米国公開ＵＳ　２０１８／０２３８９０９
Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(9):353-364. Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018;554(7691):249-254. Nicol GR, Han M, Kim J, Birse CE, Brand E, Nguyen A, Mesri M, FitzHugh W, Kaminker P, Moore PA, Ruben SM, He T : Use of an immunoaffinity-mass spectrometry-based approach for the quantification of protein biomarkers from serum samples of lung cancer patients. Mol Cell Proteomics. 2008 Oct;7(10):1974-82. Han DK, Eng J, Zhou H, Aebersold R : Quantitative profiling of differentiationinduced microsomal proteins using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nat Biotechnol. 2001 Oct;19(10):946-51. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ : Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 2004 Dec;3(12):1154-69.
　質量分析計を用いて極めて微量な物質を測定しようとした場合、同じ機種でも機体毎に検出されるピーク強度比率が異なる現象が確認される。異なる機体のピーク強度比の差異を補正する手段の一つとして、次のような絶対定量法が挙げられる。
　定量する対象物質の標準品と、強度比の基準となる物質（基準物質；対象物質の安定同位体標識物質が一般的に用いられる）を用意する。一定濃度の基準物質と、異なる濃度に振った標準品を混合したサンプルを測定することにより、基準物質に対する標準品のピーク強度比の検量線を作成する。この検量線により対象物質の絶対定量を行える。したがって、装置毎、測定毎に検量線を作成すれば、異なる装置でピーク強度比率の差異が存在していても、それに影響されることなく生体試料に存在する未知の対象物質を定量できる。
　しかし、この検量線の方法は標準品を必要とする。容易に標準品を合成できない場合や、対象物質の種類が膨大で全ての標準品を準備し、品質管理することが時間的、費用的に困難な場合や、不安定な標準品の場合は、検量線を作成することはできない。前述のように質量分析装置は機体間でピーク強度比が変化するため、検量線を作成できない場合は１台の機体で比較対象となる試料を測定しなければならないが、それでも機体の使用による検出器劣化が起きるため、ピーク強度比が変動して、一貫したデータを取得することが難しい。
　質量分析ではレーザーを照射してサンプルをイオン化させる。そのため、質量分析装置のレーザーの状態（使用回数等による劣化）によってデータに影響が生じる。従って、同じサンプルを測定した場合であっても、異なる装置間においては機差が少なからず存在する。そのためデータの安定性に欠ける。
　本発明の目的は、質量分析データの、質量分析装置の機体による差異を補正する方法、及び、質量分析装置の機差を補正するシステムを提供することにある。
　本発明は、以下の発明を含む。
　質量分析装置で、２つ以上のキャリブレーション物質を含むキャリブラントを測定して、前記キャリブレーション物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
　前記２つ以上のキャリブレーション物質のうちの１つのキャリブレーション物質のシグナルピークの強度に対する他のキャリブレーション物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
　前記シグナルピーク強度比から補正式を求める工程と、
　前記質量分析装置で、２つ以上の分析対象物質を含む試料を測定して、前記分析対象物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
　前記２つ以上の分析対象物質のうちの１つの分析対象物質のシグナルピークの強度に対する他の分析対象物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
　前記補正式を用いて前記分析対象物質の前記シグナルピーク強度比を補正する工程と、
を含む質量分析におけるシグナル強度比の機差補正方法。
　本発明はさらに、以下の発明を含む。
　質量分析装置における補正値を算出するためのキャリブラントの測定メソッドを作成する測定メソッド作成部と、
　前記測定メソッドを用いて取得した質量分析データを解析して補正値を算出する補正値算出部と、
を含む質量分析装置の機差補正システム。
　本発明によれば、キャリブレーション物質の測定結果より求めた補正式を用いて、分析対象物質のピーク強度比を補正することができる。その結果、同一の試料を異なる機体で測定しても、同等のピーク強度比を得ることが可能となる。
内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）がスパイクされた血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１）を免疫沈降（ＩＰ）後、Ａβ及びＡβ関連ペプチドを３台の質量分析装置（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１、２及び３）で測定した結果を示す。図１（Ａ）の縦軸は、ＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチド各々のピーク強度比を示す。図１（Ｂ）の縦軸は、ＡＰＰ６６９－７１１に対するＡβ、Ａβ関連ペプチド、又はＳＩＬ－Ａβ１－３８各々のピーク強度比を示す。 血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１）をＩＰ後に３台の質量分析装置（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１、２及び３）で測定した各ピーク強度比の装置間の変動係数（ＣＶ）を縦軸に示す。横軸は３台の質量分析装置で測定したの平均値を示す。 血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１）をＩＰ後にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）で測定した各ピーク強度比を対数変換した値を縦軸に示す。また、同じサンプルをＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２又は３で測定した各ピーク強度比を対数変換した値を横軸に示す。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）の測定値に対するＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２又は３の測定値の直線回帰式、及び決定係数（Ｒ2）を図中に示す。 血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１）をＩＰ後にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）で測定した各ピーク強度比を縦軸に示す。また、同じサンプルをＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２又は３で測定した各ピーク強度比を横軸に示す。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）の測定値に対するＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２又は３の測定値の累乗近似式、及び決定係数（Ｒ2）を図中に示す。 補正式を用いて、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３で測定された内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）に対するＡβ、又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比を、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）と同等のピーク強度比に補正した値を示す。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｃａｌ.）及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｃａｌ.）はその補正された値(calibrated value)を意味する。図５の縦軸は、ＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチド各々のピーク強度比を示す。図５中の数値（％）は、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｃａｌ.）及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｃａｌ.）におけるピーク強度比の変動係数（ＣＶ）を示す。 血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．２）をＩＰ後にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１、２、及び３で測定した時の、ＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチド各々のピーク強度比を示す。図６（Ａ）は、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３で測定されたＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比を補正式を用いて補正する前のピーク強度比を示し、図６（Ｂ）は補正後のピーク強度比を示す。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｃａｌ.）及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｃａｌ.）はその補正された値(calibrated value)を意味する。図６（Ａ）及び（Ｂ）中の数値（％）は、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｃａｌ.）及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｃａｌ.）におけるピーク強度比の変動係数（ＣＶ）を示す。 血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．３）をＩＰ後にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１、２、及び３で測定した時の、ＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチド各々のピーク強度比を示す。図７（Ａ）は、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３で測定されたＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比を補正式を用いて補正する前のピーク強度比を示し、図７（Ｂ）は補正後のピーク強度比を示す。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｃａｌ.）及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｃａｌ.）はその補正された値(calibrated value)を意味する。図７（Ａ）及び（Ｂ）中の数値（％）は、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｃａｌ.）及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｃａｌ.）におけるピーク強度比の変動係数（ＣＶ）を示す。 ２日（Ｄａｙ１とＤａｙ２）に分けて血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１）に対するＩＰ－ＭＳを行った結果を示す。それぞれの日にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）で測定した各ピーク強度比を対数変換した値を縦軸に示す。また、同様にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２で測定した各ピーク強度比を対数変換した値を横軸に示す。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１測定値に対するＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２の測定値の直線回帰式、及び決定係数（Ｒ2）を図中に示す。 ２日（Ｄａｙ１とＤａｙ２）に分けて血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１）に対するＩＰ－ＭＳを行った結果を示す。それぞれの日にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１（標準器）で測定した各ピーク強度比を対数変換した値を縦軸に示す。また、同様にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３で測定した各ピーク強度比を対数変換した値を横軸に示す。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１測定値に対するＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３の測定値の直線回帰式、及び決定係数（Ｒ2）を図中に示す。 検出器の交換前後のＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機、及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３号機の３条件において、ＩＣ－１～５を測定した結果を示す。横軸はＡβ１－３８／ＳＩＬ－Ａβ１－３８の量比、縦軸はＡβ１－３８／ＳＩＬ－Ａβ１－３８のピーク強度比を示す。図中に各々累乗近似式を示す。図１０（Ａ）にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機（検出器交換前）、図１０（Ｂ）にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機（検出器交換後）、図１０（Ｃ）にＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３号機の結果をそれぞれ示す。 検出器の交換前後のＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機、及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３号機の３条件においてＩＰ－ＭＳで取得したＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチド各々のピーク強度比を示す。図１１（Ａ）は、ＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比を補正式を用いて補正する前のピーク強度比を示し、図１１（Ｂ）は補正後のピーク強度比を示す。ａの値は１に固定し（ａ＝１）、ｂ値のみを用いる方法で補正した。 検出器の交換前後のＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機、及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３号機の３条件においてＩＰ－ＭＳで取得したバイオマーカーのピーク強度比、すなわち、ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２及びＡβ１－４０／Ａβ１－４２各々のピーク強度比を示す。図１２（Ａ）は、バイオマーカーのピーク強度比を補正式を用いて補正する前のピーク強度比を示し、図１２（Ｂ）は補正後のピーク強度比を示す。ａの値は１に固定し（ａ＝１）、ｂ値のみを用いる方法で補正した。 検出器の交換前後のＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機、及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３号機の３条件においてＩＰ－ＭＳで取得したＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチド各々のピーク強度比を示す。図１３（Ａ）は、ＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比を補正式を用いて補正する前のピーク強度比を示し、図１３（Ｂ）は補正後のピーク強度比を示す。ａ値とｂ値とを用いる方法で補正した。 検出器の交換前後のＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機、及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３号機の３条件においてＩＰ－ＭＳで取得したバイオマーカーのピーク強度比、すなわち、ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２及びＡβ１－４０／Ａβ１－４２各々のピーク強度比を示す。図１４（Ａ）は、を補正式を用いて補正する前のピーク強度比を示し、図１４（Ｂ）は補正後のピーク強度比を示す。ａ値とｂ値とを用いる方法で補正した。 Ａβ１－４０／Ａβ１－４２比のｂ値補正前後での比較を示す。エラーバーは３セット測定での標準偏差を示す。 ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２比のｂ値補正前後での比較を示す。エラーバーは３セット測定での標準偏差を示す。 Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　４号機における検出器電圧と補正式のｂ値の関係を示す図である。縦軸はｂ値、横軸は検出器電圧である。 Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機における検出器電圧と補正式のｂ値の関係を示す図である。縦軸はｂ値、横軸は検出器電圧である。 Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機におけるＡＤコンバータのベースラインレベルと補正式のｂ値の関係を示す図である。縦軸はｂ値、横軸は検出器電圧である。ＡＤコンバータのベースラインレベルを１８１および１７９とした場合の検出器電圧とｂ値の関係を示す． 本発明の質量分析装置の補正値算出システムの、一実施形態の概略ブロック図である。 本発明における質量分析装置の補正値を算出するための手順の一例を示すフローチャートである。 測定メソッドを作成させる場合に、表示部４に表示されているグラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）の一例である。 補正値を算出させる場合に、表示部４に表示されているグラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）の一例である。
　本発明の方法の一実施形態は、質量分析におけるシグナル強度比の機差補正方法であって、
　質量分析装置で、２つ以上のキャリブレーション物質を含むキャリブラントを測定して、前記キャリブレーション物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
　前記２つ以上のキャリブレーション物質のうちの１つのキャリブレーション物質のシグナルピークの強度に対する他のキャリブレーション物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
　前記シグナルピーク強度比から補正式を求める工程と、
　前記質量分析装置で、２つ以上の分析対象物質を含む試料を測定して、前記分析対象物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
　前記２つ以上の分析対象物質のうちの１つの分析対象物質のシグナルピークの強度に対する他の分析対象物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
　前記補正式を用いて前記分析対象物質の前記シグナルピーク強度比を補正する工程と、
を含む。
　以下に本実施形態について詳しく説明する。なお、後述の実施例においては、図１～１９を用いて、より具体的な例を示す。
［１．分析対象物質］
　分析対象物質は、特に限定されないが、例えば、ペプチド、糖ペプチド、糖鎖、タンパク質、脂質、糖脂質等が含まれ得る。ペプチド、糖ペプチド、糖鎖、タンパク質、脂質や糖脂質には種々のものが含まれ得る。より具体的には、Ａβ及びＡβ関連ペプチドであってもよい。「Ａβ及びＡβ関連ペプチド」は単に「Ａβ関連ペプチド」と総称することもある。「Ａβ及びＡβ関連ペプチド」には、アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じるＡβ及びＡβの配列を一部でも含むペプチドが含まれる。実施例においては、Ａβ及びＡβ関連ペプチドを用いた例が示されている。
　また、ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）により得られたペプチドであってもよい。あるいは、ペプチダーゼなどの酵素によるタンパク質の消化によって生成されたペプチドや、クロマトグラフィーにより分画されたペプチドであってもよい。
　分析対象物質には、内部標準物質を含んでいてもよい。内部標準物質は、当業者が適宜選択することができる。例えば、安定同位体標識された物質を用いてもよい。分析対象物質のうちの１つの物質に安定同位体標識したものを用いてもよい。実施例においては、内部標準物質として安定同位体で標識されたＡβ１－３８（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）を用いた例が示されている。ＳＩＬは、stable isotope-labeledである。
　分析対象物質を含む試料が質量分析に供される。質量分析に供される前記試料は、特に限定されないが、例えば、生体由来試料であってもよい。生体由来試料には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液；及び糞便が含まれる。血液試料には、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、質量分析に供される血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において血液試料などの生体由来試料が質量分析に供される場合は、その生体由来試料は由来元の被験者に戻すことなく破棄される。
　質量分析に供される前記試料は、種々の前処理が行われた後の試料であってもよい。例えば、免疫沈降法（ＩＰ）を行った後であってもよい。ペプチダーゼなどの酵素によるタンパク質の消化後であってもよい。クロマトグラフィーを行った後であってもよい。質量分析に供される前記試料は、一定量の内部標準物質を添加したものを用いてもよい。
　本実施形態において、予め、免疫沈降法を行った後に、免疫沈降法で得られた溶出液を質量分析に供してもよい（免疫沈降－質量分析Immunoprecipitation-mass spectrometry；ＩＰ－ＭＳ）。免疫沈降法は、分析対象物質を認識可能な抗原結合部位を持つ免疫グロブリン、または分析対象物質を認識可能な抗原結合部位を含む免疫グロブリン断片を用いて作製された抗体固定化担体を用いて行ってもよい。
　また、本実施形態において、連続的に免疫沈降（Consecutive Immunoprecipitation；ｃＩＰ）を行い、その後、質量分析装置での試料中ペプチドの検出を行ってもよい（ｃＩＰ－ＭＳ）。２回連続でアフィニティ精製を行うことにより、１回のアフィニティ精製だけでは排除しきれなかった夾雑物質を、２回目のアフィニティ精製によりさらに減少させることができる。このため、夾雑物質によるポリペプチドのイオン化抑制を防ぐことができ、生体試料中の微量なポリペプチドでも質量分析で高感度に計測することが可能となる。
［２．質量分析］
　質量分析法は、特に限定されないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法などによる質量分析法が含まれる。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＱｑＱ（エレクトロスプレーイオン化－三連四重極）型質量分析装置、ＥＳＩ－Ｑｑ－ＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化－タンデム四重極－飛行時間）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ（エレクトロスプレーイオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等を用いることができる。
　マトリックス及びマトリックス溶媒は、分析対象物質に応じて当業者が適宜決定することができる。
　マトリックスとしては、例えば、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５-ジヒドロキシ安息香酸（２，５－ＤＨＢ）、シナピン酸、３－アミノキノリン（３－ＡＱ）等を用いることができる。
　マトリックス溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール、エタノール及び水からなる群から選択して用いることができる。より具体的には、ＡＣＮ－ＴＦＡ水溶液、ＡＣＮ水溶液、メタノール－ＴＦＡ水溶液、メタノール水溶液、エタノール－ＴＦＡ水溶液、エタノール溶液などを用いることができる。ＡＣＮ－ＴＦＡ水溶液におけるＡＣＮの濃度は例えば１０～９０体積％であり、ＴＦＡの濃度は例えば０．０５～１体積％、好ましくは０．０５～０．１体積％でありうる。
　マトリックス濃度は、例えば０．１～５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｍＬ、あるいは０．３～２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．５～１０ｍｇ／ｍＬでありうる。
　ＭＡＬＤＩ質量分析による検出系を用いる場合、マトリックス添加剤（コマトリックス）が併用されることが好ましい。マトリックス添加剤は、分析対象（ポリペプチド）及び／又はマトリックスに応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、マトリックス添加剤として、ホスホン酸基含有化合物を用いることができる。具体的には、ホスホン酸基を１個含む化合物として、ホスホン酸（Phosphonic acid）、メチルホスホン酸（Methylphosphonic acid）、フェニルホスホン酸（Phenylphosphonic acid）、及び1-ナフチルメチルホスホン酸（1-Naphthylmethylphosphonic acid）等が挙げられる。また、ホスホン酸基を２個以上含む化合物として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid；ＭＤＰＮＡ）、エチレンジホスホン酸（Ethylenediphosphonic acid）、エタン-1-ヒドロキシ-1,1-ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid）、ニトリロトリホスホン酸（Nitrilotriphosphonic acid）、及びエチレンジアミノテトラホスホン酸（Ethylenediaminetetraphosphonic acid）等が挙げられる。上記のホスホン酸基含有化合物の中でも、１分子中に２以上、好ましくは２～４個のホスホン酸基を有する化合物が好ましい。
　ホスホン酸基含有化合物の使用は、例えば抗体固定化担体表面に残存した洗浄溶液の金属イオンが解離工程後の溶出液に混入した場合に有用である。この金属イオンは質量分析においてバックグラウンドへ悪影響を与える。ホスホン酸基含有化合物の使用には、このような悪影響を抑制する効果がある。
　なお、上記マトリックス添加剤以外にも、より一般的な添加剤、例えばアンモニウム塩及び有機塩基からなる群から選ばれる物質が使用されても良い。
　マトリックス添加剤は、水中又はマトリックス溶媒中０．１～１０ｗ/ｖ％、好ましくは０．２～４ｗ/ｖ％の溶液に調製することができる。マトリックス添加剤溶液及びマトリックス溶液は、例えば、１：１００～１００：１、好ましくは１：１０～１０：１の体積比で混合することができる。
［３．キャリブレーション物質］
　本実施形態において、２つ以上のキャリブレーション物質を質量分析装置で測定する。前記キャリブレーション物質の測定結果を用いて、前記質量分析装置における補正式を算出する。
　キャリブレーション物質は、当業者が適宜決定することができる。例えば、分析対象物質それ自体を用いてもよいし、分析対象物質とは異なる物質を用いてもよい。安定同位体標識した物質を用いてもよい。安定同位体標識した物質と安定同位体標識していない物質を用いてもよい。キャリブレーション物質はＡβ及びＡβ関連ペプチドを用いていてもよい。Ａβ及びＡβ関連ペプチドを分析対象物質とする場合において、例えば、安定同位体で標識されたＡβ１－３８（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）をキャリブレーション物質の１つとして用いてよい。
　キャリブレーション物質は、１つの化合物と、その化合物を安定同位体標識したものを含んでいてもよい。質量分析においては、化合物をイオン化して検出する。そのイオン化効率は化合物によって異なり、イオン化効率の差異が質量分析測定結果に影響を及ぼす。ある化合物とその化合物を安定同位体標識したものは、イオン化効率が等しい。そのため、これらをキャリブレーション物質として用いることにより、より精度の高い補正式を得ることができる。例えば、実施例２においては、Ａβ１－３８と、安定同位体で標識されたＡβ１－３８（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）をキャリブレーション物質として用いている。
［４．キャリブラント］
　キャリブラントは、キャリブレーション物質を含む溶液である。本実施形態においては、キャリブラントは２つ以上のキャリブレーション物質を含む溶液である。
　キャリブラントとしては、例えば、分析対象物質を含む試料それ自体を用いることもできる。また、分析対象物質を含む試料それ自体にキャリブレーション物質を添加したものを用いることもできる。分析対象物質を含む試料それ自体とは別に２つ以上のキャリブレーション物質を含む溶液を作製して用いてもよい。
　前記２つ以上のキャリブレーション物質を含む溶液の測定結果を用いて、前記質量分析装置における補正式を算出する。補正式を算出するためには、複数のデータが必要である。例えば、シグナルピーク強度比を用いて、補正式を算出する場合は、シグナルピーク強度比が異なる複数のデータが必要となる。
　例えば、１つのキャリブラントを用いて補正式を算出する場合は、少なくとも３種類のキャリブレーション物質を含むキャリブラントを用いる必要がある。１つのキャリブレーション物質のシグナルピーク強度に対する他の２つ以上のキャリブレーション物質のシグナルピーク強度の比をそれぞれ算出し、２つ以上のシグナルピーク強度比を得てもよい。　　　
　例えば、キャリブレーション物質をＣ１、Ｃ２、Ｃ３と表記すると、Ｃ１を基準として、Ｃ２／Ｃ１、Ｃ３／Ｃ１のピーク強度比をそれぞれ算出する。
　あるいは、シグナルピーク強度比を求めるべきキャリブレーション物質の濃度がそれぞれ異なる複数のキャリブラントを用いてもよい。この場合は、少なくとも２種類のキャリブレーション物質を用いる必要がある。１つのキャリブレーション物質のシグナルピーク強度に対する他のキャリブレーション物質のシグナルピーク強度の比を各キャリブラントについてそれぞれ算出し、２つ以上のシグナルピーク強度比を得てもよい。
　例えば、キャリブレーション物質として、キャリブレーション物質をＣ１、Ｃ２と表記すると、Ｃ２／Ｃ１のピーク強度比を、濃度が異なる複数のキャリブラントについてそれぞれ算出する。
　１つのキャリブレーション物質の濃度を一定にし、他のキャリブレーション物質の濃度を変化させた複数のキャリブラントを用いてもよい。複数のキャリブラントにおける、シグナルピーク強度比を算出すべきキャリブレーション物質の濃度比は、例えば、１／４～４の範囲としてもよい。例えば、１／４，１／２，１，２，４の濃度比となるように調整した５種類のキャリブラント溶液を用いることもできる。
［５．質量分析装置における測定結果の補正］
　本実施形態において、２つ以上のキャリブレーション物質を質量分析装置で測定した結果を用いて、前記質量分析装置における補正式を算出する。そして、算出された補正式を用いて、分析対象物質の測定結果を補正する。本発明における補正の方法には、標準器との間の補正式を用いて補正する方法が含まれる。また、存在量が既知のキャリブレーション物質を用いて、質量分析における測定結果を規格化する方法が含まれる。
　補正式は、質量分析装置毎に算出される。同一の質量分析装置であっても、検出器等の部品交換を行った場合や検出器電圧などの装置設定を変更した場合には、新たに補正式を算出することが好ましい。また、定期的に補正式の算出を行ってもよい。これにより、質量分析装置の検出器等の劣化や故障を発見することやその影響を排除した測定結果を得ることができる。従って、質量分析装置の機体や条件によらず、複数の試料間における分析対象物質の存在比を精度よく比較評価することが可能である。
　より好ましくは、分析対象物質の測定を行う際に、その測定の装置条件と同じ装置条件でキャリブレーション物質を測定し、補正式を算出する。分析対象物質の測定と同じ条件における補正式を用いることができ、より補正の精度が向上する。従って、質量分析装置の機体や条件によらず、複数の試料間における分析対象物質の存在比をより精度よく比較評価することが可能である。
［５－１．標準器との間の補正式を用いた補正］
［５－１－１．補正式の算出］
　標準器において、２つ以上のキャリブレーション物質を含むキャリブラント溶液を測定し、各キャリブレーション物質のシグナルピーク強度を得る。１つのキャリブレーション物質のシグナルピーク強度に対する、他のそれぞれのキャリブレーション物質のシグナルピーク強度の比をそれぞれ算出する。
　標準器としては、信頼性の高い質量分析装置を用いることが好ましい。各使用者は、標準器として用いるべき質量分析装置を任意に設定することができる。
　補正式を算出すべき質量分析装置において、前記２つ以上のキャリブレーション物質を含むキャリブラント溶液を測定し、各キャリブレーション物質のシグナルピーク強度を得る。１つのキャリブレーション物質のシグナルピーク強度に対する、他の１つ以上キャリブレーション物質のシグナルピーク強度の比をそれぞれ算出する。
　標準器におけるシグナルピーク強度比と、補正式を算出すべき質量分析装置におけるシグナルピーク強度比との間で回帰式を算出する。回帰式の算出には、最小二乗法等の公知の方法を適宜用いてよい。回帰式の算出には、シグナルピーク強度比の対数を用いてもよい。回帰式は、線形、多項式、指数、対数、又は累乗から適宜選択してよい。
　例えば、シグナルピーク強度比を対数変換した値を用いて直線回帰式を算出することができる。また、例えば、シグナルピーク強度比を用いて累乗回帰式を算出することができる。算出した回帰式を、当該質量分析装置の補正式とする。
　例えば、補正式を算出すべき質量分析装置におけるシグナルピーク強度比の対数をｘ、標準器におけるシグナルピーク強度比の対数をｙとして、
直線回帰式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）
の補正係数ａ及びｂを算出することができる。算出された直線回帰式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を当該質量分析装置の補正式として用いることができる。
　あるいは、補正式を算出すべき質量分析装置におけるシグナルピーク強度比をｘ、標準器におけるシグナルピーク強度比をｙとして、
累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）
の補正係数ａ及びｂを算出してもよい。算出された累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）を当該質量分析装置の補正式として用いることができる。
　補正係数ａ及びｂは、当該質量分析装置に固有の値であると考えられる。従って、質量分析装置の機体やその装置条件により異なる値であってよい。また、補正係数ａよりもｂの方が質量分析装置の機体やその装置条件により大きく影響を受ける係数であるため、例えば、累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）において、ａ＝１の固定値を用い、ｂ値のみ算出された補正係数を採用してもよい。つまり、累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）に替えてｙ＝ｘbを補正式として用いてもよい。このように、補正係数はｂのみが採用される場合には、ｂ値を補正値と称する。
［５－１－２．分析対象物質の測定と補正］
　５－１－１．で補正式を算出した質量分析装置において、分析対象物質を含む試料を測定し、分析対象物質のシグナルピーク強度を得る。分析対象物質のうちの１つ（例えば、内部標準物質）を基準とし、その基準とする分析対象物質のシグナルピーク強度に対する、他の分析対象物質のシグナルピーク強度の比を算出する。
　算出されたシグナルピーク強度比を、上記５－１－１．で算出された補正式を用いて補正する。補正後のシグナルピーク強度比は、標準器との機体による差異がキャンセルされた値となる。すなわち、標準器で測定した場合に得られるシグナルピーク強度比と同等の値となる。従って、補正後のシグナルピーク強度比を用いれば、質量分析装置の機体によらず、複数の試料間における分析対象物質のシグナルピーク強度比、すなわち、分析対象物質の存在比を比較評価することが可能である。
［５－２．シグナルピーク強度比を規格化する補正（強度比キャリブレーション）］
［５－２－１．補正式の算出］
　２つのキャリブレーション物質の濃度比が既知の複数のキャリブラント溶液を用いて、シグナルピーク強度比を規格化する補正式を算出することができる。
　２つのキャリブレーション物質の濃度比が既知の複数のキャリブラント溶液（強度比キャリブラント；ＩＣ）を用いる。１つのキャリブレーション物質が一定濃度で存在し、他の１つのキャリブレーション物質の濃度が異なる複数の溶液を用いてもよい。例えば、ＳＩＬ－Ａβ１－３８を一定濃度とし、Ａβ１－３８をＳＩＬ－Ａβ１－３８に対して１／４，１／２，１，２，４の濃度比となるように調製した溶液を用いてもよい。
　２つのキャリブレーション物質の濃度比が既知の複数のキャリブラント溶液（強度比キャリブラント；ＩＣ）を補正式を算出すべき質量分析装置で測定し、各溶液における各キャリブレーション物質のシグナルピーク強度を得る。各溶液について、一定濃度のキャリブレーション物質のシグナルピーク強度に対する他方のキャリブレーション物質のシグナルピーク強度の比をそれぞれ算出する。
　各キャリブラント溶液における２つのキャリブレーション物質の既知の濃度比と、上記で算出したシグナルピーク強度比との間で回帰式を算出する。回帰式の算出には、最小二乗法等の公知の方法を適宜用いてよい。回帰式の算出には、シグナルピーク強度比の対数を用いてもよい。回帰式は、線形、多項式、指数、対数、又は累乗から適宜選択してよい。
　例えば、シグナルピーク強度比の対数を用いて直線回帰式を算出することができる。また、例えば、シグナルピーク強度比を用いて累乗回帰式を算出することができる。算出した回帰式を、当該質量分析装置の補正式とする。
　例えば、各溶液における２つのキャリブレーション物質の既知の濃度比の対数をｘ、補正式を算出すべき質量分析装置におけるシグナルピーク強度比の対数をｙとして、
直線回帰式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）
の補正係数ａ及びｂを算出することができる。算出された直線回帰式（ｙ＝ａｘ＋ｂ）を当該質量分析装置の補正式として用いることができる。
　あるいは、各溶液における２つのキャリブレーション物質の既知の濃度比をｘ、補正式を算出すべき質量分析装置におけるシグナルピーク強度比をｙとして、
累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）
の補正係数ａ及びｂを算出してもよい。算出された累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）を当該質量分析装置の補正式として用いることができる。
　補正係数ａ及びｂは、当該質量分析装置に固有の値であると考えられる。従って、質量分析装置の機体やその装置条件により異なる値であってよい。また、補正係数ａよりもｂの方が質量分析装置の機体やその装置条件により大きく影響を受ける係数であるため、例えば、累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）において、ａ＝１の固定値を用い、ｂ値のみ算出された補正係数を採用してもよい。つまり、累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）に替えてｙ＝ｘbを補正式として用いてもよい。このように、補正係数はｂのみが採用される場合には、ｂ値を補正値と称する。
［５－２－２．分析対象物質の測定と補正］
　５－２－１．で補正式を算出した質量分析装置において、分析対象物質を含む試料を測定し、分析対象物質のシグナルピーク強度を得る。分析対象物質のうちの１つ（例えば、内部標準物質）を基準とし、その基準とする分析対象物質のシグナルピーク強度に対する、他の分析対象物質のシグナルピーク強度の比を算出する。
　算出されたシグナルピーク強度比を、上記５－２－１．で算出された補正式を用いて補正する。補正により、分析対象物質のシグナルピーク強度比は、キャリブレーション物質で規格化されたシグナルピーク強度比に変換される。得られた規格化されたシグナルピーク強度は、補正式により機体による差異がキャンセルされている。従って、質量分析装置の機体によらず、複数の試料間における分析対象物質の存在比を比較評価することが可能である。すなわち、日本のみならず、アメリカ、フランス及びその他の国々での質量分析測定結果と直接比較することができるようになる。また、この補正は、様々な質量分析を用いた研究や検査に応用可能であり、汎用性の高い技術である。
［５－２－３．補正値と装置条件］
　上述のとおり、本実施形態において、分析対象物質の測定に用いられる質量分析装置及びその装置条件において、補正式を算出し、補正を行うことにより、上述のとおり、質量分析装置の機体あるいは装置条件によらず、複数の試料間における分析対象物質の存在比を比較評価することが可能である。
　強度比キャリブレーションの補正式の作成には、２つのキャリブレーション物質の濃度比が既知の複数のキャリブラント溶液、例えば、ＳＩＬ－Ａβ１－３８を一定濃度とし、Ａβ１－３８をＳＩＬ－Ａβ１－３８に対して１／４，１／２，１，２，４の濃度比となるように調整した５種類の溶液を用いることができる。それぞれの溶液のマススペクトルには一定量のＳＩＬ－Ａβ１－３８のピークと、濃度に応じたＡβ１－３８のピークが現れる。理想的には、各キャリブラント溶液における濃度比に応じたピーク強度比になるはずである。しかし、このピーク強度比が装置状態によって変動するため、ピーク強度比が各キャリブラント溶液における濃度比と一致するように補正式を計算し、検体測定結果の補正を行う。これにより装置の機差がキャンセルされる。
　補正式は、質量分析装置の機体により異なる。また、同一の質量分析装置であっても、検出器等の部品交換を行った場合や検出器電圧などの装置設定を変更した場合には、質量分析装置の状態が異なるため、装置の状態により、それぞれ補正式が異なる。また、検出器の劣化等により装置の状態が変化した場合にも、補正式は変化しうる。
　例えば、検出器の劣化等の装置条件の影響により、同じ試料を測定した場合に、質量分析装置で検出されるシグナルピーク強度比が大きくなる。これは、存在量の小さいキャリブラント物質のシグナルピークが、検出器の劣化等の装置条件の影響により、小さくなるためと考えられる。質量分析装置において、シグナルピーク強度が小さくなりすぎると、一般に、Ｓ／Ｎ比の観点から測定精度が低下する。従って、質量分析装置において、シグナルピーク強度が小さくなりすぎないほうが好ましい。
　例えば、５－２－１．において、累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）を求めた場合、何らかの装置条件の影響により質量分析装置により検出されるシグナルピーク強度が小さくなると、補正式における補正値ｂ値は大きくなる。従って、このｂ値をある一定の範囲になるようにすれば、シグナルピーク強度が小さくなりすぎず、質量分析装置による測定精度がより向上し、補正の精度もさらに向上する。
　ｂ値は、質量分析装置の検出感度を変化させることによって、変動させることができる。ｂ値は、例えば、検出器電圧を変更することによって制御することができる。また、例えば、Analog digital（ＡＤ）コンバータのベースラインレベルを変更することによって、ｂ値を変化させることもできる。
　本実施形態によれば、補正式を用いて分析対象物質のシグナルピーク強度比を補正することにより、質量分析装置の機体あるいは装置条件によらず、複数の試料間における分析対象物質の存在比を比較評価することが可能である。また、補正式における補正係数の値がある一定の範囲になるように装置条件を調整することにより、分析対象物質のシグナルピーク強度比をさらに精度よく補正することができる。
［６．質量分析装置の補正値算出システム及びプログラム］
　本発明の一実施形態の質量分析装置の機差補正システムは、
　質量分析装置における補正値を算出するためのキャリブラントの測定メソッドを作成する測定メソッド作成部と、
　前記測定メソッドを用いて取得した質量分析データを解析して補正値を算出する補正値算出部と、
を含む。
　また、本発明の一実施形態の質量分析装置の機差補正用プログラムは、コンピュータに、
　質量分析装置における補正値を算出するためのサンプルを測定する測定メソッドを作成する測定メソッド作成ステップと、
　前記測定メソッドを用いて取得した質量分析データを解析して補正値を算出する補正値算出ステップと、
を実行させることを含む。
　本発明の質量分析装置の機差補正システム及び機差補正用プログラムの一実施形態について、以下に図面を参照して説明する。本実施形態の質量分析装置の補正値算出システム及び補正値算出用プログラムは、上記５－２．に記載のシグナルピーク強度比を規格化する補正（強度比キャリブレーション）を行うための補正値を算出するものである。
　図２０は、本実施形態の質量分析装置の補正値算出システムの概略ブロック図である。図２０に示すように、本システムは、試料に対して測定を実行する質量分析部１と、測定実行前後におけるデータ処理を行うデータ処理部２と、ユーザインターフェイスである入力部３及び表示部４と、を備える。データ処理部２は機能ブロックとして、質量分析部１における補正値を算出するためのサンプルを測定する測定メソッドを作成する測定メソッド作成部２０と、質量分析部１で得られたマススペクトルデータを解析して補正値を算出する補正値算出部２１、を含む。
　質量分析部１は、特に限定されないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法などによる質量分析法が含まれる。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＱｑＱ（エレクトロスプレーイオン化－三連四重極）型質量分析装置、ＥＳＩ－Ｑｑ－ＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化－タンデム四重極－飛行時間）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ（エレクトロスプレーイオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等を用いることができる。
　データ処理部２の実態は、例えば、汎用のパーソナルコンピュータやより高性能のワークステーションである。単体であってもよいし、複数台からなるコンピュータシステムでもよい。このようなコンピュータに専用のデータ処理用プログラムをインストールし、当該コンピュータを動作させることにより、本実施形態が達成される。また、通常、入力部３は、コンピュータに付設されたキーボードやマウスなどのポインティングデバイスである。また、表示部４は、通常、コンピュータに付設されたモニターである。
　質量分析装置は、機体や装置条件によって、同じ試料を測定した場合であっても、測定結果が異なる場合がある。この機体や装置条件による差異をキャンセルするために、５－２．に記載のように、補正を行う。
　測定メソッド作成部２０は、補正値を算出するためのキャリブラントの測定メソッドを自動で作成するものである。測定メソッド作成部２０で作成した測定メソッドに従い、質量分析部１でサンプルを測定する。測定メソッド作成部２０は、さらに設定部２０１を含む。設定部２０１は、前記キャリブラントの測定に用いられるレーザーパワー値を設定する。
　補正値算出部２１は、質量分析部１で測定されたマススペクトルデータを解析し、シグナルピーク強度比を用いて補正値を算出する。
　次に、図２０と図２１を用いて、本実施形態の質量分析装置の補正値算出システム及び補正値算出用プログラムを用いた測定について、詳しく説明する。図２１は、質量分析装置の補正値を算出するための手順を示すフローチャートである。
　使用者は、質量分析装置の補正値算出に用いるサンプルを準備する。サンプルとしては、内部標準物質と目的物質の濃度の比が段階的に異なっている５種類のサンプル（ＩＣ１～５）を用いる。一例として、その濃度の比（内部標準物質の濃度：目的物質の濃度）は、ＩＣ－１が１：４，ＩＣ－２が１：２，ＩＣ－３が１：１，ＩＣ－４が１：０．５，ＩＣ－５が１：０．２５であるものを用いる。
　使用者は、次に測定メソッドを自動作成させる。測定メソッドを作成させる場合に、表示部４に表示されているグラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）の例を図２２に示す。ＧＵＩには、データセット名入力部と、サンプルプレート表示部を含む。使用者は、入力部５を通じた操作により、データセット名を入力し、ファイル作成ボタンを押す（Ｓ１）。
　測定メソッド作成部２０は、入力されたデータセット名の測定メソッドを作成する（Ｓ２、測定メソッド作成ステップ）。具体的には、測定メソッドで用いる質量分析装置のレーザーパワー値を設定するために、予めレーザーパワー値を算出する。さらに、各サンプルＩＣ１～５のサンプル滴下位置を決定する。測定メソッド作成部２０は、表示部４に表示されているＧＵＩにレーザーパワーを表示させ、また、ＧＵＩのサンプルプレート表示部にＩＣ１～５のサンプル滴下位置を図示させる。
　レーザーパワーの算出は公知の種々の方法で行うことができる。
　例えば、以下の方法で行われる。例えば、同一の試料に対しレーザーパワーをｎ段階（ｎは３以上の整数）に変化させつつ、該試料中の特定の成分由来のイオンの信号強度を取得する測定ステップと、前記測定ステップにおいて得られた、ｎ個の信号強度又はその信号強度から求まるＳＮ比である信号値と、レーザーパワーとの関係をプロットした２軸のグラフにおいて、レーザーパワー軸方向に隣接する二つのプロット点を結ぶ直線の傾きをそれぞれ計算し、プロット点毎に、その前方側の直線の傾きである前傾値と後方側の直線の傾きである後傾値との比を反映した指標値を求め、該指標値を利用して適切なレーザーパワーを選定する処理ステップを有する、レーザーパワーの調整方法を用いることができる。
　なお、算出されたレーザーパワーは、サンプルプレートのウェルにより異なる値であってもよい。例えば、本測定メソッドで測定し補正値の算出に用いるサンプルＩＣ１～５を滴下するウェル（キャリブラントウェル）に対して算出されたレーザーパワーは、分析すべき実試料の測定に用いられるウェル（サンプルウェル）において用いられるレーザーパワーと異なる値であってもよい。例えば、キャリブラントウェルにおいて用いられるレーザーパワーを、サンプルウェルにおいて用いられるレーザーパワーよりも１０低くしてもよい。
　サンプル滴下位置の決定は公知の種々の方法で行うことができる。
　決定されたサンプル滴下位置は、図２２に例示されるように、サンプルプレート表示部に表示される。図２２において、例えば、最上段の右端からＩＣ－１，ＩＣ－２，ＩＣ－３，ＩＣ－４，ＩＣ－５を滴下するように決定することができる。
　使用者は、表示部４に示されたサンプル滴下位置に各キャリブラントＩＣ１～５を滴下し、測定を開始する。質量分析部１は、各キャリブラントを所定の条件で測定する（Ｓ３）。
　測定が終了すると、使用者は、補正値の算出の操作を行う。補正値を算出させる場合に、表示部４に表示されているグラフィカルユーザーインタフェース（ＧＵＩ）の例を図２３に示す。使用者は、入力部５を通じた操作により、前記データセット名を選択し、解析ボタンを押す。
　補正値算出部２１は、選択された前記データセット名において質量分析部１で測定されたマススペクトルデータを解析し（Ｓ４）、補正値を算出する（Ｓ５）。補正値算出ステップは、Ｓ４とＳ５を含む。補正値の算出には、例えば、上述の［５．質量分析装置における測定結果の補正］に記載の方法を用いることができる。
　具体的には、各サンプルＩＣ１～５における、内部標準物質のシグナルピーク強度に対する目的物質のシグナルピーク強度の比をそれぞれ算出する。各溶液における内部標準物質に対する目的物質の濃度比と、上記で算出したシグナルピーク強度比との間で累乗回帰式（ｙ＝ａｘb）を算出することができる。算出された回帰式の補正係数ｂを補正値ｂ値として出力する。補正値ｂ値は表示部４のＧＵＩ上に表示される。
　使用者は、その後、分析すべき試料を質量分析部１で測定し、ｂ値を用いて補正された測定結果を得る。
　以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
　多種類のペプチドを、３台の質量分析装置（いずれも同じ機種：Performance）で測定することにより、機体間のピーク強度比の差異を調査した。その結果、ピーク強度比の対数は装置間で直線の関係になることを発見した。機体間で得られた測定値の対数を元に、直線の回帰式を作成してピーク強度比を補正できることを確認した。また、ピーク強度比の対数が直線の関係であることから、対数変換しない場合はべき乗（累乗）の関係になるため、べき乗（累乗）の回帰式（累乗近似式）を作成することでもピーク強度比を補正できることを確認した。
　より実用的な方法にするため、安定同位体標識物質（濃度一定）と標識されていない同じ物質（複数の異なる濃度）からなる強度比キャリブレーション用の試料を用意した。それを質量分析装置で測定し、その強度比と量比から累乗近似式の補正式を作成し、その補正式を用いて対象物質のピーク強度比を補正した。
　回帰式を用いて、各機体で得られたピーク強度比を補正した。この補正により、異なる機体で同一の試料を測定しても、同等のピーク強度比を得ることが可能となった。また、検出器の交換や、電圧変更、劣化により変動するピーク強度比も補正する効果がある。対象物質ごとに安定同位体物質を用意する必要はなく、一種類の安定同位体物質で、対象物質量の比較評価が可能となる。
　この方法はＩＰにより得られたペプチドに限らず、ペプチダーゼなどの酵素によるタンパク質の消化によって生成されたペプチドや、クロマトグラフィーにより分画されたペプチドでも使用可能である。また、ペプチドに限らず糖ペプチドや糖鎖、脂質にも利用できる。
　以下に実施例のより具体的な内容を示す。
［実施例１：ピーク強度比を一台の装置に揃えるための補正方法］
［１－１　血漿中Ａβ及びＡβ関連ペプチドの測定］
　本実施例において分析対象物質となるAβ及びAβ関連ペプチドは次のように調製した。
　血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１）に対し、内部標準ペプチドとしてＳＩＬ－Ａβ１－３８を用いて免疫沈降－質量分析（Immunoprecipitation-mass spectrometry：ＩＰ－ＭＳ）を行った。
　まず、μFocus MALDI plateTM ９００μｍのｗｅｌｌ上に０．５μＬのマトリックス溶液（０．５ｍｇ/ｍＬ　α－cyano－４－hydroxycinnamic acid：ＣＨＣＡ，０．２％（ｗ/ｖ）Methanediphosphonic acid：ＭＤＰＮＡ）を添加し、乾燥させた。
　ＩＰは次のとおりに実施した。抗Ａβモノクローナル抗体（クローン６Ｅ１０及び４Ｇ８）を磁性ビーズに固定化した抗体固定化ビーズをＯＴＧ－ｇｌｙｃｉｎｅバッファー（１％　ｎ－Octyl－β－Ｄ－thioglucoside（ＯＴＧ），５０ｍＭ　glycine，ｐＨ２．８）で２回洗浄、洗浄バッファー１００μＬで３回洗浄した。血漿サンプル２５０μＬに、１０ｐＭ　ＳＩＬ－Ａβ１－３８（AnaSpec, San Jose, CA, USA）を含む結合バッファー（０．２％（ｗ/ｖ）ｎ－Dodecyl－β－Ｄ－maltoside（ＤＤＭ），０．２％（ｗ／ｖ）ｎ－Nonyl－β－Ｄ－thiomaltoside（ＮＴＭ），８００ｍＭ　ＧｌｃＮＡｃ，１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，３００ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）２５０μＬを混合させた後、先ほどの抗体固定化ビーズを加えて４℃で１時間インキュベーションすることによりＡβ及びＡβ関連ペプチドを捕捉した。その後、洗浄バッファー（５００μＬ、又は１００μＬ）で１回洗浄、洗浄バッファー１００μＬで４回洗浄後、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（５０μＬ、又は２０μＬ）で２回洗浄した。さらにＨ2Ｏ（３０μＬ、又は２０μＬ）で１回洗浄した後、５ｍＭ塩酸を含む７０％アセトニトリル５μＬで抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ及びＡβ関連ペプチドを溶出させた。マトリックスが添加されてあるμFocus MALDI plateTM ９００μｍ上の４ｗｅｌｌへ溶出液を１μＬずつ滴下した。それを３台のＡＸＩＭＡ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK）を用いて、ポジティブイオンモードのＬｉｎｅａｒ　ＴＯＦで測定した。マススペクトルは、ラスターモードで４００ヶ所のそれぞれの点に対して４０ショットずつ積算することにより取得した。定量値は、４ｗｅｌｌで測定したスペクトル中の内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）に対する各Ａβ及びＡβ関連ペプチドのピーク強度比を平均した値を用いた。検出限界はＳ/Ｎ＝３に設定し、検出限界以下のピークは検出不可とした。測定したＡβ及びＡβ関連ペプチドのアミノ酸配列は表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［１－２　装置間のピーク強度比の比較解析］
　血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　１）のＩＰ－ＭＳにより得られた内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）に対するＡβ、又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比を図１（Ａ）に示した。同じサンプルに対して３台の同じ機種の質量分析装置（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１～３）を用いて測定したが、ほとんどのＡβ及びＡβ関連ペプチドのピーク強度比は３台とも異なる結果であった。Ａβ１－４０の変動係数（ＣＶ）は４８．７％で、Ａβ１－４２のＣＶは５４．０％を示し、特に３台間の差が大きいことが確認された。一方、Ａβ６－４０のＣＶは３．８％を示し、３台間でほぼ同じ結果が得られていた。Ａβ６－４０はピーク強度比が１に近いが、Ａβ１－４０やＡβ１－４２はピーク強度比が１から離れている。このことから、ピーク強度比が１に近いほど３台間の差が小さく、１から離れるほど（つまり、１よりも小さくなる、又は１よりも大きくなるほど）３台間の差が大きくなる傾向があることが示唆された。
　さらに、ＡＰＰ６６９－７１１に対するＡβ、Ａβ関連ペプチド、又はＳＩＬ－Ａβ１－３８のピーク強度比でも同様に、ピーク強度比が１に近いほど３台間の機体差が小さく、１から離れるほど３台間の差が大きくなる傾向があった（図１（Ｂ））。
　３台の質量分析装置で測定した内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）に対するＡβ、又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比、及び、ＡＰＰ６６９－７１１に対するＡβ、Ａβ関連ペプチド、又はＳＩＬ－Ａβ１－３８のピーク強度比の平均値とＣＶを図２に示す。この図で明らかなように、ピーク強度比が１に近いほど３台間のＣＶが小さく、ピーク強度比が１から離れるほど３台間のＣＶが大きくなっていた。
　３台間のピーク強度比の差異に何らかの法則があるかどうか解析したところ、ピーク強度比を対数に変換した値が各機体間で直線の関係にあることが示された（図３）。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１とＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２間の回帰直線と、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１とＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３間の回帰直線は、共に決定係数Ｒ2≧０．９８５であることから、これらの直線性は良好であることが確認された。各機体間の直線回帰式は下記の通りである。
　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１とＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２間の直線回帰式：
ｙ＝１．２８２ｘ＋０．０４５
　ここで、ｘは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２におけるシグナルピーク強度比を対数変換した値であり、ｙは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１におけるシグナルピーク強度比を対数変換した値である。
　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１とＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３間の直線回帰式：
ｙ＝１．９８１ｘ＋０．０８１
　ここで、ｘは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３におけるシグナルピーク強度比を対数変換した値であり、ｙは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１におけるシグナルピーク強度比を対数変換した値である。
なお、全く同じことではあるが、対数変換しない値では、機体間の関係は累乗近似式で表される（図４）。
　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１とＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２間の累乗近似式：
ｙ＝１．１０８ｘ1.282
　ここで、ｘは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２におけるシグナルピーク強度比の値であり、ｙは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１におけるシグナルピーク強度比の値である。
　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１とＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３間の累乗近似式：
ｙ＝１．２０４ｘ1.981
　ここで、ｘは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３におけるシグナルピーク強度比の値であり、ｙは、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１におけるシグナルピーク強度比の値である。
　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１を標準器とした場合に、これらの回帰式を用いることでＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３で測定された内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）に対するＡβ、又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比を、標準器（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１）と同等のピーク強度比に補正できるかどうかを調べることにした。Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３で測定されたピーク強度比を上記直線回帰式のｘに代入し、ｙを求めることにより補正を行った（図５）。補正後の値を、それぞれＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｃａｌ.）及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｃａｌ.）と表す。その結果、全てのペプチドにおいて３台間の差が小さくなり、ＣＶも低くなった。対数変換値の直線回帰式を用いても、累乗近似式を用いても、補正後の値はそれぞれの同じ値となった。
　この結果は、同じサンプルを異なる質量分析装置で測定しても、補正式でピーク強度比を補正することにより、同じピーク強度比が得られることを示している。言い換えると、この補正式は質量分析装置の機体の違いにより生じたピーク強度比の誤差（機差）を排除することが可能であることを示している。
　ピーク強度比の対数が各機体間で直線の関係にある要因としては、質量分析の検出器で用いている二次電子増倍管（Secondary Electron Multiplier；ＳＥＭ）がイオンの電気信号を指数関数的に増幅させることにより大きな信号を得ていることにあると考えられる。
［１－３　補正式の妥当性検証］
　１－２で作成された補正式が他のサンプルでも適用可能かどうかを調べるために、上述の１－１で用いたサンプルとは異なる血漿サンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．２及びＮｏ．３）に対してＩＰ－ＭＳを行い、補正前と後のピーク強度比を比較した。ＩＰ－ＭＳは１－１と同じ方法で実施し、補正式は１－２において算出した、ピーク強度比の対数変換値に対する直線回帰式を用いた。その結果、Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．２とＮｏ．３ともに、補正することにより３台間で同等のピーク強度比を得られることが確認された（図６、７）。機体によっては検出感度が足りないペプチドもあり、その場合の検出限界以下のデータに関してはＮＤ(Not detectable)と示している。
　これらの結果は、１－２で作成された補正式を用いて補正を行うことで、どのサンプル（Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ．１、Ｎｏ．２及びＮｏ．３）においても３台のそれぞれの機体での測定において同等のピーク強度比を導き出せることを示しており、この補正式の妥当性を証明している。
［１－４　補正式の再現性検証］
　１－２で作成された補正式の再現性を検証することにした。１－１と異なる日に、１－１と同様の手順でＩＰ－ＭＳを実施し、補正式（対数変換値に対する直線回帰式）を作成した（図８、９）。１－１を実施した日をＤａｙ１とし、新たに補正用回帰式（対数変換値に対する直線回帰式）を作成した日をＤａｙ２と呼ぶ。Ｄａｙ１及びＤａｙ２で得られた各機体間の補正式は表２の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ｄａｙ１とＤａｙ２で得られた各機体間の補正式が同じかどうかを共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）により検証した。まず、ＡＮＣＯＶＡの４群の検定においてｐ＜０．０５を統計学的有意と設定して解析したところ、傾きがｐ＜０．０００１を示した。このことから、４群間で統計学的有意に異なることが証明された。
　次に、ＡＮＣＯＶＡによる４群の対比較を行った（表３）。この場合４回検定を実施することになるため、Bonferroniの調整を行ってｐ＜０．０１２５を統計学的有意と設定した。まずは回帰式の傾きの検定を行い、有意な差が認められなければ、次に回帰式の切片の検定を行った。その結果、
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｄａｙ１）　ｖｓ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｄａｙ１）と
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｄａｙ２）　ｖｓ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｄａｙ２）
の二つの比較では回帰式が異なることが証明され、
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｄａｙ１）　ｖｓ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　２（Ｄａｙ２）と
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｄａｙ１）　ｖｓ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３（Ｄａｙ２）
の２つの比較では回帰式が同じことが証明された。これらの結果は、補正式が機体によって固有の回帰式が存在しており、検出器の劣化等により装置の状態が変化しない限り、回帰式は測定した日にちによって変動しないことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２：ピーク強度比を規格化して補正する方法］
［２－１　血漿中Ａβ及びＡβ関連ペプチドの測定］
　本実施例において分析対象物質となるＡβ及びＡβ関連ペプチドは次のように調製した。
　抗Ａβモノクローナル抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）と質量分析（ＭＳ）を組み合わせたＩＰ－ＭＳを用いてヒト血漿中Ａβ関連ペプチドを測定した。ＩＰでは抗Ａβ抗体クローン６Ｅ１０(BioLegend)を磁性ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｅｐｏｘｙ(Thermo Fisher Scientific)に共有結合させて、抗体ビーズを使用した。血漿２５０μＬと内部標準ペプチドを含む反応溶液２５０μＬを混合し、抗体ビーズと混ぜて、１時間４℃で抗原抗体反応させた（１ｓｔ　ＩＰ）。内部標準（internal standard）ペプチドは１１ｐＭ安定同位体標識（ＳＩＬ）Ａβ１－３８を使用した。抗原抗体反応後、抗体ビーズを洗浄し、１ｓｔ　ＩＰ溶出液（ＤＤＭを含むグリシン緩衝液（ｐＨ２．８））を用いてＡβ関連ペプチドを溶出した。ＤＤＭを含むトリス緩衝液で中性に戻した後、もう一度、抗体ビーズでＡβ関連ペプチドと抗原抗体反応させ（２ｎｄ　ＩＰ）、洗浄後、Ａβ関連ペプチドを２ｎｄ　ＩＰ溶出液（５ｍＭ　ＨＣｌ，０．１ｍＭ　Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）で溶出した。予め、０．５ｍｇ／ｍＬ　ＣＨＣＡ／０．２％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡ０．５μＬを滴下、乾燥させたμFocus MALDI plateTM９００μｍ（Hudson Surface Technology, Inc., Fort Lee, NJ）の４ｗｅｌｌ上へ、ＩＰ後の溶出液を滴下して乾燥させた。
　マススペクトルデータはＡＸＩＭＡ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK）を用いて、ポジティブイオンモードのＬｉｎｅａｒ　ＴＯＦで取得した。Ｌｉｎｅａｒ　ＴＯＦのｍ／ｚ値はピークのアベレージマスで表示した。ｍ／ｚ値は外部標準としてhuman angiotensin II とhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulinを用いてキャリブレーションした。マススペクトルは、ラスターモードで４００ヶ所のそれぞれの点に対して４０ショットずつ積算することにより取得した。定量値は、４ｗｅｌｌで測定したスペクトル中の内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）に対する各Ａβ及びＡβ関連ペプチドのピーク強度比を平均した値を用いた。検出限界はＳ／Ｎ＝３に設定し、検出限界以下のピークは検出不可とした。
［２－２　強度比キャリブラント（ＩＣ）測定］
　ＩＰ－ＭＳで取得したＳＩＬ－Ａβ１－３８に対する各Ａβ及びＡβ関連ペプチドのピーク強度比を補正するための強度比キャリブラント（Intensity ratio Calibrant; ＩＣ）試薬の濃縮液５種類を表４の組成で調製し、冷凍保存した。ＭＳ測定前に、ＩＣ－１～５濃縮液を解凍し、２－１の２ｎｄ　ＩＰ溶出液（５ｍＭ　ＨＣｌ，０．１ｍＭ　Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）で１０倍希釈してＩＣ－１～５を調製し、予め０．５ｍｇ／ｍＬ　ＣＨＣＡ／０．２％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡ　０．５μＬを滴下、乾燥させたμFocus MALDI plateTM９００μｍ上へ、ＩＣ－１～５を１μＬずつ４ウェルに滴下して乾燥させた。ＩＣ－１～５のタンパク質・ペプチド組成を表５に示す。ＩＣ－１～５におけるＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ１－３８の量比は、それぞれ４，２，１，１／２，１／４とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＩＣ－１～５それぞれのマススペクトルデータは２－１と同様の手段で取得した。
［２－３　強度比補正］
　検出器の交換前後のＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機、及びＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　３号機の３条件において、ヒト血漿のＩＰ－ＭＳ及びＩＣ－１～５測定を実施した。
　ＩＣ－１～５のマススペクトルのＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ１－３８の強度比と量比から、累乗近似式を作成した（図１０）。図１０に示される通り、機体の状態によって、同じ存在量比でもピーク強度比が異なるため、累乗近似式も異なる。それぞれの累乗近似式をｙ＝ｘに揃えることで補正処理を行う。
　累乗近似式：ｙ＝ａｘb
　ここで、ｘは、Ａβ１－３８／ＳＩＬ－Ａβ１－３８の量比、ｙは、Ａβ１－３８／ＳＩＬ－Ａβ１－３８のピーク強度比であり、ａ及びｂは近似式における係数である。
　図１０（Ａ）において、
ｙ＝１．００３２ｘ1.0402
　図１０（Ｂ）において、
ｙ＝１．０４１３ｘ0.8182
　図１０（Ｃ）において、
ｙ＝１．０３５３ｘ0.7714
　図４や図１０で示される通り、累乗近似式のａ値は機体の状態によって変わらないが、ｂ値は機体の条件によって大きく影響されることから、ＩＣ測定で得られたａ値とｂ値とを用いて補正を行う方法と、ａの値は１に固定し（ａ＝１）、ｂ値のみを用いて補正を行う方法の２通りで評価を行った。
　ＩＰ－ＭＳのマススペクトルからＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比をそれぞれ算出し、強度比をＩＣ曲線、すなわち、ＩＣ－１～５の測定結果を用いて算出された累乗近似式に当てはめ補正した。具体的にはｙにＩＰ－ＭＳのピーク強度比を代入し、ｘを求めることで、ｙ＝ｘに揃える操作を行う。ピーク強度比の４重測定データ（ｎ＝４）の平均値を算出して解析に用いた。
　累乗近似式のａの値は１に固定し（ａ＝１）、ｂ値のみを用いて補正を行う方法を用いて補正した結果を図１１に示す。ＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ、又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比が、累乗近似式による補正により３条件間の差が小さくなり、変動係数（ＣＶ）が補正前１６．８～２１．５％から補正後３．９～１３．６％に小さくなった。
　また、バイオマーカーとして機能するＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２とＡβ１－４０／Ａβ１－４２についても評価した。補正前の段階で二つのピーク強度の差が小さく、強度比が１に近いためＣＶも十分に小さいＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２には効果が認められなかったが、強度比が大きいＡβ１－４０／Ａβ１－４２は補正前が４１．１％だったＣＶが補正後には８．０％になっていた（図１２）。
　なお、ａ値とｂ値とを用いて補正を行う方法でも３条件間のＳＩＬ－Ａβ１－３８に対するＡβ、又はＡβ関連ペプチドのピーク強度比のＣＶが小さくなる効果が認められ、バイオマーカーについてはａ＝１とした方法と全く同じ結果が得られた（図１３、１４）。
　以上結果から、本補正方法により装置間のピーク強度比のばらつきが小さくなる効果があることが示された。また、ａ値は機体の状態によって変わらないため、ｂ値のみを補正値として用いた場合であっても、装置間のピーク強度比のばらつきが小さくなる効果が得られることが示された。実施例２の方法は、ピーク強度比を累乗近似式により規格化するため、特定の機体を標準器とする必要なく、適用できる。
［２－４　強度比補正の検証］
　標準血漿に３種のＡβペプチド（Ａβ１－４０、Ａβ１－４２、及びＡＰＰ６６９－７６６）及び内部標準ペプチドをスパイクしたサンプルをＩＰ処理し、３台のＡＸＩＭＡ－ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅでＩＣ試薬とともに測定を行った。測定した機体と検出器電圧、及び、ＩＣ測定の結果から算出されたｂ値は表６の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　なお、ｂ値と検出器電圧に相関があるため、ｂ値を検出器電圧で調整することができる。
　得られたマススペクトルから内部標準に対するＡβ１－４０、Ａβ１－４２、及びＡＰＰ６６９－７６６の強度比を読み取り、この強度比をｂ値で補正しない場合とする場合で、バイオマーカー（ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２とＡβ１－４０／Ａβ１－４２）を比較した。
　図１５はＡβ１－４０／Ａβ１－４２比の補正前後での比較である。補正前のデータは３台でのばらつきが大きく、さらに１台で検出器電圧を変更した場合もばらつきが大きい。ｂ値を用いた補正を行うことで、３台のばらつきが抑えられ、一台で検出器電圧を変更した際もペプチド比が一定に保たれることが確認できた。
　図１６はＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２比の補正前後での比較である。ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２比は強度差が小さく、補正前でも３台間のばらつき及び１台で検出器電圧を変更した場合のばらつきは小さい。しかし、ｂ値を用いた補正を行うことで、よりばらつきが低く抑えられることが確認できた。
　次の表７はｂ値に着目してデータを分類し、各Ａβペプチド比のＣＶを計算したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　「全体」は６条件測定すべてで計算したＣＶ
　「１機体内で検出器電圧変更」は、Ｐ１号機で検出器電圧を変更して取得した三条件のＣＶ
　「３機体でｂ値のばらつき小」は、３機体でｂ値が０．９５に近い条件の測定結果で出したＣＶ
　「３機体でｂ値のばらつき大」は、３機体でｂ値がバラバラの３条件での測定結果で出したＣＶ
　「３機体でｂ値のばらつき小」はもともとＣＶが低く、補正前後で大きな違いはないが、その他の場合はｂ値による補正でＣＶが大きく減少していることが分かる。これは１台間で装置設定を変えた時でも、異なる機体で装置状態が異なる場合でも、ｂ値による補正が有効であることを示している。
［実施例３：補正値ｂ値の調整１］
　実施例２の２－４に記載のとおり、ｂ値と検出器電圧に相関があるため、ｂ値を検出器電圧で調整することができる。以下に、ｂ値と検出器電圧の関係を調べた結果を示す。
　キャリブレーション物質として、イオン化効率の等しい通常のＡβ１－３８と安定同位体標識したＳＩＬ－Ａβ１－３８を用いて、ＩＣ測定を行った。ＩＣ１～５として、実施例２の２－２で用いたものと同じものを用いた。
　質量分析装置Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　４号機において、検出器電圧を２７００Ｖ，２７５０Ｖ，２８００Ｖ，２８５０Ｖ，２９００Ｖ，２９５０Ｖとした場合のそれぞれで、ＩＣ測定を行った。各検出器電圧での測定結果を用いて、実施例２の２－３のように、それぞれ補正式（累乗近似式：ｙ＝ａｘb）を求めた。図１７は、検出器電圧と補正式のｂ値の関係を示す図である。縦軸はｂ値、横軸は検出器電圧（Ｖ）である。
　質量分析装置Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機において、検出器電圧を２７００Ｖ，２７２５Ｖ，２７５０Ｖ，２７７５Ｖ，２８００Ｖ，２８２５Ｖとした場合のそれぞれで、ＩＣ測定を行った。各検出器電圧での測定結果を用いて、実施例２の２－３のように、それぞれ補正式（累乗近似式：ｙ＝ａｘb）を求めた。図１８は、検出器電圧と補正式のｂ値の関係を示す図である。縦軸はｂ値、横軸は検出器電圧である。
　図１７及び図１８に示されるように、検出器電圧を上げると、ｂ値が低下する傾向が確認された。ｂ値が１．１以上の場合、検出器電圧を２５Ｖ上げるとｂ値が約０．１５程度変化し、ｂ値が１．１以下の場合、検出器電圧を２５Ｖ上げるとｂ値が約０．０３～０．０７変化した。
　このような検出器電圧とｂ値の関係を用いて、検出器の劣化等によりｂ値が上昇した場合に、検出器電圧を増加させてｂ値を一定の範囲に調整することが可能である。ｂ値を一定の範囲に調整することにより、分析対象物質のシグナルピーク強度比をさらに精度よく補正することができ得る。例えば、ｂ値の範囲を０．９～１．１とするように調整してもよい。
［実施例４：補正値ｂ値の調整２］
　ｂ値を調製する別の手段として、アナログ－デジタル変換器（ＡＤコンバータ）のベースラインレベルの調整があげられる。以下に、ｂ値とＡＤコンバータのベースラインレベル設定、およびの検出器電圧の関係を調べた結果を示す。
　キャリブレーション物質として、イオン化効率の等しい通常のＡβ１－３８と安定同位体標識したＳＩＬ－Ａβ１－３８を用いて、ＩＣ測定を行った。ＩＣ１～５として、実施例２の２－２で用いたものと同じものを用いた。
　質量分析装置Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１号機において、検出器電圧を２７００Ｖ，２７２５Ｖ，２７５０Ｖ，２７７５Ｖ，２８００Ｖ，２８２５Ｖとした場合のそれぞれで、ＩＣ測定を行った。ＡＤコンバータのベースラインレベルは、通常設定である１８１と、そこからベースラインレベル設定を下げ、ノイズレベルを上げた状態（１７９）との２条件とした。２つのベースラインレベルにおいて、それぞれデータを取得した。各検出器電圧での測定結果を用いて、実施例２の２－３のように、それぞれ補正式（累乗近似式：ｙ＝ａｘb）を求めた。図１９は、検出器電圧と補正式のｂ値の関係を示す図である。縦軸はｂ値、横軸は検出器電圧（Ｖ）である。丸のデータポイントがベースライン設定１８１、四角のデータポイントがベースライン設定１７９である。
　図１９に示されるように、同じ検出器電圧でも、ベースラインレベル設定を下げることでｂ値が低下する傾向が確認された。ｂ値が１．１以上の場合、ベースライン設定を２下げるとｂ値が約０．２～０．３５程度低下し、ｂ値が１．１以下の場合、ベースライン設定を２下げるとｂ値が約０．１５程度低下した。
　このようなＡＤコンバータのベースライン設定とｂ値の関係を用いて、検出器の劣化等によりｂ値が上昇した場合に、ベースライン設定を下げてｂ値を一定の範囲に調整することが可能である。ｂ値を一定の範囲に調整することにより、分析対象物質のシグナルピーク強度比をさらに精度よく補正することができ得る。例えば、ｂ値の範囲を０．９～１．１とするように調整してもよい。
　本発明には、例えば、以下の形態が含まれる。
（１）
　質量分析装置で、２つ以上のキャリブレーション物質を含むキャリブラントを測定して、前記キャリブレーション物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
　前記２つ以上のキャリブレーション物質のうちの１つのキャリブレーション物質のシグナルピークの強度に対する他のキャリブレーション物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
　前記シグナルピーク強度比から補正式を求める工程と、
　前記質量分析装置で、２つ以上の分析対象物質を含む試料を測定して、前記分析対象物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
　前記２つ以上の分析対象物質のうちの１つの分析対象物質のシグナルピークの強度に対する他の分析対象物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
　前記補正式を用いて前記分析対象物質の前記シグナルピーク強度比を補正する工程と、
を含む質量分析におけるシグナル強度比の機差補正方法。
（２）
　前記キャリブレーション物質が、安定同位体標識された物質と、安定同位体標識されていない物質とを含む、上記（１）に記載の補正方法。
（３）
　前記分析対象物質が、ペプチド、糖ペプチド、糖鎖、脂質、及び糖脂質からなる群に属する物質から選ばれる、上記（１）又は（２）に記載の補正方法。
（４）
　前記キャリブレーション物質が、Ａβ関連ペプチドである、上記（１）～（３）のいずれかに記載の補正方法。
（５）
　前記キャリブレーション物質が、Ａβ１－３８と、安定同位体標識されたＡβ１－３８である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の補正方法。
（６）
　前記キャリブラントが、３種類以上のキャリブレーション物質を含む、上記（１）～（５）のいずれかに記載の補正方法。
（７）
　前記キャリブラントが、複数であり、
　複数の前記キャリブラントは、前記シグナルピーク強度比を求めるべき前記キャリブレーション物質のうち少なくとも１つのキャリブレーション物質の濃度がそれぞれ異なる、上記（１）～（６）のいずれかに記載の補正方法。
（８）
　１つのキャリブレーション物質の濃度に対する他のキャリブレーション物質の濃度の比が、１／４～４の範囲である、上記（７）に記載の補正方法。
（９）
　前記補正式を求める工程において、前記シグナルピーク強度比を対数変換した値を用いて補正式を求める、上記（１）～（８）のいずれかに記載の補正方法。
（１０）
　前記補正式が、線形、多項式、指数、対数、又は累乗の補正式である、上記（１）～（９）のいずれかにに記載の補正方法。
（１１）
　前記補正式における係数が所定の値の範囲である、上記（１）～（１０）のいずれかに記載の補正方法。
（１２）
　前記補正式における前記係数は、前記質量分析装置の検出器電圧及び／又はＡＤコンバータのベースラインレベルを調整することにより、前記所定の値の範囲に調整される、上記（１１）に記載の補正方法。
（１３）
　前記補正式が、累乗近似式：
　ｙ＝ａｘb
　（ここで、ｘは、基準となるシグナルピーク強度比、又は濃度比であり、ｙは、補正式を求めるべき質量分析装置において得られたシグナルピーク強度比であり、ａは、近似式における係数であり、ｂは、近似式における係数であり、かつ、補正値である）
で表される、上記（１）～（１２）のいずれかに記載の補正方法。
（１４）
　質量分析装置における補正値を算出するためのキャリブラントの測定メソッドを作成する測定メソッド作成部と、
　前記測定メソッドを用いて取得した質量分析データを解析して補正値を算出する補正値算出部と、
を含む質量分析装置の機差補正システム。
（１５）
　前記測定メソッド作成部が、前記キャリブラントの測定に用いられるレーザーパワー値を予め算出されたレーザーパワー値に設定する設定部を含む、上記（１４）に記載の機差補正システム。
（１６）
　前記質量分析装置のサンプルプレートを表示するサンプルプレート表示部を含む、上記（１４）又は（１５）に記載の機差補正システム。
（１７）
　前記サンプルプレート表示部は、前記測定メソッドにおけるサンプル滴下位置を示す、
上記（１６）に記載の機差補正システム。
（１８）
　前記設定部は、サンプルウェルとキャリブラントウェルにそれぞれ異なるレーザーパワー値を設定する、
上記（１５）～（１７）のいずれかに記載の機差補正システム。
（１９）
　コンピュータに、
　質量分析装置における補正値を算出するためのサンプルを測定する測定メソッドを作成する測定メソッド作成ステップと、
　前記測定メソッドを用いて取得した質量分析データを解析して補正値を算出する補正値算出ステップと、
を実行させることを含む質量分析装置の機差補正用プログラム。
　１　質量分析部
　２　データ処理部
　２０　測定メソッド作成部
　２０１　設定部
　２１　補正値算出部
　３　入力部
　４　表示部

Claims (19)

  1. 　質量分析装置で、２つ以上のキャリブレーション物質を含むキャリブラントを測定して、前記キャリブレーション物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
    　前記２つ以上のキャリブレーション物質のうちの１つのキャリブレーション物質のシグナルピークの強度に対する他のキャリブレーション物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
    　前記シグナルピーク強度比から補正式を求める工程と、
    　前記質量分析装置で、２つ以上の分析対象物質を含む試料を測定して、前記分析対象物質のそれぞれのシグナルピークを得る工程と、
    　前記２つ以上の分析対象物質のうちの１つの分析対象物質のシグナルピークの強度に対する他の分析対象物質のシグナルピークの強度のシグナルピーク強度比を求める工程と、
    　前記補正式を用いて前記分析対象物質の前記シグナルピーク強度比を補正する工程と、
    を含む質量分析におけるシグナル強度比の機差補正方法。
  2. 　前記キャリブレーション物質が、安定同位体標識された物質と、安定同位体標識されていない物質とを含む、請求項１に記載の補正方法。
  3. 　前記分析対象物質が、ペプチド、糖ペプチド、糖鎖、脂質、及び糖脂質からなる群に属する物質から選ばれる、請求項１に記載の補正方法。
  4. 　前記キャリブレーション物質が、Ａβ関連ペプチドである、請求項１に記載の補正方法。
  5. 　前記キャリブレーション物質が、Ａβ１－３８と、安定同位体標識されたＡβ１－３８である、請求項１に記載の補正方法。
  6. 　前記キャリブラントが、３種類以上のキャリブレーション物質を含む、請求項１に記載の補正方法。
  7. 　前記キャリブラントが、複数であり、
    　複数の前記キャリブラントは、前記シグナルピーク強度比を求めるべき前記キャリブレーション物質のうち少なくとも１つのキャリブレーション物質の濃度がそれぞれ異なる、請求項１に記載の補正方法。
  8. 　１つのキャリブレーション物質の濃度に対する他のキャリブレーション物質の濃度の比が、１／４～４の範囲である、請求項７に記載の補正方法。
  9. 　前記補正式を求める工程において、前記シグナルピーク強度比を対数変換した値を用いて補正式を求める、請求項１に記載の補正方法。
  10. 　前記補正式が、線形、多項式、指数、対数、又は累乗の補正式である、請求項１に記載の補正方法。
  11. 　前記補正式における係数が所定の値の範囲である、請求項１に記載の補正方法。
  12. 　前記補正式における前記係数は、前記質量分析装置の検出器電圧及び／又はＡＤコンバータのベースラインレベルを調整することにより、前記所定の値の範囲に調整される、請求項１１に記載の補正方法。
  13. 　前記補正式が、累乗近似式：
    　ｙ＝ａｘb
    　（ここで、ｘは、基準となるシグナルピーク強度比、又は濃度比であり、ｙは、補正式を求めるべき質量分析装置において得られたシグナルピーク強度比であり、ａは、近似式における係数であり、ｂは、近似式における係数であり、かつ、補正値である）
    で表される、請求項１に記載の補正方法。
  14. 　質量分析装置における補正値を算出するためのキャリブラントの測定メソッドを作成する測定メソッド作成部と、
    　前記測定メソッドを用いて取得した質量分析データを解析して補正値を算出する補正値算出部と、
    を含む質量分析装置の機差補正システム。
  15. 　前記測定メソッド作成部が、前記キャリブラントの測定に用いられるレーザーパワー値を予め算出されたレーザーパワー値に設定する設定部を含む、請求項１４に記載の機差補正システム。
  16. 　前記質量分析装置のサンプルプレートを表示するサンプルプレート表示部を含む、請求項１４に記載の機差補正システム。
  17. 　前記サンプルプレート表示部は、前記測定メソッドにおけるサンプル滴下位置を示す、
    請求項１６に記載の機差補正システム。
  18. 　前記設定部は、サンプルウェルとキャリブラントウェルにそれぞれ異なるレーザーパワー値を設定する、請求項１５に記載の機差補正システム。
  19. 　コンピュータに、
    　質量分析装置における補正値を算出するためのサンプルを測定する測定メソッドを作成する測定メソッド作成ステップと、
    　前記測定メソッドを用いて取得した質量分析データを解析して補正値を算出する補正値算出ステップと、
    を実行させることを含む質量分析装置の機差補正用プログラム。
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