WO2005017598A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von lumineszierenden molekülen nach der methode der fluoreszenzkorrelationsspektroskopie - Google Patents

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Theo Lasser
Pierre-André Besse
Alexis Rochas
Alexandre Serov
Michael Gösch
Radivoje Popovic
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Definitions

  • the invention relates to a method for determining luminescent molecules by optical excitation in confocal measurement volumes, in particular 5 FCS fluorescence correlation spectroscopy methods, which comprises the following steps: a) providing a sample comprising luminescent molecules,
  • the invention also relates to an apparatus for performing 5 the method.
  • a method and a device of the type mentioned above are known from WO 02/097406.
  • the methods and devices according to WO 02/097406 enable parallel determination of luminescent molecules in a simple manner in multiple confocal volume elements by fluorescence correlation spectroscopy.
  • a spatially resolving detection matrix is used as the optical detection device, for example composed of individual avalanche photodiodes.
  • EP 0679251 B1 sets out the basics of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), which are also used in the methods according to WO 02/097406 A1 and the present application.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • substance-specific parameters are determined, which are determined by luminescence measurement on the analyte molecules. These parameters can e.g. B. translational diffusion coefficients, rotational diffusion coefficients, the emission wavelength and / or the lifetimes of an excited state of a luminescent molecule or the combination of one or more of these parameters.
  • fluorescence correlation spectroscopy can be used to investigate the chemical and photophysical dynamic properties of individual molecules (see Rigler, R .; Elson, E. S .; "Fluorescence Correlation Spectroscopy, Theory and Applications; Springer-Verlag: Berlin Heidelberg New York, 2001).
  • the intensity fluctuations of the fluorescence signals of the molecules excited by light are measured and this signal is autocorrelated.
  • a very good signal-to-noise ratio is achieved by providing the confocal detection volume in the area of a pinhole, the confocal detection volume being extremely small and e.g. can be in the femptoliter range and below.
  • Fluorescence correlation spectroscopy can be used, for example, to analyze molecular interactions, structural changes, chemical reactions, Analyze bonds to cell membranes, photophysical dynamic properties and transport or flow properties of molecules or samples.
  • Biochips are available in different versions regarding the number of measuring point points. For example, biochips with a few measuring station points are available, but also biochips with up to 100,000 measuring station points.
  • the measurement time for examining or scanning a biochip microarray with a confocal fluorescence correlation spectral copy is directly proportional to the number of measurement points and can be a few hours.
  • the use of CCD cameras with a few thousand detector elements cannot solve the time problem of parallel FCS detection of single molecules, since CCD-based systems require a comparatively long readout time for the measurement results and therefore dynamic real-time measurements (1 ns - 1 ms) are not easy enable. There is therefore a need for a parallel (multip! Ex) measurement method with fast-reacting, that is to say quasi-real-time capable, space-saving and comparatively inexpensive detector devices.
  • the object of the invention is to improve the possibility of quasi-parallel detection of luminescence events from several confocal volume elements.
  • a sensor matrix arrangement made of IC technology, in particular in CMOS technology or BICMOS technology and integrated in a sensor chip in Geiger mode circuitry, comprising avalanche photodiodes for collecting the emission radiation from the multiple confocal volume elements to be used, wherein according to a particularly preferred embodiment of the invention the sensor chip is already signal processing and evaluation circuits integrated.
  • IC technology in particular in CMOS technology or BICMOS technology
  • Geiger mode circuitry comprising avalanche photodiodes for collecting the emission radiation from the multiple confocal volume elements to be used
  • the sensor chip is already signal processing and evaluation circuits integrated.
  • These are, in particular, circuits for calculating correlation functions (autocorrelation and / or cross-correlation of different orders) and their Fourier transforms.
  • the sensor chip can have a large number of avalanche photodiodes in Geiger mode circuitry, so that, if necessary, a correspondingly large number of confocal measurement volumes can be detected in parallel. Due to the IC integration, in particular CMOS integration of the light-sensitive avalanche photodiodes, it can also be achieved that the scatter of specimens of the individual photodiodes within the chip is comparatively small and the individual integrated sensor elements thus have essentially the same detection properties. Test measurements have shown that an example of a CMOS sensor chip of the type considered here does not show the effect of after-pulsing known from photomultipliers, has a very low dark count rate of approximately 40 Hz and a very short dead time of approximately 30 ns.
  • the integrated avalanche photodiodes have a very high sensitivity and already respond to individual photons. They allow single molecule detection in the individual confocal volume elements under consideration using the FCS method.
  • the irradiation device preferably comprises at least one light source and at least one diffractive optical element, in particular, for splitting light that passes through into multiple beams. alternative come to beam splitting z.
  • the irradiation device can also comprise a light source array, in particular a laser array or VCSEL array, which already provides multiple beams in the original.
  • a light source array in particular a laser array or VCSEL array, which already provides multiple beams in the original.
  • the method can basically be carried out according to the methods described in EP 0679251 B1 or in WO 02/097406.
  • the measurement of one or a few analyte molecules is preferably carried out in a measurement volume, the concentration of the analyte molecules to be determined preferably being less than 10 6 mol / l and the measurement volume preferably being less than 10 14 i.
  • Substance-specific parameters are determined, which are determined by luminescence measurement on the analyte molecules. For details on apparatus details, reference is made to the disclosure in EP 0679251 B1 and WO 02/097406.
  • the method according to the invention can be carried out in accordance with the method according to WO 02/097406 insofar as, in preferred embodiments of the method, the luminescent molecules are selected from luminescence-labeled detection reagents which bind to an analyte present in the sample.
  • the method according to the invention can also include the measurement or determination of a cross-correlated signal which originates from a complex of analyte and detection reagent (s) containing at least two different luminescent markings
  • the molecular determination can include the measurement of a signal originating from a luminescence-labeled detection reagent, the luminescence intensity or / and decay time of the detection reagent when bound to the analyte being different from the luminescence intensity or / and decay time in the unbound state.
  • the differences in luminescence intensity or / and decay time can be determined by Quench or energy transfer processes are caused.
  • Molecular determination according to the method according to the invention can further comprise nucleic acid hybridization, one or more luminescence-labeled probes binding to a target nucleic acid.
  • the molecular determination can comprise a protein-antibody interaction, the antibodies being able to determine in different light wavelengths (colors).
  • the signals are then subjected to a cross-correlation during signal processing.
  • the molecular determination can comprise an enzymatic reaction.
  • the molecular determination can comprise nucleic acid amplification, in particular a thermocycling process.
  • the molecular determination can comprise a mutation analysis for nucleic acids.
  • the molecular determination can comprise a gene expression analysis for nucleic acids.
  • the molecular determination can include the measurement of a temperature-dependent melting curve in a nucleic acid hybridization.
  • the molecular determination can include particle selection.
  • the molecular determination can comprise nucleic acid sequencing.
  • the carrier used can contain several, in particular at least ten and preferably at least 32, separate containers for holding samples.
  • the sample can be provided in a microchannel structure, an analyte present in the sample preferably being held in the microchannel structure.
  • an analyte present in the sample is subjected to a cleavage reaction, fragments cleaved off from the analyte being determined.
  • the analyte present in the sample can be attached to a carrier particle e.g. made of plastic, glass, quartz, metal or composite.
  • the method according to the invention can be used to determine luminescent molecules, in particular single molecules, from a single sample in the different confocal measurement volumes - or from different samples in the confocal measurement volumes.
  • the parallel detection of the luminescence events in several detection volumes also allows the determination of the local flow velocity (velocity profile) in a microchannel.
  • the method can also be used to determine single molecules in a flow. Several measuring points in a sample volume can also be detected by several sensor elements, which can increase the probability of detection in highly diluted measuring samples.
  • the device proposed according to the invention for determining luminescent molecules by optical excitation in confocal measurement volumes comprises: a) a carrier arrangement for receiving a sample which contains molecules to be determined,
  • an optical excitation device which can provide multiple light beams, and in particular at least one diffractive optical element for splitting light that passes through into multiple beams, and focusing optics for focusing multiple light beams passing through into multiple confocal volume elements in the respective Has measurement volume for excitation of luminescence in the multiple confocal volume elements,
  • an optical detection device for detecting luminescence from the confocal volume elements comprising a spatially resolving sensor matrix made of avalanche photodiodes, which is produced in IC technology, in particular in CMOS technology, and integrated in a sensor chip in Geiger mode circuitry of emission radiation from the multiple confocal volume elements, and
  • the signal processing and evaluation means are integrated in the sensor chip in order to be able to carry out quasi-real-time measurements.
  • Correlators for autocorrelation determinations and / or possibly cross-correlation determinations come into question as integrated signal processing and evaluation means.
  • Circuits for performing fast Fourier transformations of the measurement signals can be provided as signal processing and evaluation means and can be integrated in the sensor chip.
  • the correlation In a preferred embodiment of the invention, gate circuits can carry out correlation operations on the "multiple-tau or multiple- ⁇ " principle.
  • multiple-tau technology see, for example, Shutze !, K., "Correlation Techniques in Dynamic Light Scattering", Journal of Applied Physics B, 1987, pp. 193-213, Schwarztze !, K., "New Concepts in Correlator Design ", Proc. of the int. Phys. Conference, Ed. E.
  • a laser is preferably used as the light source.
  • a three-dimensional optical grating which diffracts light passing through and generates a predetermined diffraction pattern comprising multiple optical foci, preferably serves as the diffractive optical element for beam splitting.
  • the carrier has several, preferably at least ten, in particular at least 100 separate containers for holding samples.
  • the carrier can have a microchannel structure with one or more channels.
  • the present application also relates to the use of a CMOS sensor chip with integrated avalanche photodiodes in a Geiger mode connection for a parallel determination of molecular interactions in multiple confocal volume elements, in particular in a method of fluorescence correlation spectroscopy.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of an embodiment of a device according to the invention.
  • 2 schematically shows a preferred example of the wiring of an avalanche photodiode pixel in the sensor chip.
  • Fig. 3 shows a schematic representation of a further embodiment of a device according to the invention.
  • a diode-pumped solid-state laser emitting with a light wavelength of 532 nm is provided as the light source, the laser beam of which is expanded by the beam expansion optics 4 with the optical elements L1 and L2, so that it diffractive optical element 7 essentially completely illuminated.
  • the collimator 6 with the optical elements L3 and L4 and the microscope objective 8 the expanded laser beam is split into a pattern of multiple foci and focused into the sample (liquid drop) at 12.
  • the confocal volume elements in the sample volume illuminated by the focused partial beams are not shown in detail in FIG. 1.
  • 14 denotes a dichroic mirror which reflects the excitation light into the microscope objective 8 and thus towards the sample.
  • the fluorescence emission emanating from the excited molecules in the confocal volumes is collected via the same objective 8, so that it passes through the dichroic mirror 14 to a bandpass filter 16.
  • the bandpass filter discriminates the signal light against Rayleigh scattered light and Raman scattered light.
  • the fluorescence emission light is then directed through the lens group L5 and L6 onto the sensor chip 20.
  • the sensor chip 20 is a CMOS chip with an integrated array of avalanche photodiodes in a Geiger mode circuit. Electronic components for operating the avalanche photodiodes and for signal processing, for example quench resistors, transistors, correlators and arithmetic circuits for further signal processing operations, are also integrated.
  • the sensor chip 20 is read out by a computer 22, with external evaluation components 24 possibly between the computer 22 and the sensor chip 20 can be interposed.
  • the sample area 12 is shown as a drop on a microscope cover glass 9.
  • the device for carrying out a high-throughput screening method in particular a microarray structure with a larger number of separate sample containers, approximately 100 or more separate sample containers, which can be identified by depressions in, can be used as the corresponding sample carrier 9 a plate are formed. If the number of containers within the carrier is greater than the number of partial beams generated by the diffractive optical element, the carrier can be scanned in several steps. For this purpose, the optics and / or the support can be readjusted by suitable measures for the individual steps.
  • a carrier with microchannels for the sample material can be used for other measurement tasks, for example for single-molecule sequencing or for single-molecule selection.
  • CMOS photodiode pixel shows schematically and as an example the electrical components of a CMOS photodiode pixel.
  • the anodes of all avalanche photodiodes AD have a high negative voltage VOP of e.g. -18.5 V biased.
  • VOP high negative voltage
  • the rest of the area of the CMOS chip is electrically at potentials between ground GND and the supply voltage VDD of, for example, 5 V.
  • a pixel comprises a circular avalanche photodiode for single-photon detection, for example, and a quenching resistor R of 270 k ⁇ , for example, which is connected in series between the cathode of the avalanche photodiode AD and the supply voltage VDD.
  • the breakdown voltage of the diode AD is, for example, 21 V.
  • the diode AD is thus biased with a voltage value of 2.5 V above the breakdown voltage.
  • a simple comparator K based on a standard inverter is also implemented at each pixel location. The design of the transistors allows the input threshold voltage to be set to 3 V for switching to outputs. As long as no charge carriers get into the multiplication region of the diode AD, no current flows into the photodiode AD.
  • the avalanche avalanche effect is triggered.
  • the avalanche current simultaneously discharges the diode capacitance (and parasitic capacitances at point A) and induces a voltage drop across the resistor R.
  • the voltage across the diode AD becomes lower.
  • the voltage at node A changes from 5 V to 2.5 V.
  • the comparator output is therefore switched to VDD.
  • the avalanche current is passively extinguished in a few nanoseconds.
  • the recharging process then starts with a time constant of approximately 30 ns.
  • a dead time of approximately 32 ns was measured for the sensor element.
  • the comparator output is switched to ground GND.
  • the output of the comparator K is connected to an input of the multiplexer shown at M, the other inputs of which are occupied by other pixel elements of the sensor array and which is part of a simple addressing circuit.
  • the multiplexer components N are preferably integrated in the sensor chip 20.
  • a transistor operating in the saturation region can be provided instead of the quench resistor R.
  • the photosensitive region of a respective avalanche photodiode is approximately 30 ⁇ m 2 . Further miniaturization is possible.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the structure of a further embodiment of a device according to the invention. Elements in FIG. 3 which correspond in function to elements in FIG. 1 are ding reference numerals, wherein for further differentiation in Fig. 3, the letters a and b are followed by the reference numbers.
  • the exemplary embodiment according to FIG. 3 is particularly suitable for cross-correlation measurement when the sample is irradiated with multiple beams of different excitation wavelengths and permits better detection specificity of biomolecules. It can be measured very precisely with high sensitivity, since only biomolecules with double dye marking are considered in the cross-correlation operation.
  • the dyes are excited in the example by means of two different laser wavelengths. Two-photon excitation is also possible.
  • a first laser 2a e.g. B. an argon laser
  • a second laser 2b e.g. B. a helium-neon laser
  • the partial beams are guided to the sample 12 by means of the mirrors 14a, 14b, so that they are focused into confocal volume elements in the sample area.
  • the microscope objective in question is provided.
  • the emission radiation emanating from the excited molecules in the confocal volumes is collected via the objective 8, so that it passes from the dichroic mirror 14c through the lens L to the beam splitter (dichroic mirror) 14e.
  • the partial beams forwarded by the beam splitter 14e pass through the bandpass filters 16a and 16b to the avalanche diode sensor chips 20a and 20b with integrated evaluation electronics.
  • the control and evaluation computer, which informa- tion from the elements 20a, 20b is not shown in Fig. 3.
  • the partial beams of different wavelengths can overlap one another in the confocal volumes in question in the sample region 12.
  • Two different dyes which are provided as markers on one and the same molecule, can then simultaneously emit two-color fluorescent light when the molecules cross the measurement volume of the foci superimposed on one another.
  • the relevant signals of the different wavelengths can then be subjected to a cross-correlation in order to e.g. B. Collect information about the number of double-labeled biomolecules in a sample volume, etc.

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Abstract

Es werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen mach der Methode der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe (12) umfassend lumineszierende Moleküle, b) Bestrahlen der Probe (12) mit einer optischen Anregungseinrichtung (2, 4, 6, 8) umfassend wenigstens eine Lichtquelle und wenigstens ein insbesondere diffraktives optisches Element (7) zur Aufspaltung von hindurchtretendem Licht in multiple Strahlen, und eine Fokussieroptik (8) zur Fokussierung von hindurchtretenden multiplen Lichtstrahlen in multiple konfokale Volumenelemente, c) Auffangen von Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen mittels einer ortsauflösenden Sensormatrixanordnung (20), wobei die Sensormatrixanordnung eine in IC-Technologie, insbesondere in CMOS-Technologie hergestellte und in einem Sensorchip (20) in Geiger-Modus-Beschaltung integrierte Sensormatrix aus Avalanche-Fotodioden AD ist, und d) Verarbeiten der von der Avalanche-Fotodiodenmatrix bereitgestellten Signale mittels einer vorzugsweise in den Sensorchip integrierten Signalverarbeitungs- und -auswerteeinrichtung.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR BESTIMMUNG VON LUMINESZIERENDEN MOLEKÜLEN NACH DER METHODE DER FLUORESZENZKORRELATIONSSEKTROSKOPIΞ
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, insbeson- 5 dere FCS-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopieverfahren, welches folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellen einer Probe umfassend lumineszierende Moleküle,
10 b) Bestrahlen der Probe mit einer optischen Anregungseinrichtung umfassend wenigstens eine Bestrahlungseinrichtung zur Erzeugung von multiplen Strahlen und eine Fokussieroptik zur Fo- kussierung von hindurchtretenden multiplen Lichtstrahlen in multiple konfokale Volumenelemente,
15 c) Auffangen von Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen mittels einer ortsauflösenden Sensormatrixanordnung und 0 d) Verarbeiten der von der Sensormatrixanordnung bereitgestellten Signale mittels einer Signalverarbeitungs- und -auswerteeinrich- tung.
Die Erfindung bezieht sich ebenso auf eine Vorrichtung zur Durchführung 5 des Verfahrens. Ein Verfahren und eine Vorrichtung der vorstehend genannten Art sind aus der WO 02/097406 bekannt.
Die Verfahren und Vorrichtungen nach der WO 02/097406 ermöglichen auf einfache Weise eine parallele Bestimmung von lumineszierenden Molekülen in multiplen konfokalen Volumenelementen durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Als optische Detektionseinrichtung dient eine ortsauflösende Detektionsmatrix, z.B. zusammengestellt aus einzelnen Avalanche- Fotodioden.
Zum Stand der Technik wird femer auf die EP 0679251 B1 verwiesen. In der EP 0679251 B1 sind Grundlagen der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) dargelegt, von denen auch bei den Verfahren nach der WO 02/097406 A1 und der vorliegenden Anmeldung Gebrauch gemacht wird. Der Offenbarungsgehalt der EP 0679251 B1 und der WO 02/097406 A1 werden insoweit auch zum Inhalt der vorliegenden Anmeldung gemacht. Mittels der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie werden stoffspezifische Parameter bestimmt, die durch Lumineszenzmessung an den Analytmolekülen ermittelt werden. Bei diesen Parametern kann es sich z. B. um Translations- diffusions-Koeffizienten, Rotationsdiffusions-Koeffizienten, die Emissionswellenlänge oder/und die Lebensdauern eines angeregten Zustandes eines lumineszierenden Moleküls oder die Kombination von einer oder mehrerer dieser Messgrößen handeln. Insbesondere kann die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie zur Untersuchung chemischer und fotophysikalischer dynamischer Eigenschaften von Einzelmolekülen genutzt werden (vgl. Rigler, R.; Elson, E. S.; "Fluorescence Correlation Spectroscopy, Theory and Applications; Springer-Verlag: Berlin Heidelberg New York, 2001).
In einer Standardanwendung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie werden die Intensitätsfluktuationen der Fluoreszenzsignale der durch Licht angeregten Moleküle gemessen und eine Autokorrelation dieses Signals vorgenommen. Ein sehr gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis wird erreicht, indem das konfokale Detektionsvolumen im Bereich einer Lochblende vorgesehen ist, wobei das konfokale Detektionsvolumen extrem klein sein kann und z.B. im Femptoliterbereich und darunter liegen kann.
Die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie kann z.B. verwendet werden, um molekulare Wechselwirkungen, Strukturänderungen, chemische Reaktionen, Bindungen an Zellmembranen, fotophysikalische dynamische Eigenschaften und Transport- bzw. Strömungseigenschaften von Molekülen bzw. Proben zu analysieren.
Ein Anwendungsbereich für die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie ist die sogenannte Biochip-Mikroarray-Analyse. Biochips sind in unterschiedlichen Varianten betreffend die Anzahl an Messplatzpunkten verfügbar. So sind Biochips mit einigen wenigen Messplatzpunkten erhältlich, aber auch Biochips, bei denen bis zu 100 000 Messplatzpunkte vorgesehen sind. Die Messzeit zum Untersuchen bzw. Scannen eines Biochip-Mikroarrays mit konfokaler Fluoreszenz-Korrelationsspektrόskopie ist direkt proportional zur Anzahl der Messpunkte und kann einige Stunden betragen. Die Verwendung von CCD-Kameras mit einigen Tausend Detektorelementen kann das Zeitproblem der parallelen FCS-Detektion von Einzelmolekülen nicht lösen, da CCD-basierte Systeme eine vergleichsweise lange Auslesezeit für die Messergebnisse benötigen und daher dynamische Echtzeitmessungen (1 ns - 1 ms) nicht ohne weiteres ermöglichen. Es besteht somit Bedarf nach einer Parallel-(Multip!ex)-Messmethode mit schnell reagierenden, also quasi- Echtzeit-fähigen, wenig Platz beanspruchenden und vergleichsweise preis- werten Detektoreinrichtungen.
Ausgehend von einem Stand der Technik gemäß der WO 02/097406 liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Möglichkeit der Quasi-Parallelde- tektion von Lumineszenzereignissen aus mehreren konfokalen Volumen- elementen zu verbessern.
Hierzu wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, als Sensormatrixanordnung eine in IC-Technologie, insbesondere in CMOS-Technologie oder BICMOS- Technologie hergestellte und in einem Sensorchip in Geiger-Modus-Be- Schaltung integrierte Sensormatrix aus Avalanche-Fotodioden zum Auffangen der Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen zu verwenden, wobei gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung der Sensorchip bereits Signalverarbeitungs- und -auswerteschaltkreise integriert enthält. Dies sind insbesondere Schaltkreise zur Berechnung von Korrelationsfunktionen (Autokorrelation oder/und Kreuzkorrelation verschiedener Ordnungen) sowie deren Fouriertransformierte.
Der Sensorchip kann eine Vielzahl von Avalanche-Fotodioden in Geiger-Mo- dus-Beschaltung aufweisen, so dass bedarfsweise entsprechend viele konfokale Messvolumina parallel detektiert werden können. Aufgrund der IC-Integration, insbesondere CMOS-Integration der lichtempfindlichen Avalan- che-Fotodioden kann überdies erreicht werden, dass Exemplarstreuungen der einzelnen Fotodioden innerhalb des Chips vergleichsweise gering sind und somit die einzelnen integrierten Sensorelemente im Wesentlichen gleiche Detektionseigenschaften aufweisen. Testmessungen haben ergeben, dass ein Beispiel eines CMOS-Sensorchip der hier betrachteten Art nicht den von Fotomultipliern her bekannten Effekt von nachlaufenden Pulsen (after pulsing) zeigt, eine sehr kleine Dunkelzählrate von etwa 40 Hz und eine sehr kurze Totzeit von etwa 30 ns hat. Die integrierten Avalanche-Fotodioden haben eine sehr hohe Empfindlichkeit und sprechen bereits auf einzelne Photonen an. Sie erlauben Einzelmolekülnachweise in den einzelnen betrachteten konfokalen Volumenelementen nach der FCS-Methode.
Die Integration von elektronischen Elementen für den Geiger-Modus-Betrieb der Avalanche-Fotodioden sowie von Signalverarbeitungs- und -auswerte- schaltkreisen, insbesondere Korrelatoren, erlaubt extrem schnelle Messungen und einen Quasi -Echtzeit-Mess- und Auswertebetrieb.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es ferner möglich, zeitaufgelöste Messungen der Fluoreszenz durchzuführen und somit zeitkorrelierte Spektroskopie (time correlated spectroscopy) zu betreiben.
Die Bestrahlungseinrichtung umfasst vorzugsweise wenigstens eine Lichtquelle und wenigstens ein insbesondere diffraktives optisches Element zur Aufspaltung von hindurchtretendem Licht in multiple Strahlen. Alternativ kommen zur Strahlaufspaltung z. B. reflektive Strahlteiler, z. B. halbdurchlässige Spiegel, in Frage.
Die Bestrahlungseinrichtung kann ferner ein Lichtquellenarray, insbesonde- re Laserarray oder VCSEL-Array umfassen, welches schon originär multiple Strahlen bereitstellt.
Das Verfahren kann grundsätzlich nach den in EP 0679251 B1 oder in WO 02/097406 beschriebenen Methoden durchgeführt werden. Dabei erfolgt vorzugsweise die Messung von einem oder wenigen Analytmolekülen in einem Messvolumen, wobei die Konzentration der zu bestimmenden Analyt- moleküle vorzugsweise kleiner 10"6 Mol/I beträgt und das Messvolumen vorzugsweise kleiner 10"14 I ist. Es werden stoffspezifische Parameter bestimmt, die durch Lumineszenzmessung an den Analytmolekülen ermittelt werden. Auf Einzelheiten zu apparativen Details wird auf die Offenbarung in EP 0679251 B1 und WO 02/097406 verwiesen.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren insoweit entsprechend dem Verfahren nach der WO 02/097406 durchgeführt werden, als in bevor- zugten Ausgestaltungen des Verfahrens die lumineszierenden Moleküle aus lumineszenzmarkierten Nachweisreagenzien ausgewählt werden, die an einen in der Probe vorhandenen Analyten binden. Auch kann das Verfahren nach der Erfindung die Messung bzw. Bestimmung eines kreuzkorrelierten Signals umfassen, das von einem, mindestens zwei unterschiedliche Lu- minenzmarkierungen enthaltendem Komplex aus Analyt- und Nachweis- reagenz(ien) stammt
Die Molekülbestimmung kann die Messung eines von einem lumineszenzmarkierten Nachweisreagens stammenden Signals umfassen, wobei die Lu- mineszenzintensität oder/und -abklingzeit des Nachweisreagens bei Bindung an den Analyten verschieden von der Lumineszenzintensität oder/und Abklingzeit im nicht gebundenen Zustand ist. Dabei können die Unterschiede der Lumineszenzintensität oder/und -abklingzeit durch Quench- oder Energietransfervorgänge hervorgerufen werden.
Die Molekülbestimmung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ferner eine Nukleinsäure-Hybridisierung umfassen, wobei eine oder mehrere lumineszenzmarkierte Sonden an eine Zielnukleinsäure binden.
Die Molekülbestimmung kann eine Protein-Antikörper-Wechselwirkung umfassen, wobei die Antikörper in unterschiedlichen Lichtwellenlängen (Farben) ermittieren können. Die Signale werden dann bei der Signalver- arbeitung einer Kreuzkorrelation unterworfen.
Unter einem weiteren Aspekt kann die Molekülbestimmung eine enzyma- tische Reaktion umfassen.
Unter einem weiteren Aspekt kann die Molekülbestimmung eine Nukleinsäu- re-Amplifikation, insbesondere einen Thermocycling-Prozess umfassen.
Unter einem weiteren Aspekt kann die Molekülbestimmung eine Mutationsanalyse bei Nukleinsäuren umfassen.
Unter einem weiteren Aspekt kann die Molekülbestimmung eine Genexpressionsanalyse bei Nukleinsäuren umfassen.
Unter einem weiteren Aspekt kann die Molekülbestimmung die Messung einer temperaturabhängigen Schmelzkurve bei einer Nukleinsäure- Hybridisierung umfassen.
Unter einem weiteren Aspekt kann die Molekülbestimmung eine Partikel- Selektion umfassen.
Unter einem weiteren Aspekt kann die Molekülbestimmung eine Nukleinsäu- re-Sequenzierung umfassen. Der verwendete Träger kann gemäß einer Ausführungsform mehrere, insbesondere mindestens zehn und vorzugsweise mindestens 32 separate Behältnisse zur Aufnahme von Proben enthalten.
Alternativ kann die Probe in einer Mikrokanalstruktur bereitgestellt werden, wobei ein in der Probe vorhandener Analyt in der Mikrokanalstruktur vorzugsweise festgehalten wird.
Unter einem weiteren Aspekt kann es vorgesehen sein, dass ein in der Probe vorhandener Analyt einer Spaltungsreaktion unterzogen wird, wobei dem Analyten abgespaltene Fragmente bestimmt werden.
Der in der Probe vorhandene Analyt kann an ein Trägerpartikeb z.B. aus Kunststoff, Glas, Quarz, Metall oder Verbundwerkstoff, gekoppelt sein.
Ganz allgemein lässt sich das Verfahren nach der Erfindung anwenden, um lumineszierende Moleküle, insbesondere Einzelmoleküle, aus einer einzelnen Probe in den verschiedenen konfokalen Messvolumina - oder aus verschiedenen Proben in den konfokalen Messvolumina zu bestimmen. Die Paralleldetektion der Lumineszenzereignisse in mehreren Detektionsvolumi- na erlaubt ferner die Bestimmung der örtlichen Flussgeschwindigkeit (Geschwindigkeitsprofil) in einem Mikrokanal.
Ferner lässt sich das Verfahren zur Bestimmung von Einzelmolekülen in einer Strömung verwenden. Auch können mehrere Messpunkte in einem Probenvolumen durch mehrere Sensorelemente erfasst werden, wodurch die Detektionswahrscheinlichkeit in stark verdünnten Messproben erhöht werden kann.
Die erfindungsgemäß vorgeschlagene Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina umfasst: a) eine Trägeranordnung zur Aufnahme einer Probe, die zu bestimmende Moleküle enthält,
b) eine optische Anregungseinrichtung, welche multiple Lichtstrah- len bereitstellen kann, und insbesondere wenigstens ein diffrak- tives optisches Element zur Aufspaltung von hindurchtretendem Licht in multiple Strahlen, und eine Fokussieroptik zur Fo- kussierung von hindurchtretenden multiplen Lichtstrahlen in multiple konfokale Volumenelemente in dem jeweiligen Messvo- lumen zur Anregung von Lumineszenz in den multiplen konfokalen Volumenelementen aufweist,
c) eine optische Detektionseinrichtung zum Nachweis von Lumineszenz aus den konfokalen Volumenelementen, wobei die optische Detektionseinrichtung eine ortsauflösende, in IC-Technologie, insbesondere in CMOS-Technologie hergestellte und in einem Sensorchip in Geiger-Modus-Beschaltung integrierte Sensormatrix aus Avalanche-Fotodioden zum Auffangen von Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen umfasst, und
d) Signalverarbeitungs- und -auswertemittel zur Verarbeitung der von der Avalanche-Fotodiodenmatrix bereitgestellten Signale.
Wie schon oben angesprochen, ist es vorteilhaft, wenn die Signalverarbeitungs- und -auswertemittel in dem Sensorchip integriert sind, um Qua- si-Echtzeitmessungen durchführen zu können.
Als integrierte Signalverarbeitungs- und -auswertemittel kommen in Frage, Korrelatoren für Autokorrelationsbestimmungen oder/und ggf. Kreuzkorrelationsbestimmungen. Als Signalverarbeitungs- und -auswertemittel können Schaltkreise zur Durchführung schneller Fourier-Transformationen der Messsignale vorgesehen und in dem Sensorchip integriert sein. Die Korrela- torschaltkreise können in einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung nach dem "Multiple-Tau- bzw. Multiple-τ"-Prinzip Korrelationsoperationen ausführen. Zur Multiple-Tau-Technik kann z.B. auf Schätze!, K., "Correlation Techniques in Dynamic Light Scattering", Journal of Applied Physics B, 1987, S. 193-213, Schätze!, K., "New Concepts in Correlator Design", Proc. of the int. Phys. Conference, Ed. E. Hilger, 1985, Ser. 77, S. 175-184, Peters, R., Introduction to the Multiple Tau Correlation Technique, ALV GmbH, 1996, Schätze!, K., Drewel, M., und Stimac, S. "Photon Correlation Measure- ments at large Lag Times: Improving the Statistical Accuracy", Journal of Modern Optics, Vol. 35, Nr. 4, 1998, S. 711-718, verwiesen werden.
Als Lichtquelle kommt vorzugsweise ein Laser in Betracht. Als diffraktives optisches Element zur Strahlaufspaltung dient vorzugsweise ein dreidimensionales optisches Gitter, das hindurchtretendes Licht beugt und ein vorbestimmtes Beugungsmuster, umfassend multiple optische Foci, erzeugt. Gemäß einer Ausführungsform der Vorrichtung nach der Erfindung hat der Träger mehrere, vorzugsweise mindestens zehn, insbesondere mindestens 100 separate Behältnisse zur Aufnahme von Proben.
Gemäß einer anderen Ausgestaltung kann der Träger eine Mikrokanalstruktur mit einem oder mehreren Kanälen aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ferner die Verwendung eines CMOS-Sensorchips mit integrierten Avalanche-Fotodioden in Geiger-Mo- dus-Beschaltung für eine parallele Bestimmung von molekularen Wechselwirkungen in multiplen konfokalen Volumenelementen, insbesondere in einem Verfahren der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung nach der Erfindung. Fig. 2 zeigt schematisch ein bevorzugtes Beispiel für die Beschaltung eines Avalanche-Fotodiodenpixels in dem Sensorchip.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung nach der Erfindung.
Bei dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung nach der Erfindung ist als Lichtquelle ein mit einer Lichtwellenlänge von 532 nm emittierender Dioden-gepumpter Festkörperlaser vorgesehen, dessen Laserstrahl von der Strahlaufweitungsoptik 4 mit den optischen Elementen L1 und L2 aufgeweitet wird, so dass er das diffraktive optische Element 7 im Wesentlichen vollständig ausleuchtet. Unter Verwendung des Kollimators 6 mit den optischen Elementen L3 und L4 und des Mikroskopobjektivs 8 wird der aufgeweitete Laserstrahl in ein Muster multipler Foci aufgespalten und in die Probe (Flüssigkeitstropfen) bei 12 fokussiert. Die durch die fokussierten Teilstrahlen beleuchteten konfokalen Volumenelemente im Probenvolumen sind in der Fig. 1 nicht im Einzelnen dargestellt. Mit 14 ist in Fig. 1 ein di- chroitischer Spiegel bezeichnet, welcher das Anregungslicht in das Mikro- skopobjektiv 8 und somit zur Probe hin reflektiert. Die von den angeregten Molekülen in den konfokalen Volumina ausgehende Fluoreszenzemission wird über dasselbe Objektiv 8 gesammelt, so dass es durch den dichroi- tischen Spiegel 14 hindurch zu einem Bandpassfilter 16 gelangt. Das Bandpassfilter diskriminiert das Signallicht gegenüber Rayleigh-Streulicht und Raman-Streulicht. Das Fluoreszenzemissionslicht wird dann durch die Linsengruppe L5 und L6 hindurch auf den Sensorchip 20 geleitet. Der Sensorchip 20 ist ein CMOS-Chip mit einem integrierten Array von Avalanche- Fotodioden in Geiger-Modus-Beschaltung. Mit integriert sind elektronische Komponenten zum Betrieb der Avalanche-Fotodioden und zur Signalver- arbeitung, z.B. Quench-Widerstände, Transistoren, Korrelatoren und Rechenschaltkreise für weitere Signalverarbeitungsoperationen. Der Sensorchip 20 wird von einem Rechner 22 ausgelesen, wobei ggf. externe Auswertekomponenten 24 zwischen dem Rechner 22 und dem Sensorchip 20 zwischengeschaltet sein können.
In dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 1 ist der Probenbereich 12 als Tropfen auf einem Mikroskop-Deckglas 9 dargestellt.
Bei der Verwendung der Vorrichtung für die Durchführung eines Hochdurch- satz-Screening-Verfahrens kommt als entsprechender Probenträger 9 insbesondere eine Mikroarray-Struktur mit einer größeren Anzahl von separaten Probenbehältnissen, etwa 100 oder mehr separaten Probenbehält- nissen, in Frage, die durch Vertiefungen in einer Platte gebildet sind. Wenn die Zahl der Behältnisse innerhalb des Trägers größer als die Anzahl der durch das diffraktive optische Element erzeugten Teilstrahlen ist, kann der Träger in mehreren Schritten gescannt werden. Hierzu kann die Optik oder/und der Träger durch geeignete Maßnahmen für die einzelnen Schritte jeweils neu justiert werden.
Für andere Messaufgaben, etwa für die Einzelmolekül-Sequenzierung oder für die Einzelmolekül-Selektion kann ein Träger mit Mikrokanälen für das Probematerial Verwendung finden.
Fig. 2 zeigt schematisch und als Beispiel die elektrischen Komponenten eines CMOS-Fotodiodenpixels. Die Anoden aller Avalanche-Fotodioden AD sind mit einer hohen negativen Spannung VOP von z.B. -18.5 V vorgespannt. Der übrige Bereich des CMOS-Chips befindet sich elektrisch auf Po- tentialen zwischen Masse GND und der Versorgungsspannung VDD von beispielsweise 5 V.
Ein Pixel umfasst eine z.B. kreisförmige Avalanche-Fotodiode für Einzelpho- tonendetektion und einen Löschwiderstand bzw. Quench-Widerstand R von z.B. 270 kΩ, welcher in Reihe zwischen der Kathode der Avalanche-Fotodiode AD von der Versorgungsspannung VDD liegt. Die Durchbruchspannung der Diode AD beträgt z.B. 21 V. Die Diode AD ist somit mit einem Spannungswert von 2.5 V über der Durchbruchspannung vorgespannt. An jedem Pixelort ist ferner ein einfacher Komparator K auf der Basis eines Standard-Inverters implementiert. Die Gestaltung der Transistoren erlaubt das Setzen der Eingangsschwellwertspannung für das Umschalten auf Aus- gäbe auf 3 V. Solange keine Ladungsträger in die Multiplikationsregion der Diode AD gelangen, fließt kein Strom in die Fotodiode AD. Wenn ein Photon die Fotodiode AD trifft, wird der Avalanche-Lawineneffekt ausgelöst. Der Avalanche-Strom entlädt simultan die Dioden kapazität (und parasitäre Kapazitäten an dem Punkt A) und induziert einen Spannungsabfall über dem Widerstand R. Die Spannung über die Diode AD wird geringer. Die Spannung am Knotenpunkt A ändert sich von 5 V auf 2,5 V. Der Komparatorausgang wird daher auf VDD geschaltet. Der Avalanche-Strom wird in einigen Nanosekunden passiv gelöscht. Danach startet der Wiederauf- ladungsprozess mit einer Zeitkonstanten von etwa 30 ns.
Es wurde eine Totzeit von etwa 32 ns für das Sensorelement gemessen. Während des Entladens steigt die Spannung an dem Knotenpunkt A von 2,5 V auf VDD. Der Komparatorausgang wird auf Masse GND geschaltet. Der Ausgang des Komparators K ist mit einem Eingang des bei M gezeigten Multiplexers verbunden, dessen andere Eingänge von anderen Pixelelementen des Sensorarrays belegt sind und der Bestandteil einer einfachen Adressierschaltung ist. Die Multiplexerkomponenten N sind vorzugsweise in den Sensorchip 20 integriert. Anstelle des Quench-Widerstandes R kann in einer alternativen Ausführungsform der Pixel ein im Sättigungsbereich arbei- tender Transistor vorgesehen sein.
In einem Ausführungsbeispiel des Sensorchips 20 ist der fotosensitive Bereich einer jeweiligen Avalanche-Fotodiode etwa 30 μm2. Eine weitere Miniaturisierung ist möglich.
Fig. 3 zeigt in schematischer Darstellung den Aufbau eines weiteren Ausführungsbeispiels einer Vorrichtung nach der Erfindung. Elemente in Fig. 3, die Elementen in Fig. 1 von der Funktion her entsprechen, sind mit korrespon- dierenden Bezugszahlen gekennzeichnet, wobei zur weiteren Differenzierung in Fig. 3 den Bezugszahlen die Buchstaben a bzw. b nachgestellt sind.
Das Ausführungsbeispiel nach Fig. 3 eignet sich insbesondere zur Kreuzkorrelationsmessung bei Bestrahlung der Probe mit multiplen Strahlen unterschiedlicher Anregungswellenlängen und erlaubt eine bessere Detektions- spezifizität von Biomolekülen. Es kann sehr genau mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden, da nur Biomoleküle mit zweifacher Dye-Markierung bei der Kreuzkorrelationsoperation betrachtet werden.
Bei einer solchen Dual-Color-Kreuzkorrelationsanalyse werden die Dyes im Beispielsfall mittels zweier unterschiedlicher Laserwellenlängen angeregt. Auch eine Zweiphotonenanregung ist möglich.
Im Beispielsfall der Fig. 3 sind als Strahlungsquellen ein erster Laser 2a, z. B. ein Argonlaser, und ein zweiter Laser 2b, z. B. ein Helium-Neon-Laser, vorgesehen. In den optischen Strahlenlängen dieser Lichtquellen folgen eine jeweilige Strahlaufweitungsoptik 4a bzw. 4b sowie die Kollimatoren 6a bzw. 6b mit einem jeweiligen diffraktiven optischen Element 7a, 7b zur Aufspaltung der aufgeweiteten Laserstrahlen in ein jeweiliges Muster multipler Foci 10a, 10b. Die Teilstrahlen werden vermittels der Spiegel 14a, 14b zur Probe 12 geleitet, so dass sie in konfokale Volumenelemente im Probenbereich fokussiert werden. Bei 8 ist das betreffende Mikroskopobjektiv vorgesehen.
Die von den angeregten Molekülen in den konfokalen Volumina ausgehende Emissionsstrahlung wird über das Objektiv 8 gesammelt, so dass es von dem dichroitischen Spiegel 14c durch die Linse L hindurch zu dem Strahltei- ler (dichroitischer Spiegel) 14e gelangt. Die von dem Strahlteiler 14e weitergeleiteten Teilstrahlen gelangen durch die Bandpassfilter 16a bzw. 16b zu den Avalanchedioden-Sensorchips 20a bzw. 20b mit integrierter Auswerteelektronik. Der Steuerungs- und Auswertungsrechner, welcher Informa- tionen von den Elementen 20a, 20b erhält, ist in Fig. 3 nicht eingezeichnet.
Nachzutragen ist noch, dass die Teilstrahlen unterschiedlicher Wellenlängen im Probenbereich 12 in betreffenden konfokalen Volumina einander überlagern können. Zwei verschiedene Dyes, die als Marker an ein und demselben Molekül vorgesehen sind, können dann simultan zweifarbiges Fluoreszenzlicht emittieren, wenn die Moleküle das Messvolumen der einander überlagerten Foci durchqueren. Die betreffenden Signale der verschiedenen Wellenlängen können dann einer Kreuzkorrelation unterzogen wer- den, um z. B. Informationen über die Anzahl von zweifach markierten Biomolekülen in einem Probenvolumen zu erfassen usw.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, insbesondere FCS- Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Verfahren, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Probe (12) umfassend lumineszierende Moleküle, b) Bestrahlen der Probe (12) mit einer optischen Anregungseinrichtung (2, 4, 6, 8) umfassend wenigstens eine Bestrahlungseinrichtung zur Erzeugung von multiplen Strahlen und eine Fokussieroptik (8) zur Fokussierung von hindurchtretenden multiplen Lichtstrahlen in multiple konfokale Volumenelemente, c) Auffangen von Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen mittels einer ortsauflösenden Sensormatrixanordnung (20), wobei die Sensormatrixanordnung eine in IC- Technologie, insbesondere in CMOS-Technologie hergestellte und in einem Sensorchip (20) in Geiger-Modus-Beschaltung in- tegrierte Sensormatrix aus Avalanche-Fotodioden AD ist, und d) Verarbeiten der von der Avalanche-Fotodiodenmatrix bereitgestellten Signale mittels einer vorzugsweise in den Sensorchip integrierten Signalverarbeitungs- und -auswerteeinrichtung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bestrahlungseinrichtung mit wenigstens einer Lichtquelle und wenigstens einem insbesondere diffraktiven optischen Element zur Aufspaltung von hindurchtretendem Licht in multiple Strahlen verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Durchführung fluoreszenzkorrelations- spektroskopischer Untersuchungen an lumineszierenden Molekülen, wobei die Signalverarbeitung die Schritte der Autokorrelation oder/und der Kreuzkorrelation oder/und der schnellen Fourier-Transformation (FFT) von Messsignalen bzw. daraus abgeleiteten Informationen umfasst.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei Korrelationsschritte verschiedener Korrelationsordnungen zur Signalauswertung durchgeführt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Signalverarbeitung Korrelationsschritte nach dem Ein-Bit-Verfahren oder/und Korrelationsschritte nach dem 4X4-Bit-Verfahren umfasst.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Signalverarbeitung Korrelationsschritte nach dem Multi-τ-Verfahren umfasst.
7. Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen durch optische Anregung in konfokalen Messvolumina, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend: a) eine Trägeranordnung (9) zur Aufnahme einer Probe (12), die zu bestimmende Moleküle enthält, b) eine optische Anregungseinrichtung (2, 4, 6, 8) zur Bereitstellung multipler Lichtstrahlen und insbesondere umfassend wenigstens eine Lichtquelle (2), wenigstens ein passives oder aktives diffraktives optisches Element (7) zur Aufspaltung von hindurchtretendem Licht in multiple Strahlen und eine Fokussieroptik (8) zur Fokussierung von hindurchtretenden multiplen Lichtstrahlen in multiple konfokale Volumenelemente in dem jeweiligen Messvolumen zur Anregung von Lumineszenz in den multiplen konfokalen Volumenelementen, c) eine optische Detektionseinrichtung (20) zum Nachweis von Lumineszenz aus den konfokalen Volumenelementen, wobei die optische Detektionseinrichtung eine ortsauflösende in IC-Technologie, insbesondere in CMOS- Technologie hergestellte und in einem Sensorchip (20) in Geiger-Modus-Beschaltung integrierte Sensormatrix aus Avalanche-Fotodioden AD zum Auffangen von Emissionsstrahlung aus den multiplen konfokalen Volumenelementen umfasst, und d) Signalverarbeitungs- und -auswertemittel zur Verarbeitung der von der Avalanche-Fotodiodenmatrix (20) bereitge- stellten Signale.
8. Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen nach Anspruch 7, wobei die Signalverarbeitungs- und -auswertemittel in den Sensorchip (20) integriert sind.
9. Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Signalverarbeitungs- und -auswertemittel wenigstens einen Korrelator, vorzugsweise mehrere Korrelatoren, zur Durchführung von Signalkorrelationsoperatoren, insbesondere zur Bestimmung der Autokorrelationsfunktionen oder/und Kreuzkorrelationsfunktionen erster oder/und höherer Korrelationsordnungen von Messsignalen, umfasst.
10. Vorrichtung zur Bestimmung von lumineszierenden Molekülen nach einem der Ansprüche 7 - 9, wobei die Signalverarbeitungs- und -auswertemittel Schaltkreise zur Durchführung einer schnellen Fourier- Transformation der Messsignale umfassen.
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