JPH06100545B2 - フライングスポット方式による蛍光イメージデンシトメータ - Google Patents
フライングスポット方式による蛍光イメージデンシトメータInfo
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- JPH06100545B2 JPH06100545B2 JP3032508A JP3250891A JPH06100545B2 JP H06100545 B2 JPH06100545 B2 JP H06100545B2 JP 3032508 A JP3032508 A JP 3032508A JP 3250891 A JP3250891 A JP 3250891A JP H06100545 B2 JPH06100545 B2 JP H06100545B2
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
- G01N30/95—Detectors specially adapted therefor; Signal analysis
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- G—PHYSICS
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
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- G—PHYSICS
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はTLCプレート(薄膜ク
ロマトグラフィープレート)上に二次元的に展開され蛍
光ラベルされた燐脂質などの試料スポットをもつ試料プ
レートを測定する二次元蛍光デンシトメトリーに関する
ものである。
ロマトグラフィープレート)上に二次元的に展開され蛍
光ラベルされた燐脂質などの試料スポットをもつ試料プ
レートを測定する二次元蛍光デンシトメトリーに関する
ものである。
【0002】
【従来の技術】TLCプレートに展開された試料を測定
する二次元デンシトメータとしては、測定光をTLCプ
レート上で往復方向に走査し、それと直交する方向にT
LCプレートを移動させて測定を行なうフライングスポ
ット方式のデンシトメータがある。また、これまでのデ
ンシトメトリーは試料による測定光の反射光や透過光か
らその吸光度を測定するものである。
する二次元デンシトメータとしては、測定光をTLCプ
レート上で往復方向に走査し、それと直交する方向にT
LCプレートを移動させて測定を行なうフライングスポ
ット方式のデンシトメータがある。また、これまでのデ
ンシトメトリーは試料による測定光の反射光や透過光か
らその吸光度を測定するものである。
【0003】フライングスポット方式としては、実施例
の図1に示されるような、中心からの距離が一様に変化
する螺旋状スリットSrと、その螺旋状スリットSrを
もつスリット円板24の半径方向に延びて螺旋状スリッ
トSrと組み合わされた固定スリットSfixとによっ
て光束を制限し、螺旋状スリットSrの往復回転運動に
よって試料面上の光束を左右に振る方式がある。試料面
上で光束を振る場合、光束が走査方向の場所によって強
度が異なる、いわゆるローカリティーをもつ。光束がロ
ーカリティーをもつのは、螺旋状スリットSrの溝穴の
幅の不均一さ、光学系の個性、特に固定スリットSfi
x上に照射される光の強度分布、又は左右に光束を振っ
た場合の光路の傾きによる検出器への入射光量の変化な
どが原因であると考えられる。
の図1に示されるような、中心からの距離が一様に変化
する螺旋状スリットSrと、その螺旋状スリットSrを
もつスリット円板24の半径方向に延びて螺旋状スリッ
トSrと組み合わされた固定スリットSfixとによっ
て光束を制限し、螺旋状スリットSrの往復回転運動に
よって試料面上の光束を左右に振る方式がある。試料面
上で光束を振る場合、光束が走査方向の場所によって強
度が異なる、いわゆるローカリティーをもつ。光束がロ
ーカリティーをもつのは、螺旋状スリットSrの溝穴の
幅の不均一さ、光学系の個性、特に固定スリットSfi
x上に照射される光の強度分布、又は左右に光束を振っ
た場合の光路の傾きによる検出器への入射光量の変化な
どが原因であると考えられる。
【0004】このようなローカリティーは試料からの反
射光や透過光の吸光度を測定するデンシトメトリーにお
いては、例えば照射光の一部をハーフミラーなどで取り
出してモニタすることができる。
射光や透過光の吸光度を測定するデンシトメトリーにお
いては、例えば照射光の一部をハーフミラーなどで取り
出してモニタすることができる。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】デンシトメトリーとし
ては、試料プレートに展開された試料成分を蛍光ラベル
する蛍光マッピングデンシトメータが考えられる。試料
成分を蛍光ラベルし、励起光により試料成分を励起して
その蛍光を測定することにより、従来の吸光度を測定す
る方法に比べて高感度な測定を行なうことができる。し
かし、蛍光マッピングデンシトメトリーにおいては、従
来の方式によりローカリティーを補正することはできな
い。本発明はフライングスポット方式による蛍光マッピ
ングデンシトメトリーを実現するに際してローカリティ
ーを補正することを目的とするものである。
ては、試料プレートに展開された試料成分を蛍光ラベル
する蛍光マッピングデンシトメータが考えられる。試料
成分を蛍光ラベルし、励起光により試料成分を励起して
その蛍光を測定することにより、従来の吸光度を測定す
る方法に比べて高感度な測定を行なうことができる。し
かし、蛍光マッピングデンシトメトリーにおいては、従
来の方式によりローカリティーを補正することはできな
い。本発明はフライングスポット方式による蛍光マッピ
ングデンシトメトリーを実現するに際してローカリティ
ーを補正することを目的とするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明では励起光強度の
補正テーブルを作成し、試料からの蛍光を補正テーブル
の値で除算することによってローカリティー補正を行な
い、ローカリティー成分を除去する。ローカリティー除
去のための補正テーブルは、例えば蛍光剤入りのTLC
プレートを測定することによって作成する。
補正テーブルを作成し、試料からの蛍光を補正テーブル
の値で除算することによってローカリティー補正を行な
い、ローカリティー成分を除去する。ローカリティー除
去のための補正テーブルは、例えば蛍光剤入りのTLC
プレートを測定することによって作成する。
【0007】そのため、本発明では測定プレートに対し
て励起光ビームを走査して照射する励起光学系と、測定
プレートの励起光照射位置からの蛍光を検出する蛍光検
出系と、測定プレートとして少なくとも励起光走査範囲
内で蛍光剤が一様に付与されたプレートを装着して測定
したときの蛍光データを測定プレート上の走査方向の位
置の情報とともに記憶する補正テーブルと、測定プレー
トとして試料プレートを装着して測定したときの蛍光検
出データを前記補正テーブルに記憶されている測定プレ
ート上の走査方向の同一位置の蛍光データで除算する演
算部とを備える。
て励起光ビームを走査して照射する励起光学系と、測定
プレートの励起光照射位置からの蛍光を検出する蛍光検
出系と、測定プレートとして少なくとも励起光走査範囲
内で蛍光剤が一様に付与されたプレートを装着して測定
したときの蛍光データを測定プレート上の走査方向の位
置の情報とともに記憶する補正テーブルと、測定プレー
トとして試料プレートを装着して測定したときの蛍光検
出データを前記補正テーブルに記憶されている測定プレ
ート上の走査方向の同一位置の蛍光データで除算する演
算部とを備える。
【0008】
【実施例】図1は一実施例を表わす。10はタングステ
ンハロゲンランプ、12は重水素ランプであり、光源と
して2種類のランプを備えている。14は光源切換えミ
ラーであり、いずれかのランプ10又は12からの光を
励起光として用いるために使用される。16はカットフ
ィルタであり、励起光成分の光を透過させるフィルタが
光路に挿入される。18は分光器の入口スリット、20
は分光器のコリメータミラー、22は回折格子である。
分光器の出口スリットは螺旋状スリットSrと固定スリ
ットSfixである。螺旋状スリットSrは円板24に
形成されており、螺旋状スリットSrは円板24の中心
からの距離が回転角に対して単調に変化する形状に設計
されている。円板24には螺旋状スリットSr以外にも
穴のサイズの異なる幾つかのスリット25が図示されて
いる。それらの固定スリット25は照射ビームを固定し
て測定する場合に円板24を停止させて使用される。円
板24はフライングスポット方式で使用されるときは励
起光が螺旋状スリットSrを透過する範囲で往復方向に
回転駆動される。26は円板24を駆動するステッピン
グモータである。螺旋状スリットSrには円板24の半
径方向に延びる固定スリットSfixが組み合わされて
いる。
ンハロゲンランプ、12は重水素ランプであり、光源と
して2種類のランプを備えている。14は光源切換えミ
ラーであり、いずれかのランプ10又は12からの光を
励起光として用いるために使用される。16はカットフ
ィルタであり、励起光成分の光を透過させるフィルタが
光路に挿入される。18は分光器の入口スリット、20
は分光器のコリメータミラー、22は回折格子である。
分光器の出口スリットは螺旋状スリットSrと固定スリ
ットSfixである。螺旋状スリットSrは円板24に
形成されており、螺旋状スリットSrは円板24の中心
からの距離が回転角に対して単調に変化する形状に設計
されている。円板24には螺旋状スリットSr以外にも
穴のサイズの異なる幾つかのスリット25が図示されて
いる。それらの固定スリット25は照射ビームを固定し
て測定する場合に円板24を停止させて使用される。円
板24はフライングスポット方式で使用されるときは励
起光が螺旋状スリットSrを透過する範囲で往復方向に
回転駆動される。26は円板24を駆動するステッピン
グモータである。螺旋状スリットSrには円板24の半
径方向に延びる固定スリットSfixが組み合わされて
いる。
【0009】分光器からの励起光は、凹面ミラー30と
平面ミラー32を経て測定プレート34に照射される。
ミラー32から測定プレート34に至る励起光光路に
は、水晶窓板36がハーフミラーとして配置されてお
り、ハーフミラー36で取り出された一部の励起光はモ
ニタ用光電子増倍管38でモニタされる。測定プレート
34に励起光が入射し、その励起部分からの蛍光を測定
するために蛍光を透過させ励起光を遮蔽するフィルタ4
0を介して蛍光用光電子増倍管42が配置されている。
測定プレート34の照射位置の透過光強度を測定するた
めに、測定プレートの裏面側には透過用光電子増倍管4
4も配置されている。
平面ミラー32を経て測定プレート34に照射される。
ミラー32から測定プレート34に至る励起光光路に
は、水晶窓板36がハーフミラーとして配置されてお
り、ハーフミラー36で取り出された一部の励起光はモ
ニタ用光電子増倍管38でモニタされる。測定プレート
34に励起光が入射し、その励起部分からの蛍光を測定
するために蛍光を透過させ励起光を遮蔽するフィルタ4
0を介して蛍光用光電子増倍管42が配置されている。
測定プレート34の照射位置の透過光強度を測定するた
めに、測定プレートの裏面側には透過用光電子増倍管4
4も配置されている。
【0010】蛍光を測定する光電子増倍管42の検出出
力はIV変換器46で電圧値に変換され、さらにAD変
換器48によってデジタル信号に変換された後、CPU
50に取り込まれてデータ処理される。CPU50はま
た、ステッピングモータ26の駆動回路52も制御して
いる。
力はIV変換器46で電圧値に変換され、さらにAD変
換器48によってデジタル信号に変換された後、CPU
50に取り込まれてデータ処理される。CPU50はま
た、ステッピングモータ26の駆動回路52も制御して
いる。
【0011】測定プレート34を照射する励起光はロー
カリティーをもつ。ローカリティーは照射ビームの走査
方向の位置xと励起光波長λの関数f(x,λ)とな
る。測定プレート34として蛍光剤入りTLCプレート
を装着し、単位強度の光で励起したときの蛍光強度をσ
(λ)とすると、量子化効率の式により、蛍光強度と励
起光強度の間には比例関係があるから、図2に示される
ようなローカリティーをもった強度f(x,λ)の光で
TLCプレートを励起した場合、その蛍光強度はσ
(λ)f(x,λ)となる。したがって、σ(λ)f
(x,λ)をローカリティー補正に保持しておき、これ
で蛍光強度σ(λ)f(x,λ)を割ると、蛍光剤入り
TLCプレート上の至る所で1となって一様な蛍光強度
が得られる。
カリティーをもつ。ローカリティーは照射ビームの走査
方向の位置xと励起光波長λの関数f(x,λ)とな
る。測定プレート34として蛍光剤入りTLCプレート
を装着し、単位強度の光で励起したときの蛍光強度をσ
(λ)とすると、量子化効率の式により、蛍光強度と励
起光強度の間には比例関係があるから、図2に示される
ようなローカリティーをもった強度f(x,λ)の光で
TLCプレートを励起した場合、その蛍光強度はσ
(λ)f(x,λ)となる。したがって、σ(λ)f
(x,λ)をローカリティー補正に保持しておき、これ
で蛍光強度σ(λ)f(x,λ)を割ると、蛍光剤入り
TLCプレート上の至る所で1となって一様な蛍光強度
が得られる。
【0012】次に、測定プレートとして試料プレートを
装着して測定する場合、単位強度の光で励起したときの
蛍光をg(x,λ)とすると、g(x,λ)は例えば図
3に示されるようなものになる。励起光のローカリティ
ーにより、デンシトメータで得られる信号はg(x,
λ)f(x,λ)になる。これを予め記憶しておいたロ
ーカリティー補正テーブルの同じ位置の値で割ると、g
(x,λ)f(x,λ)/σ(λ)f(x,λ)=g
(x,λ)/σ(λ)となり、全面一様な光源を使用し
たときと比例関係となる。
装着して測定する場合、単位強度の光で励起したときの
蛍光をg(x,λ)とすると、g(x,λ)は例えば図
3に示されるようなものになる。励起光のローカリティ
ーにより、デンシトメータで得られる信号はg(x,
λ)f(x,λ)になる。これを予め記憶しておいたロ
ーカリティー補正テーブルの同じ位置の値で割ると、g
(x,λ)f(x,λ)/σ(λ)f(x,λ)=g
(x,λ)/σ(λ)となり、全面一様な光源を使用し
たときと比例関係となる。
【0013】ローカリティー補正を行なうために、CP
U50は、図4に示されるように、補正テーブル54
と、演算部56の機能を果たす。補正テーブル54には
測定プレートとして蛍光剤入りのTLCプレートを装着
したときの蛍光測定値が記憶される。演算部56は試料
プレートを測定したときの蛍光強度を同じ走査位置の補
正テーブルの値で除算し、ローカリティー補正された蛍
光強度を得る。補正テーブル54と演算部56で用いる
走査方向の位置データはステッピングモータ26を制御
するためのデータからCPU50内で得られる。
U50は、図4に示されるように、補正テーブル54
と、演算部56の機能を果たす。補正テーブル54には
測定プレートとして蛍光剤入りのTLCプレートを装着
したときの蛍光測定値が記憶される。演算部56は試料
プレートを測定したときの蛍光強度を同じ走査位置の補
正テーブルの値で除算し、ローカリティー補正された蛍
光強度を得る。補正テーブル54と演算部56で用いる
走査方向の位置データはステッピングモータ26を制御
するためのデータからCPU50内で得られる。
【0014】フライングスポット方式の励起光の走査の
例を図5に示す。TLCプレート58を固定した状態で
励起光をx方向に走査する。1回の走査中に51ポイン
トで蛍光測定を行なうものとすると、26ポイント目が
走査の中心点となる。x方向の1回の走査が終わると、
次にTLCプレート58がy方向に所定の距離だけ移動
させられ、続いて−x方向への走査が行なわれ、その後
再びTLCプレート58が所定の距離だけy方向に移動
させられるというように、ジクザク状に走査が繰り返さ
れていく。TLCプレート58の全面にわたってこのよ
うな走査がなされる。ローカリティー補正テーブル54
には、x方向の1回の走査に対してx方向の位置データ
と蛍光剤入りTLCプレートの蛍光強度とが補正データ
として記憶される。
例を図5に示す。TLCプレート58を固定した状態で
励起光をx方向に走査する。1回の走査中に51ポイン
トで蛍光測定を行なうものとすると、26ポイント目が
走査の中心点となる。x方向の1回の走査が終わると、
次にTLCプレート58がy方向に所定の距離だけ移動
させられ、続いて−x方向への走査が行なわれ、その後
再びTLCプレート58が所定の距離だけy方向に移動
させられるというように、ジクザク状に走査が繰り返さ
れていく。TLCプレート58の全面にわたってこのよ
うな走査がなされる。ローカリティー補正テーブル54
には、x方向の1回の走査に対してx方向の位置データ
と蛍光剤入りTLCプレートの蛍光強度とが補正データ
として記憶される。
【0015】図6に補正テーブルを作成する手順を示
す。蛍光剤入りのTLCプレートを測定プレートの位置
に装着し、x方向に励起光を走査してデータを測定し、
その値を記憶していく。これを1走査分終了するまで行
なうと、TLCプレートを移動させて、同じように励起
光を走査してデータを測定していく。これを設定された
回数繰り返した後に、x座標ごとに測定データを平均化
処理し、その平均値を補正テーブルに記憶する。
す。蛍光剤入りのTLCプレートを測定プレートの位置
に装着し、x方向に励起光を走査してデータを測定し、
その値を記憶していく。これを1走査分終了するまで行
なうと、TLCプレートを移動させて、同じように励起
光を走査してデータを測定していく。これを設定された
回数繰り返した後に、x座標ごとに測定データを平均化
処理し、その平均値を補正テーブルに記憶する。
【0016】図7は測定の手順を表わしている。測定プ
レートとして試料TLCプレートを装着し、走査しなが
らデータ測定し、同じ位置の補正値を補正テーブルから
呼び出して除算演算し、これを1走査分終了するまで繰
り返す。1走査分が終了すると試料TLCプレートをy
方向に所定の1ステップ移動させ、そのy位置で再び励
起光を走査させながら測定と除算演算を繰り返す。y方
向について1ライン分の測定が終了すると、試料TLC
プレートをx方向に移動させて、再びジグザク走査を行
なって測定と除算演算を繰り返す。
レートとして試料TLCプレートを装着し、走査しなが
らデータ測定し、同じ位置の補正値を補正テーブルから
呼び出して除算演算し、これを1走査分終了するまで繰
り返す。1走査分が終了すると試料TLCプレートをy
方向に所定の1ステップ移動させ、そのy位置で再び励
起光を走査させながら測定と除算演算を繰り返す。y方
向について1ライン分の測定が終了すると、試料TLC
プレートをx方向に移動させて、再びジグザク走査を行
なって測定と除算演算を繰り返す。
【0017】補正テーブルに記憶する蛍光データとして
は、x方向に励起光を走査する範囲の中央の位置を基準
とする相対値のデータを用いることができる。x方向の
走査の中央の位置での蛍光剤入りTLCプレートの蛍光
測定値はσ(λ)f(0,λ)であり、任意の点の蛍光
測定値σ(λ)f(x,λ)をその中央の点の蛍光測定
値で割算した値、すなわちσ(λ)f(x,λ)/σ
(λ)f(0,λ)=f(x,λ)/f(0,λ)を補
正データとして補正テーブルに記憶しておく。この場合
は中央でローカリティーがないと仮定した場合に相当
し、得られる信号は試料TLCプレートのX方向の走査
の中央の点での蛍光測定値g(0,λ)f(0,λ)と
単位があってデータ処理上好都合である。
は、x方向に励起光を走査する範囲の中央の位置を基準
とする相対値のデータを用いることができる。x方向の
走査の中央の位置での蛍光剤入りTLCプレートの蛍光
測定値はσ(λ)f(0,λ)であり、任意の点の蛍光
測定値σ(λ)f(x,λ)をその中央の点の蛍光測定
値で割算した値、すなわちσ(λ)f(x,λ)/σ
(λ)f(0,λ)=f(x,λ)/f(0,λ)を補
正データとして補正テーブルに記憶しておく。この場合
は中央でローカリティーがないと仮定した場合に相当
し、得られる信号は試料TLCプレートのX方向の走査
の中央の点での蛍光測定値g(0,λ)f(0,λ)と
単位があってデータ処理上好都合である。
【0018】
【発明の効果】本発明では光束走査範囲内で蛍光剤が一
様に付与されたプレートを測定したときの蛍光データを
補正値とし、実際の試料プレートを測定したときの蛍光
測定値を除算してローカリティー補正を行なうので、フ
ライングスポット方式のデンシトメトリーにおいて試料
を蛍光ラベルし蛍光を測定して高感度な測定を行なう蛍
光デンシトメトリーを、ローカリティーによって生じる
データの位置による変動をなくして実現することができ
る。
様に付与されたプレートを測定したときの蛍光データを
補正値とし、実際の試料プレートを測定したときの蛍光
測定値を除算してローカリティー補正を行なうので、フ
ライングスポット方式のデンシトメトリーにおいて試料
を蛍光ラベルし蛍光を測定して高感度な測定を行なう蛍
光デンシトメトリーを、ローカリティーによって生じる
データの位置による変動をなくして実現することができ
る。
【図1】一実施例を示す構成図である。
【図2】光束の走査における励起光強度のローカリティ
ーを示す図である。
ーを示す図である。
【図3】試料プレートを測定したときの蛍光強度を示す
図である。
図である。
【図4】ローカリティー補正の機能を示すブロック図で
ある。
ある。
【図5】フライングスポット方式の走査を示す図であ
る。
る。
【図6】補正テーブル作成手順を示すフローチャート図
である。
である。
【図7】試料測定を示すフローチャート図である。
26 ステッピングモータ 24 円板 Sr 螺旋状スリット Sfix 固定スリット 34 測定プレート 40 蛍光フィルタ 42 蛍光用光電子増倍管 46 IV変換器 48 AD変換器 50 CPU 52 モータ駆動回路 54 補正テーブル 56 演算部
Claims (1)
- 【請求項1】 測定プレートに対して励起光ビームを走
査して照射する励起光学系と、測定プレートの励起光照
射位置からの蛍光を検出する蛍光検出系と、測定プレー
トとして少なくとも励起光走査範囲内で蛍光剤が一様に
付与されたプレートを装着して測定したときの蛍光デー
タを測定プレート上の走査方向の位置の情報とともに記
憶する補正テーブルと、測定プレートとして試料プレー
トを装着して測定したときの蛍光検出データを前記補正
テーブルに記憶されている測定プレート上の走査方向の
同一位置の蛍光データで除算する演算部とを備えたフラ
イングスポット方式による蛍光イメージデンシトメー
タ。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3032508A JPH06100545B2 (ja) | 1991-01-31 | 1991-01-31 | フライングスポット方式による蛍光イメージデンシトメータ |
CN92100398.6A CN1034241C (zh) | 1991-01-31 | 1992-01-20 | 荧光图像光密度计 |
US07/827,219 US5243401A (en) | 1991-01-31 | 1992-01-30 | Fluorescent image densitometer of flying spot system |
EP92101626A EP0497372B1 (en) | 1991-01-31 | 1992-01-31 | Fluorescent image densitometer of flying spot system |
DE69209860T DE69209860T2 (de) | 1991-01-31 | 1992-01-31 | Fluoreszenzbild-Densitometer mit Lichtpunktsystem |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3032508A JPH06100545B2 (ja) | 1991-01-31 | 1991-01-31 | フライングスポット方式による蛍光イメージデンシトメータ |
Publications (2)
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