CN104956207B - 光分析装置的评价方法和幻影样本 - Google Patents

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Abstract

简单且高精度地对光分析装置的光学系统进行评价。提供一种具备能够将激励光B聚光来在焦点位置形成共焦区(C)的光学系统(A)的光分析装置的评价方法，包括以下步骤：在光学系统(A)的焦点位置配置将荧光物质的浓度不同的两种以上的多个固体构件(2、3)邻接排列所形成的幻影样本(1)；一边使通过光学系统(A)形成的共焦区(C)和幻影样本(1)沿固体构件(2、3)的排列方向相对地移动，一边经由光学系统(A)向幻影样本(1)照射激励光；检测配置于共焦区(C)内的固体构件(2、3)处产生的荧光；以及根据检测出的荧光对光学系统(A)进行评价。

Description

光分析装置的评价方法和幻影样本
技术领域
本发明涉及一种光分析装置的评价方法和幻影样本。
背景技术
以往，已知如下一种光分析装置(例如参照专利文献1。)：能够定量地观测与通过包含荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS)等统计性处理的光分析技术所能处理的相比更低浓度的水溶液中的发光粒子的状态、特性。
该光分析装置使用如共焦显微镜或多光子激励显微镜那样能够检测来自水溶液中的共焦区(コンフォーカルボリューム)的光的光学系统。而且，一边使共焦区的位置在水溶液内移动、即一边通过共焦区对水溶液内进行扫描，一边检测在水溶液中分散并随机地运动的发光粒子被包含在共焦区内时从该发光粒子发出的光。
该光分析装置基本上针对共焦区的大小测量在水溶液中充分离散地分散的发光粒子的浓度，基于如下的非常明确且简单的原理：以比粒子在水溶液中通过水的布朗运动而扩散的速度大的速度进行扫描的共焦区通过粒子时所获得的荧光强度(光子)的脉冲列反映为共焦区的强度分布即吊钟型，根据其特征性的形状将其判断为一个粒子。
一个粒子的通过被计数为一个连续的吊钟型的山(峰)，某个确定的扫描时间中的峰数之和与水溶液中的粒子的浓度成比例。也就是说，预先将作为对象的粒子设为已知浓度的状态，一边以某个确定的时间进行扫描一边测量该期间的峰数，如果针对一系列浓度的水溶液进行该处理，则能够校正浓度和峰数。其结果，通过进行未知浓度的水溶液的测量并获得其峰数，从而能够测量浓度。
在进行这样的光分析装置的光学系统的评价的情况下，实施以下作业：准备实际不同的已知浓度的多种荧光色素分子的水溶液，通过将在各水溶液内使共焦区在规定时间内进行扫描时所获得的荧光的峰数与浓度进行对应，来校正峰数与浓度之间的关系。
此时，在确认出针对某个规定的浓度获得的峰数比从光学系统估计的数量少、或者形成峰的光子的脉冲列的高度小、即荧光的强度小等的状态的情况下，这些表示光学系统的状态不准确。在此，决定状态的要素为在水溶液中构成的共焦区的尺寸、共焦区离保持水溶液的容器的透明体即底板面的高度(焦点的位置)、扫描的速度、检测器的灵敏度、光轴的偏移等。
专利文献1：国际公开第2011/108369号
发明内容
发明要解决的问题
然而，需要费力地在极淡浓度的区域高精度地调制不同的已知浓度的多种荧光色素分子的水溶液、例如以1/10步进、即以1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、100aM那样的序列进行调整，并且在调整时也有可能发生人为的错误。另外，由于是极淡的浓度，因此由于少许水分的蒸发也有可能浓度显著地发生变动等，进而也可能发生荧光色素分子的退色等劣化，因此欠缺保存性。因此，使用实际的水溶液的试样来准确地评价光分析装置的光学系统并不容易。
本发明是鉴于上述的情形而完成的，其目的在于提供一种能够简单且高精度地评价光分析装置的光学系统的光分析装置的评价方法和幻影样本。
用于解决问题的方案
为了达成上述目的，本发明提供以下方案。
本发明的一个方式提供一种光分析装置的评价方法，该光分析装置具备能够将激励光聚光来在焦点位置形成共焦区的光学系统，该光分析装置的评价方法包括以下步骤：在上述光学系统的焦点位置配置幻影样本，其中，该幻影样本是将荧光物质的浓度不同的两种以上的多个固体构件邻接排列而形成的；一边使通过上述光学系统形成的共焦区和上述幻影样本沿上述固体构件的排列方向相对地移动，一边经由上述光学系统向上述幻影样本照射激励光；检测配置于上述共焦区内的固体构件处产生的荧光；以及根据检测出的荧光对上述光学系统进行评价。
根据本方式，在使光分析装置的光学系统的焦点位置与固体构件一致的状态下，通过使幻影样本和通过光学系统形成的共焦区沿固体构件的排列方向相对地移动，能够使检测出的荧光强度呈阶梯状地变化。
在焦点位置与固体构件一致的情况下，在固体构件的边界位置处荧光强度急剧地变化，但是在焦点位置不一致的情况下，荧光强度的变化平缓。因而，通过求出该位置处的荧光的强度变化的斜率，能够容易地评价焦点位置是否适当。另外，在共焦区被形成为适当的大小的情况下，检测出的荧光强度高，但是在共焦区小的情况下，检测出的荧光强度低，因此由此能够简单地评价共焦区的尺寸或检测器的灵敏度是否适当。
在上述方式中，也可以上述幻影样本是将含有规定浓度的荧光物质的第一固体构件和不含荧光物质的第二固体构件交替地排列而构成的。
通过这样，能够使在邻接的固体构件的边界处产生的荧光的强度差显著。
另外，在上述方式中，也可以上述固体构件以固定周期排列。
通过这样，在通过光学系统形成的共焦区与固体构件的相对移动时，通过以固定的相对速度使其相对移动，能够使所获得的荧光强度以固定的周期变化。其结果，能够基于荧光强度的周期性评价相对移动速度、即扫描速度的固定性。
另外，在上述方式中，也可以上述固体构件沿一个直线方向排列。
通过这样，仅使通过光学系统形成的共焦区和固体构件沿固体构件的排列方向呈一条直线状地移动，就能够进行上述评价。
另外，在上述方式中，也可以上述固体构件沿圆周方向排列。
通过这样，仅使通过光学系统形成的共焦区和固体构件围绕固体构件的排列中心旋转，就能够进行上述评价。
在上述方式中，也可以在对上述光学系统进行评价的步骤中，根据不同的上述固体构件的邻接位置处的荧光的强度变化的斜率，来评价上述光学系统的焦点位置是否适当。
在光学系统的焦点位置与幻影样本高精度地一致的情况下，检测出的荧光的强度在固体荧光板的邻接位置处呈阶梯状地变化，因此其斜率无限大，而在焦点位置发生偏移的情况下，荧光的强度变化的斜率变小。因而，通过检测强度变化的斜率，能够简单地评价光学系统的焦点位置是否适当。
另外，在上述方式中，也可以在对上述光学系统进行评价的步骤中，根据检测出的荧光的强度，评价共焦区的尺寸或检测器的灵敏度是否适当。
在共焦区的尺寸或检测器的灵敏度适当的情况下，能够获得规定的荧光强度，在不适当的情况下，能够获得比该规定的荧光强度低的荧光强度，因此能够简单地对它们进行评价。
另外，在上述方式中，也可以在对上述光学系统进行评价的步骤中，根据不同的上述固体构件的邻接位置处的荧光的强度变化的时间间隔，评价被上述光学系统聚光的激励光的扫描速度是否适当。
通过这样，固体构件处产生的荧光量在邻接的固体构件的边界处呈阶梯状地变化，因此通过确认其变化的时间间隔，能够简单地评价被光学系统聚光的激励光的扫描速度是否适当。
另外，本发明的另一方式提供一种在上述任一个的光分析装置的评价方法中使用的幻影样本。
根据本方式，不需要如以往那样费力地通过水溶液进行调整，因而在调整时不会发生人为的错误，并且即使是极淡的浓度，也不发生由于水分的蒸发等而引起浓度变动。另外，还难以发生荧光色素分子的退色等劣化，保存性也优秀。因此，能够简单且高精度地评价光分析装置的光学系统。
发明的效果
根据本发明，起到能够简单且高精度地评价光分析装置的光学系统这样的效果。
附图说明
图1是表示本发明的一个实施方式所涉及的幻影样本的立体图。
图2是对使用图1的幻影样本的光分析装置的评价方法进行说明的局部的立体图。
图3是表示在光分析装置的光学系统的焦点位置与图1的幻影样本一致的情况下通过光检测器检测出的荧光强度的时间变化的波形。
图4是表示在光分析装置的光学系统的焦点位置与图1的幻影样本不一致的情况下通过光检测器检测出的荧光强度的时间变化的波形。
图5是表示图1的幻影样本的变形例的立体图。
具体实施方式
以下参照附图来说明本发明的一个实施方式所涉及的光分析装置的评价方法和幻影样本1。
本实施方式所涉及的幻影样本1如图1所示那样通过将多个荧光物质浓度不同的两种固体构件2、3交替地邻接排列来构成平板状。
一方的固体构件2含有规定的荧光浓度的荧光物质。另一方的固体构件3不含荧光物质(含有荧光浓度为零的荧光物质。)。这些固体构件2、3被形成得非常薄，其宽度尺寸被高精度地设定为同一宽度尺寸。
以下对使用像这样构成的本实施方式所涉及的幻影样本1的光分析装置的评价方法进行说明。
为了使用本实施方式所涉及的幻影样本1来评价包括共焦光学系统或多光子激励光学系统的光分析装置，而如图2所示那样调节光分析装置的光学系统A来将其焦点位置配置成与幻影样本1一致。
在该状态下，向幻影样本1照射经由光学系统A传播过来的激励光B。由此，在光学系统A的焦点位置形成的共焦区C与幻影样本1一致，共焦区C内的荧光物质被激励而产生荧光。
另外，使光分析装置的扫描单元(省略图示)工作，来使共焦区C沿与光轴交叉且与固体构件2、3的排列方向一致的方向(箭头D的方向)移动。由此，使共焦区C相对于固体构件2、3相对地移动。
在固体构件2、3处产生的荧光被光分析装置的光学系统A聚光，并被未图示的光检测器检测。
即，在共焦区C与含有荧光物质的一方的固体构件2一致的期间，在固体构件2处产生荧光并从光检测器发出规定的强度的信号，另一方面，在共焦区C与不含荧光物质的另一方的固体构件3一致的期间，不从光检测器发出信号(或者，产生暗噪声水平的信号。)。因而，在共焦区C与固体构件2、3相对地移动的期间，通过光检测器检测出的信号呈矩形波状地变化。
在该情况下，在共焦区C的光轴方向位置与固体构件2、3准确吻合的情况下，被配置成固体构件2、3横穿共焦区C收敛为最细的位置，因此如图3所示那样，来自光检测器的信号在两种固体构件的边界位置处呈阶梯状地从零变为有限值或者从有限值变为零。因而，固体构件2、3的边界位置处的信号的时间变化的斜率接近无限大。
另一方面，在共焦区C的光轴方向位置未与固体构件2、3准确吻合的情况下，被配置成固体构件2、3横穿共焦区C扩展的位置，因此如图4所示那样，来自光检测器的信号在两种固体构件2、3的边界位置处平缓地变化。因而，固体构件2、3的边界位置处的信号的时间变化的斜率变小。
其结果，根据本实施方式所涉及的幻影样本1，具有以下优点：根据通过光分析装置检测出的荧光强度的信号的时间变化，能够容易地评价光学系统A的焦点位置是否与幻影样本1准确地一致。
另外，本实施方式所涉及的幻影样本1由于一方的固体构件2具有规定的荧光浓度，因此预先已知通过照射规定的强度的激励光所产生的荧光的强度。因而，如上述那样，即使在能够评价为光学系统A的焦点位置与幻影样本1准确地一致的情况下，也能够在通过光检测器检测出的信号的最大强度相对于预先已知的值较低的情况下，简单地评价是产生激励光B的光源存在问题、共焦区C的尺寸过小、还是光检测器的灵敏度下降中的哪一个。
并且，本实施方式所涉及的幻影样本1由于两种固体构件2、3高精度地具有同一宽度尺寸，因此在共焦区C与固体构件2、3的相对移动速度为等速的情况下，通过光检测器产生的信号准确地周期性地变化。因而，具有以下优点：通过检测该周期，能够简单地评价共焦区C与固体构件2、3的相对移动速度、即激励光B的扫描速度是否是固定的。
此外，在本实施方式中，将规定浓度的固体构件2和浓度为零的固体构件3交替地排列，但是取而代之地，也可以都含有荧光物质，将其浓度明确不同的固体构件交替地排列。另外，也可以将浓度不同的三种以上的固体构件进行排列。另外，也可以根据所照射的激励光的种类来更换具有含有不同的荧光物质的固体构件的幻影样本1。
另外，在本实施方式中，例示了将固体构件2、3沿直线方向的一个方向排列所得到的幻影样本1，但是取而代之地，也可以如图5所示那样采用将扇形的不同荧光浓度的固体构件2、3沿圆周方向交替地排列而形成为圆板状的幻影样本1。通过这样，仅使幻影样本1围绕其中心轴沿一个方向等速旋转就能够连续地进行上述评价。
另外，在本实施方式中，将严格具有同一宽度尺寸的固体构件2、3进行了排列，因此只要使其等速地进行相对移动，就能够在任意的位置获得周期性的输出波形，但是不限定于此。即，仅考虑邻接的固体构件2、3的边界位置处的信号变化即可，可以不需要周期性而宽度尺寸不同。
另外，即使在需要周期性的评价内容的情况下，不同种类的固体构件2、3之间也可以使宽度尺寸不同。只要使同种的固体构件2(3)的宽度尺寸一致，就能够保持周期性，因此据此也能够进行扫描速度的评价。
附图标记说明
1：幻影样本；2、3：固体构件；A：光学系统；B：激励光；C：共焦区。

Claims (8)

1.一种光分析装置的评价方法，该光分析装置具备能够将激励光聚光来在焦点位置形成共焦区的光学系统，该光分析装置的评价方法包括以下步骤：
在上述光学系统的焦点位置配置幻影样本，其中，该幻影样本是将荧光物质的浓度不同的两种以上的多个固体构件邻接排列而形成的；
一边使通过上述光学系统形成的共焦区和上述幻影样本沿上述固体构件的排列方向相对地移动，一边经由上述光学系统向上述幻影样本照射激励光；
检测配置于上述共焦区内的固体构件处产生的荧光；以及
根据检测出的荧光对上述光学系统进行评价，
其中，对上述光学系统进行评价的步骤包括：
确定不同的上述固体构件的邻接位置处的荧光的强度变化的时间间隔，
根据所确定的时间间隔评价被上述光学系统聚光的激励光的扫描速度是否适当。
2.根据权利要求1所述的光分析装置的评价方法，其特征在于，
上述幻影样本是将含有规定浓度的荧光物质的第一固体构件和不含荧光物质的第二固体构件交替地排列而形成的。
3.根据权利要求1或2所述的光分析装置的评价方法，其特征在于，
上述多个固体构件以固定周期排列。
4.根据权利要求1所述的光分析装置的评价方法，其特征在于，
上述多个固体构件沿一个直线方向排列。
5.根据权利要求1所述的光分析装置的评价方法，其特征在于，
上述多个固体构件沿圆周方向排列。
6.根据权利要求1所述的光分析装置的评价方法，其特征在于，
在对上述光学系统进行评价的步骤中，根据不同的上述固体构件的邻接位置处的荧光的强度变化的斜率，来评价上述光学系统的焦点位置是否适当。
7.根据权利要求1所述的光分析装置的评价方法，其特征在于，
在对上述光学系统进行评价的步骤中，根据检测出的荧光的强度，评价共焦区的尺寸或检测器的灵敏度是否适当。
8.一种幻影样本，在权利要求1至7中的任一项所述的光分析装置的评价方法中使用。
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