JP3706367B2 - 共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための基準デバイス、およびその評価を行うための方法およびシステム - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、第１のガラス基板の平面上に分布した試験物質、特にＤＮＡ結合アレイ等、例えば米国特許第５１４３８５４号に記載されているタイプのＤＮＡ結合アレイの２次元定量的蛍光測定を行うために使用される種類の共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための基準デバイスに関する。
【０００２】
本発明はまた、上述した種類の共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための方法に関する。
【０００３】
本発明は、より詳細には、定量的信号検出感度と、検出限界と、走査視野にわたっての共焦点容積の均一性と、走査プロセスの空間分解能と、走査視野にわたって受光される蛍光すなわち測定信号の動的挙動とに関して、上述した種類の共焦点レーザー走査顕微鏡の特徴付けを可能にする評価方法に関する。
【０００４】
本発明はさらに、基板の平面上に分布した試験物質の２次元定量的蛍光測定を行うために使用するのに適した共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するためのシステムに関する。
【０００５】
（背景）
２次元定量的蛍光測定用の共焦点レーザー走査顕微鏡の原理が図１および図２に例示されている。図１は、レーザー・ビーム１１と、ダイクロイック・ビーム・スプリッタ１２と、２つの直交方向（Ｘ−Ｙ）に空間ビームを偏向するための２次元走査エンジン１３と、対象面１５内にレーザー・ビームを合焦（すなわち焦点合わせ）するためのレンズ１４とを使用して蛍光励起する、２Ｄ飛点共焦点レーザー走査顕微鏡の光学セットアップを示す。対象面１５内の蛍光分子を励起することによって、励起レーザー１１よりも長い波長の蛍光が発生する。
【０００６】
走査領域の対象面１５内に位置する蛍光体によって放出された蛍光は、レンズ１４によって収集され、次いで、走査エンジン１３およびダイクロイック・ビーム・スプリッタ１２によって蛍光ビーム１７として伝送され、蛍光ビーム１７は、光検出デバイス２２の前にある共役面２１のピンホール・アパーチャ１９内に、レンズ１８によって合焦される。
【０００７】
バックグラウンド放射線からの概して弱い蛍光信号を識別するために現在使用されている共焦点イメージングの概念が、図２に例示される。共焦点容積Ｖｃ内部からの光放射線、すなわち蛍光信号のみが、光検出器２２によって検出される。Ｖｃは、検出光学系の光伝達関数（ＯＴＦｅｍ）と、共役面２１にある検出器ピンホール１９のサイズとによって定義される。より高いバックグラウンド抑制率が、より小さい共焦点容積Ｖｃをもたらす。
【０００８】
走査視野のサイズは通常、２０×２０平方ミリメートル程度である。共焦点容積は通常、Ｖｃ＝５×５×５０立方マイクロメートル程度であり、ここで、Ａｃ＝５×５平方マイクロメートルおよびｚｃ＝５０マイクロメートルが、それぞれほぼ合焦レーザー・ビームのスポット・サイズおよびレイリー範囲となる。視野内でレーザー・ビーム１１を走査するための走査エンジン１３の画素サイズは通常、１〜２０マイクロメートルである。
【０００９】
ＤＮＡ結合アレイ、例えば米国特許第５１４３８５４号に記載されるタイプのＤＮＡ結合アレイは、一般にフィーチャと呼ばれる、隣接セル内に細分化された化学システムを担持するガラス・チップからなる。フィーチャは、特定のプローブによって特徴付けられる。特定の核酸配列が、プローブによって不動化（捕捉）され、蛍光色素でラベル付けされる。個々のフィーチャ上にある捕捉された核酸の量が、フィーチャの順次画素読取り（走査）によって定量的蛍光測定を用いて検出される（所与の波長の光エネルギーによって励起されたときに蛍光色素が光を放出する）。フィーチャは、走査処置によって空間的にオーバーサンプルされて（すなわち、画素の数＞フィーチャの数）、数的データ解析によってガラス・チップが正確に空間参照され、物理的に測定される光強度の平均を取ることによってフィーチャ信号品質が高まる。典型的な画素サイズは１〜２０マイクロメートル程度である。
【００１０】
共焦点レーザー走査顕微鏡では、共焦点容積の断面Ａｃに対する走査視野の比が通常高く、すなわち「走査視野」／「共焦点容積の断面Ａｃ」＞＞１であり、これはｘ−ｙ位置依存光伝達関数ＯＴＦ（ｘ，ｙ）＝ＯＴＦｅｘ＊ＯＴＦｅｍを容易に導く。ここで、ＯＴＦｅｘとＯＴＦｅｍは、それぞれ励起および放出光学系の光伝達関数である。ｘ−ｙ位置依存は主に、例えば走査に使用される走査エンジン等の光学構成要素および光学機械構成要素の機械的位置合わせ不良および不完全性によるものである。これは、図３ａ、図３ｂ、および図３ｃに概略的に示されるように、走査視野にわたって不均質な感度をもたらし、それにより異常な定量的蛍光測定が生じる。一例として、図４は、ＤＮＡ結合アレイ、例えば米国特許第５１４３８５４号に記載されているタイプの走査イメージを概略的に示しており、このアレイはチェスボード・パターンを有している。図４に関連して本明細書で以後説明するように、走査イメージは、走査される対象の不均質な蛍光体密度、または走査視野にわたっての共焦点レーザー走査顕微鏡の不均質な感度により、右上コーナで、より低い信号レベルを有してる。
【００１１】
したがって、上述したタイプの共焦点レーザー走査顕微鏡の走査視野全面の感度の信頼可能な定量的測定および評価が求められている。
【００１２】
適切な参照基準ターゲット体の利用が、図４で観察される不均一性に対する器具の寄与と走査対象（例えば米国特許第５１４３８５４号に記載されているタイプのＤＮＡ結合アレイ）の寄与との区別を可能にする。しかし、共焦点レーザー走査顕微鏡の重要な性能、すなわち感度、検出限界、走査視野にわたっての均一性、空間分解能、および信号動的挙動を特徴付けるための参照蛍光ターゲット体はまだ報告されていない。
【００１３】
したがって、図４に表されるタイプの不均一性に対する器具の寄与と走査対象の寄与とを区別できるようにする適切な参照基準ターゲット体が求められている。
【００１４】
（発明の概要）
したがって、本発明の狙いは、２次元定量的蛍光測定を行うための共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を定量的に評価することができるようにする、上述した種類の基準デバイス、方法、およびシステムを提供することである。
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、この狙いは、請求項１によって定義される特徴を備える基準デバイスを用いて達成される。
【００１６】
本発明の第２の態様によれば、上述した狙いは、請求項４によって定義される方法を用いて達成される。
【００１７】
本発明の第３の態様によれば、上述した狙いは、請求項６によって定義されるシステムを用いて達成される。
【００１８】
本発明による基準デバイス、方法、およびシステムを用いて達成される主な利点は、上述した種類のＤＮＡ結合アレイを走査するための共焦点レーザー顕微鏡の性能の、定量的で非常に正確な評価を可能にすること、およびこの評価が、そのような顕微鏡を用いて（例えば）解析すべき試料ＤＮＡ結合アレイを走査することによって得られる測定結果を定量的に評価できるようにすることである。この文脈では、本発明に従って実施される評価が以下の特性の測定を含むことに留意することが重要である。
ａ）定量的信号検出感度
ｂ）定量的信号検出限界
ｃ）走査視野にわたっての共焦点容積の均一性
ｄ）走査プロセスの空間分解能、および
ｅ）受け取り蛍光に対応する測定信号の、走査視野にわたっての動的挙動
【００１９】
本発明の好ましい実施形態を、添付図面に関して本明細書で以後説明する。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
次に、本発明を、本発明の好ましい実施形態に関して説明する。これらの実施形態は、本発明の理解を助けるために記載するものであり、限定するものと解釈すべきでない。
【００２１】
図１に、２次元飛点の場合の２次元定量的蛍光測定用共焦点レーザー走査顕微鏡の基本的なセットアップを概略的に示す。ダイクロイック・ビーム・スプリッタ１２を通して伝送される励起レーザー・ビーム１１が、互いに垂直な２軸Ｘ、Ｙで２軸走査エンジン１３、例えばガルバノスキャナによって空間的に走査され、レンズ１４によって対象面１５に合焦される。この対象面１５は、軸ＸおよびＹによって定義されるＸ−Ｙ平面に平行であり、Ｘ−Ｙ平面に垂直な第３の軸Ｚに垂直である。
【００２２】
対象面１５における共焦点容積Ｖｃ内部の蛍光体が、合焦レーザー・スポット１６によって励起され、それら蛍光体の励起によって発生される蛍光１７は、共役面２１にある検出器ピンホール１９内にレンズ１８によって収集され、結像され、光検出器２２によって検出される。
【００２３】
図２に、対象面１５における共焦点容積Ｖｃ（Ｖｃ＝Ａｃ＊ｚｃ）を概略的に示す。共焦点容積Ｖｃは、理想的には、Ｚ軸に平行な回転軸と円形断面とを有する円柱形ボリュームである。共焦点容積Ｖｃは、検出光学系の光伝達関数（ＯＴＦｅｍ）と、共役面２１にある検出器ピンホール１９のサイズおよび形状とによって定義される。共焦点容積Ｖｃ内部からの光放射のみが光検出器２２によって検出される。共焦イメージングの概念は、一般に蛍光測定の場合と同様に、弱い信号レベルを検出するためにバックグラウンド抑制率を高くすることができる。
【００２４】
図３ａ、図３ｂ、および図３ｃに、走査される共焦点容積Ｖｃの様々な形の不均一性、すなわち図２に表される理想的な形状からの容積形状のずれを平面Ｙ−Ｚで概略的に示す。このずれは、走査領域にわたって測定される蛍光強度信号の振幅の不均質性をもたらす。
【００２５】
図３ａに、理想的すなわち公称の共焦点容積２３に対して傾いている走査共焦点容積２４を示す。図３ｂは、幅が一定でなく、したがって公称共焦点容積２３に比べて不均一な走査共焦点容積２５を示す。図３ｃは、公称共焦点容積２３に関して歪曲した形状を有する走査共焦点容積２６を示す。
【００２６】
使用される光学構成要素および光学機械構成要素の機械的位置合わせ不良および不完全性が、図３ａ、図３ｂ、および図３ｃで表される共焦点容積の不均一性の主な理由である。
【００２７】
図４に、米国特許第５１４３８５４号に記載されるタイプのＤＮＡ結合アレイ３１の走査イメージの概略図を示す。アレイ３１は、励起光を照射されたときに蛍光を放出するようになっている蛍光点３２のチェスボード・アレイを有する。以下の説明のために、アレイ３１の２つの区域、すなわち対角線３４からアレイ３１の右上コーナに広がる第１の区域３３と、対角線３４からアレイ３１の左下コーナに広がる第２の区域３５とを区別すると簡便である。走査対象内の不均質な蛍光体密度、または走査視野下における共焦点レーザー走査顕微鏡の不均質な感度により、図４によって表されるイメージは、アレイ３１の区域３３内に位置する蛍光点３２が、区域３５内に位置する蛍光点３２よりも低い強度の蛍光を提供することを示している。本発明による基準デバイス、方法、およびシステムの目的は、検出される蛍光の強度のそのようなばらつきが、どの程度まで、特に走査視野にわたっての共焦点レーザー走査顕微鏡の不均質感度によるものであるかを定量的に評価することである。
【００２８】
図５ａは、２次元定量的蛍光測定用共焦点レーザー走査顕微鏡の均質性および感度を定量的に特徴付けるための本発明による基準デバイス４１の第１の実施形態の上面図を示し、図５ｂはその断面図を示す。図５ａおよび図５ｂでは、寸法がミリメートル単位で示されている。
【００２９】
図５ａおよび図５ｂによって示される基準デバイス４１は、ガラス基板４３上に接合された上部ガラス・プレート４２からなる。１６×１６平方ミリメートルのガラス基板（厚さ＝１ミリメートル）が、５マイクロメートルだけエッチングされた平坦キャビティ４４（斜線領域）を有する。ガラス上部プレート４２（厚さ＝０．７ミリメートル）は、それぞれ流体入口および出口用の２つのドリル穴４５および４６を有する。別の取り得る実施形態では、ドリル穴４５および４６を有していない上部ガラス・プレート４２が、ガラス基板４３上に接合されていなくてもよい。
【００３０】
ガラス基板４３は、例えば、図４を参照して上述したＤＮＡ結合アレイ３１の基板と同一の寸法、および好ましくは同じ光学性質を有する。
【００３１】
基準デバイスのキャビティ４４は、走査領域にわたって蛍光体の所定の空間分布をもたらす所定の濃度とされた溶解蛍光体で満たされている。蛍光体は均一に溶解されるので、この空間分布は、キャビティ４４の構造によって決定され、溶解蛍光体自体によっては決定されない。図５ａおよび図５ｂを参照して説明する例では、キャビティ４４が平坦であり、したがって、蛍光体の空間分布がキャビティ４４の領域全体にわたって均一なものになる。
【００３２】
図５ａおよび図５ｂによって示される基準デバイス４１のガラス・カバー４２は、図４を参照して上述したタイプの所与のＤＮＡ結合アレイのガラス基板と同一の寸法および光学性質を有している。したがって、基準デバイス４１は、同じ光学条件下で共焦点レーザー走査顕微鏡によって走査することができる。よく定義されたキャビティ・サイズと、走査領域にわたって所定の空間分布を有する制御された蛍光体の濃度とが、走査視野にわたる感度（検出限界）および均質性に関する測定信号の検査を可能にする。上述したように、溶解蛍光体の空間分布は、キャビティ４４の構造によって決定され、均一に溶解された蛍光体自体によっては決定されない。
【００３３】
溶解蛍光体の溶液の使用は、蛍光測定を行う直前に調製が可能であるという利点を有する。したがって、溶解蛍光体の液体を充填たされたこの基準デバイスは、通常であれば比較的長時間貯蔵されると生じる可能性があるブリーチング効果の影響を受けない。このブリーチング効果は、走査視野にわたって基準デバイスの蛍光の非定量的能力をもたらす可能性がある。さらに、様々な濃度の溶解蛍光体を有する様々な溶液を簡単に調製することができ、様々な強度レベルでの蛍光測定を可能にする。特に、検出可能な強度レベルの限界を求めることができる。
【００３４】
キャビティ４４の高さは、レイリー範囲ｚｃによって与えられる共焦点容積Ｖｃの深さよりもはるかに小さく、そのためキャビティ４４内の蛍光体の薄い平坦層は、基準デバイス４１が走査視野全体にわたって走査されているときに、例えば（走査視野に垂直な）Ｚ方向における共焦点容積Ｖｃの起こり得る位置ずれについての信頼できる評価をもたらす。
【００３５】
一例として、図６は、図５ａおよび図５ｂによって示される基準デバイスを用いて得られる走査イメージのうちの列１０２４の５８８の信号プロフィルを示す。ここで、デバイスのキャビティ４４は、その広がり全体にわたって一定の厚さを有し、２００ｍｇ／ｍｌフルオレセインＴＲＩＳ溶液（水成０．１モルＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ８．３中のフルオレセイン）で満たされている。列１０２４の５８８のライン・プロフィルに関して図６に示されるように、共焦点レーザー走査顕微鏡の感度および均一性に関してイメージを解析することができる（視野＝１０×１０平方ミリメートル、画素サイズ＝１０マイクロメートル、走査の分解能は１０２４×１０２４画素、走査時間は１２６秒、使用されるトランスインピーダンス増幅器の検出感度は１０マイクロアンペア／ボルト、トランスインピーダンス増幅器と共に使用される低域フィルタのカットオフまたは６ｄＢ周波数は３０ｋＨｚであり、積分間隔ｔｄｗｅｌｌは４０マイクロ秒の持続時間を有する）。図６から理解することができるように、いくつかのノイズ信号が、得られたライン・プロフィル上に重畳されている。図６では、信号強度が任意の単位で示されている。
【００３６】
例えば走査イメージ全体にわたって信号強度の平均を取ることによって与えられる所定の値からの各画素の信号強度のずれが、共焦点レーザー走査顕微鏡の性能に関する定量的パラメータを与える。
【００３７】
他の応用例として、信号強度レベルを較正することができる。領域当たりの蛍光体の数は、溶解された蛍光体の濃度から評価することができる。したがって、測定される信号強度、および測定感度は、領域当たりの蛍光体の数に定量的に関連付けられる。
【００３８】
図７ａは、共焦点レーザー走査顕微鏡の均質性および空間分解能の定量的評価に関する本発明による基準デバイスの第２の実施形態の上面図を示し、図７ｂはその断面図を示す。
【００３９】
図７ａでは、マイクロメートル単位でのいくつかの寸法が示されている。図７ｂでは、ミリメートル単位でのいくつかの寸法が示されている。
【００４０】
図７ａおよび図７ｂに示される基準デバイス５１は、１６×１６平方ミリメートルの領域を有するガラス基板５３上にある上部ガラス・プレート５２からなる。ガラス基板５３（厚さ＝１ミリメートル）の上面は、底部内面を有するキャビティ５４を形成する５マイクロメートル・エッチング・マイクロ構造凹部を有する。キャビティ５４は、所定の濃度を有する均一に溶解された蛍光体を充填され、これはキャビティ５４の領域にわたって蛍光区域の所定の空間分布をもたらす。この空間分布は、均一に溶解された蛍光体自体によってではなくキャビティ５４の構造によって決定される。キャビティ５４は、下側外面を有するガラス上部プレート５２によってカバーされる。プレート５２の下側外面と凹部５４の底部内面との間に設けられた空間は、凹部５４の領域全体にわたって、式Ｄ＝ｆ（ｘ，ｙ）の所定の関数に従って変化する厚さＤを有する。この空間は、溶解された蛍光体で少なくとも部分的に満たされている。
【００４１】
ガラス基板５３は、例えば、図４を参照して上述したＤＮＡ結合アレイ３１の基板と同一の寸法、および好ましくは同じ光学性質を有する。
【００４２】
基準デバイス５１のガラス・カバー５２は、図４を参照して上述した種類の所与のＤＮＡ結合アレイ３１のガラス基板と同一の光学性質を有する。したがって、基準デバイス５１を、同じ光学条件下で共焦点レーザー走査顕微鏡によって走査することができる。
【００４３】
マイクロ構造キャビティ５４は、様々なパターンの蛍光区域を備える。図７ａでは、各非蛍光区域が、影付き面によって表されている。
【００４４】
蛍光区域の第１のパターンは、影付き正方形によって図７にそれぞれ表されているただ２つの非蛍光区域を備える。図７ａでは、この第１のパターンを有する蛍光区域が、基準デバイス５１の各コーナ区域５５、５６、５７、５８に位置する。これらのコーナ区域から放出される蛍光の強度に対応する測定信号を評価して、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行われる走査の走査視野にわたる均一性の度合を査定する。
【００４５】
基準デバイス５１の異なる列に位置する区域６１および６２は、蛍光フィーチャの空間分布の第２のパターンを有する。参照番号６１および６２等の区域から放出される蛍光に対応する測定信号を評価して、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行われる走査の分解能を査定する。さらに、区域６１および６２の寸法がわかっているので、走査エンジンによって行われる走査ステップの精度を査定することができる。図７ａに示されるように、区域６１および６２は細分化されており、それによりキャビティは、溶解された蛍光体によって充填される１つの接続されたリザーバを形成する。
【００４６】
異なる傾斜角を有するバーのグループの外観を有する区域６３、６４が、基準デバイス５１で利用可能な蛍光フィーチャの第３のパターンを表す。区域６３等の区域から放出される蛍光に対応する測定信号を評価して、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行われる走査に関連する動的信号挙動を査定する。
【００４７】
本発明は、上述し、それぞれ図５ａ、図５ｂおよび図７ａ、図７ｂに示される、２次元定量的蛍光測定用共焦点レーザー走査顕微鏡の定量的評価のために使用される基準デバイスに関する。本発明による基準デバイス、当該の方法で決定される典型的な特性は、
ａ）定量的信号検出感度
ｂ）定量的信号検出限界
ｃ）走査視野にわたっての共焦点容積の均一性
ｄ）走査プロセスの空間分解能
ｅ）走査視野にわたっての、受け取られた蛍光に対応する測定信号の動的挙動である。
【００４８】
共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための本発明の上述の使用は、実質的に、
評価する顕微鏡を用いて本発明による基準デバイスを走査し、第１のセットの測定値を得るステップ、
前記第１のセットの測定値を処理して、補正因子を得るステップ、
前記補正因子を記憶するステップ、
評価された顕微鏡を用いて試料、例えばＤＮＡ結合アレイを走査して、第２のセットの測定値を得るステップ、および
前記補正因子を用いて前記第２のセットの測定値を補正して、スキャナの性能によるずれがなく、したがって検査される特定の試料の特徴に、より正確に対応した第３のセットの値を得るステップ
を含む。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態を特定の用語を用いて上述してきたが、そのような説明は例示目的にすぎず、本特許出願の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく変更および変形を加えることができることを理解されたい。
【００５０】
（参照番号のリスト）
１１ 励起レーザー・ビーム
１２ ダイクロイック・ビーム・スプリッタ
１３ ２軸走査エンジン
１４、１８ レンズ
１５ 対象面
１６ 合焦レーザー・スポット
１７ 蛍光
１９ 検出器ピンホール
２１ 共役面
２２ 光検出器
２３ 公称共焦点容積（面ｚ−ｙでの断面）
２４、２５、２６ 走査共焦点容積（面ｚ−ｙでの断面）
３１ ＤＮＡ結合アレイ（対象面に位置する）
３２ 蛍光点または蛍光フィーチャ
３３、３５ 区域
３４ 対角線
４１ 基準デバイスの第１の実施形態
４２、５２ 上部プレート
４３、５３ 底部プレート
４４、５４ キャビティ
４５、４６ 穴
５１ 基準デバイスの第２の実施形態
５５、５６、５７、５８ 蛍光フィーチャの第１のパターンを有する区域
６１、６２ 蛍光フィーチャの第２のパターンを有する区域
６３、６４ 蛍光フィーチャの第３のパターンを有する区域
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２次元定量的蛍光測定を行うための共焦点レーザー走査顕微鏡の基本セットアップの概略図である。
【図２】 対象面における共焦点容積Ｖｃを概略的に示す図である。
【図３ａ】 走査視野にわたっての走査共焦点容積の様々な形の不均一性を概略的に示す図の１つである。
【図３ｂ】 走査視野にわたっての走査共焦点容積の様々な形の不均一性を概略的に示す図の１つである。
【図３ｃ】 走査視野にわたっての走査共焦点容積の様々な形の不均一性を概略的に示す図の１つである。
【図４】 ＤＮＡ結合アレイの走査イメージの概略図である。
【図５ａ】 本発明による基準デバイスの第１の実施形態の上面図である。
【図５ｂ】 図５ａによって示される実施形態の平面Ａ−Ａを介する断面図である。
【図６】 図５ａおよび図５ｂに表されるアレイの列に位置する蛍光区域によって放出される蛍光を測定することによって得られる典型的な電気信号の形状を示す図である。
【図７ａ】 本発明による基準デバイスの第２の実施形態の上面図である。
【図７ｂ】 図７ａによって示される実施形態の断面図である。

Claims (9)

1. 共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための基準デバイスであって、
   （ａ）基板（４３、５３）と、
   （ｂ）前記基板（４３、５３）の表面にわたって分布する基準蛍光物質であって、前記基板の表面にわたって所定の空間分布を有し、且つ所定の濃度で液体中に溶解されている基準蛍光物質と
   を有する基準デバイス。
2. 前記基準蛍光物質が、前記基板の前記表面にわたって一定の厚さを有することを特徴とする請求項１に記載の基準デバイス。
3. 前記基準蛍光物質が、共焦点レーザー走査顕微鏡の共焦点容積（Ｖｃ）の深さ（ｚｃ）よりも小さい厚さを有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の基準デバイス。
4. 前記基準蛍光物質が、前記基板の前記表面にわたって均一に分布されており、且つ所定の濃度を有している請求項１に記載の基準デバイス。
5. （ａ）上面に凹部（５４）を有するベース・プレート（４３、５３）であって、前記凹部が一定の厚さを有し、且つ前記上面の大部分にわたって延在し、また前記凹部（５４）の底部が底部内面を有しているベース・プレート（４３、５３）と、
   （ｂ）光学的に透明であり、前記ベース・プレートの前記凹部を覆うカバー・プレート（４２、５２）であって、該カバー・プレート（４２、５２）が下側外面を有しており、該下側外面と、前記ベース・プレートの凹部の前記底部内面との間に設けられた空間が、前記凹部（５４）の領域全体にわたって一定の厚さを有しているカバー・プレート（４２、５２）と、
   （ｃ）各区域の厚さ全体にわたって延在する前記基準蛍光物質で完全に満たされた前記空間内部の１つまたは複数の区域と
   を有することを特徴とする請求項１に記載の基準デバイス。
6. 第１の基板（３１）の平面上に分布する試験物質の２次元定量的蛍光測定を行うために使用される種類の共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための方法であって、
   前記顕微鏡を用いて基準デバイスの２次元定量的蛍光測定を行うステップを含む性能評価方法において、前記基準デバイスが、
   （ａ）第２の基板（４３、５３）と、
   （ｂ）前記第２の基板（４３、５３）の表面にわたって分布する基準蛍光物質であって、前記基板表面にわたって所定の空間分布を有し、且つ所定の濃度で液体中に溶解されている基準蛍光物質とを有している、共焦点レーザー走査顕微鏡の性能評価方法。
7. 第１の基板（３１）の平面上に分布する試験物質の２次元定量的蛍光測定を行うために使用される種類の共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するための方法であって、
   前記顕微鏡を用いて基準デバイスの２次元定量的蛍光測定を行うステップを含む性能評価方法において、前記基準デバイスが、
   （ａ）上面に凹部（５４）を有するベース・プレート（４３、５３）であって、前記凹部が一定の厚さを有し、且つ前記上面の大部分にわたって延在し、また前記凹部（５４）の底部が底部内面を有しているベース・プレート（４３、５３）と、
   （ｂ）光学的に透明であり、前記ベース・プレートの前記凹部を覆うカバー・プレート（４２、５２）であって、該カバー・プレート（４２、５２）が下側外面を有しており、該下側外面と、前記ベース・プレートの凹部の前記底部内面との間に設けられた空間が、前記凹部（５４）の領域全体にわたって一定の厚さを有しているカバー・プレート（４２、５２）と、
   （ｃ）各区域の厚さ全体にわたって延在する前記基準蛍光物質で完全に充填された前記空間内部の１つまたは複数の区域であって、前記基準蛍光物質が所定の濃度で液体中に溶 解されている１つまたは複数の区域とを有している、共焦点レーザー走査顕微鏡の性能評価方法。
8. 前記第１の基板が、ＤＮＡ結合アレイ等の一部である請求項６または請求項７に記載の方法。
9. 基板の平面上に分布する試験物質の２次元定量的蛍光測定を行うために使用されるのに適した共焦点レーザー走査顕微鏡の性能を評価するためのシステムであって、
   共焦点レーザー走査顕微鏡と、
   請求項１に記載の基準デバイスと
   を有する共焦点レーザー走査顕微鏡の性能評価システム。

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