JP4887494B2 - 蛍光目盛り基盤、蛍光目盛り付き顕微鏡基盤及び蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器 - Google Patents

Description

本発明は、主に蛍光顕微鏡観察に用いられる蛍光目盛り基盤、蛍光目盛り付き顕微鏡基盤及びこれを用いた蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器に関する。

バイオテクノロジー技術の急速な進展に伴い、生体にダメージを与えることなく、より微小な領域を観察できる手法の開発が強く望まれている。生体観察という観点から、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）や透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は真空を必要とするために、生きたままの観察には不向きであり、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）や原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は走査速度の関係で、動きの速い生体観察には不向きであるので、生物に与えるダメージが少なく生きたまま溶液中で観察できる光学顕微鏡が、バイオテクノロジー用ツールとして好ましい。なかでも、蛍光顕微鏡が生体観察に多く用いられている。現在、より小さな領域を観察したいという要求から、分解能を高め、より微細な生体組織の解析を目指した共焦点顕微鏡などの蛍光顕微鏡の開発が精力的に進められている。

従来、高分解能蛍光顕微鏡の分解能の評価には、蛍光ビーズを散布する方法が用いられていたが、ビーズの散布状況が不明で、分解能を定量的に評価することは不可能であった。このため蛍光顕微鏡の分野において、分解能を簡便に且つ定量的に測定できる「分解能評価チャート」が強く求められている。

又近年、２光子吸収顕微鏡などの非線形顕微鏡が生体の観察に使われ始め、被測定物の観察と同時に直接寸法を測定可能な「蛍光目盛り付き顕微鏡基盤」に対する需要が高まっている。特に、観察試料中に含まれる微生物の個体数の計測を行っている研究分野においては、この様な蛍光目盛り付き顕微鏡基盤があれば評価時間の大幅な短縮化が期待されるので、その実現が強く望まれているが、この様な蛍光目盛り付き顕微鏡基盤は、従来存在しない。

以上のように、従来、蛍光顕微鏡において、被測定物の観察と同時に、寸法を直接測定可能な蛍光目盛り付き顕微鏡基盤は存在していない。このため、明視野方式と光学系を同一とする蛍光顕微鏡における寸法測定は、明視野方式でスケールを別途観察しておき、同倍率で観察した蛍光顕微鏡像を明視野で測定したスケールと比較することで行われている。しかしながら、近年多く用いられるようになってきている共焦点レーザ走査型蛍光顕微鏡などは、明視野顕微鏡とは光学系が異なるために、上述のような測定を用いることができない。従って、観察と同時に寸法を測定可能な蛍光目盛り付き顕微鏡基盤は極めて重要であり、作製・取扱の容易な蛍光目盛り付き顕微鏡基盤が求められているが、この様な蛍光目盛り付き顕微鏡基盤は、従来存在しない。

本発明は、１μｍ以下の２点分解能が実現でき、被測定物の顕微鏡観察時に同時に寸法測定可能な発光強度と、高いコントラストを有し、耐退色性に優れた蛍光目盛り基盤、蛍光目盛り付き顕微鏡基盤及びこれを用いた蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の第１の態様は、（イ）励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板と、（ロ）第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層と、（ハ）開口部に、第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、（ニ）この蛍光発光層の裏面を被覆し、蛍光発光層で発光した蛍光を第１主面方向に反射するバックコート層とを備える蛍光目盛り基盤であることを要旨とする。

本発明の第２の態様は、（イ）透明基板と、（ロ）この透明基板に接して配置され、透明基板を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層と、（ハ）開口部に、透明基板に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、（ニ）透明基板、遮光層及び蛍光発光層を含む積層体を、搭載面に形成された凹部に、積層体の少なくとも一部を密閉状態で収納して搭載する支持基板とを備える蛍光目盛り付き顕微鏡基盤であることを要旨とする。

本発明の第３の態様は、（イ）第１透明基板と、（ロ）第１透明基板に接して配置され、第１透明基板を露出する開口部が目盛り状パターンをなす非蛍光発光層と、（ハ）開口部に、非蛍光発光層と同一厚さで埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、（ニ）非蛍光発光層と蛍光発光層とに接し、第１透明基板とともに非蛍光発光層と蛍光発光層とを挟む第２透明基板とを備える蛍光目盛り付き顕微鏡基盤であることを要旨とする。

本発明の第４の態様は、（イ）第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板と、（ロ）第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層と、（ハ）開口部に、第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、（ニ）透明基板、遮光層及び蛍光発光層を含む積層体を、搭載面に形成された凹部に、積層体の少なくとも一部を密閉状態で収納して搭載する支持基板と、（ホ）透明基板の第１主面側に接して配置された、被観察試料を収納する試料収納部とを備える蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器であることを要旨とする。

本発明によれば、１μｍ以下の２点分解能が実現でき、被測定物の顕微鏡観察時に同時に寸法測定可能な発光強度と、高いコントラストを有し、耐退色性に優れた蛍光目盛り基盤、蛍光目盛り付き顕微鏡基盤及びこれを用いた蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器を提供できる。

次に、図面を参照して、本発明の第１〜第３の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付している。但し、図面は模式的なものであり、厚みと平面寸法との関係、各層の厚みの比率等は現実のものとは異なることに留意すべきである。したがって、具体的な厚みや寸法は、光学的な焦点等の設計事項や以下の説明を参酌して判断すべきものである。又、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

又、以下に示す第１〜第３の実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成部品の材質、形状、構造、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。

（第１の実施の形態）
本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤は、図１に示すように、励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板２１と、第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層２３と、開口部に、第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層２５と、この蛍光発光層２５の裏面を被覆し、蛍光発光層２５で発光した蛍光を第１主面方向に反射するバックコート層２６とを備える。この蛍光目盛り基盤は、更に、透明基板２１、遮光層２３、蛍光発光層２５、バックコート層２６の積層体（２１，２３，２５，２６）を搭載する支持基板１１ａを備える。図１に示すように、支持基板１１ａの積層体（２１，２３，２５，２６）の搭載面には、凹部２７が設けられ、この凹部２７に、積層体（２１，２３，２５，２６）の一部が収納されている。

本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤は、支持基板１１ａが凹部２７を備え、この凹部２７の内部に、透明基板２１、遮光層２３、蛍光発光層２５、バックコート層２６の積層体（２１，２３，２５，２６）の一部、即ち、蛍光発光層２５及びバックコート層２６からなる凸部を収納し、この凸部を密閉状態でシールしているので、蛍光発光層２５がダメージを受けないという、実用上非常に有利な効果を奏する。

透明基板２１は、励起光の波長を透過する光学材料であれば、種々の材料が使用可能で、例えば、励起光の波長に応じて、ソーダガラス（ソーダ石灰ガラス）、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラス材料が選択可能である。顕微鏡観察に用いる蛍光目盛り基盤であれば、ホウケイ酸ガラスの一種である理化学用硬質ガラスや顕微鏡用カバーガラスを用いても良い。顕微鏡に使用されるカバーガラスは、日本工業規格（ＪＩＳ）によりその規格が定められていて厚さは、１２０〜１７０μｍ又は１５０〜１８０μｍである。なお、透明基板２１の「第１主面」とは、実質的に平板形状の透明基板２１の一方の主面（面積が最大若しくは２番目に大きな面）である。「第２主面」は、透明基板２１の「第１主面」に対向した主面である。即ち、第１及び第２主面のいずれか一方が「表面」、他方が「裏面」と解釈できる関係にある対向した２つの面を定義している。

遮光層２３としては、微細加工が容易で、励起光の波長に対して光学的に不透明な膜なら種々の薄膜が採用可能であり、例えば、クロム（Ｃｒ）膜等の金属膜を採用可能である。或いは、Ｃｒ膜と酸化クロム（Ｃｒ₂Ｏ₃）膜との複合膜等の多層膜でも良い。遮光層２３の厚さは、例えば２００ｎｍ〜５００ｎｍ程度の範囲で、加工の容易性を鑑みて選択可能である。

蛍光発光層２５としては、透明な材料に蛍光材料を分散したものが採用可能である。透明な材料としてはシリコン酸化膜（ＳｉＯ₂）、ガラス、若しくは高分子材料が使用可能である。蛍光発光層２５の厚さは、例えば、３００ｎｍ〜１μｍの範囲に選べば良い。蛍光材料を分散させる媒体として透明な高分子材料の好適な例は、高解像レジストとして微細加工に使われているポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）である。ＰＭＭＡの分子構造は、(ＣＨ₂Ｃ−ＣＨ₃−ＣＯＯＣＨ₃)_n（ｎは重合度）で示されるが、例えば、分子量７．０〜７．５×１０⁵の程度のＰＭＭＡが使用できる。ＰＭＭＡは、他の高分子樹脂に比べて、透明度が高く、光学特性に優れている。更には、耐候性や加工性が良いなどの特徴を持った材料で、コンタクトレンズ、テーブルランプカバー、看板などの日用品から機械、電気、土木などの工業部品雑貨まで、様々なところに用いられている。透明な材料に分散させる蛍光材料としては、ローダミン系、クマリン系などの有機蛍光色素、Ｙ₃Ａｌ₅Ｏ₁₂：Ｃｅ³⁺（ＹＡＧ：Ｃｅ³⁺）等の無機蛍光材料や半導体微粒子等が好適である。ローダミン系の蛍光色素は、融点が２００℃を越し、メタノール等の有機溶媒に容易に溶け、緑色の光をあてるとオレンジ色の蛍光を発する分子である。例えば、分子量５４３．１のローダミン５９０が使用できる。

バックコート層２６は、蛍光発光層２５で発光した蛍光を透明基板２１の第１主面方向に反射する層であれば、種々の材料からなる層が採用可能で、金属反射膜や誘電体多層膜によるブラッグ反射膜等でも構わない。金属反射膜をバックコート層２６として用いる場合は、例えば、金（Ａｕ）膜やアルミニウム（Ａｌ）膜が使用可能である。Ａｕ膜の場合は、膜厚８０ｎｍでほぼ１００％の反射率がある。蛍光発光層２５の保護の観点からは、膜厚５０〜６０ｎｍ程度以上あれば良いが、反射率を考慮すると、Ａｕ膜の場合は、膜厚８０〜１００ｎｍ程度が好ましい。Ａｌ膜の場合も同様な理由から膜厚１００ｎｍ程度が必要である。バックコート層２６はコントラストを高めるのに有効な方法である。ここでコントラストＣＲは、明部蛍光強度をＩ_max，暗部蛍光強度をＩ_minとすれば：
ＣＲ＝Ｉ_max／Ｉ_min …（１）
で定義される。例えば、ローダミン濃度０．０５ｗｔ％、膜厚１．２μｍの２本のライン状の蛍光発光層２５からのコントラストＣＲ＝６．０であるが、Ａｕ膜のバックコート層２６を用いることにより、コントラストＣＲ＝８．３に増大する。バックコート層２６により、蛍光色素からの発光を効率良く取り出すことができるためと考えられる。

なお、透明基板２１、遮光層２３、蛍光発光層２５、バックコート層２６を備える積層体（２１，２３，２５，２６）と、支持基板１１ａとの接着が完全であれば必ずしも、バックコート層２６を必要としない。又、支持基板１１ａ側の裏面から励起光を蛍光発光層２５に対して上方に照射したい場合にはバックコート層２６は不要である。

透明基板２１、遮光層２３、蛍光発光層２５、バックコート層２６の積層体（２１，２３，２５，２６）を搭載する支持基板１１ａは、特に透明基板である必要はないが、透明基板であっても良い。簡便には、７６ｍｍ×２６ｍｍ、厚さ１ｍｍ程度の顕微鏡用スライドガラスを、更に、例えば、１１×１３ｍｍ程度の寸法に切り出したものを支持基板１１ａとして使用しても良い。支持基板１１ａの積層体（２１，２３，２５，２６）の搭載面となる一方の主面に設けられる凹部２７の深さは、蛍光発光層２５及びバックコート層２６の厚さを考慮して決定すれば良く、例えば、蛍光発光層２５の厚さが約１μｍ、バックコート層２６の厚さが１００ｎｍ程度であれば、凹部２７の深さは３〜５μｍ程度に選択すれば良い。

遮光層２３に設けられた開口部がなす目盛り状パターンは、図２（ａ）に例示するような１次元目盛り、図２（ｂ）に例示するような格子状パターン、図２（ｃ）に例示するようなくさび状パターン等、観察の目的や使用者の要求により、種々の形状が選択可能であり、それぞれにより異なる。図２に例示したような、蛍光発光スケールは、これまでに存在しておらず、蛍光顕微鏡による細胞等の観察の際に非常に有効なものである。

図２（ｂ）に示す格子状パターンは、例えば、主格子１０μｍ程度、副格子５μｍ程度で設計する場合には、主格子の線幅は１μｍ程度、副格子の線幅は０．５μｍ程度に選定すれば良い。格子状パターンは、例えば、細胞観察時に使用するフィルター上に作製することにより、特定領域内の数量計測に有用である。現在、蛍光顕微鏡での細菌計数にされている計数用グリッドは、一辺が１００μｍの１０×１０の正方形メッシュが用いられている。実験者の練度により若干の計数値の違いが生じるが、計数している行を間違うことなどがミスの一例として挙げられる。これらのミスは、図２（ｂ）に示す計数用グリッド外枠の欄外に、行列に対応した数字やアルファベット等の印を、図１に示す構造を採用して蛍光発光層２５をパターニングして表示すれば、容易に防げる。

図２（ｃ）に示すくさび状パターンは、中心から放射状に８方向に伸びた２本のラインペアを例示しているが、例えば、放射状に伸びる２本のラインの中心線間隔を２μｍ程度まで広がったパターンとすることができる。くさび状パターンは、蛍光顕微鏡の分解能評価と光軸の等方性を評価することが可能なため、顕微鏡光学系校正用等に有用である。

図３は、共焦点落射蛍光顕微鏡に図１に示した蛍光目盛り基盤を「蛍光目盛り付き顕微鏡基盤５１」として用いた場合の模式図である。即ち、図３に示すように、蛍光目盛り付き顕微鏡基盤５１の上に細胞標本等の被観察試料（以下において単に「試料」と略記する。）５２が搭載され、被観察試料５２の上方に配置された対物レンズ５３を介して、光源５４からの励起光が試料５２を照射し、試料５２を蛍光発光させると同時に、試料５２を透過した励起光が、図１に示す蛍光発光層２５を発光させる。そして、蛍光発光層２５で発光した蛍光した蛍光が、図１に示すバックコート層２６により試料５２方向に反射され、更に試料５２を透過した蛍光が、共焦点位置に配置されたピンホール５６を介して検出器５７に到達する。

図３に示すように、光源５４からの励起光は、ピンホール５６と対物レンズ５３との間に配置されたダイクロイックミラー５５により反射され、対物レンズ５３に導かれる。一方、対物レンズ５３には、その下方の試料５２からの蛍光、更には、その下方の蛍光目盛り付き顕微鏡基盤５１の目盛りをなす蛍光発光層２５からの蛍光が上方に導かれる。対物レンズ５３を下方から上方に透過した蛍光は、ハーフミラーとして機能するダイクロイックミラー５５を透過後、ピンホール５６を介して検出器５７に到達する。図３に示す共焦点落射蛍光顕微鏡は、光源５４にレーザを用いれば、共焦点レーザ走査型顕微鏡となる。共焦点レーザ走査型顕微鏡は、現在、生体観察用として使用頻度の高い蛍光顕微鏡であるが、図３では、便宜上、試料５２の中央に焦点Ａが存在するものとして、模式的に示している。

図３に示す光学系において、励起光の焦点を外れた点Ｂの像は共焦点位置のピンホール５６を通り抜けられないから実際の結像に寄与せず、消えてしまう。つまり、ピント外れの像はぼけることなく消失する。検出器５７に届く光も焦点Ａからのものだけに限られる。焦点Ａを外れた試料５２上の観測点は、従来の顕微鏡の光学系では、ぼけはするが消えてしまうことなく画面に重なってくるために、全体としてコントラストが悪くなり、光の量もジャストピントの像からだけくるものよりずっと多くなるが、共焦点落射蛍光顕微鏡では、これを防ぐことができる。この様に、共焦点落射蛍光顕微鏡では、試料５２中に設定される焦点あとの共焦点面にピンホール５６を配置しているため、一切の迷光を排除し高解像度、高コントラストとともに光軸方向の分解能が非常に高い。

図４は、蛍光発光層２５の膜厚が０．３μｍの場合における、ＰＭＭＡに対するローダミンの重量濃度（以下、「ローダミン濃度」と略称する。）の変化に対する蛍光強度の変化を示す図である。図４において、励起光の強度は６９．６ｍＷで、励起波長は、５１０ｎｍ〜５６０ｎｍである。そして、蛍光波長：５９０ｎｍをＮＡ０．５の２０倍の観察レンズを用い、フィルターで選択して、蛍光強度を測定している。ローダミン濃度を０．０５ｗｔ％から５倍にすると約３．５倍、１０倍にすると約４倍、２０倍にすると約４．５倍の蛍光強度が得られ、更に、ローダミン濃度を濃くしていくと蛍光強度が飽和傾向にある。ローダミン濃度が、６ｗｔ％を越えると、ＰＭＭＡ混合溶液中に沈殿が見られるため、図４では、ローダミン濃度の限界濃度を６ｗｔ％としてプロットしている。図４において、２ｗｔ％以上のローダミン濃度で蛍光強度の減少が見られるが、これは観察倍率からは分からない、ナノレベルで分子の凝集状態（濃度消光）によるものと推定しているが、詳細は不明である。

図４では１６０℃、３０分の熱処理（アニーリング）をした場合の蛍光強度のローダミン濃度依存性を実線で、熱処理をしない場合の蛍光強度のローダミン濃度依存性を破線で示しているが、膜の均一性を優先して、熱処理（アニーリング）をすることにより、蛍光分子の凝集状態の変化及び熱分解が生じ、蛍光強度が熱処理をしない場合よりも減少することが分かる。

なお、特に図示はしないが、蛍光強度の膜厚依存性は小さい。例えば、ローダミン濃度０．０５ｗｔ％の試料で、膜厚を１．２μｍから７．９μｍへと約７倍にしても、蛍光強度の増大は約３倍であり、膜厚を厚くしてもそれに比例して蛍光強度は増大しない。対物レンズの倍率が上がりレンズのＮＡが高くなると、焦点深度が浅くなるために焦点が合う範囲は狭くなる。しかし、焦点以外の膜厚方向の蛍光も多く拾ってしまうために観察像が滲んでしまう。そこで、膜厚を薄くすると、蛍光色素量は減少する。膜厚を０．３μｍ（ＰＭＭＡ濃度は０．２９mol／ｌ）と薄くし、ローダミン濃度を２．０ｗｔ％と増加させた蛍光強度に対し、膜厚を０．１２μｍへと薄膜化すると、蛍光強度が減少して、パターンの認識が困難になる。そこで、ローダミン濃度を６．０ｗｔ％へと増加させると、逆に膜全体に蛍光強度のむらが観察されるようになる。これらの結果から、蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の作製には、膜厚０．３μｍ、ローダミン濃度２．０ｗｔ％の条件が適当であると考えられる。

図５（ａ）の上段は、第１の半導体（ＣｄＳｅ）からなるコア６１ａと、このコア６１ａを覆う第１の半導体（ＣｄＳｅ）より禁制帯幅の広い第２の半導体（ＺｎＳ）からなるシェル６２ａを備える半導体微粒子の断面構造を模式的に示す。半導体微粒子（サイズが小さい場合には量子ドットに相当する）は、光励起により生じた電子や正孔が３次元的に強い閉じ込めを受けるために、量子のサイズによって光学特性が決定される。又、表面や界面の影響や微粒子の周りの各種物質によっても特性が変わる。更に、半導体微粒子のサイズを一定の大きさにそろえると、半導体微粒子が発する光の色を非常に純粋な色として取り出すこともできる。コア６１ａの直径Ｌは、例えば、１〜３０ｎｍ程度、好ましくは１．５〜２０ｎｍ程度、より好ましくは２〜１０ｎｍ程度の量子ドットとなる寸法を採用可能であり、コア６１ａの直径が発光波長を決定する。そして、図５（ａ）に示すように、コア６１ａをシェル６２ａで覆うことにより、半導体微粒子の光安定性を高め、高輝度発光の微粒子となる。

図５（ａ）の下段には、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ半導体微粒子のエネルギーバンド構造を示す。１次元で考えた場合、半導体微粒子のコア６１ａの直径を量子井戸の幅Ｌに対応して考えることができる。Ｌが電子のド・ブロイ波長程度の約２０ｎｍ以下になると、井戸内の電子は量子化されて井戸層内に新たなエネルギー準位を形成する。このエネルギー準位はサブバンドと呼ばれる。サブバンドはより井戸層の厚さＬを変化させることによって、任意の準位を作ることができる。正孔も同様である。キャリア（ここでは電子）はその人工的に作られたバンド間を遷移するため、井戸の厚さＬは、図５（ａ）に示すコア６１ａの直径Ｌを、図５（ｂ）に示すコア６１ｂの直径Ｌ'に変化させることにより、遷移するエネルギーＥを変化させることができる。

次に、ＣｄＳｅ微粒子からの発光の発光波長の粒径依存性を計算する。

０ＫにおけるバルクＣｄＳｅのバンドギャップＥ_CdSeは１．８４ｅＶで、バルクＺｎＳのバンドギャップＥ_ZnSは３．９１ｅＶである。ＣｄＳｅの電子及び正孔のエネルギー順位ε_ne、ε_nhはそれぞれ：
ε_ne＝(ｈ²/２ｍ_e)(π/Ｌ)²ｎ² …（２ａ）
ε_nh＝(ｈ²/２ｍ_h)(π/Ｌ)²ｎ² …（２ｂ）
となる。ここで、ｍ_e、ｍ_hはそれぞれ電子、正孔の有効質量で、ｍ_e＝５．４２２×１０^-32ｋｇ、ｍ_h＝４．０３７×１０^-31ｋｇである。ＣｄＳｅ微粒子のバンドギャップＥ_ｇは：
Ｅ_ｇ＝Ｅ_CdSe＋ε_ne＋ε_nh …（３）
で表されるため、アインシュタインの関係式を用いると、発光波長λは：
λ＝ｈ_c/Ｅ_g＝ｈ_c/(Ｅ_CdSe＋(１/２)(１/ｍ_e＋１/ｍ_h)(ｈπｎ/Ｌ)²) …（４）
となる。ｎ＝１のときの、コア６１ａの直径Ｌと発光波長λの関係を図７に示す。Ｌが大きいとき、例えば無限大のときは式（４）の分母の第２項は０となるので、λはバルクのＣｄＳｅからの発光波長となる。Ｌが小さくなるに従い、Ｌ^２ に比例するような形でλが小さくなることが分かる。この様に、粒径が異なると発光波長が異なり、粒径が小さくなるに従ってブルーシフトすることが分かる。室温（３００Ｋ）での発光を考えると、０Ｋのときより格子のブラウン運動が激しくなることから、発光スペクトルはブロードになることが考えられる。具体的に粒径と発光波長の関係を示すと、赤色（λ＝６００ｎｍ）において粒径５．６ｎｍ、緑色（λ＝５５０ｎｍ）において粒径４．２ｎｍ、青色（λ＝４５０ｎｍ）において粒径２．８ｎｍ程度と算定される。

ＣｄＳｅ／ＺｎＳ半導体微粒子では、図６に示すようなシェル６２ｕ，６２ｖの厚さによる影響も考慮する必要がある。井戸型ポテンシャルを有限の値として扱うと、量子井戸による電子の締め付けが弱くなるために波動関数がしみだし、無限大のポテンシャルの場合と比較してサブバンドによるバンドギャップが小さくなると考えられることから、発光波長は計算値よりレッドシフトすることが考えられる。又、図６（ｂ）に示すように、シェル６２ｖの厚さを、図６（ａ）に示すシェル６２ｕの厚さよりも、薄くなると、波動関数の滲みだしが少なくなることから発光波長は、ブルーシフトすると考えられる。

又、電子の閉じ込め次元が高くなるにつれて励起子の動き回る範囲が制限されるため束縛エネルギーが大きくなることから、発光波長はレッドシフトすることが考えられる。この様な励起子の束縛エネルギーによる影響の他、結晶の異方性等の影響も発光波長λを変化させると考えられるので、実際の発光波長と量子ドットの寸法の関係は、図７に示す算定結果とは多少異なることになるが、おおよその傾向としては、図７に示すように、半導体微粒子はその粒径を変えることにより発光波長を変化させることができる。このため、半導体微粒子を用いて蛍光目盛り付き顕微鏡基盤を作製することによりスケールの色の多様性に対応可能である。例えば図２（ａ）の上段に示した１次元目盛り４１ａと、図２（ａ）の下段に示した１次元目盛り４１ｂとの色を変えることが可能である。

一般的に、蛍光色素は強い光照射により退色するという問題があるが、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ半導体微粒子では、コア６１ａ，６１ｂ，６１ｕ，６１ｖを、シェル６２ａ，６２ｂ，６２ｕ，６２ｖで覆うことにより、光劣化の少ない特性を示す。この理由は、コア６１ａ，６１ｂ，６１ｕ，６１ｖ表面のダングリングボンドや歪みに由来する表面順位が、シェル６２ａ，６２ｂ，６２ｕ，６２ｖ層を被せることにより劇的に減少するためと考えられる。このためには、コア６１ａ，６１ｂ，６１ｕ，６１ｖの直径と、シェル６２ａ，６２ｂ，６２ｕ，６２ｖの厚さを同程度にすることが好ましい。このため、半導体微粒子を用いることにより、退色の少ない蛍光目盛り付き顕微鏡基盤が実現できる。この様に、半導体微粒子は耐光性に優れ、発光強度が高く、且つ、発光波長を任意に選択可能であるので、目盛りのカラー化が可能である。

例えば、図２（ｂ）に示す計数用グリッド外枠の欄外に、行列に対応した数字やアルファベット等の印を入れることで防げることは前述したとおりであるが、半導体微粒子はその粒径を変えることにより発光波長を変化させることができるので、計数用グリッド外枠の欄外に文字だけでなく、線の色を変化させた多色刷りの行列を構成すれば、計数している行を間違う危険性が更に減少する。半導体微粒子は退色もないので、線の色を変化させた行列で、図２（ｂ）に示す格子状パターンを構成すれば信頼性の高い蛍光顕微鏡での細菌計数が可能になる。

本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤によれば、図１に示した蛍光発光層２５のパターン部分のみが蛍光発光するので、分解能チェックに有効であり、顕微鏡のセッティング時の確認用途として活用可能である。又、第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤は、毎回蛍光試薬を調整する必要がない固定されたパターンを蛍光発光層２５が構成しているので安定性や便利性に優れている。

更に、従来の蛍光ビーズでは実現できなかった、２次元空間での多種類のパターンによる確認が可能であるという顕著な効果を奏することができる。特に、半導体微粒子はその粒径を変えることにより図７に示すように、発光波長を変化させることができるので、半導体微粒子を分散した蛍光発光層２５を採用することにより、多様な測定を正確に実行することが可能になる。

図８及び図９を用いて、本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法を説明する。なお、以下に述べる蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法は、一例であり、この変形例を含めて、これ以外の種々の製造方法により、実現可能であることは勿論である。

（イ）先ず、例えば、第１主面と第１主面に対向する第２主面とを有し、厚さ１２０〜１８０μｍ程度の透明基板２１の第２主面上に電子ビーム露光（以下において「ＥＢ露光」という。）用フォトレジスト２２を、厚さ１５０ｎｍ〜３００ｎｍ程度、好ましくは１８０ｎｍ〜２５０ｎｍ程度で、全面に塗布後、ＥＢ露光によりＥＢ露光用フォトレジスト２２を図８（ａ）に示すようにパターニングする。透明基板２１には、ソーダガラス（ソーダ石灰ガラス）、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラス材料が選択可能であるが、例えば、厚さ１５０μｍ程度の顕微鏡用カバーガラスを用いても良い。透明基板２１としては、カバーガラスを用いた場合は、カバーガラスを中性洗剤中で綿棒を用いて表面を洗浄後、メタノール、及びアセトン中で超音波洗浄し瞬間的に蒸発乾燥させて清浄な表面を得た後、ＥＢ露光用フォトレジスト２２を全面に塗布すれば良い。ＥＢ露光により、例えば図２（ａ）に示したような１次元目盛りのパターンを形成する。図２（ａ）に示したような１次元目盛りのパターンでは、例えば、線幅１００ｎｍ〜２μｍ、スペース幅１００ｎｍ〜２μｍのラインアンドスペースパターンを形成するようにすれば良い。なお、顕微鏡観察の目的によっては、線幅１００ｎｍ以下、スペース幅１００ｎｍ以下の微細パターンでも良い。

（ロ）次に、図８（ｂ）に示すように、ＥＢ露光用フォトレジスト２２の上に遮光層２３を形成する。前述したように、遮光層２３としては、微細加工が容易で、蛍光顕微鏡の励起光の波長に対して光学的に不透明な膜なら種々の薄膜が採用可能であるが、ここではＣｒ膜を、例えば厚さｔ₂＝２５０ｎｍ〜３５０ｎｍ程度となるように、真空蒸着法、若しくはスパッタリング法等周知の方法で堆積する。図８（ａ）に示すＥＢ露光用フォトレジスト２２のライン幅４００ｎｍであれば、厚さｔ₂＝３００ｎｍのＣｒ膜を堆積すれば、図８（ｂ）に示すライン幅ｄ＝４００ｎｍ＋３００ｎｍ＋３００ｎｍ＝１μｍとなるが、これに限定されないことは勿論である。

（ハ）この後、ＥＢ露光用フォトレジスト２２を剥離する所謂「リフトオフ法」を用いて、図８（ｃ）に示すような遮光層２３のパターンを形成する。平面図の図示を省略しているが、図８（ｃ）に示す状態の平面図は、例えば図２（ａ）に示したような１次元目盛りのパターンの白黒反転パターンに対応する。なお、Ｃｒ膜を、遮光層２３として用いるのであれば、リフトオフ法を採用せず、フォトレジスト（ＥＢ露光用フォトレジスト）をマスクとした選択エッチングでも可能であり、例えばウェットエッチングするのであれば、硝酸セリウムアンモニウムと過塩素酸溶液等のＣｒエッチング液でパターニング可能である。

（ニ）次に、透明な高分子材料に蛍光材料を混ぜた溶媒２４を用意する。例えば、ＰＭＭＡ及びローダミンを溶媒としてのクロロホルムに溶解させる。クロロホルムに対するＰＭＭＡの濃度は、例えば、０．１４mol／ｌ、ＰＭＭＡに対するローダミンの濃度は、例えば、２ｗｔ％程度とすれば良い。半導体微粒子の場合も、高分子材料と溶媒としてのクロロホルム中で混合すれば良い。そして、図９（ｄ）に示すように、図８（ｃ）に示す状態の遮光層２３のパターンの上に、高分子材料に蛍光材料を混ぜた溶媒２４をスピンコート法にて滴下し、薄膜化する。その後、高分子材料のガラス転移点以上のアニール温度で熱処理し、図９（ｅ）に示すような遮光層２３の開口部において、第２主面に接するように埋め込まれた蛍光発光層２５を形成する。アニール温度は、高分子材料のガラス転移点に依存するので、高分子材料の材料毎に異なるが、概ね約１３０〜１６０℃である。例えば、高分子材料のガラス転移点が１２０℃であれば、ガラス転移点より１０〜４０℃上の１３０〜１６０℃が好ましい条件となる。ガラス転移点が１２０℃の場合、アニール温度が１３０℃以下では、材料の流動性が不十分なため好ましくなく、アニール温度が１６０℃以上になると、逆に高分子及び蛍光分子の熱分解温度に近づくため、好ましくない。アニール条件は有機色素の場合も半導体微粒子の場合も、同条件で良い。なお、図９（ｄ）に示す、高分子材料に蛍光材料を混ぜた溶媒２４の滴下は、スピンコート法に限定されるものでなく、キャスト法でも良い。キャスト法で、高分子材料と混ぜた溶媒を滴下する場合は、溶媒飽和雰囲気下で、室温（２０〜２５℃）で、半日〜１日放置することにより、薄膜化できる。溶媒飽和雰囲気は、簡便な方法としては、図１０に示すような、ビーカーやシャーレ等容器９１中に、透明基板２１と同時に、溶媒を浸した脱脂綿９３等を置き、蓋９２を被せて、溶媒雰囲気で飽和させた状態を実現すれば良い（勿論、図１０に示す方法は例示的に示す簡便法であり、これに限定されるものではない。）。キャスト法の場合も、その後、高分子材料のガラス転移点以上のアニール温度で、１０〜３０分の熱処理を行えば、図９（ｅ）に示すような蛍光発光層２５が形成できる。熱処理後の膜厚ｔ₄＝３００ｎｍ〜１μｍの範囲が好ましい。熱処理で膜中の残留溶媒（クロロホルム）は揮発するが、元の膜厚ｔ₃そのものを大きく変化させず、熱処理前の膜厚ｔ₃と熱処理後の膜厚ｔ₄との変化分は、測定上、ほぼ無視できる範囲内である。

（ホ）その後、図９（ｆ）に示すように、蛍光発光層２５を被覆するように、バックコート層２６を真空蒸着法、若しくはスパッタリング法等周知の方法で堆積すれば、透明基板２１、遮光層２３、蛍光発光層２５、バックコート層２６を含む積層体（２１，２３，２５，２６）が完成する。バックコート層２６には、種々の層が採用可能であるが、例えば、Ａｕ膜の場合は、膜厚ｔ₅＝８０〜１００ｎｍ程度、Ａｌ膜の場合も膜厚ｔ₅＝１００ｎｍ程度にすれば良い。

（ヘ）そして、図１に示すような、一方の主面に、例えば深さ３〜５μｍの凹部２７を備えた支持基板１１ａを用意する。支持基板１１ａの一方の主面に凹部２７を形成するには、サンドブラスト、超音波加工等を用いれば良く、イオンエッチング等のドライエッチングでも構わない。そして、透明基板２１、遮光層２３、蛍光発光層２５、バックコート層２６を含む積層体（２１，２３，２５，２６）を、バックコート層２６が下側に来るように、図９（ｆ）に示す状態とは上下逆にし、図１に示すように、凹部２７の内部に、蛍光発光層２５とバックコート層２６からなる凸部を収納する。そして、図示を省略した紫外線硬化樹脂等の接着剤により、積層体（２１，２３，２５，２６）と、支持基板１１ａとを接着すれば、本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤が完成する。積層体（２１，２３，２５，２６）と、支持基板１１ａとを接着する接着剤は、紫外線硬化樹脂に限定されるものではないが、蛍光材料の耐熱性等を考慮して、適当な材料を選べば良い。例えば、ローダミン５９０を用いる場合は、１６０℃以下で接着可能な接着剤が望ましい。又、顕微鏡観察を考慮すれば、接着剤は顕微鏡観察試料の溶媒によるダメージを受けないものが望ましい。積層体（２１，２３，２５，２６）と、支持基板１１ａとの接着は、レーザ融着による直接接着を行っても良い。なお、図１では積層体（２１，２３，２５，２６）のバックコート層２６が支持基板１１ａの上面に接しているが、支持基板１１ａの上面に位置するバックコート層２６及び遮光層２３を、透明基板２１の第２主面が露出するようにパターニングし、支持基板１１ａの上面と透明基板２１の第２主面とが直接接するようにして接着剤で接着若しくは、レーザ融着による直接接着を行っても良い。

＜第１の実施の形態の変形例＞
第１の実施の形態の冒頭で説明したように、図１に示した第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）は、支持基板１１ａがバスタブ型の凹部２７を備え、この凹部２７の内部に、透明基板２１、遮光層２３、蛍光発光層２５、バックコート層２６の積層体（２１，２３，２５，２６）の一部、即ち、蛍光発光層２５及びバックコート層２６からなる凸部を収納し、この凸部を密閉状態でシールしているので、蛍光発光層２５がダメージを受けないという、実用上非常に有利な効果を奏する。

これに対し、本発明の第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）では、図１１に例示するように、支持基板１１ｂに形成される凹部２７が、２段形状の凹部である。そして、積層体（２１，２３，２５，２６）のすべてが、この２段形状の凹部２７の内部に収容されている点が、図１に例示した第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）とは異なる。凹部２７の浅い方の段差部の深さは、透明基板２１、遮光層２３及びバックコート層２６の厚さの総和に等しいように設定され、更に深い２段目の段差部に、蛍光発光層２５及びバックコート層２６からなる凸部が収納される構造である。

図１１において、図示を省略しているが、積層体（２１，２３，２５，２６）と、支持基板１１ａとは、紫外線硬化樹脂等の接着剤により密閉状態を構成するように接着しても良く、レーザ融着による直接接着でも良い。なお、図１１では積層体（２１，２３，２５，２６）のバックコート層２６が支持基板１１ａの凹部２７の浅い方の段差部がなす肩（上面）に接しているが、段差部の肩に位置するバックコート層２６及び遮光層２３を、透明基板２１の第２主面が露出するようにパターニングし、支持基板１１ａの段差部の肩と透明基板２１の第２主面とが直接接するようにして接着剤で接着若しくは、レーザ融着による直接接着を行っても良い。図１１に示すように、２段形状の凹部２７の内部に、積層体（２１，２３，２５，２６）のすべてが収容され、且つ、支持基板１１ｂと積層体（２１，２３，２５，２６）とが密閉状態でシールされているので、図１に示した第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）に比し、更に確実且つ有効に、蛍光発光層２５がダメージを受けることを防止でき、実用上極めて有効である。

なお、図１１から分かるように、第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）が、励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板２１と、第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層２３と、開口部に、第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層２５と、この蛍光発光層２５の裏面を被覆し、蛍光発光層２５で発光した蛍光を第１主面方向に反射するバックコート層２６とを備える点では、図１に示した第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）と同様であり、重複した説明を省略する。

（第２の実施の形態）
第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）では、図１１を用いて、積層体（２１，２３，２５，２６）が、２段形状の凹部２７の内部に密閉状態で収容される構造を示したが、本発明の第２の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）は、図１２に例示するように、支持基板１１ｂに形成される凹部２７が、平坦な底部を持つ直方体の箱状の凹部である。そして、積層体（２１，２５，２８，２９）のすべてが、この箱状の凹部の内部に埋め込まれている。

更に、箱状の凹部の内部に密閉状態で埋め込み可能なように、積層体（２１，２５，２８，２９）の外部形状が直方体（矩形の平行平板）形状をなしている点が、図１１に示した第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）とは異なる。

このため、第２の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）の積層体（２１，２５，２８，２９）は、励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板２１と、第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層２８を有する点では、第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）と同様であるが、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層２５が、図１２に示すように遮光層２８の開口部の内部のみに、完全に埋め込まれている点が、第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）とは、異なる。即ち、図１２において、遮光層２８の下面と蛍光発光層２５の下面とが同一水平レベルを構成している。したがって、蛍光発光層２５で発光した蛍光を第１主面方向に反射するバックコート層２９は、遮光層２８の下面と蛍光発光層２５の下面の両方に接する平坦な層として構成されている点が、第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）とは異なる。

箱状の凹部の深さは、透明基板２１、遮光層２８及びバックコート層２９の厚さの総和に等しいように設定されている。図１２において、図示を省略しているが、平行平板状の積層体（２１，２５，２８，２９）と、支持基板１１ａとは、紫外線硬化樹脂等の接着剤により密閉状態を構成するように接着しても良く、レーザ融着による直接接着でも良い。図１２に示すように、箱状の凹部の内部に、平行平板状の積層体（２１，２５，２８，２９）のすべてが収容され、且つ、支持基板１１ｂと平行平板状の積層体（２１，２５，２８，２９）とが密閉状態でシールされているので、図１に示した第１の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）に比し、更に確実且つ有効に、蛍光発光層２５がダメージを受けることを防止でき、実用上極めて有効である。

図１３及び図１４を用いて、本発明の第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法を説明する。なお、以下に述べる蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法は、一例であり、この変形例を含めて、これ以外の種々の製造方法により、実現可能であることは勿論である。

（イ）先ず、例えば、第１主面と第１主面に対向する第２主面とを有し、厚さ１２０〜１８０μｍ程度の透明基板２１を用意する。透明基板２１には、ソーダガラス（ソーダ石灰ガラス）、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等のガラス材料が選択可能であるが、例えば、厚さ１５０μｍ程度の顕微鏡用カバーガラスを用いても良い。そして、透明基板２１の第２主面上に厚さ２５０ｎｍ〜１．５μｍ、好ましくは、３００ｎｍ〜８００ｎｍ程度の遮光層２８を形成する。遮光層２８としては、微細加工が容易で、蛍光顕微鏡の励起光の波長に対して光学的に不透明な膜なら種々の薄膜が採用可能であり、第１の実施の形態と同様に、Ｃｒ膜を、真空蒸着法、若しくはスパッタリング法等で透明基板２１の第２主面上に堆積しても良い。そして、遮光層２８の上にＥＢ露光用ＥＢ露光用フォトレジスト３１を、厚さ１５０ｎｍ〜３００ｎｍ程度、好ましくは１８０ｎｍ〜２５０ｎｍ程度で、全面に塗布後、ＥＢ露光によりＥＢ露光用フォトレジスト３１を図１３（ａ）に示すようにパターニングする。ＥＢ露光により、例えば図２（ａ）に示したような１次元目盛りのパターンを形成する。図２（ａ）に示したような１次元目盛りのパターンでは、例えば、線幅１００ｎｍ〜２μｍ、スペース幅１００ｎｍ〜２μｍのラインアンドスペースパターンを形成するようにすれば良い。なお、顕微鏡観察の目的によっては、線幅１００ｎｍ以下、スペース幅１００ｎｍ以下の微細パターンでも良い。

（ロ）次に、ＥＢ露光用フォトレジスト３１をマスクとした選択エッチングで、遮光層２８パターニングする。例えば、Ｃｒ膜を遮光層２８として用いるのであれば、硝酸セリウムアンモニウムと過塩素酸溶液等のＣｒエッチング液でＣｒ膜をパターニングしても良く、塩素（Ｃｌ₂）や四塩化炭素（ＣＣｌ₄）等の塩素系のガスを用いた反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）等のドライエッチングでＣｒ膜をパターニングしても良い。その後、ＥＢ露光用フォトレジスト３１を剥離すれば、図１３（ｂ）に示すような遮光層２８のパターンが形成される（なお、第１の実施の形態と同様に、リフトオフ法を用いて、図１３（ｂ）に示すような遮光層２８のパターンを形成しても良い。）。図示を省略しているが、図１３（ｂ）に示す状態の平面図は、例えば図２（ａ）に示したような１次元目盛りのパターンの白黒反転パターンに対応する。

（ハ）次に、ポリシロキサンポリマー等の樹脂ガラスに蛍光材料を混ぜた溶媒２４を用意する。例えば、ローダミン又は半導体微粒子をアセトン、プロパノール、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）等の溶剤を用いて、樹脂ガラスに溶解させる。例えば６０℃に加熱したテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）の１−プロキシ−２−プロパノール（ＰＧＰＥ）溶液にマレイン酸水溶液を滴下しこれに、ローダミン又は半導体微粒子を混合して、６０℃で４時間加熱攪拌した後、減圧濃縮すれば、蛍光材料を含むシロキサン樹脂溶液が得られる。樹脂ガラスとしては、１００ｎｍ世代以降の半導体装置のＳＴＩ溝に素子分離絶縁膜を埋め込む塗布型溶液：ＳＯＧ（スピン・オン・グラス）溶液として注目されている過水素化シラザン重合体溶液を用いても良い。樹脂ガラスに対するローダミン又は半導体微粒子の濃度は、例えば、２ｗｔ％程度とすれば良い。そして、図１３（ｃ）に示すように、図１３（ｂ）に示す状態の遮光層２８のパターンの上に、樹脂ガラスに蛍光材料を混ぜた溶媒２４をスピンコート法にて滴下し、薄膜化する。その後、ホットプレート等を用い、大気中若しくは酸素（Ｏ₂）雰囲気で、６０〜１００℃程度で、１〜４５分加熱（ベーキング）し、溶剤を取り除く。過水素化シラザン重合体溶液の場合は、１５０℃で３分程度のベーキングにより蛍光材料を含むポリシラザン（ＰＳＺ）膜ができる。蛍光材料として、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ半導体微粒子を用いる場合は、その後、２００℃より高く６００℃以下の温度で水蒸気を含んだ雰囲気で酸化処理を行えば、緻密度の高い蛍光材料を含む樹脂ガラス膜（シリコン酸化膜）ができる。なお、第１の実施の形態と同様に、透明な高分子材料に蛍光材料を混ぜた溶媒２４を用意しても良い。この場合も、ＰＭＭＡに対するローダミンの濃度は、例えば、２ｗｔ％程度が好ましい。そして、図１３（ｃ）に示すように、遮光層２８のパターンの上に、高分子材料に蛍光材料を混ぜた溶媒２４をスピンコート法又キャスト法にて滴下し、薄膜化すれば良い。高分子材料としてＰＭＭＡを用いる場合は、第１の実施の形態で説明したように、その後、大気中又は溶媒飽和雰囲気下で、２０〜２５℃程度の室温で、２〜３分放置する。その後、高分子材料のガラス転移点以上のアニール温度で熱処理する。

（ニ）その後、化学的機械研磨（ＣＭＰ）等の手法を用いて、遮光層２８が露出するまで平坦化を行い、蛍光材料を含む樹脂ガラス（若しくは高分子材料）からなる蛍光発光層２５を、図１４（ｄ）に示すように、遮光層２８の開口部の内部のみに、完全に埋め込まれる。即ち、図１４（ｄ）に示すように、遮光層２８の上面と蛍光発光層２５の上面とが、同一水平レベルをなす平坦面を構成する。その後、蛍光発光層２５と遮光層２８の上面を被覆するように、バックコート層２９を真空蒸着法、若しくはスパッタリング法等で堆積すれば、図１４（ｅ）に示すような透明基板２１、遮光層２８、蛍光発光層２５、バックコート層２９を含む積層体（２１，２５，２８，２９）が完成する。バックコート層２９には、種々の層が採用可能であるが、第１の実施の形態と同様に、Ａｕ膜を用いる場合は、膜厚８０〜１００ｎｍ程度、Ａｌ膜を用いる場合は膜厚１００ｎｍ程度にすれば良い。図１４（ｅ）に示すように、バックコート層２９が、遮光層２８の上面と蛍光発光層２５の上面の両方に接する平坦な層として構成されている点が、第１の実施の形態とは異なる。

（ホ）そして、図１２に示すような、一方の主面に、例えば深さ４５０ｎｍ〜１．８μｍの箱状の凹部を備えた支持基板１１ｃを用意する。箱状の凹部の深さは、透明基板２１、遮光層２８及びバックコート層２９の厚さの総和に等しいように設定されば良い。組み立ての容易性を考えれば、箱状の凹部の深さを、透明基板２１、遮光層２８及びバックコート層２９の厚さの総和より少し大きめに設定しても良い。支持基板１１ｃの一方の主面に箱状の凹部を形成するには、サンドブラスト、超音波加工等を用いれば良く、イオンエッチング等のドライエッチングでも構わない。そして、透明基板２１、遮光層２８、蛍光発光層２５、バックコート層２９を含む平行平板状の積層体（２１，２５，２８，２９）を、バックコート層２９が下側に来るように、図１４（ｅ）に示す状態とは上下逆にし、図１２に示すように、箱状の凹部の内部に、蛍光発光層２５とバックコート層２９からなる凸部を収納する。そして、図示を省略した紫外線硬化樹脂等の接着剤により、平行平板状の積層体（２１，２５，２８，２９）と、支持基板１１ｃとを接着すれば、本発明の第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤が完成する。平行平板状の積層体（２１，２５，２８，２９）と、支持基板１１ｃとを接着する接着剤は、紫外線硬化樹脂に限定されるものではなく、又、平行平板状の積層体（２１，２５，２８，２９）と、支持基板１１ｃとの接着は、レーザ融着による直接接着を行っても良い。直接接着では、透明基板２１の第１主面及び第２主面に直交する端面と、箱状の凹部の垂直側壁との間をレーザ融着すれば良い。

（第３の実施の形態）
本発明の第３の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤は、図１５に断面図に示すように、多孔質材料基板７１の一方の主面側の上部に、深さ０．３〜１．５μｍで、複数の凹部が周期的に形成され、その複数の凹部の間に定義される凸部として、主格子７１ｍと副格子７１ｓとが、交互に周期的に形成されている。図１５の断面図に対応する平面図は、図２（ｂ）に示したような格子状パターンである。図２（ｂ）の格子状パターンが、例えば、主格子の一辺の長さ１０μｍ程度、副格子の一辺の長さ５μｍ程度であれば、図１５の断面図に示す主格子７１ｍの線幅は１μｍ程度、副格子７１ｓの線幅は０．５μｍ程度に選定できる。図１５（ａ）のＡ部の拡大部が図１５（ｂ）であるが、主格子７１ｍをなす凸部の頂部に蛍光発光層７２ｍが、副格子７１ｓをなす凸部の頂部に蛍光発光層７２ｓがそれぞれ選択的に形成されている。したがって、蛍光発光層７２ｍ及び蛍光発光層７２ｓに励起光が照射されることにより、図２（ｂ）の格子状パターンの形状に蛍光が発光する。

多孔質材料基板７１には、延伸法等で作られるポリスルホン、ポリビニルデンジフルオライド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース＋ニトロセルロース混合膜等の材料が使用可能である。しかし、微細加工性を考慮すると、多孔質材料基板７１としてポリカーボネート膜（基板）にイオンビームエッチングにより孔を開けた後、薬品でエッチング処理したトッラック・エッチング基板が好適である。この様なトッラック・エッチング基板として公称孔径０．２−０．４μｍの日本ミリポア株式会社のアイソポア膜（登録商標）が使用可能である。トッラック・エッチング基板は、製法上、膜の多孔度は５％以下である。延伸法で作られる多孔質膜はスダレ状の多孔質構造であるが、トッラック・エッチング基板は、イオンビームエッチングを採用しているので、１μｍ以下の、均一な孔径の孔を垂直に貫通している。

蛍光発光層７２ｍ及び蛍光発光層７２ｓとしては、透明な高分子材料に蛍光材料を分散したものが採用可能である。透明な高分子材料の好適な例は、第１の実施の形態で説明したＰＭＭＡである。透明な材料に分散させる蛍光材料も、第１の実施の形態で説明したローダミン系、クマリン系などの有機蛍光色素、ＹＡＧ等の無機蛍光材料や半導体微粒子等が好適である。

図１６を用いて、本発明の第３の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法を説明する。なお、以下に述べる蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法は、一例であり、この変形例を含めて、これ以外の種々の製造方法により、実現可能であることは勿論である。

（イ）先ず、例えば、厚さ１０〜６０μｍ程度の多孔質材料基板７１を用意する。多孔質材料基板７１が薄いので、実際には他の支持基板（図示省略）の上に多孔質材料基板７１固定すれば良い。多孔質材料基板７１としては、例えば、ポリカーボネート膜（基板）のトッラック・エッチング基板を用いれば良い。そして、多孔質材料基板７１の一方の主面の上にＥＢ露光用フォトレジストを、厚さ１５０ｎｍ〜３００ｎｍ程度、好ましくは１８０ｎｍ〜２５０ｎｍ程度で、全面に塗布する。そして、ＥＢ露光によりＥＢ露光用フォトレジストを、例えば図２（ｂ）に示したような格子状パターンを形成する。次に、ＥＢ露光用フォトレジストをマスクとしたイオンビームエッチングで、多孔質材料基板７１の上部を、図１６（ａ）の断面図に示すように、深さ０．３〜１．５μｍでエッチングし、パターニングする。格子状パターンの主格子の一辺の長さ１０μｍ程度、副格子の一辺の長さ５μｍ程度であれば、図１６（ａ）の断面図に示す主格子７１ｍの線幅は１μｍ程度、副格子７１ｓの線幅は０．５μｍ程度に選定すれば良い。

（ロ）次に、第１の実施の形態と同様に、透明な高分子材料に蛍光材料を混ぜた溶媒７３を容器７４の内部に収納する。この場合も、第１の実施の形態と同様にＰＭＭＡに対するローダミンの濃度は、例えば、２ｗｔ％程度が好ましい。そして、図１６（ｂ）に示すように、イオンビームエッチングで加工された面が下側に来るように、図１６（ａ）に示す状態とは上下逆にし、多孔質材料基板７１の格子状パターンの形成された面を、スタンプのように、蛍光材料溶媒７３にディップする。

（ハ）その後、図１６（ｃ）に示すように、多孔質材料基板７１の下側から、多孔質材料基板７１に形成された孔を介して、空気７５を送り、格子状パターンの目となる凹部に入り込んだ余分な蛍光材料溶媒７３を吹き飛ばせば、主格子７１ｍをなす凸部の頂部及び副格子７１ｓをなす凸部の頂部に蛍光材料溶媒７３がそれぞれ選択的に残留する。その後、蛍光材料溶媒７３を乾燥させれば、主格子７１ｍをなす凸部の頂部に蛍光発光層７２ｍが、副格子７１ｓをなす凸部の頂部に蛍光発光層７２ｓがそれぞれ選択的に形成され、図１５に示す第３の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤が完成する。

（その他の実施の形態）
上記のように、本発明は第１〜第３の実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。

細胞・組織内の蛍光性物質に紫外線などの励起光をあて発する蛍光を観察する蛍光顕微鏡は、クロロフィル・脂質・ビタミンなど天然の蛍光性物質を含んだもの（自己蛍光）のほか、アクリジンオレンジや４，６−ジアミジン−２−フェニールインドール（ＤＡＰＩ）等の細胞染色蛍光色素を添加したときの二次蛍光、蛍光抗体法など広く生物学各分野で利用されている。そして、本発明の蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）は、この様な蛍光顕微鏡観察等において使用されるプラスチックシャーレ、マイクロウェルプレート、ガラスボトムディッシュ等の蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器においても同様に適応可能である。

図１７は本発明の他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレート（蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器）の平面図であり、図１８は図１７のＡ−Ａ方向から見た、他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレートの断面図である。図１７及び図１８に示すように、他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレートは外形が略長方形状の基部８１と上部が開口した円筒形状のウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…とを有する。

ウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…は、図１８の断面図に示すような垂直の内壁を有し、この内部に試料を収容可能としている。基部８１は、図１７に示すように、行及び列方向に一定間隔で配列した多数のウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…により、マイクロウェルプレートを構成している。隣接するウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…の行及び列方向の中心間距離は、９ｍｍに標準化され、１枚のマイクロウェルプレートが有するウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…の数は８行×１２列（９６個）、３行×８列（２４個）等が一般的である。ウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…のそれぞれの上端近傍の基部８１は、基部８１の上面から円筒状に僅かに突出したリム構造８４を有する。リム構造８４は、試験中に試料の蒸発及び各ウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…間での試料の混合（クロスコンタミネーション）を防止するために粘着性フィルムを貼り付ける場合があり、その際の密着性向上のためである。

通常のマイクロウェルプレートのウェルの下端は円錐状に細くなり先端が半球状に閉じた形状や、円筒状で先端が平坦に閉じた形状等が用途に応じて使用されるが、図１８の断面図に示すように、本発明の他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレートでは、ウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…の下端は平坦である。そして、ウェル（試料収納部）８２_ij-1の直下に、図１１を用いて説明した第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り基盤（２１_ij-1、２３_ij-1，２５_ij-1，２６_ij-1）が、ウェル（試料収納部）８２_ijの直下に、蛍光目盛り基盤（２１_ij、２３_ij，２５_ij，２６_ij）が、ウェル（試料収納部）８２_ij+1の直下に、蛍光目盛り基盤（２１_ij+1、２３_ij+1，２５_ij+1，２６_ij+1）が、それぞれ配置されている。ここで、蛍光目盛り基盤（２１_ij-1、２３_ij-1，２５_ij-1，２６_ij-1）は、励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板２１_ij-1と、第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層２３_ij-1と、開口部に、第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層２５_ij-1と、この蛍光発光層２５_ij-1の裏面を被覆し、蛍光発光層２５_ij-1で発光した蛍光を第１主面方向に反射するバックコート層２６_ij-1とを備える。又、蛍光目盛り基盤（２１_ij、２３_ij，２５_ij，２６_ij）は、励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板２１_ijと、第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層２３_ijと、開口部に、第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層２５_ijと、この蛍光発光層２５_ijの裏面を被覆し、蛍光発光層２５_ijで発光した蛍光を第１主面方向に反射するバックコート層２６_ijとを備える。同様に、蛍光目盛り基盤（２１_ij+1、２３_ij+1，２５_ij+1，２６_ij+1）は、励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板２１_ij+1と、第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層２３_ij+1と、開口部に、第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層２５_ij+1と、この蛍光発光層２５_ij+1の裏面を被覆し、蛍光発光層２５_ij+1で発光した蛍光を第１主面方向に反射するバックコート層２６_ij+1とを備える。図１８のような構造に、他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレートを構成しておくことにより、マイクロウェルプレートで臨床検査、ＤＮＡ分析等の検査をする場合、蛍光目盛り基盤を用いて、ＤＮＡの寸法等のスケールを簡単に測定できる。

本発明の他の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤（蛍光目盛り付き顕微鏡基盤）では、図１９に例示するように、支持基板１１ｄに形成される凹部が、２段形状の凹部であり、蛍光目盛り基盤（２１_ij-1、２３_ij-1，２５_ij-1，２６_ij-1）、蛍光目盛り基盤（２１_ij、２３_ij，２５_ij，２６_ij）及び蛍光目盛り基盤（２１_ij+1、２３_ij+1，２５_ij+1，２６_ij+1）のそれぞれが、その積層構造のすべてが凹部の内部に収容されている。２段形状の凹部の内部に、蛍光目盛り基盤（２１_ij-1、２３_ij-1，２５_ij-1，２６_ij-1）、蛍光目盛り基盤（２１_ij、２３_ij，２５_ij，２６_ij）及び蛍光目盛り基盤（２１_ij+1、２３_ij+1，２５_ij+1，２６_ij+1）のそれぞれが完全に収容され、且つ、支持基板１１ｄと蛍光目盛り基盤（２１_ij-1、２３_ij-1，２５_ij-1，２６_ij-1）、蛍光目盛り基盤（２１_ij、２３_ij，２５_ij，２６_ij）及び蛍光目盛り基盤（２１_ij+1、２３_ij+1，２５_ij+1，２６_ij+1）とがそれぞれ密閉状態でシールされているので、蛍光発光層（２５_ij-1，２５_ij，２５_ij+1，）がダメージを受けることを防止でき、実用上極めて有効である。

なお、図１８の断面図では、説明の便宜上、蛍光発光層（２５_ij-1，２５_ij，２５_ij+1，）のパターンを各ウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…の直径と比較できる程度に拡大して図示しているが、現実には、蛍光発光層（２５_ij-1，２５_ij，２５_ij+1，）のパターンは１μｍ若しくはサブμｍレベルのランイ・アンド・スペス・パターンであるので、各ウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…の底部の極一部に形成されることになる。又、図２（ａ）に示す１次元目盛り、図２（ｂ）に示す格子状パターンや、図２（ｂ）に示すくさび状パターンのいずれでも構わない。

又、図１８では、マイクロウェルプレートの各ウェルの底部に、図１１を用いて説明した第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り基盤を配置する例を示したが、これに限定されず、図１、図１２、図１５に例示するような、第１〜第３の実施の形態で説した蛍光目盛り基盤を配置しても良いことは勿論である。

図１９は、図１７のＡ−Ａ方向から見た断面図に対応する、本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレート（蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器）の断面図である。図１８に示したマイクロウェルプレートでは、基部８１に対し井戸型に下方に向かって掘り込まれた凹部として、ウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…が構成された例を示したが、図１９では試験菅と同様な、所定の厚さの円筒状の側壁で囲まれてウェル（試料収納部）８２_ij-1，８２_ij，８２_ij+1，…が構成されている点が異なる。他は、図１８に示したマイクロウェルプレートと実質的に同様であるので、重複した説明を省略する。図１９に示す本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレートにおいても、支持基板１１ｄに形成された２段形状の凹部の内部に、蛍光目盛り基盤（２１_ij-1、２３_ij-1，２５_ij-1，２６_ij-1）、蛍光目盛り基盤（２１_ij、２３_ij，２５_ij，２６_ij）及び蛍光目盛り基盤（２１_ij+1、２３_ij+1，２５_ij+1，２６_ij+1）のそれぞれが完全に収容され、且つ、支持基板１１ｄと蛍光目盛り基盤（２１_ij-1、２３_ij-1，２５_ij-1，２６_ij-1）、蛍光目盛り基盤（２１_ij、２３_ij，２５_ij，２６_ij）及び蛍光目盛り基盤（２１_ij+1、２３_ij+1，２５_ij+1，２６_ij+1）とがそれぞれ密閉状態でシールされているので、蛍光発光層（２５_ij-1，２５_ij，２５_ij+1，）がダメージを受けることを防止でき、実用上極めて有効である。図１９でも、マイクロウェルプレートの各ウェルの底部に、図１１を用いて説明した第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り基盤を配置する例を示したが、これに限定されないことは図１８の場合と同様であり、図１、図１２、図１５に例示するような、第１〜第３の実施の形態で説した蛍光目盛り基盤を配置しても良い。

図２０は本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きガラスボトムディッシュ（蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器）の鳥瞰図であり、図２１は、この更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きガラスボトムディッシュの断面図である。図２０に示すように、更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きガラスボトムディッシュは、ディッシュ４０の中央部に細胞培養等を行う試料収納部（ホール部）４３が形成されている。細胞培養時は、図２０に示したディッシュ蓋部４２をディッシュ４０に被せる。本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きガラスボトムディッシュにおいては、試料収納部（ホール部）４３の底部の直下に図２（ａ）に例示した１次元目盛り４１が形成されている。

試料収納部（ホール部）４３の底部の直下に配置される蛍光目盛り基盤（２１，２５，８８）は、図１１を用いて説明した第２の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤と同様に、励起光が入射する第１主面、この第１主面に対向する第２主面を有する透明基板２１と、第２主面に接して配置され、第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす透明な非蛍光発光層８８と、開口部の内部のみに完全に埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層２５とを備える。「透明な非蛍光発光層８８」としては、スパッタリング法やＣＶＤ法で形成したシリコン酸化膜若しくはシリコン窒化膜、ポリシロキサンポリマー等の樹脂ガラス、ＰＭＭＡ等の透明な高分子材料が採用可能である。更に、図２１に例示するように、支持基板１１ｅに形成される凹部が、箱形の凹部であり、蛍光目盛り基盤（２１，２５，８８）が、その積層構造のすべてが凹部の内部に収容されている。箱形の凹部の内部に、蛍光目盛り基盤（２１，２５，８８）が完全に収容され、且つ、支持基板１１ｅと蛍光目盛り基盤（２１，２５，８８）が密閉状態でシールされているので、蛍光発光層（２５，２５，２５，）がダメージを受けることを防止でき、実用上極めて有効である。図２１のような構造に、ガラスボトムディッシュを構成しておくことにより、ガラスボトムディッシュの試料収納部（ホール部）４３で培養した細胞を蛍光観察する場合、底部の蛍光目盛り基盤を用いて、細胞の寸法等のスケールを簡単に測定できる。

なお、図２０では、説明の便宜上、１次元目盛り４１のパターンを試料収納部（ホール部）４３の直径と比較できる程度に拡大して図示しているが、現実には、１次元目盛り４１のパターンは１μｍ若しくはサブμｍレベルのランイ・アンド・スペス・パターンであるので、試料収納部（ホール部）４３の底部の極一部に形成されることになる。又、図２（ｂ）に示す格子状パターンや、図２（ｂ）に示すくさび状パターンを試料収納部（ホール部）４３の底部に形成しても構わない。

一般に、ガラスボトムディッシュでは、試料収納部（ホール部）４３の裏面側（図２１において下方）に対物レンズ５３をおいて培養した細胞等の試料５２をガラスボトムディッシュの裏面側から蛍光観察するので、この場合は、蛍光目盛り基盤（２１，２５，８８）の第１及び第２の実施の形態で説明したバックコート層２６は省略する必要がある。又、高倍率の対物レンズ５３による観察をするためには、支持基板１１ｅ、蛍光目盛り基盤（２１，２５，８８）及び試料収納部（ホール部）４３の底部を含めた全体の厚さｔ₈が、ＪＩＳに規定されるＮｏ．０（厚み１２０〜１７０μｍ）、Ｎｏ．１Ｓ（厚み１５０〜１８０μｍ）の厚さのカバーグラスと同等になるように設計すれば良い。又、図２１では、ガラスボトムディッシュの各ウェルの底部に、図１２を用いて説明した第２の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤を配置する例を示したが、これに限定されず、図１、図１１、図１５に例示するような、第１の実施の形態、第１の実施の形態の変形例、或いは第３の実施の形態で説明した蛍光目盛り基盤を配置しても良いことは勿論である（但し、試料収納部（ホール部）４３の裏面側に対物レンズ５３をおいて試料５２をガラスボトムディッシュの裏面側から蛍光観察する場合は、バックコート層２６は省略する必要がある。）。

１次元目盛り４１のパターンの存在により、ガラスボトムディッシュの裏面側から蛍光観察する場合は屈折率の違い等で、試料５２の像が歪む可能性があるが、上述したように、１次元目盛り４１のパターンは１μｍ若しくはサブμｍレベルのランイ・アンド・スペス・パターンであるので、試料収納部（ホール部）４３の底部の極一部に形成されるため、その影響は十分小さくすることが可能である。

本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤（２１，２５，８７，８８）は、図２２に示すように、第１透明基板２１と、第１透明基板２１に接して配置され、第１透明基板２１を露出する開口部が目盛り状パターンをなす非蛍光発光層８８と、非蛍光発光層８８の開口部の内部のみに完全に埋め込まれている蛍光発光層２５と、非蛍光発光層８８の上面と蛍光発光層２５の上面の両方に接する平坦な第２透明基板８７を備える。「透明な非蛍光発光層８８」としては、スパッタリング法やＣＶＤ法で形成したシリコン酸化膜若しくはシリコン窒化膜、ポリシロキサンポリマー等の樹脂ガラス、ＰＭＭＡ等の透明な高分子材料が採用可能であるが、非蛍光発光層８８をＣｒ膜のような金属膜で構成すれば遮光層となる。図２２に示す蛍光目盛り付き顕微鏡基盤（２１，２５，８７，８８）は、バックコート層を有しないので、図２１に示すガラスボトムディッシュの試料収納部（ホール部）４３に収納された培養細胞等の試料５２を、試料収納部（ホール部）４３の裏面側（図２１において下方）から蛍光観察する場合の蛍光目盛りに好適であるが、図２２に示すように、第２透明基板８７の上に、試料５２を搭載することも可能である。第２の実施の形態で説明したように、図２２に示す蛍光目盛り付き顕微鏡基盤（２１，２５，８７，８８）の蛍光発光層２５は、ポリシロキサンポリマー等の樹脂ガラスに蛍光材料を混ぜた層でも良く、ＰＭＭＡ等の透明な高分子材料に蛍光材料を混ぜた層でも良い。そして、蛍光材料としては、第１の実施の形態で説明したローダミン又は半導体微粒子等が採用可能である。図２２に示す本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法は、図１３及び図１４を用いて説明した第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法とほぼ同様である。即ち、第２の実施の形態の説明の図１４（ｄ）に示すように、非蛍光発光層８８の上面と蛍光発光層２５の上面とが、同一水平レベルをなす平坦面を構成するまでは、第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法と全く同一で良い（但し、非蛍光発光層８８として、第２の実施の形態での金属膜等の遮光層の代わりに、ＥＢ露光用フォトレジスト等の透明材料を用い、この透明材料のパターンの内部に蛍光発光層２５を埋め込む。）。第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法では、その後、蛍光発光層２５と非蛍光発光層８８の上面を被覆するように、バックコート層２９を真空蒸着法、若しくはスパッタリング法等で堆積しているが、図２２に示す構造では、バックコート層２９の代わりに、第２透明基板８７を形成している点が第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法とは異なる。

図２２に示す本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法において、蛍光発光層２５と非蛍光発光層８８の上面を被覆するように、第２透明基板８７を形成する方法は、別途用意した第２透明基板８７を、紫外線硬化樹脂等の接着剤により、蛍光発光層２５と非蛍光発光層８８の上面に接着しても良く、直接接合法で第２透明基板８７と非蛍光発光層８８の上面とを接合しても良い。直接接合法で第２透明基板８７と非蛍光発光層８８の上面とを接合するには、別途用意した第２透明基板８７の表面と、蛍光発光層２５と非蛍光発光層８８の上面をそれぞれ、鏡面になるまで研磨して、互いに接合すれば良い。一方、樹脂ガラスにＣｄＳｅ／ＺｎＳ半導体微粒子を分散させた蛍光発光層２５の場合は耐熱性が高いので、図２２に示す本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法では、蛍光発光層２５と非蛍光発光層８８の上面の上に、シリコン酸化膜、シリコン窒化膜等の第２透明基板８７をプラズマＣＶＤや光ＣＶＤで堆積しても良い。例えば、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）／Ｏ₂プラズマやＴＥＯＳ／Ｏ₃反応などを用いれば低温でＣＶＤできる。又、ＳＯＧの手法で、蛍光材料を含まないシロキサン樹脂溶液を塗布しても、蛍光発光層２５と非蛍光発光層８８の上面に第２透明基板８７を形成することができる。又、非蛍光発光層８８の代わりにＥＢ露光用フォトレジストで非蛍光発光層８８と同様なパターンを形成し、ＥＢ露光用フォトレジストのパターンの内部に蛍光発光層２５を埋め込んだ構造等の、高温の処理を厭う構造の場合は、蛍光材料を含まないＰＭＭＡ等の高分子材料や、蛍光材料を含まない紫外線硬化樹脂によって、第２透明基板８７を形成しても良い。

この様に、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な特許請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。

本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤を説明する模式的断面図である。 本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の蛍光発光層のパターンの具体例を説明する概略的な平面図である。 共焦点落射蛍光顕微鏡に本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤を用いる場合の構成の一例を示す模式図である。 蛍光発光層２５の膜厚が０．３μｍの場合における、ＰＭＭＡに対するローダミンの重量濃度の変化に対する蛍光強度の変化を示す図である。 ＣｄＳｅ／ＺｎＳ半導体微粒子の物理的構造と対応するエネルギーバンド構造を示す模式図である。 ＣｄＳｅ／ＺｎＳ半導体微粒子におけるシェルの厚さによる影響を説明する模式図である。 半導体微粒子の発光波長のコア径依存性を説明する図である。 本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法を説明する工程断面図である（その１）。 本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法を説明する工程断面図である（その２）。 本発明の第１の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法において、高分子材料に蛍光材料を混ぜた溶媒滴下した透明基板を、溶媒飽和雰囲気下で処理する具体的方法を説明する模式図である。 本発明の第１の実施の形態の変形例に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤を説明する模式的断面図である。 本発明の第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤を説明する模式的断面図である。 本発明の第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法を説明する工程断面図である（その１）。 本発明の第２の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤の製造方法を説明する工程断面図である（その２）。 本発明の第３の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤を説明する模式的断面図である。 本発明の第２の実施の形態に係る蛍光目盛り基盤の製造方法を説明する工程断面図である。 本発明の他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレート（蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器）を説明する模式的平面図である。 図１７のＡ−Ａ方向から見た本発明の他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレートを説明する模式的断面図である。 本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きマイクロウェルプレート（蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器）を説明する模式的断面図である。 本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きガラスボトムディッシュ（蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器）を説明する鳥瞰図である。 図２０に示した本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付きガラスボトムディッシュを説明する模式的断面図である。 本発明の更に他の実施の形態に係る蛍光目盛り付き顕微鏡基盤を説明する模式的断面図である。

符号の説明

１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄ，１１ｅ…支持基板
２１，２１_ij…透明基板（第１透明基板）
２２，３１…ＥＢ露光用フォトレジスト
２３，２３_ij…遮光層
２４…溶媒
２５，２５_ij…蛍光発光層
２６，２６_ij…バックコート層
２７…凹部
２８…遮光層
２９…バックコート層
４０…ディッシュ
４２…ディッシュ蓋部
４３…試料収納部（ホール部）
５１…蛍光目盛り付き顕微鏡基盤
５２…被観察試料
５２…試料
５３…対物レンズ
５４…光源
５５…ダイクロイックミラー
５６…ピンホール
５７…検出器
６１ａ，６１ｂ，６１ｕ，６１ｖ…コア
６２ａ，６２ｂ，６２ｕ，６２ｖ…シェル
７１…多孔質材料基板
７１ｍ…主格子
７１ｓ…副格子
７２ｍ，７２ｓ…蛍光発光層
７３…溶媒
７４…容器
７５…空気
８１…基部
８２_ij…ウェル
８４…リム構造
８７…第２透明基板
８８…非蛍光発光層
９１…容器
９２…蓋
９３…脱脂綿

Claims (10)

1. 励起光が入射する第１主面、該第１主面に対向する第２主面を有する透明基板と、
   前記第２主面に接して配置され、前記第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層と、
   前記開口部に、前記第２主面に接するように埋め込まれ、前記励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、
   該蛍光発光層の裏面を被覆し、前記蛍光発光層で発光した蛍光を前記第１主面方向に反射するバックコート層
   とを備えることを特徴とする蛍光目盛り基盤。
2. 前記蛍光発光層が、直径１〜３０ｎｍの第１の半導体からなるコアと、該コアを覆い、前記第１の半導体より禁制帯幅の広い第２の半導体からなり、厚さ１〜３０ｎｍのシェルからなる蛍光材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の蛍光目盛り基盤。
3. 透明基板と、
   該透明基板に接して配置され、前記透明基板を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層と、
   前記開口部に、前記透明基板に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、
   前記透明基板、前記遮光層及び前記蛍光発光層を含む積層体を、搭載面に形成された凹部に、前記積層体の少なくとも一部を密閉状態で収納して搭載する支持基板
   とを備えることを特徴とする蛍光目盛り付き顕微鏡基盤。
4. 前記蛍光発光層の裏面を被覆し、前記蛍光発光層で発光した蛍光を前記透明基板方向に反射するバックコート層を更に備えることを特徴とする請求項３に記載の蛍光目盛り付き顕微鏡基盤。
5. 第１透明基板と、
   前記第１透明基板に接して配置され、前記第１透明基板を露出する開口部が目盛り状パターンをなす非蛍光発光層と、
   前記開口部に、前記非蛍光発光層と同一厚さで埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、
   前記非蛍光発光層と前記蛍光発光層とに接し、前記第１透明基板とともに前記非蛍光発光層と前記蛍光発光層とを挟む第２透明基板
   とを備えることを特徴とする蛍光目盛り付き顕微鏡基盤。
6. 前記非蛍光発光層は、前記蛍光が光学的に透過しない遮光層であることを特徴とする請求項５に記載の蛍光目盛り付き顕微鏡基盤。
7. 前記蛍光発光層が、直径１〜３０ｎｍの第１の半導体からなるコアと、該コアを覆い、前記第１の半導体より禁制帯幅の広い第２の半導体からなり、厚さ１〜３０ｎｍのシェルからなる蛍光材料を含むことを特徴とする請求項３〜６のいずれか１項記載の蛍光目盛り付き顕微鏡基盤。
8. 第１主面、該第１主面に対向する第２主面を有する透明基板と、
   前記第２主面に接して配置され、前記第２主面を露出する開口部が目盛り状パターンをなす遮光層と、
   前記開口部に、前記第２主面に接するように埋め込まれ、励起光により蛍光を発光する蛍光発光層と、
   前記透明基板、前記遮光層及び前記蛍光発光層を含む積層体を、搭載面に形成された凹部に、前記積層体の少なくとも一部を密閉状態で収納して搭載する支持基板と、
   前記透明基板の前記第１主面側に接して配置された、被観察試料を収納する試料収納部
   とを備えることを特徴とする蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器。
9. 前記蛍光発光層の裏面を被覆し、前記蛍光発光層で発光した蛍光を前記透明基板方向に反射するバックコート層を更に備えることを特徴とする請求項８に記載の蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器。
10. 前記蛍光発光層が、直径１〜３０ｎｍの第１の半導体からなるコアと、該コアを覆い、前記第１の半導体より禁制帯幅の広い第２の半導体からなり、厚さ１〜３０ｎｍのシェルからなる蛍光材料を含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の蛍光目盛り付き顕微鏡用試料容器。
    
    
    
    

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