JPWO2014141516A1 - 光分析装置の評価方法およびファントムサンプル - Google Patents

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Abstract

簡易にかつ精度よく光分析装置の光学系を評価する。励起光Ｂを集光して焦点位置にコンフォーカルボリュームＣを形成可能な光学系Ａを備える光分析装置の評価方法であって、蛍光物質の濃度の異なる２種以上の複数の固体部材（２，３）を隣接して配列してなるファントムサンプル（１）を光学系Ａの焦点位置に配置するステップと、光学系Ａにより形成されるコンフォーカルボリュームＣとファントムサンプル（１）とを固体部材（２，３）の配列方向に相対的に移動させつつ、光学系Ａを介してファントムサンプル１に励起光を照射するステップと、コンフォーカルボリュームＣ内に配置された固体部材（２，３）において発生した蛍光を検出するステップと、検出された蛍光に基づいて光学系Ａを評価するステップとを含む光分析装置の評価方法を提供する。

Description

本発明は、光分析装置の評価方法およびファントムサンプルに関するものである。
従来、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるよりも低い濃度の水溶液中の発光粒子の状態や特性を定量的に観測することができる光分析装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この光分析装置は、共焦点顕微鏡または多光子励起顕微鏡のように水溶液中のコンフォーカルボリュームからの光を検出可能な光学系を用いる。そして、水溶液内においてコンフォーカルボリュームの位置を移動させながら、すなわち、コンフォーカルボリュームによって水溶液内を走査しながら、水溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子がコンフォーカルボリューム内に包含されたときに、その発光粒子から発せられる光を検出するようになっている。
この光分析装置は、基本的に、コンフォーカルボリュームの大きさに対して、水溶液中で十分に離散的に分散している発光粒子の濃度を計測するものであり、粒子が水溶液中を水のブラウン運動によって拡散する速さよりも大きな速度で走査されるコンフォーカルボリュームが粒子を通過する際に得られる蛍光強度（フォトン）のパルス列が、コンフォーカルボリュームの強度分布である釣鐘型を反映しており、この特徴的な形状から、これを１つの粒子と判断するという非常に明確で単純な原理に基づいている。
１つの粒子の通過は、１つの連なった釣鐘型の山（ピーク）として数えられ、ある決まった走査時間中のピーク数の和は、水溶液中の粒子の濃度に比例する。つまり、あらかじめ対象となる粒子を既知の濃度の状態として、ある決まった時間だけ走査しながらこの間のピーク数を計測し、これが一連の濃度の水溶液に対して行われれば、濃度とピーク数を校正することができる。その結果、未知の濃度の水溶液の計測を行い、そのピーク数を得ることで濃度を計測できることになる。
このような光分析装置の光学系の評価を行う場合には、実際に異なる既知濃度の複数種の蛍光色素分子の水溶液を用意して、各水溶液内においてコンフォーカルボリュームを所定時間にわたって走査させたときに得られる蛍光のピーク数を濃度に対応させることで、ピーク数と濃度との関係を校正する作業を実施する。
このとき、ある所定の濃度に対して得られるピーク数が光学系から見積もられる数よりも少ない、あるいは、ピークをなすフォトンのパルス列の高さが小さい、つまり蛍光の強度が小さいなどの状態が確認された場合には、それらは光学系の状態が正しくないことを示す。ここで、状態を決める要素は、水溶液中に構成されるコンフォーカルボリュームのサイズ、水溶液が保持されている容器の透明体である底板面からのコンフォーカルボリュームの高さ（焦点の位置）、走査の速度、検出器の感度、光軸のズレなどである。
国際公開第２０１１／１０８３６９号
しかしながら、異なる既知濃度の複数種の蛍光色素分子の水溶液を、極めて薄い濃度の領域において精度よく調製すること、例えば、１／１０ステップで、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、１００ａＭのようなシリーズで調整することは、労力を必要とし、さらに調整時に人為的なエラーが生じる可能性もある。また、極めて薄い濃度のため、若干の水分の蒸発によっても劇的に濃度が変動するなどの可能性があること、さらには、蛍光色素分子の退色などの劣化も起こりうるため保存性に欠ける。このため実際の水溶液の試料を使って、光分析装置の光学系を正しく評価することは、容易ではない。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易にかつ精度よく光分析装置の光学系を評価することができる光分析装置の評価方法およびファントムサンプルを提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、励起光を集光して焦点位置にコンフォーカルボリュームを形成可能な光学系を備える光分析装置の評価方法であって、蛍光物質の濃度の異なる２種以上の複数の固体部材を隣接して配列してなるファントムサンプルを前記光学系の焦点位置に配置するステップと、前記光学系により形成されるコンフォーカルボリュームと前記ファントムサンプルとを前記固体部材の配列方向に相対的に移動させつつ、前記光学系を介して前記ファントムサンプルに励起光を照射するステップと、前記コンフォーカルボリューム内に配置された固体部材において発生した蛍光を検出するステップと、検出された蛍光に基づいて前記光学系を評価するステップとを含む光分析装置の評価方法を提供する。
本態様によれば、光分析装置の光学系の焦点位置を固体部材に一致させた状態で、固体部材の配列方向にファントムサンプルと光学系により形成されるコンフォーカルボリュームとを固体部材の配列方向に相対的に移動させることにより、検出される蛍光強度をステップ状に変化させることができる。
焦点位置が固体部材に一致している場合には、固体部材の境界位置において蛍光強度が急激に変化するが、焦点位置が一致していない場合には、蛍光強度の変化はなだらかである。したがって、この位置における蛍光の強度変化の傾きを求めることにより、焦点位置が適正であるか否かを容易に評価することができる。また、コンフォーカルボリュームが適正な大きさに形成されている場合には、検出される蛍光強度は高いが、コンフォーカルボリュームが小さい場合には、検出される蛍光強度は低いので、これによりコンフォーカルボリュームのサイズあるいは検出器の感度が適正であるか否かを簡易に評価することができる。
上記態様においては、前記ファントムサンプルが、所定濃度の蛍光物質を含有する第１の固体部材と、蛍光物質を含まない第２の固体部材とを交互に配列して構成されていてもよい。
このようにすることで、隣接する固体部材の境界において発生する蛍光の強度差を顕著にすることができる。
また、上記態様においては、前記固体部材が、一定周期で配列されていてもよい。
このようにすることで、光学系により形成されるコンフォーカルボリュームと固体部材との相対移動に際し、一定の相対速度で相対移動させることにより、得られる蛍光強度を一定の周期で変化させることができる。その結果、蛍光強度の周期性から、相対移動速度、すなわち、走査速度の一定性を評価することができる。
また、上記態様においては、前記固体部材が、一直線方向に配列されていてもよい。
このようにすることで、光学系により形成されるコンフォーカルボリュームと固体部材とを固体部材の配列方向に一直線状に移動させるだけで、上記評価を行うことができる。
また、上記態様においては、前記固体部材が、周方向に配列されていてもよい。
このようにすることで、光学系により形成されるコンフォーカルボリュームと固体部材とを、固体部材の配列中心回りに回転させるだけで、上記評価を行うことができる。
上記態様においては、前記光学系を評価するステップが、異なる前記固体部材の隣接位置における蛍光の強度変化の傾きに基づいて、前記光学系の焦点位置が適正であるか否かを評価してもよい。
光学系の焦点位置がファントムサンプルに精度よく一致している場合には、検出される蛍光の強度は、固体蛍光板の隣接位置においてステップ状に変化するため、その傾きは限りなく大きいが、焦点位置がズレている場合には、蛍光の強度変化の傾きは小さくなる。したがって、強度変化の傾きを検出することにより光学系の焦点位置が適正であるか否かを簡易に評価することができる。
また、上記態様においては、前記光学系を評価するステップが、検出された蛍光の強度に基づいて、コンフォーカルボリュームのサイズあるいは検出器の感度が適正であるか否かを評価してもよい。
コンフォーカルボリュームのサイズあるいは検出器の感度が適正である場合には、所定の蛍光強度を得ることができ、不適正な場合には、それよりも低い蛍光強度が得られるので、これらを簡易に評価することができる。
また、上記態様においては、前記光学系を評価するステップが、異なる前記固体部材の隣接位置における蛍光の強度変化の時間間隔に基づいて、前記光学系による励起光の走査速度が適正であるか否かを評価してもよい。
このようにすることで、固体部材において発生する蛍光量は、隣接する固体部材の境界においてステップ状に変化するので、その変化の時間間隔を確認することで、光学系による励起光の走査速度が適正であるか否かを簡易に評価することができる。
また、本発明の他の態様は、上記いずれかの光分析装置の評価方法に用いられるファントムサンプルを提供する。
本態様によれば、従来のような水溶液によって調整する労力が不要であり、したがって調整時に人為的なエラーが発生せず、また、極めて薄い濃度であっても、水分の蒸発等による濃度変動も発生しない。また、蛍光色素分子の退色などの劣化も起こり難く、保存性にも優れている。このため光分析装置の光学系を簡易にかつ精度よく評価することができる。
本発明によれば、簡易にかつ精度よく光分析装置の光学系を評価することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係るファントムサンプルを示す斜視図である。 図１のファントムサンプルを用いた光分析装置の評価方法を説明する部分的な斜視図である。 図１のファントムサンプルに光分析装置の光学系の焦点位置が一致している場合に光検出器により検出される蛍光強度の時間変化を示す波形である。 図１のファントムサンプルに光分析装置の光学系の焦点位置が一致していない場合に光検出器により検出される蛍光強度の時間変化を示す波形である。 図１のファントムサンプルの変形例を示す斜視図である。
本発明の一実施形態に係る光分析装置の評価方法およびファントムサンプル１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るファントムサンプル１は、図１に示されるように、蛍光物質の濃度の異なる２種類の固体部材２，３を交互に隣接して複数配列することにより平板状に構成されている。
一方の固体部材２は、所定の蛍光濃度の蛍光物質を含んでいる。他方の固体部材３は蛍光物質を含んでいない（蛍光濃度ゼロの蛍光物質を含んでいる。）。これらの固体部材２，３は十分に薄く形成され、その幅寸法は、精度よく同一の幅寸法となるように設定されている。
このように構成された本実施形態に係るファントムサンプル１を用いた光分析装置の評価方法について以下に説明する。
本実施形態に係るファントムサンプル１を用いて、共焦点光学系あるいは多光子励起光学系を含む光分析装置を評価するには、図２に示されるように、光分析装置の光学系Ａを調節してその焦点位置がファントムサンプル１に一致するように配置する。
この状態で光学系Ａを介して伝播されてきた励起光Ｂをファントムサンプル１に照射する。これにより、光学系Ａの焦点位置に形成されるコンフォーカルボリュームＣがファントムサンプル１に一致し、コンフォーカルボリュームＣ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。
また、光分析装置の走査手段（図示略）を作動させて、コンフォーカルボリュームＣを光軸に交差し、かつ、固体部材２，３の配列方向に一致する方向（矢印Ｄの方向）に移動させる。これにより、コンフォーカルボリュームＣが固体部材２，３に対して相対的に移動させられる。
固体部材２，３において発生した蛍光は、光分析装置の光学系Ａにより集光され、図示しない光検出器によって検出される。
すなわち、コンフォーカルボリュームＣが蛍光物質を含む一方の固体部材２に一致している間は、固体部材２において蛍光が発生し光検出器から所定の強度の信号が発生する一方、コンフォーカルボリュームＣが蛍光物質を含まない他方の固体部材３に一致している間は、光検出器からは信号が発生しない（あるいは、暗ノイズレベルの信号が発生する。）。したがって、コンフォーカルボリュームＣと固体部材２，３とが相対的に移動する間に、光検出器により検出される信号は、矩形波状に変化する。
この場合において、コンフォーカルボリュームＣの光軸方向位置が固体部材２，３に正しく合致している場合には、コンフォーカルボリュームＣが最も細く収束した位置を固体部材２，３が横切るように配置されるので、図３に示されるように２種類の固体部材の境界位置で光検出器からの信号が、ゼロから有限値あるいは有限値からゼロへステップ状に変化する。したがって、固体部材２，３の境界位置における信号の時間変化の傾きは無限大に近い。
その一方で、コンフォーカルボリュームＣの光軸方向位置が固体部材２，３に正しく合致していない場合には、コンフォーカルボリュームＣが拡がった位置を固体部材２，３が横切るように配置されるので、図４に示されるように、２種類の固体部材２，３の境界位置における光検出器からの信号は、なだらかに変化する。したがって、固体部材２，３の境界位置における信号の時間変化の傾きは小さくなる。
その結果、本実施形態に係るファントムサンプル１によれば、光分析装置によって検出される蛍光強度の信号の時間変化によって、光学系Ａの焦点位置がファントムサンプル１に正しく一致しているか否かを容易に評価することができるという利点がある。
また、本実施形態に係るファントムサンプル１は、一方の固体部材２が所定の蛍光濃度を有しているので、所定の強度の励起光を照射することにより発生する蛍光の強度は予め分かっている。したがって、上記のようにして、光学系Ａの焦点位置がファントムサンプル１に正しく一致していると評価できる場合においても、光検出器により検出される信号の最大強度が予め分かっている値に対して低い場合には、励起光Ｂを発生する光源に問題があるか、コンフォーカルボリュームＣのサイズが小さすぎるか、光検出器の感度が低下しているかのいずれかを簡易に評価することができる。
さらに、本実施形態に係るファントムサンプル１は、２種類の固体部材２，３が、精度よく同一の幅寸法を有しているので、コンフォーカルボリュームＣと固体部材２，３との相対移動速度が等速である場合には、光検出器により発生される信号は正しく周期的に変化する。したがって、この周期を検出することにより、コンフォーカルボリュームＣと固体部材２，３との相対移動速度、すなわち、励起光Ｂの走査速度が一定であるか否かを簡易に評価することができるという利点がある。
なお、本実施形態においては、所定濃度の固体部材２と濃度ゼロの固体部材３とを交互に配列したが、これに代えて、いずれも蛍光物質を含有し、その濃度が明確に異なる固体部材を交互に配列してもよい。また、濃度が異なる３種以上の固体部材を配列してもよい。また、照射する励起光の種類に応じて異なる蛍光物質を含有する固体部材を有するファントムサンプル１を入れ替えることにしてもよい。
また、本実施形態においては、直線方向一方向に固体部材２，３を配列したファントムサンプル１を例示したが、これに代えて、図５に示されるように、扇形の異なる蛍光濃度の固体部材２，３を周方向に交互に配列して円板状に形成したファントムサンプル１を採用してもよい。このようにすることで、ファントムサンプル１をその中心軸回りに一方向に等速度回転させるだけで、連続的に上記評価を行うことができる。
また、本実施形態においては、厳密に同一の幅寸法を有する固体部材２，３を配列したので、等速度で相対移動させている限り、どの位置でも周期的な出力波形を得ることができるが、これに限定されるものではない。すなわち、隣接する固体部材２，３の境界位置における信号変化を考慮するだけであれば、周期性は不要であり、幅寸法は同一でなくてもよい。
また、周期性が必要な評価内容の場合においても、異なる種類の固体部材２，３どうしは幅寸法を異ならせてもよい。同種の固体部材２（３）の幅寸法を一致させておけば、周期性は保たれるので、これによっても走査速度の評価を行うことができる。
１ ファントムサンプル
２，３ 固体部材
Ａ 光学系
Ｂ 励起光
Ｃ コンフォーカルボリューム

Claims (9)

  1. 励起光を集光して焦点位置にコンフォーカルボリュームを形成可能な光学系を備える光分析装置の評価方法であって、
    蛍光物質の濃度の異なる２種以上の複数の固体部材を隣接して配列してなるファントムサンプルを前記光学系の焦点位置に配置するステップと、
    前記光学系により形成されるコンフォーカルボリュームと前記ファントムサンプルとを前記固体部材の配列方向に相対的に移動させつつ、前記光学系を介して前記ファントムサンプルに励起光を照射するステップと、
    前記コンフォーカルボリューム内に配置された固体部材において発生した蛍光を検出するステップと、
    検出された蛍光に基づいて前記光学系を評価するステップとを含む光分析装置の評価方法。
  2. 前記ファントムサンプルが、所定濃度の蛍光物質を含有する第１の固体部材と、蛍光物質を含まない第２の固体部材とを交互に配列してなる請求項１に記載の光分析装置の評価方法。
  3. 前記固体部材が、一定周期で配列されている請求項１または請求項２に記載の光分析装置の評価方法。
  4. 前記固体部材が、一直線方向に配列されている請求項１から請求項３のいずれかに記載の光分析装置の評価方法。
  5. 前記固体部材が、周方向に配列されている請求項１から請求項３のいずれかに記載の光分析装置の評価方法。
  6. 前記光学系を評価するステップが、異なる前記固体部材の隣接位置における蛍光の強度変化の傾きに基づいて、前記光学系の焦点位置が適正であるか否かを評価する請求項１から請求項５のいずれかに記載の光分析装置の評価方法。
  7. 前記光学系を評価するステップが、検出された蛍光の強度に基づいて、コンフォーカルボリュームのサイズあるいは検出器の感度が適正であるか否かを評価する請求項１から請求項５のいずれかに記載の光分析装置の評価方法。
  8. 前記光学系を評価するステップが、異なる前記固体部材の隣接位置における蛍光の強度変化の時間間隔に基づいて、前記光学系による励起光の走査速度が適正であるか否かを評価する請求項１から請求項５のいずれかに記載の光分析装置の評価方法。
  9. 請求項１から請求項８のいずれかに記載の光分析装置の評価方法に用いられるファントムサンプル。
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