ES2291328T3 - Dispositivo de referencia para evaluar el funcionamiento de un microscopio de barrido con laser confocal, un metodo y un sistema para realizar dicha evaluacion. - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo de referencia para evaluar el funcionamiento de un microscopio de barrido con rayo láser confocal, de manera que dicho dispositivo de referencia se caracteriza por que comprende: (a) un sustrato (43, 53), y (b) materia fluorescente de referencia distribuida por toda la superficie de dicho sustrato (43, 53), teniendo dicha materia fluorescente de referencia una distribución espacial predeterminada por dicha superficie y estando dicha materia fluorescente de referencia disuelta en un líquido en una concentración predeterminada.
Description
Dispositivo de referencia para evaluar el
funcionamiento de un microscopio de barrido con láser confocal, un
método y un sistema para realizar dicha evaluación.
La presente invención se refiere a un
dispositivo de referencia para evaluar el funcionamiento de un
microscopio de barrido con láser confocal.
La invención se refiere en particular a un
dispositivo de referencia para evaluar el funcionamiento de un
microscopio de barrido con láser confocal del tipo utilizado para
realizar una medición bidimensional cuantitativa de la
fluorescencia de la materia de prueba distribuida sobre una
superficie plana de un primer sustrato de vidrio en particular, una
micromatriz multigénica o genochip y microchip de ADN o similares,
por ejemplo, una micromatriz multigénica del tipo descrito en la
patente americana 5.143.854.
Esta invención también hace referencia a un
método para evaluar el funcionamiento de un microscopio de barrido
con láser confocal, y en particular de un microscopio de barrido con
láser confocal del tipo anteriormente mencionado.
La invención se refiere más en particular a un
método de evaluación que permita la caracterización de un
microscopio de barrido con láser confocal del tipo anteriormente
mencionado en lo que se refiere a la sensibilidad de detección
cuantitativa de la señal, el límite de detección, la uniformidad del
volumen confocal sobre el campo de barrido de visión, la resolución
espacial del proceso de barrido y el comportamiento dinámico de la
señal medida por el campo de barrido de la visión, correspondiendo
dicha señal medida a la luz fluorescente recibida.
La invención se refiere además a un sistema para
evaluar el funcionamiento de un microscopio de barrido con láser
confocal que sea apto para ser utilizado para realizar una medición
de fluorescencia cuantitativa bidimensional de la materia de prueba
distribuida sobre una superficie plana de un sustrato.
Los dispositivos de referencia para evaluar el
funcionamiento de los instrumentos para realizar mediciones ópticas
han sido descritos, por ejemplo, por la Especificación de la patente
americana 5.581.631 y por la Especificación de la patente americana
4.662.745.
La especificación de la patente americana
5.581.631 describe un aparato para verificar la linealidad del
sistema de recogida de imágenes en un sistema citológico, es decir,
un sistema que comprende un microscopio de transmisión y los
objetivos del microscopio biológico. En este aparato una imagen
primitiva que comprende una estructura periódica, por ejemplo, un
portaobjetos de calibración, por ejemplo, una placa de vidrio con un
código de barras en la misma, se coloca en el plano focal del
objeto de un sistema de recogida de imágenes, se obtiene una imagen
de la imagen primitiva y se procesa la información de la imagen, por
ejemplo, para comprobar la linealidad del sistema, estando definida
la linealidad como el cambio en el voltaje fuera del sistema con
respecto a la entrada del nivel de luz, para comprobar la respuesta
de la frecuencia del sistema usando una función de transferencia de
la modulación, y /o para determinar un cociente del sistema señal
frente a ruido para regiones específicas del espectro de
frecuencia.
La especificación de la patente americana
4.662.745 describe una placa de calibración que tiene
características conocidas tanto de la reflectancia como de la
luminiscencia para calibrar por efecto de campo un instrumento
adaptado para medir la energía luminosa que emana de una célula
fotoluminiscente en unas estrechas bandas de frecuencia en la
región visible y casi visible del espectro. La placa de calibración
descrita por la Especificación de patentes nr. 4.662.745 se fabrica
uniendo un revestimiento de cerámica o vidrio que contiene un
material fotoluminiscente de tierras raras a un sustrato rígido,
como una placa de acero, y el revestimiento de cerámica es
posteriormente chorreado con arena con un abrasivo fino.
El principio o fundamento de la microscopía de
barrido con láser confocal para la medición bidimensional de la
fluorescencia cuantitativa se muestra en las figuras 1 y 2. La
figura 1 muestra la instalación óptica de un microscopio de barrido
con láser confocal de punto móvil bidimensional, usando para la
excitación de la fluorescencia un haz de rayos láser 11, un divisor
o separador de haz dicroico 12, un motor explorador biaxial 13 para
la deflexión espacial del haz en dos direcciones ortogonales
(X-Y) y una lente 14 para focalizar el haz de rayos
láser en un plano del objeto 15. La luz fluorescente de una longitud
de onda mayor que el láser de excitación 11 es generada excitando
las moléculas fluorescentes en el plano del objeto 15.
La luz fluorescente emitida por los fluoróforos
localizados en el plano del objeto 15 del área barrida es recogida
por la lente 14 y luego transmitida por medio del motor explorador
13 y el separador del haz dicroico 12 como un haz de luz
fluorescente 17 que es concentrado por la lente 18 en una abertura
puntiforme 19 en un plano conjugado 21 frente al dispositivo de
fotodetección 22.
El concepto de imagen confocal que se utiliza
frecuentemente para discriminar la señal de fluorescencia
generalmente débil procedente de la radiación de fondo, se muestra
en la figura 2. Solamente la radiación óptica procedente del
volumen confocal Vc, es decir, la señal de fluorescencia, es
detectada por el fotodetector 22. Vc es definido por la función de
transferencia óptica de la óptica de detección (OTFem) y el tamaño
del poro detector 19 en el plano conjugado 21. Índices de supresión
de fondo superiores dan lugar a volúmenes confocales Vc
inferiores.
El tamaño del campo de visión explorado es
habitualmente del orden de 20 x 20 milímetros cuadrados. El volumen
confocal es generalmente del orden de Vc = 5 x 5 x 50 micrómetros
cúbicos, donde Ac = 5 x 5 micrómetros cuadrados y zc = 50
micrómetros es aproximadamente el tamaño del punto y la distribución
de Rayleigh del haz de rayos láser concentrado, respectivamente. El
tamaño del píxel del motor explorador 13 para el barrido del haz de
rayos láser 11 en el campo de visión es típicamente de 1 a 20
micrómetros.
Las micromatrices multigénicas o genochips de
ADN, por ejemplo, las descritas en la patente americana nr.
5.143.854, consisten en un chip de vidrio que lleva un sistema
químico subdividido en celdas adyacentes, denominadas
frecuentemente rasgos distintivos. Los rasgos distintivos se
caracterizan por unas sondas específicas. Las secuencias
específicas de ácido nucleico son inmovilizadas (capturadas) por las
sondas y marcadas con un colorante fluorescente. La cantidad de
ácido nucleico capturado en cada uno de los rasgos distintivos se
detecta utilizando una medición cuantitativa de la fluorescencia
(el colorante fluorescente emite luz cuando es excitado por la
energía luminosa de una longitud de onda determinada) mediante la
lectura secuencial de píxeles (barrido) de los rasgos distintivos.
Los rasgos distintivos son muestreados espacialmente mediante el
procedimiento de barrido (es decir, número de píxeles > número
de rasgos distintivos) para obtener una referencia espacial exacta
del chip de vidrio mediante el análisis numérico de los datos y para
una mayor calidad de las señales de dichos rasgos distintivos
promediando las intensidades luminosas medidas físicamente. Los
tamaños típicos de los píxeles son del orden de 1 a 20
micrómetros.
El cociente del campo de visión barrido respecto
a la sección transversal Ac del volumen confocal es claramente alto
en la microscopía de barrido con rayo láser confocal, es decir,
"campo de visión barrido"/"sección transversal Ac del
volumen confocal">>1, lo que fácilmente conduce a una
posición x-y que depende de la función de
transferencia óptica OTF (x,y) = OTFex* OTFem, donde OTFex y OTFem
son las funciones de transferencia ópticas de la óptica de
excitación y de emisión, respectivamente. La dependencia de la
posición x-y se debe principalmente a la mala
alineación mecánica y a las imperfecciones de los componentes
ópticos y opto-mecánicos, como por ejemplo, el
motor explorador utilizado para el barrido. Produce una sensibilidad
poco homogénea sobre el campo de visión barrido, tal como se
representa esquemáticamente en las figuras 3a, 3b y 3c y esto en
cambio conduce a unas mediciones erróneas de la fluorescencia
cuantitativa. Como un ejemplo de ello, la figura 4 muestra
esquemáticamente la imagen explorada de un genochip de ADN, por
ejemplo, del tipo descrito en la patente americana nr. 5.143.854,
que tiene un patrón o modelo tipo tablero de ajedrez. Tal como se
describe a continuación con respecto a la figura 4, la imagen
explorada o barrida tiene un nivel de señal inferior en la esquina
superior derecha, debido a la densidad poco homogénea de los
fluoróforos en el objeto escaneado o bien debido a la sensibilidad
poco homogénea del microscopio de barrido con rayo láser confocal
sobre el campo de visión barrido.
Existe por lo tanto una necesidad de una
medición cuantitativa fidedigna y de una evaluación de la
sensibilidad en el campo de visión barrido de un microscopio de
barrido con rayo láser confocal del tipo anteriormente des-
crito.
crito.
La disponibilidad de un objeto de referencia
estándar apropiado permitirá discriminar entre las contribuciones
del objeto del instrumento y del objeto escaneado (por ejemplo, un
genochip de ADN del tipo descrito en la patente americana nr.
5.143.854) a la no uniformidad observada en la figura 4. Sin
embargo, todavía no se tiene información alguna sobre los objetos
de referencia fluorescentes para caracterizar funcionamientos clave
de un microscopio de barrido con rayo láser confocal, es decir,
sensibilidad, límite de detección, el comportamiento dinámico de la
uniformidad, de la resolución espacial y de la señal en todo el
campo de visión explorado.
Existe por lo tanto una necesidad de un objeto
de referencia estándar apropiado que permita discriminar entre las
contribuciones del objeto explorado y del objeto del instrumento a
una no uniformidad del tipo representado en la figura 4.
El objetivo de la invención consiste por tanto
en aportar un dispositivo de referencia, un método y un sistema del
tipo anteriormente mencionado que permita evaluar de forma
cuantitativa el funcionamiento de un microscopio de barrido con
rayo láser confocal para realizar mediciones de fluorescencia
cuantitativas y bidimensionales.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención
este objetivo se logra con un dispositivo de referencia que
comprende los rasgos distintivos definidos por la reivindicación
1.
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención el objetivo anteriormente mencionado se logra con un
sistema como el definido por la reivindicación 10.
Las ventajas principales que se tienen con un
dispositivo de referencia, un método y un sistema conforme a la
invención son que estos permiten una evaluación cuantitativa y
altamente precisa del funcionamiento de un microscopio con rayos
láser confocal para el barrido de los genochips de ADN del tipo
anteriormente mencionado, y que esta evaluación permite evaluar de
forma cuantitativa los resultados de la medición obtenidos mediante
el barrido con un microscopio de ese tipo, por ejemplo, una muestra
de genochip de ADN que va a ser analizada. En este contexto es
importante destacar que la evaluación realizada conforme a la
invención incluye la medición de las características
siguientes:
- a)
- sensibilidad de detección de la señal cuantitativa
- b)
- límite de detección de la señal cuantitativo
- c)
- uniformidad del volumen confocal en el campo de visión explorado
- d)
- resolución espacial del proceso de barrido, y
- e)
- comportamiento dinámico de la señal medida en todo el campo de visión explorado, correspondiendo dicha señal medida a la luz fluorescente recibida.
Las configuraciones preferidas de la invención
se han descrito a continuación con respecto a los dibujos adjuntos,
donde:
Figura 1 muestra una representación esquemática
de la instalación básica de un microscopio de barrido con rayo
láser confocal para realizar una medición de la fluorescencia,
bidimensional y cuantitativa,
Figura 2 muestra esquemáticamente un volumen
confocal Vc en un plano del objeto,
Figuras 3a, 3b y 3c muestran representaciones
esquemáticas de diversas formas de no uniformidad del volumen
confocal barrido en todo el campo de visión explorado,
Figura 4 muestra una representación esquemática
de una imagen escaneada de un genochip de ADN
Figura 5a muestra una visión superior de una
primera configuración de un dispositivo de referencia conforme a la
invención
Figura 5b muestra un perfil transversal a través
de un plano A-A de la configuración mostrada por la
figura 5a,
Figura 6 muestra la forma de una señal eléctrica
representativa obtenida midiendo la luz fluorescente emitida por
las zonas fluorescentes situadas en una fila del genochip de ADN
representado en las figuras 5a y 5b.
Figura 7a muestra una visión superior de una
segunda configuración de un dispositivo de referencia conforme a la
invención
Figura 7b muestra un perfil transversal de la
configuración mostrada por la figura 7a.
La presente invención se describirá ahora
teniendo en cuenta sus configuraciones o versiones preferidas. Estas
configuraciones se explican con la idea de comprender mejor la
invención pero ésta no se limita a las mismas.
La figura 1 muestra esquemáticamente una
instalación básica de un microscopio de barrido con rayo láser
confocal para la medición cuantitativa, bidimensional de la
fluorescencia en el caso de un punto móvil bidimensional. Un haz de
rayos láser de excitación 11, que es transmitido a través de un
divisor o separador de haz dicroico 12, es barrido espacialmente
por medio de un motor explorador biaxial 13, por ejemplo un
galvanómetro-explorador en dos ejes X, Y,
perpendicular uno a otro, y es focalizado por una lente 14 en un
plano del objeto 15 que es paralelo al plano X-Y
definido por los ejes X e Y, y que es perpendicular a un tercer eje
Z que es perpendicular al plano X-Y.
Los fluoróforos dentro del volumen confocal Vc
en el plano del objeto 15 son excitados por el punto enfocado con
láser 16 y la luz fluorescente 17 generada por excitación de dichos
fluoróforos es recogida y representada por una imagen por una lente
18 en una abertura puntiforme 19 en el plano conjugado 21 y
detectada por el fotodetector 22.
La figura 2 muestra esquemáticamente un volumen
confocal Vc (con Vc = Ac * zc) en el plano del objeto 15. El
volumen confocal Vc es idealmente un volumen cilíndrico que tiene un
eje de rotación paralelo al eje Z y una sección transversal
circular. El volumen confocal Vc viene definido por la función de
transferencia óptica (OTFem) de la óptica de detección y por el
tamaño y la forma de la abertura puntiforme 19 en el plano
conjugado 21. Solamente la radiación óptica procedente del volumen
confocal Vc es detectada por el fotodetector 22. El concepto de la
representación de la imagen confocal permite unos índices de
supresión de fondo elevados para detectar niveles de señal débiles,
como es frecuentemente el caso en las mediciones de la
fluorescencia.
\newpage
Las figuras 3a, 3b y 3c muestran
representaciones esquemáticas en el plano Y-Z de
diversas formas de no uniformidad del volumen confocal barrido Vc,
es decir de las desviaciones de la forma de este volumen de la forma
ideal representada en la figura 2. Estas desviaciones producen
heterogeneidades de la amplitud de la señal de intensidad de la luz
fluorescente medida en toda el área explorada.
La figura 3a muestra un volumen confocal
explorado 24 que está inclinado con respecto a un volumen confocal
nominal o ideal 23. La figura 3b muestra un volumen confocal
explorado 25 que no presenta una anchura constante y que por
consiguiente no es uniforme en comparación con el volumen confocal
nominal 23. La figura 3c muestra un volumen confocal explorado 26
que tiene una forma que está distorsionada con respecto al volumen
confocal nominal 23.
La desalineación y la imperfección mecánicas de
los componentes ópticos y optomecánicos utilizados son las razones
principales para las irregularidades de los volúmenes confocales
representados en las figuras 3a, 3b y 3c.
La figura 4 muestra una representación
esquemática de una imagen explorada del genochip de ADN 31 del tipo
descrito en la patente americana nr. 5, 143,854. El genochip 31
tiene una micromatriz tablero de ajedrez de puntos fluorescentes 32
del tipo descrito en la patente americana nr. 5, 143,854 apta para
emitir luz fluorescente cuando es irradiada con luz de excitación.
Para los objetivos de la siguiente descripción es conveniente
distinguir dos zonas del genochip 31: una primera zona 33 que se
extiende desde una diagonal 34 hasta el extremo o la esquina
derecha superior del genochip 31, y una segunda zona 35 que se
extiende desde la diagonal 34 hasta la esquina izquierda inferior
del genochip 31. Debido tanto a la densidad irregular del fluoróforo
en el objeto explorado como a la sensibilidad poco homogénea del
microscopio de barrido con rayo láser confocal en el campo de
visión explorado, la imagen representada por la figura 4 indica que
los puntos fluorescentes 32 situados en la zona 33 del genochip 31
proporcionan una luz fluorescente de intensidad menor que los puntos
fluorescentes 32 localizados en la zona 35. El objetivo de un
dispositivo de referencia, un método y un sistema conforme a la
invención consiste en evaluar de forma cuantitativa hasta que punto
dichas variaciones de la intensidad de la luz fluorescente
detectada se deben específicamente a la sensibilidad poco homogénea
del microscopio de barrido con rayo láser confocal en todo el campo
de visión explorado.
La figura 5a muestra una visión desde arriba y
la figura 5b una sección transversal de una primera configuración
de un dispositivo de referencia conforme a la invención para
caracterizar de forma cuantitativa la homogeneidad y sensibilidad
de un microscopio de barrido con rayo láser confocal para la
medición cuantitativa bidimensional de la fluorescencia. En las
figuras 5a y 5b se indican las dimensiones en milímetros.
El dispositivo de referencia 41 que muestran las
figuras 5a y 5b consiste en una placa de vidrio superior 42 unida a
un sustrato de vidrio 43. El sustrato de vidrio de 16x15 milímetros
cuadrados (grosor = 1 milímetro) tiene una cavidad planar grabada
de 5 micrómetros 44 (área rayada). La placa superior de vidrio 42
(espesor = 0,7 milímetros) tiene dos agujeros perforados 45,46
respectivamente para la entrada y salida de fluido. En otra
configuración posible, una placa de vidrio 42 superior sin agujeros
perforados 45 y 46 puede no estar unida a un sustrato de vidrio
43.
El sustrato de vidrio 43 tiene, por ejemplo,
dimensiones idénticas y preferiblemente las mismas propiedades
ópticas que el sustrato del genochip de ADN 31 descrito previamente
con referencia a la figura 4.
La cavidad 44 del dispositivo de referencia se
llena de fluoróforos disueltos con una concentración predeterminada
lo que conduce a una distribución predeterminada espacial de los
fluoróforos por todo el área explorada. Puesto que los fluoróforos
se disuelven uniformemente, esta distribución espacial viene
determinada por la estructura de la cavidad 44 y no por los
fluoróforos disueltos propiamente. En el ejemplo descrito con
respecto a las figuras 5a y 5b la cavidad 44 es plana y por lo
tanto la distribución espacial de los fluoróforos es uniforme por
toda el área de la cavidad 44.
La cubierta de vidrio 42 del dispositivo de
referencia 41 que muestran las figuras 5a y 5b tiene idénticas
dimensiones y propiedades ópticas que un sustrato de vidrio de un
genochip de ADN determinado del tipo anteriormente descrito con
referencia a la figura 4. Por lo tanto, el dispositivo de referencia
41 puede ser explorado por el microscopio de barrido con rayo láser
confocal en las mismas condiciones ópticas. El tamaño bien definido
de la cavidad y la concentración controlada de fluoróforo con una
distribución espacial predeterminada por toda el área explorada
permite la investigación de la señal de medición con respecto a la
sensibilidad (límite de detección) y a la homogeneidad por el campo
de visión explorado. Tal como se ha mencionado antes la distribución
espacial de los fluoróforos disueltos viene determinada por la
estructura de la cavidad 44 y no por los propios fluoróforos
disueltos unifor-
memente.
memente.
El uso de una solución de fluoróforos disueltos
tiene la ventaja de que se puede preparar justo antes de que se
realice la medición de la fluorescencia. Por consiguiente, el
dispositivo de referencia relleno de un líquido a base de
fluoróforos disueltos no se ve afectado por un posible efecto de
blanqueo, que de otro modo podría aparecer si se ha almacenado
durante largo tiempo y podría llevar a una capacidad de
fluorescencia no cuantitativa del dispositivo de referencia por
todo el campo de visión explorado. Además, se pueden preparar
fácilmente varias soluciones con diferentes concentraciones de
fluoróforos disueltos, lo que permite mediciones de fluorescencia a
diversos niveles de intensidad. En particular, es posible determinar
el límite del nivel de intensidad detectable.
La altura de la cavidad 44 es muy inferior a la
profundidad del volumen confocal Vc indicada por la distribución de
Rayleigh zc, de manera que la capa planar delgada de fluoróforos en
la cavidad 44 permita una evaluación fidedigna de, por ejemplo,
posibles desplazamientos del volumen confocal Vc en la dirección Z
(perpendicular al campo de visión explorado) a medida que el
dispositivo de referencia 41 está siendo explorado por todo el
campo de visión barrido.
A modo de ejemplo la figura 6 muestra el perfil
de la señal de la fila 588 de 1024 de la imagen explorada obtenida
con el dispositivo de referencia que muestran las figuras 5a y 5b:
la cavidad 44 del dispositivo tiene un grosor constante en toda su
extensión y se llena de una solución de 200 mg/ml de fluoresceína
TRIS (fluoresceína en tampón acuoso TRIS 0,1 molar pH 8,3). Se
puede analizar la sensibilidad y la uniformidad de la imagen del
microscopio de barrido con rayo láser confocal, tal como se muestra
en la figura 6 para el perfil lineal de la fila 588 de 1024 (campo
de visión = 10 x 10 mm^{2}, tamaño del píxel = 10 micrómetros, la
resolución de la imagen es de 1024 x 1024 píxeles, el tiempo de
barrido es de 126 segundos, la sensibilidad de detección del
amplificador de transimpedancia utilizado es de 10 microamperios por
voltio, la frecuencia de corte o la frecuencia de 6 dB del filtro
de paso bajo utilizado con el amplificador de transimpedancia es de
30 kHz, el intervalo de integración tdwell tiene una duración de 40
microsegundos). Como se puede apreciar en la figura 6 alguna señal
de ruido se superpone en el perfil lineal obtenido. En la figura 6
la intensidad de la señal se indica en unidades arbitrarias.
La desviación de la intensidad de la señal de
cada píxel de un valor predeterminado, que viene dada por ejemplo
por la intensidad de la señal promediada en toda la imagen
explorada, proporciona un parámetro cuantitativo para el
funcionamiento de un microscopio de barrido con rayo láser
confocal.
Como una aplicación posterior es posible
calibrar el nivel de intensidad de la señal. El número de
fluoróforos por área se puede evaluar a partir de la concentración
de fluoróforos disueltos. Por lo tanto, la intensidad de la señal
medida y la sensibilidad de la medición están relacionadas con el
número de fluoróforos por área de un modo cuantitativo.
La figura 7a muestra una visión superior y la
figura 7b un perfil transversal de una segunda configuración de un
dispositivo de referencia para una evaluación cuantitativa de la
homogeneidad y resolución espacial de un microscopio de barrido con
rayo láser confocal.
En la figura 7a se indican algunas dimensiones
en micrómetros. En la figura 7b se indican algunas dimensiones en
milímetros.
El dispositivo de referencia 51 mostrado por las
figuras 5a y 5b consiste en una placa de vidrio superior 52 sobre
un sustrato de vidrio 53 que tiene un área de 16 x 16 milímetros
cuadrados. La superficie superior del sustrato de vidrio 53 (grosor
= 1 milímetro) tiene una depresión grabada, microestructurada, de 5
micrómetros que forma una cavidad 54 que tiene una superficie
interna de base. La cavidad 54 se llena con fluoróforos disueltos
uniformemente que tienen una concentración predeterminada, lo que
conduce a una distribución espacial predeterminada de las zonas
fluorescentes por el área de la cavidad 54. Esta distribución
espacial no está determinada por los fluoróforos disueltos
uniformemente sino que por la estructura de la cavidad 54. La
cavidad 54 está recubierta por una placa superior de vidrio 52 que
tiene una superficie externa inferior. El espacio comprendido entre
la superficie exterior inferior de la placa 52 y la superficie
interna de base de la depresión 54 tiene un grosor D que varía
según una función predeterminada de la forma
D = f(x,y) por todo el área de la depresión 54. Este último espacio se llena al menos parcialmente con los fluoróforos
disueltos.
D = f(x,y) por todo el área de la depresión 54. Este último espacio se llena al menos parcialmente con los fluoróforos
disueltos.
El sustrato de vidrio 53 tiene, por ejemplo,
unas dimensiones idénticas y preferiblemente las mismas propiedades
ópticas que el sustrato del genochip de ADN 31 descrito antes con
respecto a la figura 4.
La cubierta de vidrio 52 del dispositivo de
referencia 51 tiene unas propiedades ópticas idénticas que un
sustrato de vidrio de un genochip de ADN determinado 31 del tipo
anteriormente descrito con respecto a la figura 4. El dispositivo
de referencia 51 puede por tanto ser explorado por un microscopio de
barrido con rayo láser confocal en las mismas condiciones
ópticas.
La cavidad microestructurada 54 comprende
diferentes modelos de zonas fluorescentes. En la figura 7a cada
zona no fluorescente viene representada por una superficie
sombreada.
Un primer modelo o patrón de las zonas
fluorescentes comprende solamente dos zonas no fluorescentes, cada
una de las cuales está representada en la figura 7 por un cuadrado
sombreado. En la figura 7a las zonas fluorescentes que tienen este
primer modelo están situadas en cada una de las esquinas 55, 56, 57,
58 del dispositivo de referencia 51. Las señales medidas que
corresponden a la intensidad de la luz fluorescente emitida desde
estas zonas son evaluadas con el fin de evaluar el grado de
uniformidad en todo el campo de visión barrido de la exploración
realizada con un microscopio de barrido con rayo láser confocal.
Las zonas 61 y 62 localizadas en diferentes
filas del dispositivo de referencia 51 tienen un segundo patrón de
distribución espacial de los rasgos fluorescentes. Las señales
medidas que corresponde a la luz fluorescente emitida desde zonas
como la 61 y la 62 son evaluadas con el fin de evaluar la resolución
de la exploración realizada con un microscopio de barrido con rayo
láser confocal. Además, puesto que las dimensiones de las zonas 61
y 62 son conocidas, se puede evaluar la exactitud de los pasos
realizados en la exploración por el motor explorador. Tal como se
muestra en la figura 7a, las zonas 61 y 62 están subdivididas de
manera que la cavidad forma un recipiente conectado que es
rellenado por los fluoróforos disueltos.
Las zonas 63, 64 que tiene el aspecto de un
grupo de barras que tienen diferentes ángulos de inclinación
representan un tercer modelo de los rasgos fluorescentes disponible
para el dispositivo de referencia 51. Las señales medidas que
corresponden a la luz fluorescente emitida por una zona como la zona
63 se evalúan con el fin de valorar el comportamiento dinámico de
la señal asociado al barrido realizado con un microscopio de barrido
con rayo láser confocal.
La presente invención se refiere a los
dispositivos de referencia descritos antes y que aparecen en las
figuras 5a, 5b y 7a, 7b, respectivamente, que se utilizan para una
evaluación cuantitativa de un microscopio de barrido con rayo láser
confocal para la medición bidimensional, cuantitativa de la
fluorescencia. Las características típicas determinadas con un
dispositivo de referencia, respectivamente un método, conforme a la
invención son
- a)
- sensibilidad a la detección cuantitativa de la señal,
- b)
- límite de detección cuantitativo de la señal,
- c)
- uniformidad del volumen confocal en todo el campo de visión explorado,
- d)
- resolución espacial del proceso de barrido, y
- e)
- comportamiento dinámico de la señal medida en todo el campo de visión explorado, correspondiendo dicha señal medida a la luz fluorescente recibida.
El uso anteriormente mencionado de la invención
para evaluar el funcionamiento de un microscopio de barrido con
rayo láser confocal comprende sustancialmente
explorar un dispositivo de referencia de acuerdo
con la invención con un microscopio que se va a evaluar para
obtener un primer grupo de valores de medición,
procesar dicho primer grupo de valores de
medición para obtener los factores de corrección,
almacenar dichos factores de corrección,
explorar una muestra, por ejemplo, un genochip
de ADN, con el microscopio evaluado para obtener un segundo grupo
de valores de medición, y
corregir dicho segundo grupo de valores de
medición con dichos factores de corrección para obtener un tercer
grupo de valores, libres de desviaciones debido al funcionamiento de
explorador y que por tanto correspondan con mayor exactitud a las
características de la muestra en particular examinada.
Aunque las configuraciones preferidas de la
invención ya han sido descritas usando términos específicos, dicha
descripción es para fines ilustrativos meramente, y se entiende que
se pueden realizar cambios y variaciones sin alejarse de la
finalidad de las reivindicaciones de esta solicitud de patente.
- 11
- haz de rayos láser de excitación
- 12
- separador o divisor de haz dicroico
- 13
- motor explorador biaxial
- 14
- lente
- 15
- plano del objeto
- 16
- punto enfocado con láser
- 17
- luz fluorescente
- 18
- lente
- 19
- abertura puntiforme
20
- 21
- plano conjugado
- 22
- fotodetector
- 23
- volumen confocal nominal (corte de sección transversal en el plano z-y)
- 24
- volumen confocal explorado (corte de sección transversal en el plano z-y)
- 25
- volumen confocal explorado (corte de sección transversal en el plano z-y)
- 26
- volumen confocal explorado (corte de sección transversal en el plano z-y)
27
28
29
30
- 31
- matriz multigénica o genochip de ADN (localizada en el plano del objeto)
- 32
- punto fluorescente o rasgo fluorescente
- 33
- zona
- 34
- diagonal
- 35
- zona
36
37
38
39
40
- 41
- primera configuración del dispositivo de referencia
- 42
- placa superior
- 43
- placa inferior
- 44
- cavidad
- 45
- agujero
- 46
- agujero
47
48
49
50
51
- 52
- segunda configuración del dispositivo de referencia
- 53
- placa superior
- 54
- placa inferior
- 55
- cavidad
- 56
- zona que tiene un primer patrón de rasgos fluorescentes
- 57
- zona que tiene un primer patrón de rasgos fluorescentes
- 58
- zona que tiene un primer patrón de rasgos fluorescentes
- 59
- zona que tiene un primer patrón de rasgos fluorescentes
60
61
- 62
- zona que tiene un segundo patrón de rasgos fluorescentes
- 63
- zona que tiene un segundo patrón de rasgos fluorescentes
- 64
- zona que tiene un tercer patrón de rasgos fluorescentes
- 65
- zona que tiene un tercer patrón de rasgos fluorescentes.
Claims (10)
1. Un dispositivo de referencia para evaluar el
funcionamiento de un microscopio de barrido con rayo láser
confocal, de manera que dicho dispositivo de referencia se
caracteriza porque comprende:
(a) un sustrato (43, 53), y
(b) materia fluorescente de referencia
distribuida por toda la superficie de dicho sustrato (43, 53),
teniendo dicha materia fluorescente de referencia una distribución
espacial predeterminada por dicha superficie y estando dicha
materia fluorescente de referencia disuelta en un líquido en una
concentración predeterminada.
2. Un dispositivo de referencia conforme a la
reivindicación 1, de manera que dicha materia fluorescente de
referencia tiene un espesor constante por dicha superficie de dicho
sustrato.
3. Un dispositivo de referencia conforme a la
reivindicación 1 ó 2, donde dicha materia fluorescente de referencia
tiene un grosor que es menor de la profundidad (zc) de un volumen
confocal (Vc) de dicho microscopio de barrido con rayo láser
confocal.
4. Un dispositivo de referencia conforme a la
reivindicación 1, en el cual dicha materia fluorescente de
referencia está distribuida uniformemente por dicha superficie de
dicho sustrato y la materia fluorescente de referencia tiene una
concentración predeterminada.
5. Un dispositivo de referencia conforme a la
reivindicación 1, en el que dicho sustrato (43, 53) tiene una
superficie superior que tiene una depresión (54), dicha depresión
tiene una profundidad constante y se extiende por una parte
sustancial de dicha superficie superior, dicha depresión (54) tiene
además una superficie interna sobre una base de dicha depresión
(54),
comprendiendo dicho dispositivo de
referencia
una placa protectora (42, 52), siendo dicha
placa protectora ópticamente transparente y cubriendo dicha
depresión de dicho sustrato, teniendo dicha placa protectora además
una superficie externa inferior y estando dispuesta de forma que un
espacio entre dicha superficie externa inferior de dicha placa
protectora y dicha superficie interna de dicha depresión tenga una
profundidad constante sobre toda el área de dicha depresión
(54),
estando una o más zonas de dicho espacio
completamente llenas de dicha materia fluorescente de referencia
que se extiende por la parte más profunda de cada zona.
6. Un método para evaluar el funcionamiento de
un microscopio de barrido con rayo láser confocal del tipo
utilizado para realizar una medición de fluorescencia cuantitativa
bidimensional de la materia de prueba distribuida por una
superficie plana de un primer sustrato (31),
de forma que dicho método se caracteriza
porque comprende:
realizar una medición bidimensional cuantitativa
de la fluorescencia de un dispositivo de referencia usando dicho
microscopio para obtener los valores medidos para uno o más
parámetros cuantitativos, de forma que dicho dispositivo de
referencia comprenda
- (a)
- un segundo sustrato (43, 53) y
- (b)
- materia fluorescente de referencia distribuida por una superficie de dicho segundo sustrato (43, 53), teniendo dicha materia fluorescente de referencia una distribución espacial predeterminada sobre dicha superficie, y estando dicha materia fluorescente de referencia disuelta en un líquido en una concentración predeterminada.
7. Un método conforme a la reivindicación 6, de
forma que dicho método comprende el procesar dichos valores medidos
y los valores predeterminados para determinar un parámetro
cuantitativo del funcionamiento de dicho microscopio.
8. Un método conforme a la reivindicación 6,
donde dicho sustrato (43, 53) tiene una superficie superior que
tiene una depresión (54), teniendo dicha depresión una profundidad
constante y extendiéndose por una parte sustancial de dicha
superficie superior, teniendo dicha depresión (54) además una
superficie interna sobre una base de dicha depresión, y
comprendiendo dicho dispositivo de
referencia
- una placa protectora (42, 52), siendo dicha placa protectora ópticamente transparente y capaz de cubrir dicha depresión de dicha placa de base, teniendo dicha placa protectora además una superficie externa inferior y estando dispuesta de manera que un espacio entre dicha superficie externa inferior y dicha superficie interna inferior de dicha depresión tenga una profundidad constante sobre toda la zona de dicha depresión (54),
- una o más zonas dentro de dicho espacio estando completamente llenas de dicha materia fluorescente de referencia que se extiende por toda la profundidad de la zona.
9. Un método conforme a la reivindicación 6, en
el que dicha medición cuantitativa bidimensional de la fluorescencia
es eficaz para usarse con un genochip de ADN.
10. Un sistema para evaluar el funcionamiento de
un microscopio de barrido con rayo láser confocal, que se
caracteriza porque consta de:
un microscopio de barrido con rayo láser
confocal, y
un dispositivo de referencia conforme a la
reivindicación 1.
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