WO2003027676A1 - Fluoreszenz-biosensorchip und fluoreszenz-biosensorchip-anordnung - Google Patents

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WO2003027676A1
WO2003027676A1 PCT/DE2002/002954 DE0202954W WO03027676A1 WO 2003027676 A1 WO2003027676 A1 WO 2003027676A1 DE 0202954 W DE0202954 W DE 0202954W WO 03027676 A1 WO03027676 A1 WO 03027676A1
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biosensor chip
electromagnetic radiation
fluorescence biosensor
wavelength range
fluorescence
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PCT/DE2002/002954
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Inventor
Meinrad Schienle
Ralf Brederlow
Franz Hofmann
Martin Jenkner
R. Johannes Luyken
Christian Paulus
Petra Schindler-Bauer
Roland Thewes
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Infineon Technologies Ag
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/064—Stray light conditioning
    • G01N2201/0642—Light traps; baffles

Definitions

  • the invention relates to a fluorescence biosensor chip and a fluorescence biosensor chip arrangement.
  • Bio and genetic engineering is to be able to detect biological molecules such as DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA, proteins, polypeptides etc.
  • biological molecules such as DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA, proteins, polypeptides etc.
  • DNA molecules deoxyribonucleic acid
  • detection methods are becoming increasingly important in the industrial identification and evaluation of new drugs of organic and genetic engineering origin. These detection methods open up diverse applications, for example in medical diagnostics, in the pharmaceutical industry, in the chemical industry, in food analysis as well as in environmental and food technology.
  • a DNA is a double helix, which is made up of two cross-linked helical single chains, so-called half-strands. Each of these half-strands has a base sequence, the genetic information being determined by means of the order of the bases (adenine, guanine, thymine, cytosine).
  • Half strands of DNA have the characteristic property of being very specific in binding only to very specific other molecules. It is therefore a prerequisite for docking a strand of nucleic acid to another strand of nucleic acid that the two molecules are complementary to one another.
  • the two molecules must clearly fit together like a key and the matching lock (so-called key-lock principle). This principle, given by nature, can be used for the selective detection of molecules in a liquid to be examined.
  • catcher molecules for example by means of microdispensing
  • catcher molecules are first applied and immobilized on a substrate made of a suitable material, ie are permanently fixed to the surface of the biochip sensor.
  • catcher molecules for example by means of microdispensing
  • it is known to immobilize biomolecules with thiol groups (SH groups) on gold surfaces.
  • Presence of DNA half-strands complementary to the capture molecules can be used.
  • the liquid to be examined for the presence of a specific DNA half-strand must be brought into active contact with the immobilized capture molecules.
  • the DNA half strand hybridizes to the catcher molecule, i.e. he is bound to it. If, as a result of this binding, the value of a physical variable that can be measured is changed in a characteristic manner, the value of this variable can be measured and the presence or absence of a DNA half-strand in a liquid to be examined can be detected in this way.
  • nucleic acids can be used as capture molecules for peptides or proteins that bind specifically to nucleic acids. It is also known to use peptides or proteins as capture molecules for other proteins or peptides that bind the capture peptide or capture protein. It is also important the use of low molecular weight chemical compounds as capture molecules for proteins or peptides that bind to these low molecular weight compounds. Low molecular weight chemical compounds are those chemical compounds that have less than about 1,700 daltons (molecular weight in grams per mole). Conversely, the use of proteins and peptides as capture molecules for low-molecular compounds which may be present in a liquid to be examined is also possible.
  • Electronic detection methods are known for the detection of the binding that has taken place between the capture molecule applied to the substrate and the molecule to be detected that is present in the liquid to be examined.
  • the value of the capacitance can be measured between two electrodes on which capture molecules are immobilized. If molecules to be detected hybridize with the capture molecules, the value of the capacity changes in a characteristic manner and the hybridization event can be detected by means of an electrical signal.
  • a DNA sensor is described for example in [1].
  • the detection sensitivity of such electronic detection methods for DNA molecules is limited. Problems also arise in such a way that sensitive biomolecules (e.g. DNA, proteins) can be decomposed if they come into direct contact with free electrical charges on the surface of electrodes. It is known that many proteins denature outside of a range of pH values characteristic of each protein.
  • a hybridization event can be detected optically when a hybridized molecule has a fluorescent dye capable of emitting fluorescent electromagnetic radiation in a characteristic wavelength range after the fluorescent dye has been excited by absorbing light of a primary wavelength range.
  • biomolecules to be detected containing analytes for example DNA half-strands, are to be coupled to a fluorescence marker via a suitable linker molecule.
  • the biomolecules to be detected fluorescence-labeled in this way have hybridized with the capture molecules immobilized on the sensor surface, and if light of a suitable wavelength is radiated, which can be absorbed by the fluorescence marker, then the irradiated light is absorbed by the fluorescence markers and light quanta of a different wavelength are re-emitted (resonance fluorescence) , The intensity of the fluorescent light re-emitted from the sensor surface is then a measure of the number of docked molecules to be detected.
  • the re-emitted fluorescent light basically has a longer wavelength (and lower energy) than the exciting primary light. This physical effect makes it possible to separate the fluorescent light from the exciting light by using suitable optical filters which absorb, reflect or transmit depending on the wavelength. If these filters are chosen appropriately, for the wavelength of the
  • the intensity of the fluorescent light to be detected is often several orders of magnitude lower than the intensity of the exciting primary light, which complicates the measurement of the fluorescent light and limits the detection sensitivity of the sensor.
  • the intensity of the fluorescent light should be quantitatively detectable over the largest possible range by means of the sensor (high dynamic range).
  • a good spatial resolution is required of a sensor arrangement, since the sensor elements of the arrangement are often equipped with different capture molecules in order to be able to simultaneously detect different molecules to be detected. High demands are therefore placed on the quality of the optics of a reading device.
  • Known readers typically use a laser scanner for excitation and a confocal microscope to detect the emitted light.
  • An optical edge filter is also inserted in the detection beam path, which suppresses the exciting wavelength ("long wave pass").
  • FIG. 1A shows a fluorescence biosensor chip 100 which is known from [2].
  • the fluorescence biosensor chip 100 has a light source 101 which emits light 100a
  • Wavelength range emitted The light 100a emitted by the light source 101 passes through the light source filter 102, as a result of which essentially monochromatic primary light falls on the biochip 103.
  • a biological sample is attached to the biochip 103, the biological molecules having a fluorescent marker.
  • the fluorescence markers of the biomolecules on the biochip 103 are set up in such a way that they absorb the light from the light source 101 transmitted through the light source filter 102. After the light has been absorbed, the fluorescent markers re-emit light of a second wavelength which differs from the wavelength of the incoming light. The re-emitted light has a longer wavelength than the primary light 100a (red shift). That from the fluorescent markers of the biomolecules on the biochip
  • the lens 104 which is set up such that it images the individual light signals in the correct location on the CCD sensor device 106.
  • the sensor filter 105 is set up in such a way that it is transparent to the wavelength of the re-emitted light, whereas it is transparent to the wavelength of the primary light.
  • the CCD sensor arrangement 106 (“Charge coupled device”) registers the fluorescence events on the biochip 103.
  • the adjustment of the fluorescent biosensor chip 100 which is complex due to the optics or the complicated measuring system, is complicated, which means that the user-friendliness of the Fluorescence biosensor chips 100 result. This is disadvantageous.
  • the fluorescence biosensor chip 100 is expensive because it has expensive individual components such as the CCD sensor arrangement 106.
  • a further fluorescence biosensor chip 110 is known from [3], [4] and is shown in FIG. IB.
  • the fluorescence biosensor chip 110 has a light source 111, which emits light purple of a primary wavelength range.
  • the light purple emitted by the light source 111 first passes through an optical element 112 and then through a light source filter 113.
  • the light source filter 113 is set up in such a way that it is only permeable to electromagnetic radiation of a certain wavelength or a certain wavelength range. That through that
  • Light source filter 113 transmitted light is deflected by means of an optical reflector element 114 and thereby passes into cavities 116 of a sample holder 115, in which the biological molecules to be examined are arranged. If a hybridization event has taken place in one of the cavities 116, ie if molecules having a fluorescence marker have hybridized with the capture molecules in one of the cavities 116, suitably chosen fluorescence markers can absorb the light from the light source 111 incident on the cavities 116 and shift them towards longer wavelengths Re-emit wavelength. The primary light and the re-emitted light arrive at the sensor filter 117, which is transparent to light of the wavelengths of the fluorescent radiation, whereas it is essentially impermeable to light of the wavelengths of the primary light.
  • the individual components of the fluorescence biosensor chip 110 can be assembled by the user. It is the spatial separation of the components that leads to a large spatial Expansion leads to a reduction, but the fluorescence biosensor chip 110 is not very easy to use. Furthermore, the fluorescence biosensor chip 110 is too expensive for many applications.
  • the fluorescence biosensor chips known from the prior art have a complicated structure and a complex structure, are large and therefore expensive. Furthermore, the fluorescence biosensor chips known from the prior art are sometimes not very user-friendly.
  • Another sensor chip is known from [5]. This has a photodiode manufactured according to the CMOS process and an integrated Fabry-Perot filter.
  • a Fabry-Perot filter is made up of two semitransparent mirrors which are arranged at a defined distance from one another, the inner surface of the first mirror ideally being totally reflective and the inner surface of the other mirror having a reflectivity only slightly below one. If incident light passes through the first mirror, the light is often reflected on the inner surface of the second mirror and then on the inner surface of the first mirror, then again on the inner surface of the second mirror, etc., with each reflection on the inner surface of the second A small proportion of the mirror is also transmitted through the second mirror. The transmitted individual beams interfere in such a way that the Fabry-Perot interferometer is only permeable to light of certain wavelengths.
  • the biosensor known from [5] is not intended for the detection of biological molecules.
  • a sensor arrangement known from [6].
  • a camera is known on the basis of photodiodes integrated in a substrate, an image point of the image to be recorded by the camera being composed of three photodiodes, which three photodiodes according to the RGB system with a red, a green and a blue Filters are covered.
  • [7] discloses a device and a method with a field light source array for integrated sample acquisition.
  • [8] discloses a method for producing a carrier coated with biologically or chemically functional materials.
  • [9] describes a light emission detection device which has an LCD matrix as a two-dimensional controllable light source and a CCD matrix opposite the LCD matrix for detecting the optical behavior of a respective sample substance located between the LCD matrix and the CCD matrix ,
  • a method and a device for spatially resolved fluorescence-optical detection of substances immobilized on a surface of a planar carrier are known from [10].
  • the amount of probes fixed on spots of a glass plate is determined by using fluorescent material to identify the probes to emit light.
  • the amount of sample hybridized with the probes is determined by causing fluorescent material to identify the sample to emit light.
  • [12] discloses an analysis substrate using the transmission of fluorescent light.
  • the invention is based on the problem of creating a less complex and therefore less expensive fluorescence biosensor chip.
  • the problem is solved by a fluorescence biosensor chip and a fluorescence biosensor chip arrangement with the features according to the independent patent claims.
  • a fluorescence biosensor chip has a substrate, at least one detection device arranged in or on the substrate for detecting electromagnetic radiation, an optical filter layer arranged on the substrate and an immobilization layer arranged on the optical filter layer for immobilizing
  • all components of the fluorescence biosensor chip are therefore integrated in the fluorescence biosensor chip. Because all components of the fluorescence biosensor chip are spatially very closely adjacent, the fluorescence biosensor chip has a very small size. This provides a very compact fluorescence biosensor chip.
  • Immobilization layer which according to the invention serves as a sensor level
  • the detection devices integrated in the substrate which serve for the indirect detection of hybridization events, are typically arranged on the order of magnitude less than 100 ⁇ m from one another, which results in a good spatial resolution of the fluorescence biosensor chip Has.
  • the fluorescence biosensor chip according to the invention is also designed such that it can be produced using standardized CMOS-compatible semiconductor technology processes. The development of expensive machines for producing the fluorescence biosensor chip is therefore unnecessary, as a result of which the fluorescence biosensor chip can be produced inexpensively and with little effort.
  • the individual components of the fluorescence biosensor chip can also be produced from inexpensive materials.
  • the substrate is preferably made of silicon material.
  • the substrate can be a silicon wafer.
  • the at least one detection device of the fluorescence biosensor chip according to the invention has at least one photodiode, which is set up in such a way that electromagnetic radiation of a first wavelength range can be detected.
  • the at least one detection device as a photodiode, which is integrated in the substrate, a sensitive and inexpensive to produce detector for electromagnetic radiation is provided.
  • the optical filter layer is preferably set up in such a way that the optical filter layer emits electromagnetic radiation from a second
  • the optical filter layer is clearly set up in such a way that it absorbs and / or reflects that part of the electromagnetic radiation incident on the surface of the optical filter layer that is to be shielded by the photodiode, since this electromagnetic radiation is not the radiation to be detected.
  • the first wavelength range in which the photodiode is sensitive to the detection of electromagnetic radiation, lies outside the second wavelength range, it is ensured that the electromagnetic radiation to be detected by the photodiode can at least partially penetrate the optical filter layer.
  • the absorption layer suppresses the irradiation of the photodiodes with electromagnetic radiation which is not to be detected by those hybridized on the immobilization layer
  • Molecules originate, for example, scattered light from the environment or primary light for exciting fluorescent markers of molecules to be detected that may be hybridized on the immobilization layer.
  • the Detection sensitivity of the fluorescence biosensor chip can be increased.
  • the optical filter layer preferably has at least one bandpass filter and / or at least one edge filter.
  • a band filter is further understood to mean an optical filter which is essentially opaque to electromagnetic radiation in a wavelength range between a lower limit wavelength and an upper limit wavelength, whereas the band filter is essentially transparent to electromagnetic radiation below the lower limit wavelength and above the upper limit wavelength ,
  • An edge filter is further understood to mean an optical filter that is essentially either opaque to electromagnetic radiation below a cutoff wavelength and is transparent to electromagnetic radiation above the cutoff wavelength, or that is opaque to electromagnetic radiation above a cutoff wavelength and for electromagnetic radiation below the cutoff wavelength is permeable.
  • Filter layer can be a dielectric interference filter with a layer sequence of at least two materials, wherein a first material has a high refractive index and a second material has a low refractive index.
  • the first material with a high refractive index is preferably one of the materials titanium oxide (Ti0 2 ), silicon nitride (Si 3 N, hafnium oxide (Hf0 2 ), zirconium oxide (Zr0 2 ), aluminum oxide (Al 2 0 3 ), polysilicon (polycrystalline silicon) or Indium tin oxide (ITO), but the first material can also be silicon dioxide (Si0 2 ).
  • the first material can be any mixture of the named or other materials, such that the first material has a suitable refractive index.
  • the use of most of the materials mentioned as the first material for the dielectric interference filter has the The advantage that layers of the materials mentioned can be applied using standardized CMOS processes. This has an advantageous effect on the cost of the fluorescence biosensor chip, since it enables the fluorescence biosensor chip to be produced using standardized and sophisticated methods.
  • the second material of the dielectric interference filter with a low refractive index is preferably silicon dioxide (Si0 2 ), which is also compatible with CMOS processes and thus the inexpensive and inexpensive manufacture of the
  • the second material can also be one of the materials titanium oxide (Ti0 2 ), silicon nitride (Si 3 N 4 ), hafnium oxide (Hf0 2 ), zirconium oxide (Zr0 2 ), aluminum oxide (Al 2 0 3 ), polysilicon (polycrystalline silicon) or indium -Tin Oxide (ITO).
  • the second material can be any mixture of the named or other materials, such that the second material has a suitable refractive index.
  • the materials of the dielectric filter of the fluorescence biosensor chip according to the invention are not restricted to the materials mentioned. Any other suitable material with a sufficiently high refractive index can be selected for the first material with a high refractive index, and any other suitable material with a sufficiently low refractive index can be selected for the second material with a low refractive index.
  • the dielectric interference filter for light between a first
  • Cut-off wavelength and a second cut-off wavelength should be as opaque as possible.
  • the interference filter should be set up in such a way that it has a transmission coefficient of ideally zero, realistically as close to zero as possible, for electromagnetic radiation with a wavelength above the lower limit wavelength and below the upper limit wavelength.
  • the dielectric interference filter for electromagnetic radiation with a wavelength below the lower limit wavelength or above that The upper limit wavelength should be as transparent as possible, ie have a transmission coefficient of ideally one for electromagnetic radiation of the wavelength ranges mentioned, realistically as close as possible to one.
  • the dielectric interference filter should have a large edge steepness, that is to say that the transmission coefficient should drop as suddenly as possible from one to zero at the lower limit wavelength and rise as suddenly as possible from zero to one at the upper limit wavelength.
  • the dielectric interference filter is preferably an arrangement of 31 layers with alternating high and low refractive index:
  • the layer thicknesses are given in quarters of optical wavelengths, i.e. in multiples and fractions of «/ 4.
  • the designation 0, 5H denotes a layer made of a high-index ("H" for "high") material, the thickness of which corresponds to half a quarter of the wavelength of the incident light in the medium passing through.
  • 0.5H therefore designates a «/ 8 layer made of the highly refractive material, where • is the quotient of the vacuum light wavelength and the refractive index of the medium.
  • the «/ 8-layer of the high-index material is followed by a * / 4-layer of the low-index material (" L “for” low “). This is followed by 14 • / 4 double layers of alternating high-index material and low-index material.
  • the layer arrangement is in turn closed off by a »/ 8 layer made of the highly refractive material.
  • the layer system described is composed of alternating layers of silicon dioxide material (low refractive index) and silicon nitride material (high refractive index).
  • the wavelength of the reflection maximum can be determined at a fixed angle of incidence of the light.
  • the dielectric interference filter made of 31 layers of silicon dioxide / silicon nitride, light in a wavelength range between approximately 350 nanometers and approximately 390 nanometers is reflected to more than 99%.
  • the optical filter layer of the fluorescence biosensor chip of the invention can also have at least one edge filter.
  • the edge filter is preferably a color filter made from an organic material.
  • Such color filters made of organic materials have a wavelength-dependent absorption coefficient.
  • Such color filters made of organic materials often do not have steep filter flanks, as are required for a large dynamic range, but such filters have the advantageous property of often not having a strong ripple, i.e. to have no oscillatory characteristics in the absorption coefficient-wavelength characteristic.
  • the use of edge filters is therefore particularly advantageous according to the invention if an edge filter is combined with a bandpass filter.
  • the suitable combination of at least one bandpass filter and / or at least one edge filter makes it possible to be able to adjust the absorption properties of the optical filter layer of the fluorescence biosensor chip of the invention flexibly to the needs of the individual case.
  • the optical filter layer can be simply designed.
  • the optical filter layer can be designed to optimize
  • the optical filter layer According to the invention, a desired balance between cost-effectiveness and accuracy of detection can be achieved.
  • the fluorescence biosensor chip preferably also has a circuit layer between the substrate and the optical filter layer, with the circuit layer at least one electrical component is integrated and the circuit layer is electrically coupled to the at least one detection device.
  • the circuit layer By arranging the circuit layer between the substrate and the optical filter layer, it is possible to manufacture the fluorescence biosensor chip with the circuit layer according to a standardized CMOS process. This contributes to the low cost of the fluorescence biosensor chip.
  • the circuit layer essentially serves to electrically read out a hybridization event detected by the detection devices on the immobilization layer. If a hybridization event occurs on the immobilization layer and an electromagnetic fluorescence signal is emitted in the direction of the photodiodes by the hybridized molecules to be detected, then charge separation takes place in the photodiodes, which can be read out electrically by means of the electronic components of the circuit layer.
  • the at least one detection device can be electrically controlled by means of the circuit layer.
  • each individual photodiode can be read out to determine whether it has an electrical signal due to a hybridization event on the immobilization layer.
  • the immobilization layer of the fluorescence biosensor chip has, for example, one or a combination of the materials silicon dioxide, silicon nitride, organic material and / or gold.
  • Catcher molecules are set up in such a way that a molecule which is complementary to the catcher molecule and can be detected can be coupled to the ready-to-bind catcher molecules.
  • the number of molecules to be detected can be greater than the number of molecules on the immobilization layer of a fluorescence biosensor chip immobilized capture molecules. If each of the capture molecules of a fluorescence biosensor chip has hybridized with a molecule to be detected, the fluorescence biosensor chip is in "saturation", ie it has no ready-to-bind
  • Capture molecules can in particular be nucleic acids (DNA or RNA), peptides, polypeptides, proteins or low molecular weight compounds. In chemistry, low-molecular compounds are understood to mean compounds with molecular masses of less than 1,700 daltons (molecular mass in grams per mole).
  • the material or materials from which the immobilization layer is made is or are matched to the capture molecules to be coupled.
  • the capture molecules are immobilized on the surface of the immobilization layer using the microdispensing technique. This automatically (“soap assembly” technique) forms bonds between the material of the immobilization layer and those end groups of the capture molecules which form a chemical bond with the material of the immobilization layer.
  • the material pair gold / sulfur has particularly advantageous properties, so that the connection of sulfur-containing groups (for example thiol end groups) of capture molecules with immobilization layers made of gold material is to be mentioned as a particularly advantageous combination.
  • the catcher molecules are very selective to very specific molecules to be detected which are complementary to the catcher molecules. In other words, only very specific, structurally appropriate molecules to be detected attach to a specific capture molecule. If different capture molecules are attached to the surface of the immobilization layer, a parallel analysis of different substances to be detected is possible.
  • the parallel analysis of different substances to be detected for example different DNA half strands or different proteins, has a time-saving effect and is particularly interesting for "high throughput screening" analyzes.
  • the analysis of a solution of an unknown composition can ideally be carried out in a single analysis step using the fluorescence biosensor chip according to the invention. Such a highly parallel analysis saves time.
  • Detection devices not only incident the light to be detected from the molecules to be detected hybridized with the capture molecules. Rather, stray light from the surroundings or primary light provided for exciting fluorescent markers also falls on the detection devices. This parasitic electromagnetic radiation falsifies the signal of the detection devices. It is therefore desirable to quantitatively measure the strength of this noise signal (or background signal) and to subtract it from the detected signals.
  • This can be achieved according to the invention in that a surface section of the immobilization layer is free of capture molecules, so that a noise signal can be removed from the at least one detection device arranged below this surface section.
  • the noise signal (also called background or background signal) can also be measured simultaneously by several detection devices, which further increases the sensitivity of the detection.
  • the molecules to be detected and / or the capture molecules preferably have a fluorescent marker, the fluorescent marker being set up in such a way that it emits electromagnetic radiation from a third
  • Wavelength range emitted at least part of the third wavelength range lying outside the fourth wavelength range, and at least part of the fourth wavelength range lying within the first wavelength range.
  • the fluorescence biosensor chip of the invention is described clearly below. If no molecules to be detected with fluorescent markers are attached to the capture molecules on the surface of the fluorescence biosensor chip, then externally irradiated light passes through the capture molecules and the immobilization layer essentially without weakening. However, the incident light is reflected by an appropriately selected filter layer and therefore does not reach the photodiodes integrated in the substrate.
  • the molecules to be detected can hybridize with the capture molecules arranged on the immobilization layer of the fluorescence biosensor chip if the capture molecules and the molecules to be detected are based on the key - Match the lock principle.
  • the hybridized molecules to be detected are provided with a suitable fluorescent marker.
  • the capture molecules can also be provided with a fluorescent marker. Fluorescence markers are groups of molecules that emit electromagnetic radiation from a particular
  • Absorb wavelength range (referred to above as the third wavelength range) and after absorption of another electromagnetic radiation Emit wavelength range (called fourth wavelength range above).
  • the fluorescence markers re-emit electromagnetic radiation with increased wavelengths compared to the incident light.
  • Fluorescence markers are usually coupled to molecules to be detected via so-called linker molecules, that is to say the molecule to be detected with molecules coupling to the fluorescence marker (or the capture molecule). If molecules to be detected with fluorescence markers coupled thereto hybridize to capture molecules immobilized on the surface of the immobilization layer, the fluorescence markers are spatially close to the immobilization layer.
  • this electromagnetic radiation can be absorbed by the fluorescent markers, provided that the electromagnetic radiation has at least one wavelength within the third wavelength range within which the fluorescent markers can absorb electromagnetic radiation.
  • the fluorescent markers are placed in an electronic excitation state, which is characterized by a medium lifespan.
  • the fluorescent markers re-emit electromagnetic radiation of a fourth wavelength range, the fourth wavelength range having more long-wave electromagnetic ones
  • Radiation has as the third wavelength range.
  • the light re-emitted by the fluorescent markers has a longer wavelength than the incident light.
  • the intensity of the re-emitted light is typically several orders of magnitude lower than the intensity of the incident light, which is provided, for example, by an external radiation source.
  • the fluorescent light of the fourth wavelength range and the non-absorbed externally incident light pass through the immobilization layer and reach the optical filter layer.
  • the optical filter layer is set up in such a way that the optical filter layer totally reflects electromagnetic radiation of a second wavelength range, at least one Part of the first wavelength range, in which the detection devices can detect electromagnetic radiation, lies outside the second wavelength range.
  • the second wavelength range in which the optical filter layer is totally reflected is set up according to the invention in such a way that the light incident from the outside is essentially reflected and that the light of the fourth wavelength range which is re-emitted by the fluorescent markers is transmitted essentially through the optical filter layer.
  • the electromagnetic radiation of the fourth wavelength range emitted by a fluorescent marker on a specific catcher molecule penetrates the optical filter layer and, ideally after passing through the essentially transparent circuit layer, reaches the photodiode in the substrate which is the smallest distance from the emitting fluorescent marker.
  • the photodiode which is set up in such a way that it can detect electromagnetic radiation of a first wavelength range, is suitable for detecting the electromagnetic fluorescence radiation of the fourth wavelength range, since the inventive one
  • Fluorescence biosensor chip is set up in such a way that at least part of the fourth wavelength range lies within the first wavelength range.
  • the photodiode is suitable for detecting the fluorescence radiation and is therefore suitable for the indirect detection of a
  • hybridization events can be detected by detecting fluorescent radiation, in that after molecules to be detected have been docked onto catcher molecules having fluorescent markers, the sensor level is brought into active contact with a substance that has been set up in such a way that catcher molecules having fluorescent markers without docked to be detected Molecules are detached from the sensor level, whereas catcher molecules with molecules attached to them remain attached to the sensor level even in the presence of the substance. After capture molecules having fluorescent markers are detached without molecules hybridized with them to be detected, only those capture molecules with fluorescent markers to which molecules to be detected are docked remain at the sensor level. These hybridization events are then based on the principle described above by detecting the
  • Fluorescent radiation of the fluorescent markers coupled to the capture molecules is detectable. According to the alternative concept described, it is not necessary to bind fluorescent markers to the molecules to be detected, instead the fluorescent markers can be bound to the capture molecules.
  • fluorescent markers can only be added after the hybridization events. If the fluorescent markers are set up in such a way that they only bind to capture molecules with molecules hybridized to them to be detected (e.g. only bind to double-stranded DNA), the intensity of the electromagnetic radiation emitted by the fluorescence markers is characteristic of the number of hybridization events that have taken place.
  • different fluorescent markers can also be used to detect different molecules with different fluorescent markers.
  • a parallel analysis is thereby possible, by means of which the different components of an analyte can be examined and quantified simultaneously.
  • coumarin (1,2-benzopyrone 2H-1-benzopyran-2-one, C 9 H 6 0 2 ) is used as the fluorescent marker.
  • the fluorescent dye coumarin has the property, when excited with electromagnetic radiation with a wavelength of 370 nanometers, in a wavelength range around 460 Nanometer around to re-emit electromagnetic fluorescent radiation.
  • the fluorescence marker coumarin thus ensures a sufficiently strong red shift of the re-emitted electromagnetic radiation, so that the exciting and emitted electromagnetic radiation can be easily separated from one another.
  • Any other suitable material such as FITC, Cy2, Alexa Fluor 488, BODIPY 493, Rhodamine 123, R6G, TET, JOE, HEX, BODIPY 530, Alexa 532, R-Phycoerythrin, TRITC, Cy3, TAMRA, Texas Red can also be used as fluorescent marker , ROX, BODIPY 630 and Cy5 can be used.
  • the surface of the fluorescence biosensor chip preferably has a matrix-like arrangement of individual sensor fields.
  • each individual sensor field can be read out individually by means of the circuit layer.
  • the sensor fields are arranged as densely as possible. This is advantageous for "high throughput screening" applications.
  • the dense arrangement of sensor fields is associated with the risk that optical crosstalk can occur from one sensor field to an adjacent sensor field.
  • the photodiodes integrated in the substrate map the immobilization layer with the capture molecules immobilized thereon in the correct position. As a result, a photodiode is essentially sensitive to the fluorescent radiation of those capture molecules which are arranged essentially above the photodiode.
  • Optical crosstalk is now understood to mean that electromagnetic fluorescent radiation from a fluorescent marker is not emitted onto the essentially underneath photodiode, but rather is emitted, for example, in the direction of another photodiode arranged to the left or right of this photodiode.
  • a hybridization event on a catcher molecule will be incorrectly detected by a photodiode that is not arranged below the catcher molecule.
  • possibilities are created according to the invention for optical crosstalk between neighboring ones To keep sensor fields low or to prevent them. This has the advantageous effect that a high integration density of sensors on the fluorescence biosensor chip is combined with reduced optical crosstalk.
  • At least one isolation trench for optically isolating adjacent detection devices is preferably introduced into at least one surface area of the fluorescence biosensor chip, which trench extends at least one isolation trench through the immobilization layer into a region of the optical filter layer stretches in such a way that a detection device is arranged below each area between two adjacent isolation trenches.
  • at least part of the surface of the at least one isolation trench is covered with a layer of an absorbent material or at least one of the trenches is filled with an absorbent material, the absorbent material being set up in such a way that at least electromagnetic radiation is generated by means of the absorbent material of the respective wavelength range or the respective wavelength ranges is absorbed or reflected.
  • fluorescence radiation is emitted from a fluorescence marker which is arranged essentially above a first photodiode in relation to the direction of incidence of light, in a direction in which not the underlying photodiode but an adjacent photodiode is arranged, then one can be used between the photodiodes suitably introduced and filled with an electromagnetic radiation absorbing material at least partially filled trench to prevent the electromagnetic fluorescent radiation from a fluorescence marker which is arranged essentially above a first photodiode in relation to the direction of incidence of light, in a direction in which not the underlying photodiode but an adjacent photodiode is arranged, then one can be used between the photodiodes suitably introduced and filled with an electromagnetic radiation absorbing material at least partially filled trench to prevent the electromagnetic fluorescent radiation from a
  • Fluorescence photodiode is detected. Instead of false detection, the fluorescent radiation is absorbed by the absorbent material in the trench. This reduces the risk of optical crosstalk. This is advantageous because it increases the detection sensitivity of the fluorescence biosensor chip and reduces the susceptibility to errors of the fluorescence biosensor chip.
  • Optical crosstalk can be further reduced by providing a barrier layer made of an absorbent material in at least one area of the circuit layer, such that a detection device is arranged below each area between two adjacent barrier layers, the absorbent material being set up in this way that it absorbs or reflects electromagnetic radiation of at least the respective wavelength range or the respective wavelength ranges.
  • the isolation trench is introduced, for example etched, into the immobilization layer and at least partially into the optical filter layer.
  • Fluorescence radiation which is re-emitted by a fluorescence marker at such an angle that the fluorescence radiation does not pass through the isolation trench on its way to a left or right of the photodiode arranged below the fluorescence marker, but through the circuit layer below the isolation trench is running, can be detected by a "wrong" photodiode despite the isolation trench.
  • barrier layers made of absorbent material can be introduced into the circuit layer as described above. These barrier layers have essentially the same function as the absorbent material in the isolation trenches, namely absorbing and / or reflecting fluorescent radiation on the way to a “wrong” photodiode. However, the barrier layer perceives this functionality in the circuit layer, whereas the isolation trenches this functionality in the immobilization layer and perceive in the optical filter layer.
  • the barrier layers in the circuit layer preferably fulfill a double function.
  • the absorbing and / or reflecting barrier layers if they are made of an electrically conductive material, can also perform the function of electronic components in the circuit layer.
  • the barrier layers can be used as electrical leads to the
  • the barrier layers are preferably metallic conductor tracks or through holes introduced into the circuit layer, which are filled with an electrically conductive and electromagnetic radiation absorbing / reflecting material.
  • optical crosstalk between neighboring sensor fields is further reduced, which increases the sensitivity of detection.
  • the double function of the barrier layer according to the invention as a means for reducing optical crosstalk on the one hand and as electrically integrated components on the other hand is economical and space-saving.
  • the invention also provides a fluorescence biosensor chip arrangement with a fluorescence biosensor chip and an electromagnetic radiation source.
  • the fluorescence biosensor chip has a substrate, at least one detection device arranged in or on the substrate for detecting electromagnetic radiation from a first
  • Wavelength range an optical filter layer arranged on the substrate for absorbing and / or reflecting electromagnetic radiation of a second wavelength range, an immobilization layer arranged on the optical filter layer for immobilizing capture molecules, the detection device, the filter layer and the immobilization layer in the fluorescence biosensor chip are integrated.
  • the electromagnetic radiation source is set up in such a way that by means of the electromagnetic radiation source Surface area of the fluorescence biosensor chip can be irradiated with electromagnetic radiation of a third wavelength range.
  • the fluorescence biosensor chip arrangement of the invention essentially has an electromagnetic radiation source.
  • the electromagnetic radiation source is intended to cover the surface area of the fluorescence biosensor chip with electromagnetic radiation from a third party
  • the electromagnetic radiation source is preferably a laser, a light-emitting diode, a gas discharge lamp or an incandescent lamp. If the electromagnetic radiation source is configured as a laser, this enables the surface of the fluorescence biosensor chip to be irradiated with monochromatic, narrow-band light. Monochromatic light can be easily filtered out by means of a filter layer, the optical absorption properties of which depend on the wavelength.
  • the fluorescence biosensor chip arrangement also has a large number of capture molecules which are coupled to the immobilization layer and which are set up in such a way that a molecule which is complementary to the capture molecule and can be detected can be coupled to the capture molecule.
  • the capture molecules are coupled to the immobilization layer as described above with reference to the fluorescence biosensor chip.
  • Each molecule to be detected also has a fluorescent marker, the fluorescent marker being such is set up so that it at least partially absorbs electromagnetic radiation of the third wavelength range and emits electromagnetic radiation of a fourth wavelength range after absorption, at least part of the third wavelength range lying outside the fourth wavelength range and at least part of the fourth wavelength range lying within the first wavelength range. In addition, at least part of the first wavelength range lies outside the second wavelength range.
  • the functionality of the fluorescence biosensor chip arrangement according to the invention is described in more detail below.
  • the surface of the fluorescence biosensor chip arrangement is irradiated with electromagnetic radiation of the third wavelength range by means of the electromagnetic radiation source.
  • the immobilization layer, on which capture molecules are immobilized, is located on the surface of the fluorescence biosensor chip arrangement of the invention.
  • a solution with molecules to be detected is brought into active contact with this active sensor surface. If the molecules to be detected in this solution are sufficiently complementary to capture molecules immobilized on the immobilization layer, the molecules to be detected are hybridized with the capture molecules.
  • the molecules to be detected are coupled to a fluorescence marker, for example, via a linker molecule, the fluorescence marker being set up in such a way that it at least partially absorbs electromagnetic radiation of the third wavelength range. Therefore, after the hybridization of the molecules to be detected to the capture molecules, the light emitted by the electromagnetic radiation source is absorbed by the fluorescent markers to the molecules to be detected.
  • the fluorescence markers are set up in such a way that after absorption of electromagnetic radiation of the third wavelength range, the fluorescence markers emit electromagnetic radiation of a fourth wavelength range, at least part of the third wavelength range outside the fourth Wavelength range. This means that the fluorescent radiation of the fluorescent markers is longer-wave than the previously absorbed radiation of the third wavelength range, which is provided by the electromagnetic radiation source.
  • the optical filter layer is set up such that electromagnetic radiation of the second wavelength range is absorbed and / or reflected by means of the optical filter layer.
  • the optical filter layer completely reflects or absorbs the electromagnetic radiation of the third wavelength range that comes from the external electromagnetic radiation source.
  • the optical filter layer ideally completely transmits the electromagnetic radiation of the fourth wavelength range, which originates from the fluorescence markers.
  • the optical filter layer is set up in such a way that it is completely transparent to the fluorescent light, whereas it is completely transparent to the light of the electromagnetic radiation source.
  • at least part of the fourth wavelength range, in which the fluorescent radiation of the fluorescent markers lies lies within the first wavelength range, within which the detection devices are capable of detecting electromagnetic radiation.
  • Embodiments of the fluorescence biosensor chip arrangement of the invention are described below, by means of which the detection sensitivity of the fluorescence biosensor chip arrangement can be increased.
  • the electromagnetic radiation source can preferably be aligned such that the electromagnetic radiation emitted by the electromagnetic radiation source is at a predeterminable angle to the normal direction of the optical filter layer.
  • the direction in which the electromagnetic radiation from the electromagnetic radiation source impinges on the catcher molecules can clearly be specified, for example by using an electromagnetic radiation source that generates a bundle of parallel light beams and by making this electromagnetic radiation source displaceable, rotatable, pivotable or tiltable ,
  • the part of the exciting light transmitted through the optical filter does not directly hit the photodiode which is arranged essentially below the absorbing and emitting fluorescent marker.
  • the interfering primary light which reduces the detection sensitivity of the fluorescence biosensor chip arrangement is partially “geometrically” shielded.
  • the obliquely incident exciting light can be isolated as described above by means of insulation Trenches and / or barrier layers may be shielded from detection.
  • shadow effects can advantageously be used are used to increase the detection sensitivity of the fluorescence biosensor chip arrangement.
  • the electromagnetic radiation source is set up in such a way that the electromagnetic radiation emitted by the electromagnetic radiation source is emitted in pulses and in which the detection devices are set up in such a way that the electromagnetic radiation emitted by the fluorescence markers is in the time intervals between the Pulses can be detected by means of the detection devices.
  • Absorb the exciting light has a finite, non-zero lifespan. If a short pulse of exciting light is radiated onto the fluorescent markers by means of the electromagnetic radiation source, the fluorescent markers are brought into an excited electron state by absorption of the light. Due to the high speed of light, the incident light not absorbed by the fluorescent markers reaches the detector devices almost instantaneously, the signal of which is not detected at this point in time. In other words, the detection devices are switched off during the pulse. After a time interval which essentially corresponds to the mean life of the excited electron state of the fluorescence marker, a time-delayed electromagnetic fluorescence wave is emitted by the fluorescence markers.
  • the time delay is in the order of magnitude of the natural lifespan of excited electron states (approximately microseconds to nanoseconds). If the measurement signal of the detection devices is only recorded after this time delay, the parasitic detection of exciting light is avoided and only fluorescent radiation is detected.
  • detection devices with sufficiently good time resolution should preferably be selected, for example photodiodes that have a time resolution in the sub-nanosecond range. through Suppression of the detection of the primary light increases the detection sensitivity of the fluorescence biosensor chip arrangement of the invention.
  • FIG. 1A shows a schematic view of a fluorescence biosensor chip according to the prior art
  • Figure IB is an exploded view of another
  • FIG. 2 shows a cross-sectional view of a fluorescence biosensor chip according to a first exemplary embodiment of the invention
  • FIG. 3 shows a cross-sectional view of a fluorescence biosensor chip according to a second exemplary embodiment of the invention
  • Figure 4 is a diagram that schematically shows the dependence of the
  • FIG. 5A shows a top view of a fluorescence biosensor chip according to a third exemplary embodiment of the invention
  • FIG. 5B shows an enlarged partial cross-sectional view along the section line II 'from FIG. 5A according to FIG third preferred embodiment of the fluorescence biosensor chip of the invention
  • Figure 6A is a circuit diagram with a control logic for controlling a sensor field according to a preferred
  • FIG. 6B shows an enlarged view of the control logic for controlling a sensor field in accordance with the preferred one
  • FIG. 7 shows a cross-sectional view of a fluorescence biosensor chip arrangement according to a preferred one
  • a fluorescence biosensor chip 200 according to a first exemplary embodiment of the invention is described below with reference to FIG. 2.
  • the fluorescence biosensor chip 200 has a substrate 201, at least one detection device 202 arranged in or on the substrate 201 for detecting electromagnetic radiation, an optical filter layer 203 arranged on the substrate 201 and an immobilization layer 204 arranged on the optical filter layer 203 to immobilize capture molecules.
  • the detection devices 202, the filter layer 203 and the immobilization layer 204 are integrated in the fluorescence biosensor chip 200, as shown in FIG. 2.
  • Substrate 201 made of silicon material.
  • six detection devices 202 are provided, whereby each of the six detection devices 202 is designed as a photodiode, which are set up in such a way that electromagnetic radiation from a first
  • Wavelength range is detectable.
  • adjacent detection devices 202 are arranged at a distance “d” from one another.
  • the distance “d” is therefore a measure of the one-dimensional spatial resolution of the fluorescence biosensor chip 200 according to the invention.
  • d 2 is a measure of the two-dimensional spatial resolution of the fluorescence biosensor chip 200 according to the invention, ie for the required surface of the fluorescence biosensor chip 200 pro sensor pixels.
  • the optical filter layer 203 is set up in such a way that the optical filter layer 203 absorbs electromagnetic radiation of a second wavelength range, at least part of the first wavelength range lying outside the second wavelength range.
  • the optical filter layer 203 is designed as an edge filter.
  • the edge filter 203 of the fluorescence biosensor chip 200 absorbs electromagnetic radiation below a cutoff wavelength.
  • the optical edge filter 203 is a color filter made of an organic material.
  • the optical filter layer 203 has a thickness “h”, which according to the exemplary embodiment described is of the order of magnitude of 70 micrometers.
  • the thickness “h” of that as an organic edge filter The optical filter layer 203 configured must be large enough to absorb as completely as possible such electromagnetic radiation that should not reach the detection devices 202, and the optical filter layer 203 designed as an organic edge filter should be chosen sufficiently thin to accommodate such electromagnetic radiation which should arrive at the detection devices 202 in order to be detected by the detection devices 202 to a sufficient extent.
  • the immobilization layer 204 shown in FIG. 2 is a thin gold layer.
  • the fluorescence biosensor chip 200 furthermore has a circuit layer 205 between the substrate 201 and the optical filter layer 203, at least one electrical component being integrated in the circuit layer 205, and the circuit layer 205 with the at least one detection Device 202 is electrically coupled.
  • the electrical components that are integrated in the circuit layer 205 are not shown in FIG. 2.
  • the circuit layer 205 is set up in such a way that the detection devices 202 can each be individually electrically controlled by means of the circuit layer 205.
  • the circuit layer 205 has MOS transistors for selecting one of the detection devices 202, which are electrically conductive
  • the circuit layer 205 has a thickness “1”, which according to the exemplary embodiment described is approximately five micrometers.
  • the thickness “1” should be selected to be sufficiently small or the materials should be selected appropriately be that losses due to absorption of electromagnetic radiation to be detected in the circuit layer 205 are low.
  • the fluorescence biosensor chip 200 also contains a multiplicity of capture molecules 206 which are coupled to the immobilization layer 204 and which are set up in such a way that a molecule 207 to be detected which is complementary to the capture molecule 206 can be coupled to each of the capture molecules 206 ready for binding.
  • the capture molecules 206 shown in Fig. 2 are DNA strands.
  • Each molecule 207 to be detected has a fluorescent marker 208.
  • the fluorescence markers 208 are set up in such a way that the fluorescence markers 208 absorb electromagnetic radiation of a third wavelength range and, after absorption has taken place, emit electromagnetic radiation of a fourth wavelength range.
  • the fluorescent label 208 shown in Fig. 2 is coumarin. In that shown in Fig. 4
  • the diagram shows the emission spectrum of coumarin after the fluorescent dye coumarin has been excited with electromagnetic radiation with a wavelength of 370 nanometers.
  • electromagnetic radiation with a wavelength of 370 nanometers.
  • This emission spectrum corresponds to the fourth wavelength range defined above.
  • Fluorescence biosensor chips 200 not only in active contact with molecules 207 to be detected, which are coupled to a fluorescence marker 208. Furthermore, molecules 209 are also in active contact with the catcher molecules 206 on the surface of the immobilization layer 204. These molecules 209 are also coupled to fluorescent markers 210, which however differ from the fluorescent markers 208 coupled to the molecules 207 to be detected in that the fluorescent markers 210 in other Wavelength ranges absorb or fluoresce as the fluorescent markers 208 of the molecules 207 to be detected. In contrast to the molecules 207 to be detected, which are complementary to the catcher molecules 206 and are consequently attached to the catcher molecules, the molecules 209 are not complementary to the catcher molecules 206 and are therefore not able to hybridize with the capture molecules 206.
  • the functionality of the fluorescence biosensor chip 200 is described below.
  • the fluorescence biosensor chip 200 is brought into contact with a solution which, among other things, contains the molecules 207 to be detected with fluorescent markers 208 coupled to them via linker molecules.
  • Molecules 207 complementary to the catcher molecules 206 hybridize with the catcher molecules 206. If appropriate, a suitable rinsing or washing step is carried out.
  • the hybridization event can be detected by irradiation of electromagnetic radiation of the third wavelength range in which the fluorescent markers 208 absorb.
  • the fluorescent markers 208 After absorption has taken place, the fluorescent markers 208 re-emit light of a fourth wavelength range, the re-emitted light being longer-wavelength than the absorbed light. Both the incident light and the fluorescent light pass through the essentially transparent immobilization layer 204 and reach the optical filter layer 203.
  • the optical filter layer 203 designed as an organic edge filter is designed as a blocking filter for the exciting light wavelength (third wavelength range). That is, the light of the incident wavelength is essentially completely absorbed by the optical filter layer 203, whereas the fluorescent light of the fourth wavelength range is transmitted essentially unattenuated by the optical filter layer 203.
  • the fluorescent light After passing through the essentially transparent circuit layer 205, the fluorescent light preferably reaches that of the photodiodes 202, which is arranged essentially below the fluorescent marker 208 from which the fluorescent light was emitted.
  • the photodiodes 202 are set up such that electromagnetic radiation of the first wavelength range can be detected.
  • Fluorescence radiation is within the first wavelength range, the photodiode 202 is able to detect the fluorescence light. This on the one hand detects a hybridization event, on the other hand the intensity of the detected fluorescent light is a measure of the number of molecules attached, i.e. for the degree of complementary action between capture molecules 206 and molecules 207 to be detected.
  • Photodiodes 202 have a very high dynamic range, a high detection sensitivity can be achieved with the fluorescence biosensor chip according to the invention.
  • a high dynamic range is understood to mean that the detector can measure electromagnetic fluorescence radiation of a large intensity range.
  • the spatial resolution of the fluorescence biosensor chip 200 is not achieved, as in the prior art, by means of lens optics, but rather by means of electrical selection of a sensor region on the immobilization layer 204, which is essentially arranged above a specific photodiode 202.
  • a surface section 211 of the immobilization layer 204 is free of capture molecules 206, so that a noise signal can be removed from the at least one reference detection device 202a arranged below this surface section 211. Since no catcher molecules are immobilized on the surface of the immobilization layer 204 above the reference detection device 202a, this can
  • Detection device 202a removes that noise signal or background signal or zero signal which originates from the parasitic electromagnetic radiation and which has to be subtracted from the signals of all other detection devices 202 in order to obtain a signal which is proportional to the intensity of the fluorescent light. This subtraction is carried out by means of an electronic differential circuit.
  • a fluorescence biosensor chip 300 according to a second exemplary embodiment of the invention is described with reference to FIG. 3.
  • the fluorescence biosensor chip 300 has a substrate 301, a detection device 302 arranged in the substrate for detecting electromagnetic radiation, an optical filter layer 303 arranged on the substrate 301 and one arranged on the optical filter layer 303
  • Immobilization layer 304 for immobilizing capture molecules.
  • the detection device 302, the filter layer 303 and the immobilization layer 304 are integrated in the fluorescence biosensor chip 300.
  • the functionality of the fluorescence biosensor chip 300 largely corresponds to that of the fluorescence biosensor chip 200, which is described above with reference to FIG. 2. Therefore, only those features are discussed at this point that are configured differently from the fluorescence biosensor chip arrangement 200 in the fluorescence biosensor chip arrangement 300.
  • the optical filter layer 303 is designed as a band filter.
  • the exact structure of the optical filter layer 303 is described below with reference to FIG. 4.
  • the detection device 302 is designed as a photodiode 302, which is integrated in the substrate 301. As shown in FIG. 3, further integrated circuit elements 304 are introduced into the substrate 301.
  • the silicon dioxide region 304a serves to electrically isolate adjacent photodiodes 302.
  • the n-doped silicon regions 304b, 304c are part of the control electronics with which a specific photodiode 302 can be controlled.
  • the substrate 301 is a p-doped silicon substrate.
  • a circuit layer 306 is arranged between the substrate 301 and the optical filter layer 303, at least one electrical component 306a being integrated in the circuit layer 306, and the circuit layer 306 being electrically coupled to the detection device 302 , As shown in FIG. 3, the integrated circuit elements 306a form a transistor-like arrangement together with the n-doped silicon regions 304b, 304c and the p-doped silicon substrate 301, the detection device 302 being electrically controllable by means of this transistor-like arrangement is.
  • a large number of capture molecules are immobilized on the immobilization layer 305, of which only one capture molecule 307 is shown in FIG. 3 for reasons of simplicity.
  • the capture molecule 307 shown in FIG. 3 is a DNA half-strand, the bases 307a of which are shown schematically in FIG. 3.
  • a molecule 308 which is complementary to the catcher molecule 307 and is to be detected is coupled to the catcher molecule 307.
  • the molecule 308 to be detected has a fluorescent marker 309.
  • the catcher molecule 307 and the molecule 308 to be detected are two mutually complementary DNA half-strands.
  • Electromagnetic radiation of a third wavelength range 310 which is provided, for example, by an external electromagnetic radiation source (not shown in FIG. 3), impinges on the fluorescent marker 309 and is partially absorbed by it.
  • the fluorescence marker 309 re-emits electromagnetic fluorescence radiation of a fourth wavelength range 311, some of the emitted
  • Fluorescence radiation reaches the fluorescence biosensor chip 300.
  • the electromagnetic radiation of the fourth wavelength range 311 strikes the filter layer 303, which is set up in such a way that the electromagnetic Radiation of the fourth wavelength range 311 is at least partially transmitted through the filter layer 303. As shown in FIG. 3, this part reaches the photodiode 302 and is detected there.
  • the electromagnetic radiation of the fourth wavelength range 310 is largely reflected on the optical filter layer 303. In the ideal case, this means that no electromagnetic radiation of the third wavelength range 310 reaches the photodiode 302.
  • Wavelength range 311 penetrates to the detection device 302, whereas the primary light of the third wavelength range 310 does not penetrate to the detection device 302.
  • the optical filter layer 303 is designed as a bandpass filter, which is a dielectric interference filter with a layer sequence of two materials, a first material having a high refractive index and a second material having a low refractive index.
  • the first material with a high refractive index is silicon nitride and the second material with a low refractive index is silicon dioxide.
  • the dielectric interference filter according to the described preferred exemplary embodiment has 31 alternating layers of alternating silicon dioxide and silicon nitride.
  • the present dielectric interference filter is described by the following nomenclature:
  • H is a layer made of the high-index material
  • the layer thicknesses are given in multiples of * / 4 (•: light wavelength in the medium). With * / 4 the fourth part of the light wavelength in the medium is meant, ie the quotient of the light wavelength in vacuum and the refractive index of the respective medium.
  • the filter layer according to the invention has a "/ 8 layer of the high-index material, a" / 4 layer of the low-index material, 14 double layers, each of the double layers consisting of a • / 4 plate of the high-index material and a • / 4- Platelet of the low-index material is built up, as well as a »/ 8-layer of the high-index material.
  • Interference filter with a wavelength dependence of the transmission as shown in Fig. 4, obtained.
  • a dielectric interference filter configured in this way reflects electromagnetic radiation in the wavelength range between 350 nanometers and 390
  • the wavelength of the reflection maximum i.e. of the transmission minimum in FIG. 4
  • the wavelength of the reflection maximum can be set at a fixed angle of incidence of the electromagnetic radiation by adjusting the layer thickness of the individual layers of the dielectric interference filter. Since the calculated transmission has a pronounced transmission minimum in a relatively wide wavelength range between 350 nanometers and 390 nanometers, depending on the wavelength, as shown in FIG. 4, such a filter is also suitable for suppressing the exciting light of broadband excitation sources such as e.g. LEDs are suitable. If spectrally even wider light sources are to be used, for example also at light wavelengths below the left flank at 350
  • an additional filter is required to filter out electromagnetic radiation in the lower wavelength range. This can be implemented, for example, by means of a suitable edge filter.
  • the emission spectrum of coumarin is also drawn as a dashed line, as is obtained after excitation of the dye with electromagnetic radiation of the wavelength 370 nanometers.
  • the emission spectrum of coumarin is relatively broadband, the left flank of the emission spectrum of coumarin is clearly longer-wave than the right limit of the wavelength range in which the optical filter described above reflects almost totally.
  • the long-wave passband of the dielectric interference filter should be made as flat as possible, i.e. it is particularly advantageous to ensure an approximately constant and as high a transmission as possible over the entire fluorescence range of the dye. This can be done by varying the layer thicknesses of the dielectric filter layer and the materials used for this.
  • the dielectric interference filter described is suitable for the fluorescence biosensor chip according to the invention if coumarin is used as the fluorescence marker.
  • the transmission of the dielectric interference filter described is greater than 75% above approximately 415 nanometers and greater than 92% above 450 nanometers.
  • the fluorescent light of the dye coumarin is only slightly weakened when it passes through the optical filter layer.
  • the greatest possible steepness i.e. a sudden increase from a transmission zero to a transmission one
  • FIGS. 5A, 5B The fluorescence biosensor chip 500 shown in FIGS. 5A, 5B is described below.
  • FIG. 5A shows a top view of the fluorescence biosensor chip 500
  • FIG. 5B shows a cross-sectional view of part of the fluorescence biosensor chip 500 shown in FIG. 5A along the section line II '.
  • the fluorescence biosensor chip 500 shown in FIGS. 5A, 5B is a third preferred exemplary embodiment of the fluorescence biosensor chip according to the invention and differs only in some aspects from the previously described fluorescence biosensor chips 200, 300. Furthermore, the complete functionality of the Fluorescence biosensor chips 500 explained, rather only the supplementary features compared to the previously described exemplary embodiments will be discussed.
  • FIG. 5B shows a fluorescence biosensor chip 500 with a substrate 501, at least one detection device 502 arranged in or on the substrate 501 for detecting electromagnetic radiation, an optical filter layer 503 arranged on the substrate 501 and one on the optical filter layer 503 arranged immobilization layer 505 for immobilizing capture molecules.
  • the detection devices 502, the optical filter layer 503 and the immobilization layer 505 are integrated in the fluorescence biosensor chip 500.
  • the substrate 501 is a p-doped silicon substrate.
  • the detection devices 502 are silicon photodiodes integrated in the substrate 501.
  • the optical filter layer 503 is, according to the exemplary embodiment described with reference to FIGS. 5A, 5B, a dielectric interference filter.
  • Immobilization layer 505 is a thin layer of gold.
  • silicon dioxide regions 504 are introduced into the substrate 501.
  • a circuit layer 504 is also arranged between the substrate 501 and the optical filter layer 503, at least one electrical component 506a being integrated in the circuit layer 504 and the circuit Layer 504 is electrically coupled to the at least one detection device 502. This coupling is explicitly shown in Fig. 5B.
  • the integrated circuit elements 506a which are shown in FIG. 5B, are electrically conductive connection means which enable the silicon photodiodes 502 to be coupled to control electronics.
  • the fluorescence biosensor chip 500 also has a multiplicity of capture molecules 507 which are coupled to the immobilization layer 505 and which are set up in such a way that a molecule 508 which is complementary to the capture molecule 507 and can be detected can be coupled to the capture molecule 507.
  • the reference number 507a denotes the individual bases which are those which are designed as a DNA half-strand
  • molecules 508 to be detected which are complementary to the DNA half strands 507, also DNA half strands, are on capture molecules
  • the molecules to be detected are also 508 DNA half strands, the molecules to be detected also have
  • Fluorescence markers 509 are coupled to the molecules 508 to be detected.
  • At least one isolation trench 510 for optically isolating neighboring detection devices 502 is introduced into at least one surface area of the fluorescence biosensor chip 500, which at least one isolation trench 510 extends through the immobilization layer 505 into a region of the optical filter layer 503 extends in such a way that a detection device 502 is arranged below each area between two adjacent isolation trenches 510.
  • the at least one isolation trench 510 is covered with a layer of an absorbent material 511, the absorbent material 511 being set up in such a way that it absorbs electromagnetic radiation.
  • the isolation trench 510 and the absorbent material introduced into the isolation trench 510 511 is explained below with reference to FIG. 5B and in particular the electromagnetic fluorescence radiation 512 schematically shown therein, which is emitted by the fluorescence marker 509 arranged on the left in FIG. 5B.
  • the various detection devices 502 in the substrate 501 correspond to the sensor pixels on the surface of the immobilization layer 505.
  • all those capture molecules 507 immobilized on the surface of the immobilization layer 505 belong to the detection device 502 which Is arranged substantially below this capture molecule 507.
  • the left detection device 502 is provided for the detection of fluorescent radiation which the left immobilized on the surface of the immobilization layer 505
  • Capture molecule 507 runs out.
  • the right-hand detection device 502 shown in FIG. 5B serves for the detection of fluorescence radiation which originates from a fluorescence marker 509 which is bound to a molecule 508 to be detected, which molecule 508 is docked to a capture molecule 507 which is essentially above the right detection device 502.
  • the left fluorescent marker 509 emits electromagnetic fluorescent radiation 512.
  • this fluorescence radiation which is an indirect consequence of a hybridization event on the left capture molecule 507 arranged on the surface of the immobilization layer 505, should be detected by the left detection device 502.
  • the electromagnetic fluorescent radiation 512 is emitted in such a direction that it is not emitted onto the left detection device 502 shown in FIG. 5B, but rather towards the right detection device 502.
  • Fluorescence radiation 512 detected by the right detection device 502 this would falsify the measurement. This phenomenon is referred to as optical crosstalk between two adjacent sensor fields belonging to the left and right detection devices 502, respectively. With the isolation trench 510 partially filled with the absorbent material 511, the undesired phenomenon of optical crosstalk is reduced.
  • the electromagnetic fluorescent radiation 512 is emitted in the direction of the right silicon photodiode 502 shown in FIG. 5B, but this electromagnetic fluorescent radiation 512 must pass the isolation trench 510 and on the way to the right silicon photodiode 502 pass through the partially filled absorbent material 511.
  • the absorbent material 511 is set up in such a way that electromagnetic radiation is thereby absorbed, in particular in the wavelength range of the fluorescent radiation of the fluorescent markers 509 used.
  • the electromagnetic fluorescent radiation 512 is absorbed in the absorbent material 511 in the isolation trench 510 and therefore cannot reach the right detection device 502 shown in FIG. 5B. This reduces optical crosstalk between neighboring sensor fields.
  • the isolation trenches 510 filled with an absorbent material 511.
  • the fluorescence radiation 513 is likewise not emitted in the direction of the detection device 502 which is essentially below it, but rather in the direction of the detection device 502 arranged to the left of the fluorescence marker 509. Due to the geometric conditions shown in FIG. 5B, the electromagnetic fluorescence radiation 513 is not emitted by absorbent material 511 in isolation trench 510.
  • a barrier layer 514 made of an absorbent material is arranged in at least one area of the circuit layer 504, such that a detection device 502 is arranged below each area between two adjacent barrier layers 514, the absorbent material is set up so that it absorbs electromagnetic radiation.
  • the integrated circuit elements 506a can also take on the function of the absorbent barrier layer 514.
  • the integrated circuit elements 506a are to be produced from a material that absorbs and / or reflects electromagnetic radiation.
  • the integrated circuit elements 506a can therefore perform a double function: on the one hand they can serve as electronic circuit elements, on the other hand they can help to reduce the phenomenon of optical crosstalk.
  • FIG. 5A shows a plan view of the fluorescence biosensor chip 500 according to the described exemplary embodiment of the invention.
  • the isolation trench 510 which according to the exemplary embodiment shown is designed as a coherent isolation region, is shown in FIG. 5A.
  • the individual sensor fields 515, 516 which are defined by the regions between the isolation trenches 510 and which are covered with catcher molecules 507, are shown in FIG. 5A.
  • FIG. 5A An essentially matrix-shaped arrangement of sensor fields 601 is shown in FIG. 6A.
  • the representation selected in FIG. 6A essentially corresponds to the representation of the fluorescence biosensor chip 500 in FIG. 5A. Not shown in Fig. 5A and in Fig. 6A in
  • the circuitry is shown in detail, by means of which each of the sensor fields 601 of the fluorescence biosensor chip 600 can be controlled.
  • the controllability of a specific row and the controllability of a specific column of the sensor fields 601 arranged in the form of a matrix is realized by means of the control circuit 602.
  • each individual sensor field 601 can be controlled by means of the row selection lines 603 and the column selection lines 604.
  • the number of row selection lines 603 (six in the example) and column selection lines 604 (six in the example) depends on the number of sensor fields 601. If the number of columns in the sensor field is 2 m , 2 m row selection lines 603 are required. If the number of columns of the sensor fields 601 is 2 n , 2n column selection lines 604 are required for the sequential activation of all columns.
  • the individual row select lines 603 are partially interdependent.
  • Row select lines 603 are labeled ZI, ZI, Z2, Z2, Z3 and
  • Row selection lines 603 Z2 and Z2 at mutually complementary values.
  • the row selection lines 603 Z3 and Z3 are also at mutually complementary values.
  • Sl, Sl, S2, S2, S3 and S3 are designated.
  • the signals at Sl and Sl are always on complementary logic
  • the signals at S2 and S2 are always at mutually complementary values and the signals at S3 and S3 are always at mutually complementary values.
  • Each of the sensor fields 601 is coupled to three of the six row selection lines 603 according to the exemplary embodiment shown in FIG. 6A and is three to the one according to the embodiment shown in
  • the selected sensor array 601a is coupled to first, second and third row select lines 603a, 603b and 603c.
  • the first row selection line 603a is ZI
  • the second row selection line 603b is Z2
  • the third row selection line 603c is Z3.
  • the selected sensor array 601a is coupled to a first, a second and a third column selection line 604a, 604b, 604c. Referring to Figure 6A, these are the first Column selection line 604a S1, the second column selection line 604b S2 and the third column selection line 604c
  • FIG. 6B schematically indicates with two arrows with the reference numeral 606 that the photodiode 605 is set up in such a way that electromagnetic fluorescent radiation can be detected. If electromagnetic radiation 606 arrives at the photodiode 605, the electrical properties of the photodiode 605 change in a characteristic manner and an electrical signal is present at the source of a first transistor 607a coupled to the photodiode 605. This signal can only pass the first transistor 607a if a voltage signal is present at the gate region of the first transistor 607a and therefore a conductive channel is formed between the source region and the drain region, i.e. when on the first column select line 604a
  • Signal with a logical value "1" is present, that is, when a signal with a logical value "1" is present at S1. If this is the case, the electrical signal of the photodiode 605 can pass from the source region to the drain region of the transistor 607a and from there to the source region of the second transistor 607b.
  • Transistor 607b is present can only reach the drain region of the second transistor 607b if a voltage signal is present at the gate region of the second transistor 607b and a conductive channel is therefore formed between the source region and the drain region, ie if the electrical signal applied to the second column selection line 604b has a logic value "1", that is to say if a signal having a logic value "1" is applied to S2. In this case, the electrical signal passes from the source region of the second transistor 607b to the drain region of the second transistor 607b and from there to the source region of the third transistor 607c.
  • the electrical signal present at the source region of the third transistor 607c can only reach the drain region of the third transistor 607c if a voltage signal is present at the gate region of the third transistor 607c and therefore between the source region and the drain -A region is formed a conductive channel, ie when on the third
  • the electrical node 608 shown in FIG. 6B is coupled to the source region of a fourth transistor 609a.
  • the electrical signal present at the source region of the fourth transistor 609a can only then go to the drain region of the fourth transistor
  • the drain region of the fifth transistor 609b arrive when the second row selection line 603b coupled to the gate region of the fifth transistor 609b is occupied with an electrical signal with a logic value "1". This means that at the second designated Z2 Line selection line 603b an electrical signal with a logic value "1" must be present. In this case, the electrical signal present at the source region of the fifth transistor 609b reaches the drain region of the fifth transistor 609b and from there to the source region of the sixth transistor 609c coupled to it.
  • the electrical signal present at the source region of the sixth transistor 609c can only reach the drain region of the sixth transistor 609c if a voltage signal is present at the gate region of the sixth transistor 609c and therefore between the source region and the Drain area a conductive channel is formed, ie when an electrical signal with a logic value "1" is present on the third line selection line 603c, that is, when an electrical signal with a logic value "1" is present at Z3. Only in this
  • the electrical signal present at the source region of the sixth transistor 609c can reach the drain region of the sixth transistor 609c. If this condition is also fulfilled, the second row of sensor fields 601 belonging to the selected sensor field 601a is selected.
  • the selected sensor field 601a is therefore selected if and only if on the first column selection line 604a S1 and on the second column selection line 604b S2 and on the third column selection line 604c S3 and on the first
  • Row selection line 603c Z3 each an electrical Signal with a logic value "1" is present. If there is also an electrical signal with a logic value "0" only on one of the six mentioned selection lines 603a, 603b, 603c, 604a, 604b, 604c, the corresponding sensor field is not selected. If both the row and the column of the selected sensor field 601a are selected, the electrical signal detected by the photodiode 605 arrives at the means for detecting the electrical current 610 or at the means for detecting the electrical voltage 611. This results in a specific selected sensor field 601a can be selected and the strength of the electrical sensor signal applied to the detection device 605 of the selected sensor field 601a can be read out.
  • FIG. 7 shows a preferred exemplary embodiment of a fluorescence biosensor chip arrangement 700, which is explained in more detail below.
  • the fluorescence biosensor chip arrangement 700 has a fluorescence biosensor chip 700a and an electromagnetic radiation source 705.
  • the fluorescence biosensor chip 700a has a substrate 701, six detection devices 702 arranged in the substrate 701 for detecting electromagnetic radiation of a first wavelength range, an optical filter layer 703 arranged on the substrate 701 for absorbing and / or reflecting electromagnetic radiation of a second wavelength range and an immobilization layer 704 arranged on the optical filter layer 703 for immobilizing capture molecules.
  • the detection devices 702, the optical filter layer 703 and the immobilization layer 704 are integrated in the fluorescence biosensor chip 700a.
  • the electromagnetic radiation source 705 is set up in such a way that a surface area of the fluorescence biosensor chip 700a can be irradiated with electromagnetic radiation of a third wavelength range by means of the electromagnetic radiation source 705.
  • the fluorescence biosensor chip 700a has a circuit layer 706 which is between the Substrate 701 and the optical filter layer 703 is arranged.
  • the electromagnetic radiation source 705 is a laser.
  • the fluorescence biosensor chip 700a has a multiplicity of catcher molecules 707, which are coupled to the immobilization layer 704 and which are set up in such a way that the catcher molecules 707 are attached molecule 708 which is complementary to the catcher molecule 707 can be coupled.
  • Each molecule 708 to be detected has a fluorescence marker 709 which is set up in such a way that it at least partially absorbs electromagnetic radiation of the third wavelength range and, after absorption, emits electromagnetic radiation of a fourth wavelength range. At least part of the third wavelength range lies outside the fourth wavelength range and at least part of the fourth wavelength range lies within the first wavelength range. At least part of the first wavelength range lies outside the second wavelength range.
  • molecules 710 with fluorescent markers 711 which are not complementary to the catcher molecules 707 and therefore do not couple to them.
  • circuit layer 206 capture molecule 207 molecule to be detected

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Fluoreszenz-Biosensorchip und eine Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung. Der Fluoreszenz-Biosensorchip weist auf ein Substrat, mindestens eine in oder auf dem Substrat angeordnete Detektions-Einrichtung zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung, eine auf dem Substrat angeordnete optische Filterschicht, eine auf der optischen Filterschicht angeordnete Immobilisierungs-Schicht zum Immobilisieren von Fängermolekülen, wobei die Detektions-Einrichtung, die optische Filterschicht und die Immobilisierungs-Schicht in dem Fluoreszenz-Biosensorchip integriert sind. Die Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung weist einen Fluoreszenz-Biosensorchip und eine elektromagnetische Strahlungsquelle auf.

Description

Beschreibung
Fluoreszenz-Biosensorchip und Fluoreszenz-Biosensorchip- Anordnung
Die Erfindung betrifft einen Fluoreszenz-Biosensorchip und eine Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung .
Die Bio- und Gentechnologie hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Eine Grundtechnik in der
Bio- und Gentechnologie ist es, biologische Moleküle wie DNA (Desoxyribonukleinsäure) oder RNA, Proteine, Polypeptide etc. nachweisen zu können. Vor allem Biomoleküle, in denen Erbgutinformation kodiert ist, insbesondere DNA-Moleküle (Desoxyribonukleinsäure) sind für viele medizinische Anwendungen von großem Interesse. Daher erlangen Nachweisverfahren zunehmende Bedeutung bei der industriellen Identifikation und Bewertung von neuen Medikamenten organischer und gentechnolgischer Herkunft. Diese Nachweisverfahren eröffnen vielfältige Anwendungen beispielsweise in der medizinischen Diagnostik, in der Pharmaindustrie, in der chemischen Industrie, in der Lebensmittelanalytik sowie in der Umwelt- und Lebensmitteltechnik.
Eine DNA ist eine Doppelhelix, die aus zwei vernetzten wendeiförmigen Einzelketten, sog. Halbsträngen, aufgebaut ist. Jeder dieser Halbstränge weist eine Basensequenz auf, wobei mittels der Reihenfolge der Basen (Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin) die Erbinformation festgelegt ist. DNA- Halbstränge weisen die charakteristische Eigenschaft auf, sehr spezifisch nur mit ganz bestimmten anderen Molekülen eine Bindung einzugehen. Daher ist es für das Andocken eines Nukleinsäurestrangs an einen anderen Nukleinsäurestrang Voraussetzung, dass die beiden Moleküle zueinander komplementär sind. Anschaulich müssen die beiden Moleküle zueinander passen wie ein Schlüssel und das dazu passende Schloss (sog. Schlüssel-Schloss-Prinzip) . Dieses von der Natur vorgegebene Prinzip kann zum selektiven Nachweis von Molekülen in einer zu untersuchenden Flüssigkeit verwendet werden. Die Grundidee eines auf diesem Prinzip basierenden Biochip-Sensors besteht darin, dass auf einem Substrat aus einem geeigneten Material zunächst sogenannte Fängermoleküle (z.B. mittels Mikrodispensierung) aufgebracht und immobilisiert werden, d.h. an der Oberfläche des Biochip- Sensors dauerhaft fixiert werden. In diesem Zusammenhang ist es bekannt, Biomoleküle mit Thiol-Gruppen (SH-Gruppen) an Gold-Oberflächen zu immobilisieren.
Ein solcher Biochip-Sensor mit einem Substrat und daran gebundenen Fängermolekülen, die beispielsweise auf einen bestimmten nachzuweisenden DNA-Halbstrang sensitiv sind, wird üblicherweise zum Untersuchen einer Flüssigkeit auf das
Vorhandensein von zu den Fängermolekülen komplementären DNA- Halbsträngen verwendet werden. Hierzu ist die auf das Vorhandensein eines bestimmten DNA-Halbstrangs zu untersuchende Flüssigkeit mit dem immobilisierten Fängermolekülen in Wirkkontakt zu bringen. Sind ein
Fängermolekül und ein zu untersuchender DNA-Halbstrang zueinander komplementär, so hybridisiert der DNA-Halbstrang an dem Fängermolekül, d.h. er wird daran gebunden. Wenn infolge dieser Bindung sich der Wert einer messtechnisch erfassbaren physikalischen Größe in charakteristischer Weise ändert, so kann der Wert dieser Größe gemessen werden und auf diese Weise das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines DNA-Halbstrangs in einer zu untersuchenden Flüssigkeit nachgewiesen werden.
Das beschriebene Prinzip ist nicht auf den Nachweis von DNA- Halbsträngen beschränkt. Vielmehr sind weitere Kombinationen von auf dem Substrat aufgebrachten Fängermolekülen und zu erfassenden Molekülen in einer zu untersuchenden Flüssigkeit bekannt. So können beispielsweise Nukleinsäuren als Fängermoleküle für Peptide oder Proteine, die nukleinsäurespezifisch binden, verwendet werden. Weiterhin bekannt ist, Peptide oder Proteine als Fängermoleküle für andere, das Fängerpeptid bzw. das Fängerprotein bindende Proteine oder Peptide zu verwenden. Von Bedeutung ist ferner die Verwendung von niedermolekularen chemischen Verbindungen als Fängermoleküle für an diese niedermolekularen Verbindungen bindende Proteine oder Peptide . Niedermolekulare chemische Verbindungen sind solche chemischen Verbindungen, die weniger als etwa 1.700 Dalton (Molekulargewicht in Gramm pro Mol) aufweisen. Umgekehrt ist auch die Verwendung von Proteinen und Peptiden als Fängermoleküle für eventuell in einer zu untersuchenden Flüssigkeit vorhandene niedermolekulare Verbindungen möglich.
Zum Nachweis der erfolgten Bindung zwischen dem auf dem Substrat aufgebrachten Fängermolekül und dem in der zu untersuchenden Flüssigkeit vorhandenen, zu erfassenden Molekül sind elektronische Nachweisverfahren bekannt. So kann beispielsweise der Wert der Kapazität zwischen zwei Elektroden gemessen werden, an denen Fängermoleküle immobilisiert sind. Hybridisieren nachzuweisende Moleküle mit den Fängermolekülen, so verändert sich der Wert der Kapazität in charakteristischer Weise und das Hybridisierungsereignis kann mittels eines elektrisches Signal nachgewiesen werden. Ein derartiger DNA-Sensor ist beispielsweise in [1] beschrieben. Allerdings ist die Nachweisempfindlichkeit solcher elektronischer Nachweismethoden für DNA-Moleküle begrenzt. Auch treten Probleme dergestalt auf, dass empfindliche Biomoleküle (z.B. DNA, Proteine) zersetzt werden können, wenn sie in direkten Kontakt mit freien elektrischen Ladungen an der Oberfläche von Elektroden gelangen. Es ist bekannt, dass viele Proteine außerhalb eines für jedes Protein charakteristischen Bereichs von pH-Werten denaturieren.
Alternativ werden optische Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von nachzuweisenden Molekülen verwendet. Die Detektion eines Hybridisierungsereignisses kann auf optische Weise erfolgen, wenn ein hybridisiertes Molekül einen Fluoreszenzfarbstoff mit der Fähigkeit aufweist, elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung in einem charakteristischen Wellenlängenbereich zu emittieren, nachdem der Fluoreszenzfarbstoff mittels Absorption von Licht eines primären Wellenlängenbereichs angeregt worden ist. Die im Analyten enthaltenen nachzuweisenden Biomoleküle, beispielsweise DNA-Halbstränge, sind hierfür über ein geeignetes Linker-Molekül mit einem Fluoreszenzmar er zu koppeln. Haben die auf diese Weise fluoreszenzmarkierten nachzuweisenden Biomoleküle mit den auf der Sensoroberfläche immobilisierten Fängermolekülen hybridisiert, und wird Licht einer geeigneten Wellenlänge eingestrahlt, das von dem Fluoreszenzmarker absorbierbar ist, so wird das eingestrahlte Licht von den Fluoreszenzmarkern absorbiert und Lichtquanten einer anderen Wellenlänge reemittiert (Resonanzfluoreszenz) . Die Intensität des von der Sensoroberfläche reemittierten Fluroreszenz-Lichtes ist dann ein Maß für die Zahl der angedockten nachzuweisenden Moleküle. Das reemittierte Fluoreszenzlicht hat grundsätzlich eine längere Wellenlänge (und niedrigere Energie) als das anregende Primärlicht. Dieser physikalische Effekt macht eine Trennung des Fluoreszenzlichtes vom anregenden Licht mittels Verwendung geeigneter optischer Filter möglich, die wellenlängenabhängig absorbieren, reflektieren bzw. transmittieren. Werden diese Filter geeignet gewählt, um für die Wellenlänge des
Primärlichtes undurchlässig zu sein, dagegen aber für die Wellenlänge des reemittierten Lichtes durchlässig zu sein, so ist ein Nachweis des reemittierten Lichtes mittels hinter dem Filter angeordneten Detektoren möglich.
Häufig ist die Intensität des nachzuweisenden Fluoreszenzlichtes einige Größenordnungen geringer als die Intensität des anregenden Primärlichtes, was die messtechnische Erfassung des Fluoreszenzlichtes erschwert und die Nachweisempfindlichkeit des Sensors begrenzt. Ferner soll mittels des Sensors die Intensität des Fluoreszenzlichtes über einen möglichst großen Bereich quantitativ erfassbar sein (hoher Dynamikbereich) . Darüber hinaus wird von einer Sensoranordnung eine gute Ortsauflösung verlangt, da häufig die Sensorelemente der Anordnung mit unterschiedlichen Fängermolekülen ausgestattet sind, um simultan unterschiedliche nachzuweisende Moleküle nachweisen zu können. An die Qualität der Optik eines Auslesegerätes sind daher hohe Anforderungen gestellt. Bei bekannten Auslesegeräten werden typischerweise ein Laserscanner zur Anregung und ein konfokales Mikroskop zum Detektieren des emittierten Lichtes verwendet. In den Detektionsstrahlengang ist ferner ein optisches Kantenfilter eingefügt, das die anregende Wellenlänge unterdrückt ("long wave pass" ) .
In Fig. 1A ist ein Fluoreszenz-Biosensorchip 100 gezeigt, der aus [2] bekannt ist. Der Fluoreszenz-Biosensorchip 100 weist auf eine Lichtquelle 101, die Licht 100a eines breiten
Wellenlängenbereichs emittiert. Das von der Lichtquelle 101 emittierte Licht 100a tritt durch das Lichtquellenfilter 102 hindurch, wodurch im Wesentlichen monochromatisches Primärlicht auf den Biochip 103 einfällt. Auf dem Biochip 103 ist eine biologische Probe angebracht, wobei die biologischen Moleküle einen Fluoreszenzmarker aufweisen. Die Fluoreszenzmarker der Biomoleküle auf dem Biochip 103 sind derart eingerichtet, dass sie das durch das Lichtquellenfilter 102 transmittierte Licht der Lichtquelle 101 absorbieren. Nach erfolgter Absorption des Lichts reemittieren die Fluoreszenzmarker Licht einer zweiten Wellenlänge, die sich von der Wellenlänge des eintreffenden Lichtes unterscheidet. Das reemittierte Licht ist langwelliger als das Primärlicht 100a (Rotverschiebung) . Das von den Fluoreszenzmarkern der Biomoleküle auf den Biochip
103 reemittierte Licht trifft auf die Linse 104, die derart eingerichtet ist, dass sie die einzelnen Lichtsignale ortsrichtig auf die CCD-Sensoreinrichtung 106 abbildet. Bevor das Licht auf die CCD-Sensoreinrichtung 106 trifft, tritt es durch das Sensorfilter 105 hindurch. Das Sensorfilter 105 ist derart eingerichtet, dass es für die Wellenlänge des reemittierten Lichtes durchlässig ist, wohingegen es für die Wellenlänge des Primärlichts undurchlässig ist. Die CCD- Sensoranordnung 106 ("Charge coupled device") registriert die Fluoreszenzereignisse auf dem Biochip 103. Allerdings ist die aufgrund der Optik bzw. des komplizierten Messsystems erforderliche Justage des apparativ aufwändigen Fluoreszenz- Biosensorchips 100 kompliziert, woraus eine verbesserungsbedürftige Benutzerfreundlichkeit des Fluoreszenz-Biosensorchips 100 resultiert. Dies ist nachteilhaft. Ferner ist der Fluoreszenz-Biosensorchip 100 teuer, da er teure Einzelkomponenten wie die CCD- Sensoranordnung 106 aufweist.
Aus [3], [4] ist ein weiterer Fluoreszenz-Biosensorchip 110 bekannt, der in Fig. IB gezeigt ist. Der Fluoreszenz- Biosensorchip 110 weist eine Lichtquelle 111 auf, die Licht lila eines primären Wellenlängenbereiches emittiert. Das von der Lichtquelle 111 emittierte Licht lila tritt zunächst durch ein optisches Element 112 und anschließend durch ein Lichtquellenfilter 113 hindurch. Das Lichtquellenfilter 113 ist derart eingerichtet, dass es nur für elektromagnetische Strahlung einer bestimmten Wellenlänge oder eines bestimmten Wellenlängenbereichs durchlässig ist. Das durch das
Lichtquellenfilter 113 transmittierte Licht wird mittels eines optischen Reflektorelements 114 umgelenkt und gelangt dadurch in Kavitäten 116 eines Probenhalters 115, in der die zu untersuchenden biologischen Moleküle angeordnet sind. Hat in einer der Kavitäten 116 ein Hybridisierungsereignis stattgefunden, d.h. haben einen Fluoreszenzmarker aufweisende Moleküle mit den Fängermolekülen in einer der Kavitäten 116 hybridisiert, so können geeignet gewählte Fluoreszenzmarker das auf die Kavitäten 116 einfallende Licht der Lichtquelle 111 absorbieren und mit einer zu größeren Wellenlängen hin verschobenen Wellenlänge reemittieren. Das Primärlicht und das reemittierte Licht gelangen auf das Sensorfilter 117, das für Licht der Wellenlängen der Fluoreszenz-Strahlung durchlässig ist, wohingegen es für Licht der Wellenlängen des Primärlichts im Wesentlichen undurchlässig ist. Daher gelangt im Idealfall ausschließlich das Fluoreszenzlicht auf die Photodetektoren 118 auf dem Biochip 119. Ein Signal auf den Photodetektoren 118 ist nur dann erfassbar, wenn auf der einem Photodetektor 118 räumlich entsprechenden Kavität ein Hybridisierungsereignis stattgefunden hat. Wie in Fig. IB durch die gepunkteten Linien angedeutet, sind die Einzelkomponenten des Fluoreszenz-Biosensorchips 110 vom Benutzer zusammenbaubar. Zwar ist damit die räumliche Trennung der Bauelemente, die zu einer großen räumlichen Ausdehnung führt, verringert, jedoch weist der Fluoreszenz- Biosensorchip 110 einen geringen Bedienungskomfort auf. Ferner ist der Fluoreszenz-Biosensorchip 110 für viele Anwendungen zu teuer .
Die aus dem Stand der Technik bekannten Fluoreszenz- Biosensorchips weisen einen komplizierten Aufbau und eine komplexe Struktur auf, sind groß und damit teuer. Ferner sind die aus dem Stand der Technik bekannten Fluoreszenz- Biosensorchips teilweise nicht sehr benutzerfreundlich.
Aus [5] ist ein weiterer Sensorchip bekannt. Dieser weist eine gemäß dem CMOS-Prozess hergestellte Photodiode und ein integriertes Fabry-Perot-Filter auf. Ein Fabry-Perot-Filter ist aus zwei teildurchlässigen Spiegeln aufgebaut, die in einem definierten Abstand voneinander angeordnet sind, wobei die Innenfläche des ersten Spiegels idealerweise totalreflektierend ist und die Innenfläche des anderen Spiegels eine Reflektivität nur wenig unterhalb von eins aufweist. Tritt einfallendes Licht durch den ersten Spiegel hindurch, so wird das Licht an der Innenfläche des zweiten Spiegels und anschließend an der Innenfläche des ersten Spiegels, dann wieder an der Innenfläche des zweiten Spiegels usw. vielfach reflektiert, wobei bei jeder Reflektion an der Innenfläche des zweiten Spiegels auch ein geringer Anteil durch den zweiten Spiegel transmittiert wird. Die transmittierten Einzelstrahlen interferieren derart, dass das Fabry-Perot-Interferometer nur für Licht bestimmter Wellenlängen durchlässig ist. Der aus [5] bekannte Biosensor ist allerdings nicht zum Nachweis biologischer Moleküle vorgesehen.
Selbiges gilt für eine aus [6] bekannte Sensoranordnung. Aus [6] ist eine Kamera auf der Basis von in einem Substrat integrierten Photodioden bekannt, wobei ein Bildpunkt des von der Kamera aufzuzeichnenden Bildes aus drei Photodioden zusammengesetzt ist, welche drei Photodioden gemäß dem RGB- System mit einem roten, einem grünen und einem blauen Filter bedeckt sind. Aus [7] ist eine Vorrichtung und ein Verfahren mit Feldlichtquellenarray für eine integrierte Probenerfassung bekannt .
[8] offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines mit biologisch oder chemisch funktionellen Materialien beschichteten Trägers.
In [9] ist eine Lichtemissions-Detektionsvorrichtung beschrieben, die eine LCD-Matrix als zweidimensionale steuerbare Lichtquelle und eine der LCD-Matrix zugewandt- gegenüberliegende CCD-Matrix zur Detektion des optischen Verhaltens einer jeweiligen zwischen LCD-Matrix und CCD- Matrix befindlichen Probensubstanz aufweist.
Aus [10] sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zum ortsaufgelösten fluoreszenzoptischen Nachweis von auf einer Oberfläche eines planaren Trägers immobilisierten Substanzen bekannt .
Bei einem aus [11] bekannten Hybridisierungs- Detektionsverfahren wird die Menge von auf Spots einer Glasplatte fixierten Sonden ermittelt, indem Fluoreszenzmaterial zum Identifizieren der Sonden zum Emittieren von Licht gebracht wird. Die Menge von mit den Sonden hybridisierter Probe wird ermittelt, indem Fluoreszenzmaterial zum Identifizieren der Probe zum Emittieren von Licht gebracht wird.
[12] offenbart ein Analyse-Substrat unter Verwendung der Übertragung von Fluoreszenzlicht.
Aus [13] ist ein Verfahren und eine Einrichtung zur Bestimmung von Substanzen, wie z.B. DNA-Sequenzen, in einer Probe, bekannt.
Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, einen weniger aufwändigen und somit kostengünstigeren Fluoreszenz- Biosensorchip zu schaffen. Das Problem wird durch einen Fluoreszenz-Biosensorchip und eine Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst.
Ein Fluoreszenz-Biosensorchip weist ein Substrat, mindestens eine in oder auf dem Substrat angeordnete Detektions- Einrichtung zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung, eine auf dem Substrat angeordnete optische Filterschicht und eine auf der optischen Filterschicht angeordnete Immobilisierungs-Schicht zum Immobilisieren von
Fängermolekülen auf, wobei die Detektions-Einrichtung, die Filterschicht und die Immobilisierungs-Schicht in dem Fluoreszenz-Biosensorchip integriert sind.
Erfindungsgemäß sind also alle Komponenten des Fluoreszenz- Biosensorchips in dem Fluoreszenz-Biosensorchip integriert. Indem alle Komponenten des Fluoreszenz-Biosensorchips dadurch räumlich sehr eng benachbart sind, hat der Fluoreszenz- Biosensorchip eine sehr geringe Größe. Dadurch ist ein sehr kompakter Fluoreszenz-Biosensorchip bereitgestellt. Die
Immobilisierungs-Schicht, die erfindungsgemäß als Sensorebene dient, und die in dem Substrat integrierten Detektions- Einrichtungen, die zum indirekten Nachweis von Hybridisierungsereignissen dienen, sind größenordnungsmäßig typischerweise weniger als 100 «m voneinander entfernt angeordnet, was eine gute Ortsauflösung des Fluoreszenz- Biosensorchips zur Folge hat. Auch ist der erfindungsgemäße Fluoreszenz-Biosensorchip derart konzipiert, dass er mit standardisierten CMOS-kompatiblen halbleitertechnologischen Verfahren herstellbar ist. Somit ist die Entwicklung teurer Maschinen zum Herstellen des Fluoreszenz-Biosensorchips entbehrlich, wodurch der Fluoreszenz-Biosensorchip kostengünstig und mit geringem Aufwand herstellbar ist. Auch sind die Einzelkomponenten des Fluoreszenz-Biosensorchips aus kostengünstigen Materialien herstellbar.
Bei dem Fluoreszenz-Biosensorchip der Erfindung ist das Substrat vorzugsweise aus Silizium-Material hergestellt. So kann das Substrat beispielsweise ein Silizium-Wafer sein. Die mindestens eine Detektions-Einrichtung des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchips weist gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiels mindestens eine Photodiode auf, die derart eingerichtet ist, dass damit elektromagnetische Strahlung eines ersten Wellenlängenbereichs detektierbar ist.
Indem die mindestens eine Detektions-Einrichtung als Photodiode ausgestaltet ist, die in dem Substrat integriert ist, ist ein empfindlicher und kostengünstig herstellbarer Detektor für elektromagnetische Strahlung bereitgestellt.
Vorzugsweise ist die optische Filterschicht derart eingerichtet, dass die optische Filterschicht elektromagnetische Strahlung eines zweiten
Wellenlängenbereichs absorbiert und/oder reflektiert, wobei zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs liegt.
Anschaulich ist die optische Filterschicht derart eingerichtet, dass sie denjenigen Teil der auf die Oberfläche der optischen Filterschicht eintreffenden elektromagnetischen Strahlung absorbiert und/oder reflektiert, die von der Photodiode abgeschirmt werden soll, da diese elektromagnetische Strahlung nicht die nachzuweisende Strahlung ist. Indem zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs, in dem die Photodiode auf den Nachweis elektromagnetischer Strahlung sensitiv ist, außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs liegt, ist sichergestellt, dass die von der Photodiode nachzuweisende elektromagnetische Strahlung die optische Filterschicht zumindest teilweise durchdringen kann. Dadurch unterdrückt die Absorptionsschicht die Bestrahlung der Photodioden mit solcher elektromagnetischer Strahlung, die nicht von an der Immobilisierungs-Schicht hybridisierten nachzuweisenden
Molekülen stammt, beispielsweise Streulicht aus der Umgebung oder Primärlicht zum Anregen von Fluoreszenzmarkern von gegebenenfalls an der Immobilisierungs-Schicht hybridisierten nachzuweisenden Molekülen. Mittels einer geeigneten Wahl der optischen Filterschicht kann daher die Nachweisempfindlichkeit des Fluoreszenz-Biosensorchips erhöht werden .
Die optische Filterschicht weist vorzugsweise mindestens ein Bandfilter und/oder mindestens ein Kantenfilter auf.
Unter einem Bandfilter wird im weiteren ein optisches Filter verstanden, das im Wesentlichen in einem Wellenlängenbereich zwischen einer unteren Grenzwellenlänge und einer oberen Grenzwellenlänge für elektromagnetische Strahlung undurchlässig ist, wohingegen der Bandfilter unterhalb der unteren Grenzwellenlänge und oberhalb der oberen Grenzwellenlänge für elektromagnetische Strahlung im Wesentlichen durchlässig ist.
Unter einem Kantenfilter wird im Weiteren ein optisches Filter verstanden, das im Wesentlichen entweder für elektromagnetische Strahlung unterhalb einer Grenzwellenlänge undurchlässig ist und für elektromagnetische Strahlung oberhalb der Grenzwellenlänge durchlässig ist, oder das für elektromagnetische Strahlung oberhalb einer Grenzwellenlänge undurchlässig ist und für elektromagnetische Strahlung unterhalb der Grenzwellenlänge durchlässig ist.
Das mindestens eine Bandfilter, das die optische
Filterschicht aufweisen kann, kann ein dielektrisches Interferenzfilter mit einer Schichtenfolge aus mindestens zwei Materialien sein, wobei ein erstes Material einen hohen Brechungsindex und ein zweites Material einen niedrigen Brechungsindex aufweist. Das erste Material mit einem hohen Brechungsindex ist vorzugsweise eines der Materialien Titanoxid (Ti02) , Siliziumnitrid (Si3N , Hafniumoxid (Hf02) , Zirkoniumoxid (Zr02) , Aluminiumoxid (Al203) , Polysilizium (polykristallines Silizium) oder Indium-Zinn-Oxid (ITO) . Das erste Material kann aber auch Siliziumdioxid (Si02) sein.
Ferner kann das erste Material eine beliebige Mischung aus den genannten oder anderen Materialien sein, derart, dass das erste Material einen geeigneten Brechungsindex aufweist. Die Verwendung der meisten der genannten Materialien als erstes Material für das dielektrische Interferenzfilter hat den Vorteil, dass das Aufbringen von Schichten der genannten Materialien mit standardisierten CMOS-Prozessen realisierbar ist. Dies wirkt sich vorteilhaft auf die Kosten des Fluoreszenz-Biosensorchips auf, da es die Herstellung des Fluoreszenz-Biosensorchips mit standardisierten und ausgereiften Verfahren ermöglicht. Das zweite Material des dielektrischen Interferenzfilters mit einem niedrigen Brechungsindex ist vorzugsweise Siliziumdioxid (Si02) , das ebenfalls mit CMOS-Prozessen kompatibel ist und somit die kostengünstige und wenig aufwändige Herstellung des
Fluoreszenz-Biosensorchips unterstützt. Das zweite Material kann aber auch eines der Materialien Titanoxid (Ti02) , Siliziumnitrid (Si3N4) , Hafniumoxid (Hf02) , Zirkoniumoxid (Zr02) , Aluminiumoxid (Al203) , Polysilizium (polykristallines Silizium) oder Indium-Zinn-Oxid (ITO) sein. Ferner kann das zweite Material eine beliebige Mischung aus den genannten oder anderen Materialien sein, derart, dass das zweite Material einen geeigneten Brechungsindex aufweist. Es ist zu betonen, dass die Materialien des dielektrischen Filters des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchips nicht auf die genannten Materialien beschränkt sind. Es kann für das erste Material mit einem hohen Brechungsindex jedes andere geeignete Material mit einem ausreichend hohen Brechungsindex gewählt werden, und es kann für das zweite Material mit einem niedrigen Brechungsindex jedes andere geeignete Material mit einem ausreichend niedrigen Brechungsindex gewählt werden.
Entscheidend für die Funktionalität des dielektrischen Interferenzfilters ist es, dass das dielektrische Interferenzfilter für Licht zwischen einer ersten
Grenzwellenlänge und einer zweiten Grenzwellenlänge möglichst undurchlässig sein soll. Mit anderen Worten soll das Interferenzfilter derart eingerichtet sein, dass es für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge oberhalb der unteren Grenzwellenlänge und unterhalb der oberen Grenzwellenlänge einen Transmissionskoeffizienten von idealerweise Null, realistischerweise möglichst nah bei Null aufweist. Dagegen soll das dielektrische Interferenzfilter für elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge unterhalb der unteren Grenzwellenlänge oder oberhalb der oberen Grenzwellenlänge möglichst gut durchlässig sein, d.h. für elektromagnetische Strahlung der genannten Wellenlängenbereiche einen Transmissionskoeffizienten von idealerweise eins, realistischerweise möglichst nahe bei eins aufweisen. Ferner soll das dielektrische Interferenzfilter eine große Flankensteilheit aufweisen, d.h., dass der Transmissionskoeffizient bei der unteren Grenzwellenlänge möglichst sprunghaft von eins auf Null abfallen und bei der oberen Grenzwellenlänge möglichst sprunghaft von Null auf eins ansteigen soll.
Vorzugsweise ist das dielektrische Interferenzfilter eine Anordnung aus 31 Schichten mit abwechselnd hohem und niedrigen Brechungsindex:
0,5H; L; (HL) 0,5H
Dabei sind die Schichtdicken in Vierteln von optischen Wellenlängen angegeben, d.h. in Vielfachen und Bruchteilen von «/4. Mit der Bezeichnung 0 , 5H ist eine Schicht aus einem hochbrechenden („H" für „high") Material bezeichnet, deren Dicke der Hälfte einer Viertel Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes in dem durchlaufenden Medium entspricht. 0,5H bezeichnet demzufolge eine «/8-Schicht aus dem hochbrechenden Material, wobei • der Quotient aus der Vakuum- Lichtwellenlänge und dem Brechungsindex des Mediums ist. Auf die «/8-Schicht des hochbrechenden Materials folgt eine */4- Schicht des niederbrechenden Materials („L" für „low"). Darauf folgen 14 • /4-Doppelschichten aus alternierend dem hochbrechenden Material und dem niederbrechenden Material.
Die Schichtanordnung wird wiederum von einer »/8-Schicht aus dem hochbrechenden Material abgeschlossen. Das beschriebene Schichtsystem ist aus alternierenden Schichten von Siliziumdioxid-Material (niederbrechend) und Siliziumnitrid- Material (hochbrechend) aufgebaut.
Mittels Einstellen der Schichtdicken lässt sich die Wellenlänge des Reflexionsmaximums bei einem festgelegten Einfallswinkel des Lichtes festlegen. Gemäß dem oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiels des dielektrischen Interferenzfilters aus 31 Schichten Siliziumdioxid/Siliziumnitrid wird Licht in einem Wellenlängenbereich zwischen ungefähr 350 Nanometer und ungefähr 390 Nanometer zu mehr als 99% reflektiert.
Wie oben beschrieben, kann die optische Filterschicht des Fluoreszenz-Biosensorchips der Erfindung auch mindestens ein Kantenfilter aufweisen. Das Kantenfilter ist vorzugsweise ein aus einem organischen Material hergestelltes Farbfilter. Derartige Farbfilter aus organischen Materialien weisen einen wellenlängenabhängigen Absorptionskoeffizienten auf. Derartige Farbfilter aus organischen Materialien weisen zwar häufig keine steilen Filterflanken auf, wie sie für einen großen Dynamikbereich erforderlich sind, jedoch haben derartige Filter die vorteilhafte Eigenschaft, häufig keine starke Welligkeit aufzuweisen, d.h. keine oszillatorischen Merkmale in der Absorptionskoeffizient-Wellenlängen-Kennlinie aufzuweisen. Daher ist der Einsatz von Kantenfiltern erfindungsgemäß besonders vorteilhaft, wenn ein Kantenfilter mit einem Bandfilter kombiniert wird.
Die geeignete Kombination von mindestens einem Bandfilter und/oder mindestens einem Kantenfilter ermöglicht es, die Absorptionseigenschaften der optischen Filterschicht des Fluoreszenz-Biosensorchips der Erfindung flexibel auf die Bedürfnisse des Einzelfalls einstellen zu können. Für Anwendungen, bei denen eine mäßige Nachweisempfindlichkeit ausreichend ist, kann die optische Filterschicht einfach ausgestaltet sein. Alternativ dazu kann die optische Filterschicht gestaltet sein, um eine optimierte
Nachweisempfindlichkeit des Fluoreszenz-Biosensorchips beispielsweise in bestimmten Wellenlängenbereichen zu ermöglichen. Daher kann mittels des erfindungsgemäßen Ausgestaltens der optischen Filterschicht eine gewünschte Balance zwischen Kostengünstigkeit und Nachweisgenauigkeit erreicht werden.
Der Fluoreszenz-Biosensorchip weist vorzugsweise ferner eine Schaltkreis-Schicht zwischen dem Substrat und der optischen Filterschicht auf, wobei in die Schaltkreis-Schicht mindestens ein elektrisches Bauelement integriert ist und wobei die Schaltkreis-Schicht mit der mindestens einen Detektions-Einrichtung elektrisch gekoppelt ist.
Indem die Schaltkreis-Schicht zwischen dem Substrat und der optischen Filterschicht angeordnet ist, ist eine Herstellung des Fluoreszenz-Biosensorchips mit der Schaltkreis-Schicht nach einem standardisierten CMOS-Prozess ermöglicht. Dies trägt zur Kostengünstigkeit des Fluoreszenz-Biosensorchips bei. Die Schaltkreis-Schicht dient im Wesentlichen dazu, ein von den Detektions-Einrichtungen detektiertes Hybridisierungsereignis auf der Immobilisierungs-Schicht elektrisch auszulesen. Erfolgt auf der Immobilisierungs- Schicht ein Hybridisierungsereignis und wird von den hybridisierten nachzuweisenden Molekülen ein elektromagnetisches Fluoreszenzsignal in Richtung der Photodioden ausgesendet, so erfolgt in den Photodioden eine Ladungstrennung, die mittels der elektronischen Bauelemente der Schaltkreis-Schicht elektrisch auslesbar ist.
Insbesondere ist mittels der Schaltkreis-Schicht die mindestens eine Detektions-Einrichtung elektrisch ansteuerbar. Mit anderen Worten kann jede einzelne Photodiode dahingehend ausgelesen werden, ob an ihr ein elektrisches Signal infolge eines Hybridisierungsereignisses auf der Immobilisierungs-Schicht anliegt.
Die Immobilisierungs-Schicht des Fluoreszenz-Biosensorchips weist beispielsweise eines oder eine Kombination der Materialien Siliziumdioxid, Siliziumnitrid organisches Material und/oder Gold auf.
Ferner können gemäß dem erfindungsgemäßen Fluoreszenz- Biosensorchip eine Vielzahl von Fängermolekülen mit der Immobilisierungs-Schicht gekoppelt sein, wobei die
Fängermoleküle derart eingerichtet sind, dass an die bindungsbereiten Fängermoleküle ein zu dem Fängermolekül komplementäres nachzuweisendes Molekül ankoppelbar ist. Insbesondere kann die Anzahl nachzuweisender Moleküle größer sein als die Anzahl der auf der Immobilisierungs-Schicht eines Fluoreszenz-Biosensorchips immobilisierten Fängermoleküle. Hat jedes der Fängermoleküle eines Fluoreszenz-Biosensorchips mit einem nachzuweisenden Molekül hybridisiert, ist der Fluoreszenz-Biosensorchip in „Sättigung", d.h. er weist keine bindungsbereiten
Fängermoleküle mehr auf, so dass nicht hybridisierte nachzuweisende Moleküle ggf. mit anderen Fängermolekülen an außerhalb des Sättigungszustands befindlichen Fluoreszenz- Biosensorchips (z.B. bei einer Anordnung mehrerer Fluoreszenz-Biosensorchips) hybridisieren können. Die
Fängermoleküle können insbesondere Nukleinsäuren (DNA oder RNA) , Peptide, Polypeptide, Proteine oder niedermolekulare Verbindungen sein. Unter niedermolekularen Verbindungen werden in der Chemie Verbindungen mit molekularen Massen von unter 1.700 Dalton (Molekülmasse in Gramm pro Mol) verstanden. Das oder die Materialien, aus dem oder denen die Immobilisierungs-Schicht hergestellt ist, wird oder werden auf die anzukoppelnden Fängermoleküle abgestimmt. Die Fängermoleküle werden mittels der Mikrodispensierungstechnik an der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht immobilisiert. Dabei bilden sich automatisch ("Seif Assembly" -Technik) Bindungen zwischen dem Material der Immobilisierungs-Schicht und solchen Endgruppen der Fängermoleküle, die mit dem Material der Immobilisierungs-Schicht eine chemische Bindung eingehen. Besonders vorteilhafte Eigenschaften weist diesbezüglich des Materialpaar Gold/Schwefel auf, sodass als besonders vorteilhafte Kombination die Anbindung von schwefelhaltigen Gruppen (beispielsweise Thiol-Endgruppen) von Fängermolekülen mit aus Goldmaterial hergestellten Immobilisierungs-Schichten anzuführen ist.
Die Fängermoleküle sind sehr selektiv auf ganz bestimmte, zu den Fängermolekülen komplementäre nachzuweisende Moleküle sensitiv. Mit anderen Worten lagern sich nur ganz bestimmte, strukturell passende nachzuweisende Moleküle an ein bestimmtes Fängermolekül an. Bringt man also verschiedene Fängermoleküle auf der Oberfläche der Immobilisierungs- Schicht an, so ist eine parallele Analyse verschiedener nachzuweisender Stoffe möglich. Die parallele Analyse verschiedener nachzuweisender Stoffe, beispielsweise verschiedener DNA-Halbstränge oder verschiedener Proteine, wirkt zeitsparend und ist besonders für "High Throughput Screening" -Analysen interessant. So kann die Analyse einer Lösung einer unbekannten Zusammensetzung idealerweise in einem einzigen Analyseschritt unter Verwendung des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchips realisiert werden. Eine derartige hochparallele Analyse wirkt zeitsparend.
Diejenigen auf der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht immobilisierten Fängermoleküle, die im Wesentlichen oberhalb einer der Detektions-Einrichtungen angeordnet sind, können als zu dieser Detektions-Einrichtung zugehörige Sensoren dienen. Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Fluoreszenz- Biosensorchips tritt nun das Problem auf, dass auf die
Detektions-Einrichtungen nicht nur das nachzuweisende Licht von den mit den Fängermolekülen hybridisierten nachzuweisenden Molekülen einfällt. Vielmehr fällt auf die Detektions-Einrichtungen auch Streulicht aus der Umgebung oder zum Anregen von Fluoreszenzmarkern vorgesehenes Primärlicht ein. Diese parasitäre elektromagnetische Strahlung verfälscht das Signal der Detektions-Einrichtungen. Daher ist es wünschenswert, die Stärke dieses Rauschsignals (bzw. Untergrundsignals) quantitativ zu erfassen und von den detektierten Signalen zu subtrahieren. Dies ist erfindungsgemäß realisierbar, indem ein Oberflächenabschnitt der Immobilisierungs-Schicht frei von Fängermolekülen ist, sodass an der mindestens einen unterhalb dieses Oberflächenabschnitts angeordneten Detektions-Einrichtung ein Rauschsignal abnehmbar ist.
Indem das Rauschsignal von den Signalen aller anderen Detektions-Einrichtungen subtrahiert wird, ist von den anderen Signalen der Beitrag von parasitärem Streulicht von dem zu detektierenden Fluoreszenzlicht trennbar, wodurch die Nachweisempfindlichkeit des Fluoreszenz-Biosensorchips erhöht ist. Das Rauschsignal (auch Nulleffekt oder Untergrundsignal genannt) kann auch simultan von mehreren Detektions- Einrichtungen gemessen werden, was die Nachweisempfindlichkeit weiter erhöht. Vorzugsweise weisen die nachzuweisenden Moleküle und/oder die Fängermoleküle einen Fluoreszenzmarker auf, wobei der Fluoreszenzmarker derart eingerichtet ist, dass er elektromagnetische Strahlung eines dritten
Wellenlängenbereichs absorbiert und nach erfolgter Absorption elektromagnetische Strahlung eines vierten
Wellenlängenbereich emittiert, wobei zumindest ein Teil des dritten Wellenlängenbereichs außerhalb des vierten Wellenlängenbereichs liegt, und wobei zumindest ein Teil des vierten Wellenlängenbereichs innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs liegt.
Im Weiteren wird die Funktionalität des Fluoreszenz- Biosensorchips der Erfindung anschaulich beschrieben. Wenn an der Oberfläche des Fluoreszenz-Biosensorchips keine nachzuweisenden Moleküle mit Fluoreszenzmarkern an den Fängermolekülen angelagert sind, so gelangt extern eingestrahltes Licht durch die Fängermoleküle und die Immobilisierungs-Schicht im Wesentlichen ungeschwächt hindurch. Das eingestrahlte Licht wird jedoch von einer entsprechend gewählten Filterschicht reflektiert und gelangt daher nicht bis zu den in das Substrat integrierten Photodioden.
Bringt man die Oberfläche des Fluoreszenz-Biosensorchips dagegen mit einer Lösung, die nachzuweisende Moleküle enthält, in Kontakt, so können nachzuweisende Moleküle mit den auf der Immobilisierungs-Schicht des Fluoreszenz- Biosensorchips angeordneten Fängermolekülen hybridisieren, falls die Fängermoleküle und die nachzuweisenden Moleküle nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip zusammenpassen. Die hybridisierten nachzuweisenden Moleküle sind mit einem geeigneten Fluoreszenzmarker versehen. Alternativ können die auch die Fängermoleküle mit einem Fluoreszenzmarker versehen sein. Fluoreszenzmarker sind Molekülgruppen, die elektromagnetische Strahlung eines bestimmten
Wellenlängenbereichs (oben als der dritte Wellenlängenbereich bezeichnet) absorbieren und nach erfolgter Absorption elektromagnetische Strahlung eines anderen Wellenlängenbereichs (oben vierter Wellenlängenbereich genannt) emittieren. Die Fluoreszenzmarker reemittieren elektromagnetische Strahlung mit im Vergleich zu dem eingestrahlten Licht erhöhten Wellenlängen. Fluoreszenzmarker werden an nachzuweisende Moleküle üblicherweise über sogenannte Linker-Moleküle, also das nachzuweisende Molekül mit dem Fluoreszenzmarker (bzw. dem Fängermolekül) koppelnde Moleküle, angekoppelt. Hybridisieren nachzuweisende Moleküle mit daran angekoppelten Fluoreszenzmarkern an an der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht immobilisierten Fängermolekülen, so befinden sich die Fluoreszenzmarker räumlich nahe der Immobilisierungs-Schicht. Wird Licht eines geeigneten Wellenlängenbereichs von extern eingestrahlt, so kann diese elektromagnetische Strahlung von den Fluoreszenzmarkern absorbiert werden, sofern die elektromagnetische Strahlung zumindest eine Wellenlänge innerhalb des dritten Wellenlängenbereichs aufweist, innerhalb dem die Fluoreszenzmarker elektromagnetische Strahlung absorbieren können. Dadurch werden die Fluoreszenzmarker in einen elektronischen Anregungszustand versetzt, der durch eine mittlere Lebensdauer gekennzeichnet ist. Im Mittel nach dieser mittleren Lebensdauer reemittieren die Fluoreszenzmarker elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängenbereichs, wobei der vierte Wellenlängenbereich langwelligere elektromagnetischere
Strahlung aufweist als der dritte Wellenlängenbereich. Mit anderen Worten hat das von den Fluoreszenzmarkern reemittierte Licht eine längere Wellenlänge als das einfallende Licht. Allerdings ist die Intensität des reemittierten Lichtes typischerweise mehrere Größenordnungen geringer als die Intensität des einfallenden Lichtes, das beispielsweise von einer externen Strahlungsquelle bereitgestellt ist. Das Fluoreszenzlicht des vierten Wellenlängenbereichs und das nicht absorbierte extern einfallende Licht durchlaufen die Immobilisierungs-Schicht und gelangen zu der optischen Filterschicht. Wie oben beschrieben, ist die optische Filterschicht derart eingerichtet, dass die optische Filterschicht elektromagnetische Strahlung eines zweiten Wellenlängenbereichs totalreflektiert, wobei zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs, in dem die Detektions- Einrichtungen elektromagnetische Strahlung detektieren können, außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs liegt. Der zweite Wellenlängenbereich, in dem die optische Filterschicht totalreflektiert, ist erfindungsgemäß derart eingerichtet, dass das von extern einfallende Licht im Wesentlichen reflektiert wird und dass das von den Fluoreszenzmarkern reemittierte Licht des vierten Wellenlängenbereichs im Wesentlichen durch die optische Filterschicht transmittiert wird. Dadurch gelangt im Wesentlichen nur das intensitätsschwache Fluoreszenzlicht durch die Filterschicht hindurch, wohingegen das intensitätsstarke externe Licht, das zur Anregung der Fluoreszenzmarker diente, reflektiert wird. Die von einem an einem bestimmten Fängermolekül befindlichen Fluoreszenzmarker emittierte elektromagnetische Strahlung des vierten Wellenlängenbereichs durchdringt die optische Filterschicht und gelangt idealerweise nach Hindurchtreten durch die im Wesentlichen transparente Schaltkreis-Schicht auf diejenige Photodiode in dem Substrat, die von dem emittierenden Fluoreszenzmarker den geringsten Abstand aufweist. Die Photodiode, die derart eingerichtet ist, dass damit elektromagnetische Strahlung eines ersten Wellenlängenbereichs detektierbar ist, ist zum Nachweis der elektromagnetischen Fluoreszenzstrahlung des vierten Wellenlängenbereichs geeignet, da der erfindungsgemäße
Fluoreszenz-Biosensorchip derart eingerichtet ist, dass zumindest ein Teil des vierten Wellenlängenbereichs innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs liegt. Dadurch ist die Photodiode geeignet zum Nachweis der Fluoreszenzstrahlung und ist somit geeignet zum indirekten Nachweis eines
Hybridisierungsereignisses auf einem darüber angeordneten Fängermolekül .
Alternativ können Hybridisierungsereignisse mittels Detektieren von Fluoreszenzstrahlung nachgewiesen werden, indem nach Andocken nachzuweisender Moleküle an Fluoreszenzmarker aufweisende Fängermoleküle die Sensorebene mit einer derart eingerichteten Substanz in Wirkkontakt gebracht wird, dass mittels dieser Substanz Fluoreszenzmarker aufweisende Fängermoleküle ohne angedockte nachzuweisende Moleküle von der Sensorebene abgelöst werden, wohingegen Fängermoleküle mit daran angedockten nachzuweisenden Molekülen auch in Anwesenheit der Substanz an der Sensorebene angedockt bleiben. Nachdem Fluoreszenzmarker aufweisende Fängermoleküle ohne damit hybridisierten nachzuweisenden Molekülen abgelöst sind, verbleiben an der Sensorebene lediglich solche Fluoreszenzmarker aufweisende Fängermoleküle, an denen nachzuweisende Moleküle angedockt sind. Diese Hybridisierungsereignisse sind dann gemäß dem oben beschriebenen Prinzip mittels Erfassen der
Fluoreszenzstrahlung der an den Fängermolekülen angekoppelten Fluoreszenzmarkern nachweisbar. Gemäß dem beschriebenen Alternativkonzept ist es entbehrlich, Fluoreszenzmarker an nachzuweisenden Molekülen zu binden, statt dessen ist eine Anbindung der Fluoreszenzmarker an den Fängermolekülen möglich.
Gemäß einem weiteren Alternativkonzept können Fluoreszenzmarker erst nach den Hybridisierungsereignissen zugegeben werden. Sind die Fluoreszenzmarker derart eingerichtet, dass sie nur an Fängermolekülen mit daran hybridisierten nachzuweisenden Molekülen binden (z.B. nur an doppelsträngiger DNA binden) , so ist die Intensität der von den Fluoreszenzmarkern emittierten elektromagnetischen Strahlung charakteristisch für die Anzahl der erfolgten Hybridisierungsereignisse .
Erfindungsgemäß können auch verschiedene Fluoreszenzmarker verwendet werden, um unterschiedliche Moleküle mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern nachzuweisen. Dadurch ist eine parallele Analyse möglich, mittels welcher die verschiedenen Komponenten eines Analyten simultan untersuchbar und quantifizierbar sind.
Als Fluoreszenzmarker wird beispielsweise Coumarin (1,2- Benzpyron 2H-l-Benzpyran-2-on, C9H602) verwendet. Der Fluoreszenzfarbstoff Coumarin hat die Eigenschaft, bei Anregung mit elektromagnetischer Strahlung der Wellenlänge 370 Nanometer in einem Wellenlängenbereich um ungefähr 460 Nanometer herum elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung zu reemittieren. Der Fluoreszenzmarker Coumarin gewährleistet also eine ausreichend starke Rotverschiebung der reemittierten elektromagnetischen Strahlung, sodass anregende und emittierte elektromagnetische Strahlung voneinander gut trennbar sind. Als Fluoreszenzmarker kann auch jedes andere geeignete Material wie beispielsweise FITC, Cy2 , Alexa Fluor 488, BODIPY 493, Rhodamine 123, R6G, TET, JOE, HEX, BODIPY 530, Alexa 532, R-Phycoerythrin, TRITC, Cy3 , TAMRA, Texas Red, ROX, BODIPY 630 und Cy5 verwendet werden.
Die Oberfläche des Fluoreszenz-Biosensorchips weist vorzugsweise eine matrizenartige Anordnung einzelner Sensorfelder auf. Wie oben angesprochen, ist jedes einzelne Sensorfeld mittels der Schaltkreis-Schicht einzeln auslesbar. Um die Integrationsdichte der Sensorfelder zu erhöhen, sind die Sensorfelder möglichst dicht angeordnet. Dies ist für "High-Throughput-Screening" -Anwendungen vorteilhaft . Andererseits ist die dichte Anordnung von Sensorfeldern mit der Gefahr verbunden, dass optisches Übersprechen von einem Sensorfeld zu einem benachbarten Sensorfeld auftreten kann. Die in dem Substrat integrierten Photodioden bilden die Immobilisierungs-Schicht mit den daran immobilisierten Fängermolekülen ortsrichtig ab. Dadurch ist eine Photodiode im Wesentlichen auf die Fluoreszenzstrahlung derjenigen Fängermoleküle sensitiv, die im Wesentlichen oberhalb der Photodiode angeordnet sind. Unter optischem Übersprechen wird nun verstanden, dass elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung eines Fluoreszenzmarkers nicht auf die im Wesentlichen darunter liegende Photodiode abgestrahlt wird, sondern beispielsweise in Richtung einer links oder rechts neben dieser Photodiode angeordneten anderen Photodiode emittiert wird. Dadurch besteht die Gefahr, dass ein Hybridisierungsereignis an einem Fängermolekül fehlerhafterweise von einer Photodiode, die nicht unterhalb des Fängermoleküls angeordnet ist, nachgewiesen wird. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass erfindungsgemäß Möglichkeiten geschaffen sind, optisches Übersprechen zwischen benachbarten Sensorfeldern gering zu halten oder zu unterbinden. Daraus resultiert die vorteilhafte Wirkung, dass eine hohe Integrationsdichte von Sensoren auf dem Fluoreszenz- Biosensorchip mit verringertem optischen Übersprechen kombiniert ist.
Um dieses Ziel zu erreichen, ist vorzugsweise in mindestens einen Oberflächenbereich des Fluoreszenz-Biosensorchips mindestens ein Isolations-Graben zum optischen Isolieren benachbarter Detektions-Einrichtungen eingebracht, welcher mindestens eine Isolations-Graben sich durch die Immobilisierungs-Schicht hindurch bis in einen Bereich der optischen Filterschicht hineinerstreckt derart, dass unterhalb jedes Bereichs zwischen zwei benachbarten Isolations-Gräben jeweils eine Detektions-Einrichtung angeordnet ist. Vorzugsweise ist mindestens ein Teil der Oberfläche des mindestens einen Isolations-Grabens mit einer Schicht aus einem absorbierenden Material bedeckt oder es ist mindestens einer der Gräben mit einem absorbierenden Material gefüllt, wobei das absorbierende Material derart eingerichtet ist, dass mittels des absorbierenden Materials elektromagnetische Strahlung zumindest des jeweiligen Wellenlängenbereichs bzw. der jeweiligen Wellenlängenbereiche absorbiert oder reflektiert wird.
Wenn, wie oben beschrieben, von einem bezogen auf die Lichteinfallsrichtung im Wesentlichen oberhalb einer ersten Photodiode angeordneten Fluoreszenzmarker Fluoreszenzstrahlung in eine Richtung emittiert wird, in der nicht die darunter gelegene Photodiode, sondern eine daran benachbarte Photodiode angeordnet ist, so kann mittels eines zwischen die Photodioden geeignet eingebrachten und mit einem elektromagnetische Strahlung absorbierenden Material zumindest teilweise aufgefüllten Grabens verhindert werden, dass die elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung von einer
„falschen" Photodiode nachgewiesen wird. Statt einem falschen Nachweis wird die Fluoreszenzstrahlung von dem absorbierenden Material in dem Graben absorbiert. Dadurch ist die Gefahr des optischen Übersprechens herabgesetzt. Dies ist vorteilhaft, da dadurch die Nachweisempfindlichkeit des Fluoreszenz-Biosensorchips erhöht und die Fehleranfälligkeit des Fluoreszenz-Biosensorchips verringert ist.
Optisches Übersprechen kann weiter verringert werden, indem in mindestens einem Bereich der Schaltkreis-Schicht eine Barriereschicht aus einem absorbierenden Material vorgesehen ist, derart, dass unterhalb jedes Bereichs zwischen zwei benachbarten Barriereschichten jeweils eine Detektions- Einrichtung angeordnet ist, wobei das absorbierende Material derart eingerichtet ist, dass es elektromagnetische Strahlung zumindest des jeweiligen Wellenlängenbereichs bzw. der jeweiligen Wellenlängenbereiche absorbiert oder reflektiert.
Wie oben beschrieben ist der Isolations-Graben in die Immobilisierungs-Schicht und zumindest teilweise in die optische Filterschicht eingebracht, beispielsweise geätzt. Fluoreszenzstrahlung, die in einem derartigen Winkel von einem Fluoreszenzmarker reemittiert wird, dass die Fluoreszenzstrahlung bei ihrem Weg zu einer links oder rechts der unterhalb des Fluoreszenzmarkers angeordneten Photodiode nicht durch den Isolations-Graben hindurch tritt, sondern unterhalb des Isolations-Grabens durch die Schaltkreis- Schicht läuft, kann trotz des Isolations-Grabens von einer „falschen" Photodiode nachgewiesen werden. Mittels der Isolations-Gräben ist die Gefahr optischen Übersprechens also verringert, nicht aber unbedingt vollständig ausgeschlossen.
Um optisches Übersprechen weiter herabzusetzen, können wie oben beschrieben Barriereschichten aus absorbierendem Material in die Schaltkreis-Schicht eingebracht werden. Diese Barriereschichten haben im Wesentlichen dieselbe Funktion wie das absorbierende Material in den Isolations-Gräben, nämlich Fluoreszenzstrahlung auf dem Weg zu einer „falschen" Photodiode zu absorbieren und/oder zu reflektieren. Allerdings nimmt die Barriereschicht diese Funktionalität in der Schaltkreis-Schicht wahr, wohingegen die Isolations- Gräben diese Funktionalität in der Immobilisierungs-Schicht und in der optischen Filterschicht wahrnehmen. Vorzugsweise erfüllen die Barriereschichten in der Schaltkreis-Schicht eine Doppelfunktion. Einerseits wird - wie oben beschrieben- optisches Übersprechen mittels der Barriereschichten unterbunden, andererseits können die absorbierenden und/oder reflektierenden Barriereschichten, sofern diese aus einem elektrisch leitfähigen Material hergestellt sind, auch die Funktion elektronischer Bauelemente in der Schaltkreis- Schicht wahrnehmen. So können beispielsweise die Barriereschichten als elektrische Zuleitungen zu den
Photodioden in den Substrat dienen. Vorzugsweise sind die Barriereschichten in die Schaltkreis-Schicht eingebrachte metallische Leiterbahnen oder Durchgangslöcher, die mit einem elektrisch leitfähigen und elektromagnetische Strahlung absorbierenden/reflektierenden Material aufgefüllt sind. Mittels der Barriereschichten ist optisches Übersprechen zwischen benachbarten Sensorfeldern weiter vermindert, wodurch die Nachweisempfindlichkeit erhöht ist. Die erfindungsgemäße Doppelfunktion der Barriereschicht als Mittel zum Vermindern optischen Übersprechens einerseits und als elektrisch integrierte Bauelemente andererseits ist ökonomisch und platzsparend.
Durch die Erfindung ist ferner eine Fluoreszenz- Biosensorchip-Anordnung mit einem Fluoreszenz-Biosensorchip und einer elektromagnetischen Strahlungsquelle bereitgestellt. Der Fluoreszenz-Biosensorchip weist auf ein Substrat, mindestens eine im oder auf dem Substrat angeordnete Detektions-Einrichtung zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung eines ersten
Wellenlängenbereichs, eine auf dem Substrat angeordnete optische Filterschicht zum Absorbieren und/oder Reflektieren von elektromagnetischer Strahlung eines zweiten Wellenlängenbereichs, eine auf der optischen Filterschicht angeordnete Immobilisierungs-Schicht zum Immobilisieren von Fängermolekülen, wobei die Detektions-Einrichtung, die Filterschicht und die Immobilisierungs-Schicht in dem Fluoreszenz-Biosensorchip integriert sind. Die elektromagnetische Strahlungsquelle ist derart eingerichtet, dass mittels der elektromagnetischen Strahlungsquelle ein Oberflächenbereich des Fluoreszenz-Biosensorchips mit elektromagnetischer Strahlung eines dritten Wellenlängenbereichs bestrahlbar ist.
Es ist zu betonen, dass all diejenigen Ausgestaltungen, die weiter oben bezugnehmend auf den erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchip beschrieben sind, auch für die erfindungsgemäße Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung gelten.
Die Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung der Erfindung weist zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchip im Wesentlichen eine elektromagnetische Strahlungsquelle auf. Die elektromagnetische Strahlungsquelle ist dafür vorgesehen, den Oberflächenbereich des Fluoreszenz-Biosensorchips mit elektromagnetischer Strahlung eines dritten
Wellenlängenbereichs zu bestrahlen. Vorzugsweise ist die elektromagnetische Strahlungsquelle ein Laser, eine Leuchtdiode, eine Gasentladungslampe oder eine Glühlampe. Ist die elektromagnetische Strahlungsquelle als Laser ausgestaltet, so ist dadurch ermöglicht, dass die Oberfläche des Fluoreszenz-Biosensorchips mit monochromatischem, schmalbandigem Licht bestrahlbar ist. Monochromatisches Licht ist mittels einer Filterschicht, deren optische Absorptionseigenschaften wellenlängenabhängig sind, gut wegfilterbar .
Die Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung weist ferner eine Vielzahl von Fängermolekülen auf, die mit der Immobilisierungs-Schicht gekoppelt sind und die derart eingerichtet sind, dass an die Fängermoleküle ein zu dem Fängermolekül komplementäres nachzuweisendes Molekül ankoppelbar ist. Die Ankopplung der Fängermoleküle an die Immobilisierungs-Schicht erfolgt so, wie dies weiter oben bezugnehmend auf den Fluoreszenz-Biosensorchip beschrieben worden ist.
Jedes nachzuweisende Molekül weist darüber hinaus einen Fluoreszenzmarker auf, wobei der Fluoreszenzmarker derart eingerichtet ist, dass er zumindest teilweise elektromagnetische Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs absorbiert und nach erfolgter Absorption elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängenbereichs emittiert, wobei zumindest ein Teil des dritten Wellenlängenbereichs außerhalb des vierten Wellenlängenbereichs liegt und wobei zumindest ein Teil des vierten Wellenlängenbereichs innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs liegt. Darüber hinaus liegt zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs.
Im Weiteren wird die Funktionalität der erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung näher beschrieben. Mittels der elektromagnetischen Strahlungsquelle wird die Oberfläche der Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung mit elektromagnetischer Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs bestrahlt. An der Oberfläche der Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung der Erfindung befindet sich die Immobilisierungs-Schicht, an der Fängermoleküle immobilisiert sind. Eine Lösung mit nachzuweisenden Molekülen wird mit dieser aktiven Sensoroberfläche in Wirkkontakt gebracht. Sind in dieser Lösung befindliche nachzuweisende Moleküle mit auf der Immobilisierungs-Schicht immobilisierten Fängermolekülen ausreichend komplementär, so erfolgt eine Hybridisierung der nachzuweisenden Moleküle mit den Fängermolekülen. Die nachzuweisenden Moleküle sind beispielsweise über ein Linker-Molekül mit einem Fluoreszenzmarker gekoppelt, wobei der Fluoreszenzmarker derart eingerichtet ist, dass er zumindest teilweise elektromagnetische Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs absorbiert. Daher erfolgt nach der Hybridisierung der nachzuweisenden Moleküle an den Fängermolekülen eine Absorption des von der elektromagnetischen Strahlungsquelle emittierten Lichtes durch die Fluoreszenzmarker an den nachzuweisenden Molekülen. Die Fluoreszenzmarker sind derart eingerichtet, dass nach der Absorption elektromagnetischer Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs die Fluoreszenzmarker elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängenbereichs emittieren, wobei zumindest ein Teil des dritten Wellenlängenbereichs außerhalb des vierten Wellenlängenbereichs liegt. Dies bedeutet, dass die Fluoreszenzstrahlung der Fluoreszenzmarker langwelliger ist als die zuvor absorbierte Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs, die von der elektromagnetischen Strahlungsquelle bereitgestellt ist. Die Primärstrahlung in dem dritten Wellenlängenbereich und die Fluoreszenzstrahlung in dem vierten Wellenlängenbereich durchdringen die Immobilisierungs-Schicht und gelangen dann zu der optischen Filterschicht. Die optische Filterschicht ist derart eingerichtet, dass mittels der optischen Filterschicht elektromagnetische Strahlung des zweiten Wellenlängenbereichs absorbiert und/oder reflektiert wird. Idealerweise wird von der optischen Filterschicht die elektromagnetische Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs, die von der externen elektromagnetischen Strahlungsquelle stammt, vollständig reflektiert bzw. absorbiert. Dagegen wird idealerweise von der optischen Filterschicht die elektromagnetische Strahlung des vierten Wellenlängenbereichs, die von den Fluoreszenzmarkern stammt, vollständig transmittiert . Mit anderen Worten ist die optische Filterschicht derart eingerichtet, dass sie für das Fluoreszenzlicht vollständig durchlässig ist, wohingegen sie für das Licht der elektromagnetischen Strahlungsquelle vollständig undurchlässig ist.
Dadurch gelangt im Idealfall ausschließlich die Fluoreszenzstrahlung zu den in dem Substrat integrierten Detektions-Einrichtungen zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung des ersten Wellenlängenbereichs. Erfindungsgemäß liegt zumindest ein Teil des vierten Wellenlängenbereichs, in dem die Fluoreszenzstrahlung der Fluoreszenzmarker liegt, innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs, innerhalb dem die Detektions-Einrichtungen zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung fähig sind. Dadurch kann die erfolgte Hybridisierung von nachzuweisenden Molekülen samt Fluoreszenzmolekülen mit an der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht gebundenen Fängermolekülen mittels eines elektrischen Signals an den in dem Substrat integrierten Photodioden nachgewiesen werden. Dabei kommt der geeigneten Einstellung der beteiligten Wellenlängenbereiche eine maßgebliche Bedeutung zu.
Im Weiteren werden Ausgestaltungen der Fluoreszenz- Biosensorchip-Anordnung der Erfindung beschrieben, mittels welcher die Nachweisempfindlichkeit der Fluoreszenz- Biosensorchip-Anordnung erhöhbar ist.
Vorzugsweise ist die elektromagnetische Strahlungsquelle derart ausrichtbar, dass die von der elektromagnetischen Strahlungsquelle emittierte elektromagnetische Strahlung unter einem vorgebbaren Winkel zur Normalen-Richtung der optischen Filterschicht.
Anschaulich ist die Richtung, unter der die elektromagnetische Strahlung der elektromagnetischen Strahlungsquelle auf die Fängermoleküle einfällt, vorgebbar, beispielsweise indem eine elektromagnetische Strahlungsquelle verwendet wird, die ein Bündel paralleler Lichtstrahlen erzeugt, und indem diese elektromagnetische Strahlungsquelle verschiebbar, drehbar, schwenkbar bzw. kippbar eingerichtet ist. Mittels eines schrägen Einfalls des anregenden Lichtes auf die Fluoreszenzmarker trifft der durch den optischen Filter transmittierte Teil des anregenden Lichtes nicht direkt auf diejenige Photodiode, die im Wesentlichen unterhalb des absorbierenden und emittierenden Fluoreszenzmarkers angeordnet ist. Mit anderen Worten wird das die Nachweisempfindlichkeit der Fluoreszenz- Biosensorchip-Anordnung verringernde störende Primärlicht teilweise „geometrisch" abgeschirmt. Um zu verhindern, dass das schräg einfallende anregende Licht in benachbarten Photodioden nachteilige Wirkungen entfaltet, kann das schräg einfallende anregende Licht wie oben beschrieben mittels Isolations-Gräben und/oder Barriereschichten gegebenenfalls vom Nachweis abgeschirmt werden.
Mittels Ausnützens des schrägen Einfalls der elektromagnetischen Strahlung der elektromagnetischen Strahlungsquelle können Schatteneffekte vorteilhaft genutzt werden, um die Nachweisempfindlichkeit der Fluoreszenz- Biosensorchip-Anordnung zu erhöhen.
Gemäß einer anderen Ausgestaltung der Erfindung ist die elektromagnetische Strahlungsquelle derart eingerichtet, dass die von der elektromagnetischen Strahlungsquelle emittierte elektromagnetische Strahlung in Pulsen emittiert ist und bei dem die Detektions-Einrichtungen derart eingerichtet sind, dass die von den Fluoreszenzmarkern emittierte elektromagnetische Strahlung in den Zeitintervallen zwischen den Pulsen mittels der Detektions-Einrichtungen detektierbar ist .
Dabei wird der physikalische Effekt ausgenützt, dass der angeregte Elektronenzustand des Fluoreszenzmarkers nach
Absorbieren des anregenden Lichtes eine endliche, von Null verschiedene Lebensdauer aufweist. Strahlt man einen kurzen Puls von anregendem Licht mittels der elektromagnetischen Strahlungsquelle auf die Fluoreszenzmarker ein, so werden die Fluoreszenzmarker mittels Absorption des Lichts in einen angeregten Elektronenzustand versetzt. Das nicht von den Fluoreszenzmarkern absorbierte einfallende Licht erreicht aufgrund der hohen Lichtgeschwindigkeit quasi instantan die Detektoreinrichtungen, deren Signal zu diesem Zeitpunkt nicht erfasst wird. Mit anderen Worten sind die Detektions- Einrichtungen während des Pulses ausgeschaltet. Nach einem Zeitintervall, das im Wesentlichen der mittleren Lebensdauer des angeregten Elektronenzustandes des Fluoreszenzmarkers entspricht, wird von den Fluoreszenzmarkern eine zeitverzögerte elektromagnetische Fluoreszenzwelle abgestrahlt. Die Zeitverzögerung liegt in der Größenordnung der natürlichen Lebensdauer von angeregten Elektronenzuständen (ungefähr Mikrosekunden bis Nanosekunden) . Wird erst nach dieser Zeitverzögerung das Messsignal der Detektions-Einrichtungen aufgenommen, so ist der parasitäre Nachweis von anregendem Licht vermieden und es wird nur Fluoreszenzstrahlung nachgewiesen. Hierzu sind vorzugsweise Detektions-Einrichtungen mit ausreichend guter Zeitauflösung zu wählen, beispielsweise Photodioden, die eine Zeitauflösung im Sub-Nanosekundenbereich aufweisen. Mittels Unterdrückung des Nachweises des Primärlichtes ist die Nachweisempfindlichkeit der Fluoreszenz-Biosensorchip- Anordnung der Erfindung erhöht.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im Weiteren näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1A eine schematische Ansicht eines Fluoreszenz- Biosensorchips gemäß dem Stand der Technik,
Figur IB eine Explosionsdarstellung eines anderen
Fluoreszenz-Biosensorchips gemäß dem Stand der Technik,
Figur 2 eine Querschnittsansicht eines Fluoreszenz- Biosensorchips gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung,
Figur 3 eine Querschnittsansicht eines Fluoreszenz- Biosensorchips gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel der Erfindung,
Figur 4 ein Diagramm, das schematisch die Abhängigkeit der
Transmission von der Wellenlänge eines dielektrischen Interferenzfilters gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen optischen Filterschicht zeigt,
Figur 5A eine Draufsicht eines Fluoreszenz-Biosensorchips gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel der Erfindung,
Figur 5B eine vergrößerte teilweise Querschnittsansicht entlang der Schnittlinie I-I' aus Figur 5A gemäß dem dritten bevorzugten Ausführungsbeispiels des Fluoreszenz-Biosensorchips der Erfindung,
Figur 6A ein Schaltbild mit einer Ansteuerlogik zum Ansteuern eines Sensorfeldes gemäß einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel des Fluoreszenz-Biosensorchips der Erfindung,
Figur 6B eine vergrößerte Ansicht der Ansteuerlogik zum Ansteuern eines Sensorfeldes gemäß dem bevorzugten
Ausführungsbeispiel des Fluoreszenz-Biosensorchips der Erfindung,
Figur 7 eine Querschnittsansicht einer Fluoreszenz- Biosensorchip-Anordnung gemäß einem bevorzugten
Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Im Weiteren wird bezugnehmend auf Fig. 2 ein Fluoreszenz- Biosensorchip 200 gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben.
Der Fluoreszenz-Biosensorchip 200 weist ein Substrat 201, mindestens eine in oder auf dem Substrat 201 angeordnete Detektions-Einrichtung 202 zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung, eine auf dem Substrat 201 angeordnete optische Filterschicht 203 und eine auf der optischen Filterschicht 203 angeordnete Immobilisierungs- Schicht 204 zum Immobilisieren von Fängermolekülen auf. Die Detektions-Einrichtungen 202, die Filterschicht 203 und die Immobilisierungs-Schicht 204 sind in dem Fluoreszenz- Biosensorchip 200 integriert, wie in Fig. 2 gezeigt.
Gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchips 200 ist das
Substrat 201 aus Siliziummaterial hergestellt. Darüber hinaus sind sechs Detektions-Einrichtungen 202 bereitgestellt, wobei jede der sechs Detektions-Einrichtungen 202 als Photodiode ausgebildet ist, die derart eingerichtet sind, dass damit elektromagnetische Strahlung eines ersten
Wellenlängenbereichs detektierbar ist. Wie in Fig. 2 gezeigt, sind benachbarte Detektions-Einrichtungen 202 in einem Abstand „d" voneinander angebracht. Der Abstand „d", der gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel gleich 200 Mikrometer ist, ist ein Maß für die Pixelgröße eines Sensorfeldes auf der Oberfläche des Fluoreszenz- Biosensorchips. Mit anderen Worten gehören all diejenigen auf der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht 204 immobilisierbaren Fängermoleküle, die zu einer bestimmten Detektions-Einrichtung 202 einen geringeren Abstand haben als zu allen anderen Sensoreinrichtungen 202, zu einem Sensorpixel. Der Abstand „d" ist daher ein Maß für die eindimensionale Ortsauflösung des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchips 200. Mit anderen Worten ist d2 ein Maß für die zweidimensionale Ortsauflösung des erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchips 200, d.h. für die erforderliche Oberfläche des Fluoreszenz-Biosensorchips 200 pro Sensorpixel.
Die optische Filterschicht 203 ist derart eingerichtet, dass die optische Filterschicht 203 elektromagnetische Strahlung eines zweiten Wellenlängenbereichs absorbiert, wobei zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs liegt.
Gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel ist die optische Filterschicht 203 als Kantenfilter ausgestaltet. Das Kantenfilter 203 des Fluoreszenz-Biosensorchips 200 absorbiert elektromagnetische Strahlung unterhalb einer Grenzwellenlänge. Das optische Kantenfilter 203 ist ein aus einem organischen Material hergestelltes Farbfilter.
Wie in Fig. 2 gezeigt, hat die optische Filterschicht 203 eine Dicke „h", die gemäß dem beschriebenen Ausführungsbeispiel in der Größenordnung von 70 Mikrometer liegt. Die Dicke „h" der als organisches Kantenfilter ausgestalteten optischen Filterschicht 203 ist ausreichend groß zu wählen, um solche elektromagnetische Strahlung, die nicht zu den Detektions-Einrichtungen 202 gelangen soll, möglichst vollständig zu absorbieren, und die als organisches Kantenfilter ausgestaltete optische Filterschicht 203 ist ausreichend dünn zu wählen, um solche elektromagnetische Strahlung, die zu den Detektions-Einrichtungen 202 gelangen soll, um von den Detektions-Einrichtungen 202 nachgewiesen zu werden, in ausreichendem Maße zu transmittieren.
Die in Fig. 2 gezeigte Immobilisierungs-Schicht 204 ist gemäß dem beschriebenen Ausführungsbeispiel eine dünne Goldschicht.
Der Fluoreszenz-Biosensorchip 200 weist ferner eine Schaltkreis-Schicht 205 zwischen dem Substrat 201 und der optischen Filterschicht 203 auf, wobei in die Schaltkreis- Schicht 205 mindestens ein elektrisches Bauelement integriert ist, und wobei die Schaltkreis-Schicht 205 mit der mindestens einen Detektions-Einrichtung 202 elektrisch gekoppelt ist.
Die elektrischen Bauelemente, die in der Schaltkreis-Schicht 205 integriert sind, sind in Fig. 2 nicht gezeigt. Die Schaltkreis-Schicht 205 ist derart eingerichtet, dass mittels der Schaltkreis-Schicht 205 die Detektions-Einrichtungen 202 jeweils einzeln elektrisch ansteuerbar sind. Ein
Ausführungsbeispiel für einen geeigneten elektrischen Ansteuer-Schaltkreis wird weiter unten beschrieben. Gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Fluoreszenz-Biosensorchip 200 weist die Schaltkreis-Schicht 205 MOS-Transistoren zum Auswählen einer der Detektions-Einrichtungen 202, elektrisch leitende
Verbindungen zum Ankoppeln der Detektions-Einrichtung 202 an einen Ansteuer-Schaltkreis und weitere elektronische Bauelemente auf, die zur Verstärkung und Auswertung des Messsignals dienen. Diese elektrischen Bauelemente sind in die Schaltkreis-Schicht 205 integriert. Wie in Fig. 2 gezeigt, hat die Schaltkreis-Schicht 205 eine Dicke „1", die gemäß dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ungefähr fünf Mikrometer ist. Die Dicke „1" sollte ausreichend klein gewählt sein bzw. die Materialien sollten geeignet gewählt sein, dass Verluste infolge Absorption nachzuweisender elektromagnetischer Strahlung in der Schaltkreis-Schicht 205 gering sind.
Der Fluoreszenz-Biosensorchip 200 enthält ferner eine Vielzahl von Fängermolekülen 206, die mit der Immobilisierungs-Schicht 204 gekoppelt sind und die derart eingerichtet sind, dass an jedes der bindungsbereiten Fängermoleküle 206 ein zu dem Fängermolekül 206 komplementäres nachzuweisendes Molekül 207 ankoppelbar ist. Die in Fig. 2 gezeigten Fängermoleküle 206 sind DNA- Halbstränge. Jedes nachzuweisende Molekül 207 weist einen Fluoreszenzmarker 208 auf.
Die Fluoreszenzmarker 208 sind derart eingerichtet, dass die Fluoreszenzmarker 208 elektromagnetische Strahlung eines dritten Wellenlängenbereichs absorbieren und nach erfolgter Absorption elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängenbereichs emittieren. Der in Fig. 2 gezeigte Fluoreszenzmarker 208 ist Coumarin. In das in Fig. 4 gezeigte
Diagramm ist das Emmisionsspektrum von Coumarin eingezeichnet, nachdem der Fluoreszenzfarbstoff Coumarin mit elektromagnetischer Strahlung der Wellenlänge 370 Nanometer angeregt worden ist. Man erkennt eine relativ breite Absorptionsbande mit einem Maximum nahe 460 Nanometer. Dieses Emissionsspektrum entspricht gemäß dem beschriebenen Ausführungsbeispiel dem oben definierten vierten Wellenlängenbereich.
Wie in Fig. 2 gezeigt, ist der Oberflächenbereich des
Fluoreszenz-Biosensorchips 200 nicht nur mit nachzuweisenden Molekülen 207, die mit einem Fluoreszenz-Marker 208 gekoppelt sind, in Wirkkontakt. Ferner sind auch Moleküle 209 in Wirkkontakt mit den Fängermolekülen 206 auf der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht 204. Diese Moleküle 209 sind ebenfalls mit Fluoreszenzmarkern 210 gekoppelt, die sich allerdings von den mit den nachzuweisenden Molekülen 207 gekoppelten Fluoreszenzmarkern 208 dahingehend unterscheiden, dass die Fluoreszenzmarker 210 in anderen Wellenlängenbereichen absorbieren bzw. fluoreszieren als die Fluoreszenzmarker 208 der nachzuweisenden Moleküle 207. Im Unterschied zu den nachzuweisenden Molekülen 207, die zu den Fängermolekülen 206 komplementär sind und infolgedessen an die Fängermoleküle angelagert sind, sind die Moleküle 209 zu den Fängermolekülen 206 nicht komplementär und daher nicht in der Lage, mit den Fängermolekülen 206 zu hybridisieren. Diese Betrachtung zeigt, dass der Nachweis von Molekülen mittels Anlagerns an die Fängermoleküle 206 sehr selektiv erfolgt. Wären die Moleküle 210 zu den Fängermolekülen 206 komplementär, so würden nur die Moleküle 210 mit den Fängermolekülen 206 hybridisieren, wohingegen die nachzuweisenden Moleküle 208 mit den Fängermolekülen 206 in diesem alternativen Falle nicht hybridisieren würden. Die Entscheidung, ob die Moleküle 207 oder die Moleküle 209 an den Fängermolekülen 206 anlagern, kann mittels Analyse der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts der Fluoreszenzmarker 208 oder 210 bestimmt werden.
Im Weiteren wird die Funktionalität des Fluoreszenz- Biosensorchips 200 beschrieben. Der Fluoreszenz-Biosensorchip 200 wird mit einer Lösung in Kontakt gebracht, welche unter anderem die nachzuweisenden Moleküle 207 mit daran über Linker-Moleküle gekoppelten Fluoreszenzmarkern 208 enthält. Zu den Fängermolekülen 206 komplementäre Moleküle 207 hybridisieren mit den Fängermolekülen 206. Gegebenenfalls wird ein geeigneter Spül- bzw. Wasch-Schritt durchgeführt. Das Hybridisierungsereignis ist mittels Einstrahlung von elektromagnetischer Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs, in dem die Fluoreszenzmarker 208 absorbieren, nachweisbar.
Nach erfolgter Absorption reemittieren die Fluoreszenzmarker 208 Licht eines vierten Wellenlängenbereichs, wobei das reemittierte Licht langwelliger ist als das absorbierte Licht. Sowohl das eingestrahlte Licht als auch das Fluoreszenzlicht treten durch die im Wesentlichen transparente Immobilisierungs-Schicht 204 hindurch und gelangen zu der optischen Filterschicht 203. Die als organisches Kantenfilter ausgestaltete optische Filterschicht 203 ist als Sperrfilter für die anregende Lichtwellenlänge (dritter Wellenlängenbereich) ausgeführt. Das heißt, das Licht der eingestrahlten Wellenlänge wird von der optischen Filterschicht 203 im Wesentlichen vollständig absorbiert, wohingegen das Fluoreszenzlicht des vierten Wellenlängenbereichs durch die optische Filterschicht 203 im Wesentlichen ungeschwächt transmittiert wird.
Nach dem Hindurchtreten durch die im Wesentlichen transparente Schaltkreis-Schicht 205 gelangt das Fluoreszenzlicht vorzugsweise zu derjenigen der Photodioden 202, die im Wesentlichen unterhalb desjenigen Fluoreszenzmarkers 208 angeordnet ist, von welchem das Fluoreszenzlicht emittiert wurde. Die Photodioden 202 sind derart eingerichtet, dass damit elektromagnetische Strahlung des ersten Wellenlängenbereichs detektierbar ist. Indem die Fluoreszenzmarker 208 derart eingerichtet sind, dass zumindest ein Teil des vierten Wellenlängenbereichs (derjenige Wellenlängenbereich, in dem die
Fluoreszenzstrahlung liegt) innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs liegt, ist die Photodiode 202 imstande, das Fluoreszenzlicht nachzuweisen. Dadurch wird einerseits ein Hybridisierungsereignis nachgewiesen, andererseits ist die Intensität des nachgewiesenen Fluoreszenzlichtes ein Maß für die Zahl der angelagerten Moleküle, d.h. für den Grad der Komplementär!tat zwischen Fängermolekülen 206 und nachzuweisenden Molekülen 207.
Licht der anregenden Wellenlänge gelangt nicht durch die optische Filterschicht 203 und ist daher nicht in den Photodioden 202 nachweisbar. Dadurch ist erfindungsgemäß eine Trennung des Fluoreszenzlichtes von dem anregenden Licht mittels der optischen Filterschicht 203 ermöglicht. Da Photodioden 202 einen sehr hohen Dynamikbereich aufweisen, ist bei dem erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchip eine hohe Nachweisempfindlichkeit erreichbar. Unter einem hohen Dynamikumfang wird verstanden, dass von dem Detektor elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung eines großen Intensitätsbereichs messbar ist. Die Ortsauflösung des Fluoreszenz-Biosensorchips 200 wird nicht, wie gemäß dem Stand der Technik, mittels einer Linsenoptik erzielt, sondern mittels elektrischer Auswahl eines Sensorbereiches auf der Immobilisierungs-Schicht 204, die im Wesentlichen oberhalb einer bestimmten Photodiode 202 angeordnet ist.
Wie in Fig. 2 gezeigt, ist ein Oberflächenabschnitt 211 der Immobilisierungs-Schicht 204 frei von Fängermolekülen 206, sodass an der mindestens einen unterhalb dieses Oberflächenabschnittes 211 angeordneten Referenz-Detektions- Einrichtung 202a, ein Rauschsignal abnehmbar ist. Da oberhalb der Referenz-Detektions-Einrichtung 202a keine Fängermoleküle auf der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht 204 immobilisiert sind, können sich in diesem
Oberflächenabschnitt 211 auch keine nachzuweisenden Moleküle 207 anlagern, sodass in diesem Oberflächenabschnitt 211 keine Fluoreszenzmarker 208 angeordnet sind. Daher gelangt keine Fluoreszenzstrahlung auf die Referenz-Detektions-Einrichtung 202a. Hinsichtlich der parasitären, auf die Detektions- Einrichtungen 202, 202a einfallenden elektromagnetischen Strahlung (beispielsweise anregendes Licht oder Streulicht aus der Umgebung) gilt für die Referenz-Detektions- Einrichtung 202a das Gleiche wie für die Detektions- Einrichtungen 202. Daher ist an der Referenz-Detektions- Einrichtung 202a dasjenige Rauschsignal oder Untergrundsignal oder Nullsignal abnehmbar, das von der parasitären elektromagnetischen Strahlung herrührt, und das von den Signalen aller anderen Detektions-Einrichtungen 202 abzuziehen ist, um ein Signal zu erhalten, das der Intensität des Fluoreszenzlichtes proportional ist. Diese Subtraktion wird mittels einer elektronischen Differenzschaltung durchgeführt .
Bezugnehmend auf Fig. 3 wird ein Fluoreszenz-Biosensorchip 300 gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben. Der Fluoreszenz-Biosensorchip 300 weist ein Substrat 301, eine in dem Substrat angeordnete Detektions-Einrichtung 302 zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung, eine auf dem Substrat 301 angeordnete optische Filterschicht 303 und eine auf der optischen Filterschicht 303 angeordnete
Immobilisierungs-Schicht 304 zum Immobilisieren von Fängermolekülen auf. Die Detektions-Einrichtung 302, die Filterschicht 303 und die Immobilisierungs-Schicht 304 sind in dem Fluoreszenz-Biosensorchip 300 integriert.
Die Funktionalität des Fluoreszenz-Biosensorchips 300 entspricht weitgehend dem des Fluoreszenz-Biosensorchips 200, der oben bezugnehmend auf Fig. 2 beschrieben ist. Daher wird an dieser Stelle nur auf diejenigen Merkmale eingegangen, die in der Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung 300 abweichend von der Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung 200 ausgestaltet sind.
So ist die optische Filterschicht 303 abweichend von der in Fig. 2 gezeigten optischen Filterschicht 203 als Bandfilter ausgebildet. Der genaue Aufbau der optischen Filterschicht 303 wird weiter unten bezugnehmend auf Fig. 4 beschrieben.
Die Detektions-Einrichtung 302 ist wie in Fig. 3 gezeigt als Photodiode 302 ausgebildet, die in das Substrat 301 integriert ist. Wie in Fig. 3 gezeigt, sind in das Substrat 301 weitere integrierte Schaltkreiselemente 304 eingebracht. Der Silziumdioxid-Bereich 304a dient zum elektrischen Isolieren benachbarter Photodioden 302. Die n-dotierten Siliziumbereiche 304b, 304c sind Teil der Ansteuerelektronik, mit der eine bestimmte Photodiode 302 ansteuerbar ist. Das Substrat 301 ist ein p-dotiertes Silizium-Substrat .
Darüber hinaus ist eine Schaltkreis-Schicht 306 zwischen dem Substrat 301 und der optischen Filterschicht 303 angeordnet, wobei in die Schaltkreis-Schicht 306 mindestens ein elektrisches Bauelement 306a integriert ist, und wobei die Schaltkreis-Schicht 306 mit der Detektions-Einrichtung 302 elektrisch gekoppelt ist. Wie in Fig. 3 gezeigt, bilden die integrierten Schaltkreiselemente 306a gemeinsam mit den n-dotierten Silizium-Bereichen 304b, 304c und dem p-dotierten Silizium- Substrat 301 eine transistorähnliche Anordnung aus, wobei mittels dieser transistorähnlichen Anordnung die Detektions- Einrichtung 302 elektrisch ansteuerbar ist.
Auf der Immobilisierungs-Schicht 305 sind eine Vielzahl von Fängermolekülen immobilisiert, von denen in Fig. 3 aus Gründen der Einfachheit nur ein Fängermolekül 307 eingezeichnet ist. Das in Fig. 3 gezeigte Fängermolekül 307 ist ein DNA-Halbstrang, dessen Basen 307a in Fig. 3 schematisch eingezeichnet sind.
An das Fängermolekül 307 ist ein zu dem Fängermolekül 307 komplementäres nachzuweisendes Molekül 308 angekoppelt. Das nachzuweisende Molekül 308 weist einen Fluoreszenzmarker 309 auf. Bei dem Fängermolekül 307 und bei dem nachzuweisenden Molekül 308 handelt es sich um zwei zueinander komplementäre DNA-Halbstränge .
Unter nochmaliger Bezugnahme auf Fig. 3 wird im Weiteren erläutert, auf welche Weise mittels des Fluoreszenz- Biosensorchips 300 ein Hybridisierungsereignis nachweisbar ist.
Elektromagnetische Strahlung eines dritten Wellenlängenbereichs 310, die beispielsweise von einer externen elektromagnetischen Strahlungsquelle (nicht gezeigt in Fig. 3) bereitgestellt ist, trifft auf den Fluoreszenzmarker 309 und wird von diesem teilweise absorbiert. Der Fluoreszenzmarker 309 reemittiert elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung eines vierten Wellenlängenbereichs 311, wobei ein Teil der emittierten
Fluoreszenzstrahlung auf den Fluoreszenz-Biosensorchip 300 gelangt. Die elektromagnetische Strahlung des vierten Wellenlängenbereichs 311 trifft auf die Filterschicht 303, die derart eingerichtet ist, dass die elektromagnetische Strahlung des vierten Wellenlängenbereichs 311 zumindest teilweise durch die Filterschicht 303 transmittiert wird. Dieser Teil gelangt, wie in Fig. 3 gezeigt, zu der Photodiode 302 und wird dort erfasst. Die elektromagnetische Strahlung des vierten Wellenlängenbereichs 310 wird größtenteils an der optischen Filterschicht 303 reflektiert. Dadurch gelangt im Idealfall keine elektromagnetische Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs 310 auf die Photodiode 302. Somit ist es erfindungsgemäß realisiert, dass ausschließlich nachzuweisendes Fluoreszenzlicht des vierten
Wellenlängenbereichs 311 bis zu der Detektions-Einrichtung 302 vordringt, wohingegen das Primärlicht des dritten Wellenlängenbereichs 310 nicht bis zu der Detektions- Einrichtung 302 vordringt.
Im Weiteren wird beschrieben, wie die optische Filterschicht 303 gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ausgestaltet ist. Die optische Filterschicht 303 ist als Bandfilter ausgestaltet, das ein dielektrischer Interferenzfilter mit einer Schichtenfolge aus zwei Materialien ist, wobei ein erstes Material einen hohen Brechungsindex und ein zweites Material einen niedrigen Brechungsindex aufweist. Das erste Material mit einem hohen Brechungsindex ist Siliziumnitrid, und das zweite Material mit einem niedrigen Brechungsindex ist Siliziumdioxid. Das dielektrische Interferenzfilter gemäß dem beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiel weist 31 alternierende Schichten aus abwechselnd Siliziumdioxid und Siliziumnitrid auf. Das vorliegende dielektrische Interferenzfilter wird durch folgende Nomenklatur beschrieben:
0,5H; L; (HL)"; 0,5H
Diese Nomenklatur ist wie folgt zu lesen: Mit „H" ist eine Schicht aus dem hochbrechenden Material
(d.h. aus einem Material mit einem hohen Brechungsindex) , im Beispiel Siliziumnitrid, bezeichnet. Mit „L" ist eine Schicht aus dem niederbrechenden Material mit einem kleinen Brechungsindex bezeichnet, im vorliegenden Fall Siliziumdioxid. Mit der hochgestellten Zahl 14 ist angezeigt, dass 14 alternierende Doppelschichten aus abwechselnd der hochbrechenden und niederbrechenden Schicht vorgesehen sind. Die Schichtdicken sind in Vielfachen von */4 (•: Lichtwellenlänge im Medium) angegeben. Mit */4 ist der vierte Teil der Lichtwellenlänge im Medium gemeint, d.h. der Quotient aus der Lichtwellenlänge im Vakuum und dem Brechungsindex des jeweiligen Mediums. Mit anderen Worten weist die erfindungsgemäße Filterschicht eine »/8-Schicht des hochbrechenden Materials, eine »/4-Schicht des niederbrechenden Material, 14 Doppelschichten, wobei jede der Doppelschichten aus einem • /4-Plättchen des hochbrechenden Materials und einem • /4-Plättchen des niederbrechenden Materials aufgebaut ist, sowie eine »/8-Schicht des hochbrechenden Materials auf. Dadurch wird ein
Interferenzfilter mit einer Wellenlängenabhängigkeit der Transmission, wie sie in Fig. 4 gezeigt ist, erhalten. Wie in Fig. 4 gezeigt, reflektiert ein derartig ausgestalteter dielektrischer Interferenzfilter elektromagnetische Strahlung in dem Wellenlängenbereich zwischen 350 Nanometer und 390
Nanometer zu mehr als 99%. Insbesondere ist die Wellenlänge des Reflektionsmaximums, d.h. des Transmissionsminimums in Fig. 4, bei einem festgelegten Einfallswinkel der elektromagnetischen Strahlung mittels Justage der Schichtdicke der Einzelschichten des dielektrischen Interferenzfilters einstellbar. Da die berechnete Transmission in Abhängigkeit der Wellenlänge, wie sie in Fig. 4 dargestellt ist, in einem relativ breiten Wellenlängenbereich zwischen 350 Nanometer und 390 Nanometer ein ausgeprägtes Transmissionsminimum aufweist, ist ein derartiges Filter auch zum Unterdrücken des anregenden Lichtes breitbandiger Anregungsquellen wie z.B. Leuchtdioden geeignet. Sollen spektral noch breitere Lichtquellen verwendet werden, die beispielsweise auch bei Lichtwellenlängen unterhalb der linken Flanke bei 350
Nanometer elektromagnetische Strahlung emittieren, so ist ein zusätzliches Filter erforderlich, um elektromagnetische Strahlung im unteren Wellenlängenbereich wegzufiltern. Dies kann beispielsweise mittels eines geeigneten Kantenfilters realisiert sein.
In das in Fig. 4 gezeigte Diagramm ist als gestrichelte Linie auch das Emissionsspektrum von Coumarin eingezeichnet, wie es nach einer Anregung des Farbstoffes mit elektromagnetischer Strahlung der Wellenlänge 370 Nanometer erhalten wird. Wenngleich das Emissionsspektrum von Coumarin relativ breitbandig ist, so ist doch die linke Flanke des Emissionsspektrums von Coumarin deutlich langwelliger, als die rechte Grenze desjenigen Wellenlängenbereichs, in dem das oben beschriebene optische Filter annähernd totalreflektiert. Der langwellige Durchlassbereich des dielelektrischen Interferenzfilters ist möglichst flach zu gestalten, d.h. es ist besonders günstig, über den gesamten Fluoreszenzbereich des Farbstoffs hinweg eine annähernd konstante und möglichst hohe Transmission zu gewährleisten. Dies kann mittels Variation der Schichtdicken der dielektrischen Filterschicht sowie der dafür verwendeten Materialien geschehen. Das beschriebene dielektrische Interferenzfilter ist für den erfindungsgemäßen Fluoreszenz-Biosensorchip geeignet, wenn als Fluoreszenzmarker Coumarin verwendet wird. Unter nochmaliger Bezugnahme auf Fig. 4 ist die Transmission des beschriebenen dielektrischen Interferenzfilters oberhalb etwa 415 Nanometer größer als 75%, oberhalb von 450 Nanometer größer als 92%. Dadurch wird das Fluoreszenzlicht des Farbstoffes Coumarin beim Durchgang durch die optische Filterschicht nur wenig geschwächt. Es ist nochmals zu betonen, dass für die Funktionalität des dielektrischen Interferenzfilters eine möglichst große Flankensteilheit (also ein möglichst sprunghafter Anstieg von einer Transmission Null auf eine Transmission eins) vorteilhaft ist, um das Anregungslicht gut zu unterdrücken und das Emissionsspektrum möglichst geringfügig zu dämpfen.
Im Weiteren wird der in Fig. 5A, Fig. 5B gezeigte Fluoreszenz-Biosensorchip 500 beschrieben. In Fig. 5A ist eine Draufsicht auf den Fluoreszenz- Biosensorchip 500 gezeigt, und in Fig. 5B ist eine Querschnittsansicht eines Teil des in Fig. 5A gezeigten Fluoreszenz-Biosensorchips 500 entlang der Schnittlinie I-I' gezeigt. Der in Fig. 5A, Fig. 5B gezeigte Fluoreszenz- Biosensorchip 500 ist ein drittes bevorzugtes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Fluoreszenz- Biosensorchips und unterscheidet sich nur hinsichtlich einiger Aspekte von den zuvor beschriebenen Fluoreszenz- Biosensorchips 200, 300. Im Weiteren wird nicht die komplette Funktionalität des Fluoreszenz-Biosensorchips 500 erläutert, vielmehr wird nur auf die ergänzenden Merkmale verglichen mit den zuvor beschriebenen Ausführungsbeispielen schwerpunktmäßig eingegangen.
In Fig. 5B ist ein Fluoreszenz-Biosensorchip 500 mit einem Substrat 501, mindestens einer in oder auf dem Substrat 501 angeordneten Detektions-Einrichtung 502 zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung, einer auf dem Substrat 501 angeordneten optischen Filterschicht 503 und einer auf der optischen Filterschicht 503 angeordneten Immobilisierungs- Schicht 505 zum Immobilisieren von Fängermolekülen gezeigt. Die Detektions-Einrichtungen 502, die optische Filterschicht 503 und die Immobilisierungs-Schicht 505 sind in dem Fluoreszenz-Biosensorchip 500 integriert.
Das Substrat 501 ist ein p-dotiertes Silizium-Substrat. Die Detektions-Einrichtungen 502 sind in das Substrat 501 integrierte Silizium-Photodioden. Die optische Filterschicht 503 ist gemäß dem bezugnehmend auf Fig. 5A, Fig. 5B beschriebenen Ausführungsbeispiel ein dielektrisches Interferenzfilter. Die Immobilisierungs-Schicht 505 ist eine dünne Goldschicht. Neben den Silizium-Photodioden 502 sind in das Substrat 501 Siliziumdioxid-Bereiche 504 eingebracht.
Zwischen dem Substrat 501 und der optischen Filterschicht 503 ist ferner eine Schaltkreis-Schicht 504 angeordnet, wobei in die Schaltkreis-Schicht 504 mindestens ein elektrisches Bauelement 506a integriert ist und wobei die Schaltkreis- Schicht 504 mit der mindestens einen Detektions-Einrichtung 502 elektrisch gekoppelt ist. Diese Kopplung ist in Fig. 5B explizit gezeigt. Die integrierten Schaltkreiselemente 506a, die in Fig. 5B eingezeichnet sind, sind elektrisch leitfähige Verbindungsmittel, die eine Ankopplung der Silizium- Photodioden 502 an eine Ansteuerelektronik ermöglichen.
Der Fluoreszenz-Biosensorchip 500 weist ferner eine Vielzahl von Fängermolekülen 507 auf, die mit der Immobilisierungs- Schicht 505 gekoppelt sind, und die derart eingerichtet sind, dass an die Fängermoleküle 507 ein zu dem Fängermolekül 507 komplementäres nachzuweisendes Molekül 508 ankoppelbar ist.
Mit der Bezugsziffer 507a sind die einzelnen Basen bezeichnet, welche die als DNA-Halbstrang ausgebildeten
Fängermoleküle 507 aufweisen. Wie in Fig. 5B gezeigt, sind zu den DNA-Halbsträngen 507 komplementäre nachzuweisende Moleküle 508, ebenfalls DNA-Halbstränge, an Fängermolekülen
507 angelagert. Da auch die nachzuweisenden Moleküle 508 DNA- Halbstränge sind, weisen auch die nachzuweisenden Moleküle
508 einzelne Basen 508a auf. An den nachzuweisenden Molekülen 508 sind Fluoreszenzmarker 509 angekoppelt.
Darüber hinaus ist in mindestens einen Oberflächenbereich des Fluoreszenz-Biosensorchips 500 mindestens ein Isolations- Graben 510 zum optischen Isolieren benachbarter Detektions- Einrichtungen 502 eingebracht, welcher mindestens eine Isolations-Graben 510 sich durch die Immobilisierungs-Schicht 505 hindurch bis in einen Bereich der optischen Filterschicht 503 hinein erstreckt, derart, dass unterhalb jedes Bereichs zwischen zwei benachbarten Isolations-Gräben 510 jeweils eine Detektions-Einrichtung 502 angeordnet ist. Wie in Fig. 5B gezeigt, ist der mindestens eine Isolations-Graben 510 mit einer Schicht aus einem absorbierenden Material 511 bedeckt, wobei das absorbierende Material 511 derart eingerichtet ist, dass es elektromagnetische Strahlung absorbiert.
Die Funktionalität des Isolations-Grabens 510 und des in dem Isolations-Graben 510 eingebrachten absorbierenden Materials 511 wird im Folgenden bezugnehmend auf Fig. 5B und insbesondere die darin schematisch eingezeichnete elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 512, die von dem in Fig. 5B links angeordneten Fluoreszenzmarker 509 ausgesandt wird, erläutert. Wie oben angesprochen, entsprechen die verschiedenen Detektions-Einrichtungen 502 in dem Substrat 501 den Sensorpixeln auf der Oberfläche der Immobilisierungs- Schicht 505. Anschaulich gehören all diejenigen auf der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht 505 immobilisierten Fängermoleküle 507 zu derjenigen Detektions-Einrichtung 502, die im Wesentlichen unterhalb dieses Fängermoleküls 507 angeordnet ist. So ist bezugnehmend auf Fig. 5B die linke Detektions-Einrichtung 502 zum Nachweis von Fluoreszenzstrahlung vorgesehen, die von dem linken auf der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht 505 immobilisierten
Fängermolekül 507 ausgeht. Und die rechte in Fig. 5B gezeigte Detektions-Einrichtung 502 dient dem Nachweis von Fluoreszenzstrahlung, die von einem Fluoreszenzmarker 509 herrührt, der an ein nachzuweisendes Molekül 508 angebunden ist, welches nachzuweisende Molekül 508 an ein Fängermolekül 507 angedockt ist, das sich im Wesentlichen oberhalb der rechten Detektions-Einrichtung 502 befindet.
Wie in Fig. 5B gezeigt, wird von dem linken Fluoreszenzmarker 509 elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 512 ausgesendet. Gemäß dem oben Gesagten sollte diese Fluoreszenzstrahlung, die eine indirekte Folge eines Hybridisierungsereignisses an dem linken auf der Oberfläche der Immobilisierungs-Schicht 505 angeordneten Fängermoleküls 507 ist, von der linken Detektions-Einrichtung 502 nachgewiesen werden. Die elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 512 wird aber in eine derartige Richtung ausgesendet, dass diese nicht auf die linke in Fig. 5B gezeigte Detektions-Einrichtung 502, sondern eher in Richtung der rechten Detektions-Einrichtung 502 abgestrahlt wird. Würde die elektromagnetische
Fluoreszenzstrahlung 512 von der rechten Detektions- Einrichtung 502 nachgewiesen, so würde dies die Messung verfälschen. Dieses Phänomen wird als optisches Übersprechen zwischen zwei benachbarten Sensorfeldern, die zu der linken bzw. der rechten Detektions-Einrichtung 502 gehören, bezeichnet. Mit dem teilweise mit dem absorbierenden Material 511 gefüllten Isolations-Graben 510 ist erreicht, dass das unerwünschte Phänomen des optischen Übersprechens vermindert ist.
Wie in Fig. 5B gezeigt, wird die elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 512 zwar in Richtung der rechten in Fig. 5B gezeigten Silizium-Photodiode 502 ausgesandt, jedoch muss diese elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 512 auf dem Weg zu der rechten Silizium-Photodiode 502 den Isolations-Graben 510 und das darin teilweise eingefüllte absorbierende Material 511 durchlaufen. Das absorbierende Material 511 ist derart eingerichtet, dass dadurch elektromagnetische Strahlung insbesondere in dem Wellenlängenbereich der Fluoreszenzstrahlung der verwendeten Fluoreszenzmarker 509 absorbiert wird. Dadurch wird die elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 512 in dem absorbierenden Material 511 in dem Isolations-Graben 510 absorbiert und kann daher nicht zu der rechten in Fig. 5B gezeigten Detektions-Einrichtung 502 gelangen. Dadurch ist optisches Übersprechen zwischen benachbarten Sensorfeldern vermindert .
Wie jedoch in Fig. 5B gezeigt ist, kann mittels der mit einem absorbierenden Material 511 gefüllten Isolations-Gräben 510 nicht vollständig optisches Übersprechen verhindert werden. Diesbezüglich sei auf die elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 513 verwiesen, die von dem rechten in Fig. 5B gezeigten Fluoreszenzmarker 509 ausgesendet wird. Die Fluoreszenzstrahlung 513 wird ebenfalls nicht in Richtung der im Wesentlichen darunter liegenden Detektions-Einrichtung 502 ausgesendet, sondern eher in Richtung der links des Fluoreszenzmarkers 509 angeordneten Detektions-Einrichtung 502. Aufgrund der in Fig. 5B gezeigten geometrischen Gegebenheiten wird die elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 513 nicht von dem absorbierenden Material 511 in dem Isolations-Graben 510 absorbiert. Diese Ausführungen zeigen, dass der Isolations-Graben 510 und das absorbierende Material 511 allein optisches Übersprechen nicht in jedem Falle vollständig unterbinden.
Um optisches Übersprechen weiter zu vermindern, ist in mindestens einem Bereich der Schaltkreis-Schicht 504 eine Barriereschicht 514 aus einem absorbierenden Material angeordnet, derart, dass unterhalb jedes Bereichs zwischen zwei benachbarten Barriereschichten 514 jeweils eine Detektions-Einrichtung 502 angeordnet ist, wobei das absorbierende Material derart eingerichtet ist, dass es elektromagnetische Strahlung absorbiert. Die Barriereschicht
514 absorbiert die elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung 513. Dadurch ist mittels der Barriereschicht 514 das nachteilige Phänomen des optischen Übersprechens vermindert. Es ist diesbezüglich darauf hinzuweisen, dass auch die integrierten Schaltkreiselemente 506a neben ihrer elektronischen Funktionalität (beispielsweise als elektrisch leitfähige Verbindungsmittel) auch die Funktion der absorbierenden Barriereschicht 514 mitübernehmen können. Dazu sind die integrierten Schaltkreiselemente 506a aus einem elektromagnetische Strahlung absorbierenden und/oder reflektierenden Material herzustellen. Die integrierten Schaltkreiselemente 506a können also eine Doppelfunktion wahrnehmen: Einerseits können sie als elektronische Schaltkreiselemente dienen, andererseits können sie dazu beitragen, das Phänomen des optischen ÜberSprechens zu vermindern .
In Fig. 5A ist eine Draufsicht auf den Fluoreszenz- Biosensorchip 500 gemäß dem beschriebenen Ausführungsbeispiel der Erfindung gezeigt. Insbesondere ist der Isolations-Graben 510, der gemäß dem gezeigten Ausführungsbeispiels als zusammenhängender Isolationsbereich ausgestaltet ist, in Fig. 5A gezeigt. Ferner sind die einzelnen Sensorfeider 515, 516, die durch die Bereiche zwischen den Isolations-Gräben 510 definiert sind, und die mit Fängermolekülen 507 belegt sind, in Fig. 5A gezeigt. Insbesondere sind die Sensorfelder
515 und 516 gezeigt, die in Fig. 5B als vergrößerter Querschnitt entlang der Schnittlinie I-I' gezeigt sind. Im Folgenden wird das Schaltschema zum Ansteuern und Abtasten jeder einzelnen der Detektions-Einrichtungen gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des Fluoreszenz- Biosensorchips 600 beschrieben, der in Fig. 6A schematisch in Draufsicht gezeigt ist. In Fig. 6A ist eine im Wesentlichen matrixförmige Anordnung von Sensorfeldern 601 gezeigt. Dabei entspricht die in Fig. 6A gewählte Darstellung im Wesentlichen der Darstellung des Fluoreszenz-Biosensorchips 500 in Fig. 5A. In Fig. 5A nicht gezeigt und in Fig. 6A im
Detail gezeigt ist die Schaltungstechnik, mittels derer jedes einzelne der Sensorfelder 601 des Fluoreszenz-Biosensorchips 600 ansteuerbar ist. Die Ansteuerbarkeit einer bestimmten Zeile und die Ansteuerbarkeit einer bestimmten Spalte der matrixförmig angeordneten Sensorfelder 601 ist mittels der Ansteuerschaltung 602 realisiert.
Mittels der Ansteuerschaltung 602 ist mittels der Zeilenauswahl-Leitungen 603 und der Spaltenauswahl-Leitungen 604 jedes einzelne Sensorfeld 601 ansteuerbar.
Es ist zu betonen, dass die Zahl der Zeilenauswahl-Leitungen 603 (im Beispiel sechs) und der Spaltenauswahl-Leitungen 604 (im Beispiel sechs) von der Anzahl der Sensorfelder 601 abhängt. Ist die Zahl der Spalten des Sensorfeldes gleich 2m, so sind 2m Zeilenauswahl-Leitungen 603 erforderlich. Ist die Zahl der Spalten der Sensorfelder 601 gleich 2n, so sind zum sequentiellen Ansteuern aller Spalten 2n Spaltenauswahl- Leitungen 604 erforderlich.
Im in Fig. 6A gezeigten Beispiel sind 8 = 23 Zeilen und 8 = 23 Spalten von Sensorfeldern 601 gezeigt, sodass 6 = 2 x 3 Zeilenauswahl-Leitungen 603 und 6 = 2 x 3 Spaltenauswahl- Leitungen 604 vorgesehen sind.
Wie in Fig. 6A gezeigt, sind die einzelnen Zeilenauswahl- Leitungen 603 voneinander teilweise abhängig. Die
Zeilenauswahl-Leitungen 603 sind mit ZI, ZI, Z2 , Z2 , Z3 und
Z3 bezeichnet. Dies bedeutet, dass wenn das Signal der Zeilenauswahl-Leitung ZI auf einem logischen Wert „1" ist, das Signal der Zeilenauswahl-Leitung ZI auf einem logischen Wert „0" ist. Und wenn das Signal der Zeilenauswahl-Leitung ZI auf einem logischen Wert „0" ist, ist das Signal der Zeilenauswahl-Leitung ZI auf einem logischen Wert „1". Die
Signale an ZI und an ZI liegen also immer auf zueinander entgegengesetzten logischen Werten. Analog liegen auch die
Zeilenauswahl-Leitungen 603 Z2 und Z2 auf zueinander komplementären Werten. Auch die Zeilenauswahl-Leitungen 603 Z3 und Z3 liegen auf zueinander komplementären Werten.
Dasselbe gilt für die Spaltenauswahl-Leitungen 604, die mit
Sl , Sl , S2 , S2 , S3 und S3 bezeichnet sind. Die Signale an Sl und Sl liegen stets auf zueinander komplementären logischen
Werten, die Signale an S2 und S2 liegen stets auf zueinander komplementären Werten und die Signale an S3 und S3 liegen stets auf zueinander komplementären Werten.
Jedes der Sensorfelder 601 ist mit drei der gemäß dem in Fig. 6A gezeigten Ausführungsbeispiel sechs Zeilenauswahl- Leitungen 603 gekoppelt und ist mit drei der gemäß dem in
Fig. 6A gezeigten Ausführungsbeispiel sechs Spaltenauswahl- Leitungen 604 gekoppelt.
Im Folgenden wird exemplarisch erläutert, wie das in Fig. 6A gezeigte ausgewählte Sensorfeld 601a mittels der gezeigten Ansteuerschaltung 602 ansteuerbar ist.
Wie in Fig. 6B gezeigt, ist das ausgewählte Sensorfeld 601a mit einer ersten, einer zweiten und einer dritten Zeilenauswahl-Leitung 603a, 603b und 603c gekoppelt. Wiederum bezugnehmend auf Fig. 6A ist die erste Zeilenauswahl-Leitung 603a ZI, die zweite Zeilenauswahl-Leitung 603b Z2 und die dritte Zeilenauswahl-Leitung 603c Z3. Darüber hinaus ist das ausgewählte Sensorfeld 601a mit einer ersten, einer zweiten und einer dritten Spaltenauswahl-Leitung 604a, 604b, 604c gekoppelt. Bezugnehmend auf Fig. 6A sind dies die erste Spaltenauswahl-Leitung 604a Sl , die zweite Spaltenauswahl- Leitung 604b S2 und die dritte Spaltenauswahl-Leitung 604c
S3.
Innerhalb des ausgewählten Sensorfeldes 601a ist eine
Photodiode 605 angeordnet, die im Wesentlichen einer der in Fig. 5A gezeigten Detektions-Einrichtungen 502 entspricht.
In Fig. 6B ist schematisch mit zwei Pfeilen mit der Bezugsziffer 606 angedeutet, dass die Photodiode 605 derart eingerichtet ist, dass damit elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung nachweisbar ist. Trifft auf die Photodiode 605 elektromagnetische Strahlung 606 ein, so ändern sich die elektrischen Eigenschaften der Photodiode 605 in charakteristischer Art und Weise und es liegt an der Source eines mit der Photodiode 605 gekoppelten ersten Transistors 607a ein elektrisches Signal an. Dieses Signal kann den ersten Transistor 607a nur dann passieren, wenn an dem Gate-Bereich des ersten Transistors 607a ein Spannungssignal anliegt und daher zwischen dem Source-Bereich und dem Drain-Bereich ein leitender Kanal ausgebildet ist, d.h. wenn an der ersten Spaltenauswahl-Leitung 604a ein
Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt, also wenn an Sl ein Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt. Ist dies der Fall, so kann das elektrische Signal der Photodiode 605 von dem Source-Bereich zu den Drain-Bereich des Transistors 607a gelangen und gelangt von dort weiter zu dem Source-Bereich des zweiten Transistors 607b.
Das elektrische Signal, das an dem Source-Bereich des zweiten
Transistors 607b anliegt, kann nur dann zu dem Drain-Bereich des zweiten Transistors 607b gelangen, wenn an dem Gate- Bereich des Transistors zweiten 607b ein Spannungssignal anliegt und daher zwischen dem Source-Bereich und dem Drain- Bereich ein leitender Kanal ausgebildet ist, d.h. wenn das an der zweiten Spaltenauswahl-Leitung 604b anliegende elektrische Signal einen logischen Wert „1" aufweist, also wenn an S2 ein Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt. In diesem Fall gelangt das elektrische Signal von dem Source- Bereich des zweiten Transistors 607b zu dem Drain-Bereich des zweiten Transistors 607b und von dort aus zu dem Source- Bereich des dritten Transistors 607c. Das an dem Source- Bereich des dritten Transistors 607c anliegende elektrische Signal kann nur dann zu dem Drain-Bereich des dritten Transistors 607c gelangen, wenn an dem Gate-Bereich des dritten Transistors 607c ein Spannungssignal anliegt und daher zwischen dem Source-Bereich und dem Drain-Bereich ein leitender Kanal ausgebildet ist, d.h. wenn an der dritten
Spaltenauswahl-Leitung 604c und damit an S3 ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt. Ist dies der Fall, so gelangt das elektrische Signal von dem Source- Bereich des dritten Transistors 607c zu dem Drain-Bereich des dritten Transistors 607c und von dort aus zu dem elektrischen Knoten 608. Dadurch ist die das ausgewählte Sensorfeld 601a aufweisende sechste Spalte von Sensorfeldern 601 ausgewählt. Mit anderen Worten ist die auszuwählende Spalte der Sensorfelder 601 von den an den Spaltenauswahl-Leitungen 603 anliegenden logischen Werten abhängig.
Um das ausgewählte Sensorfeld 601a auszuwählen, ist neben der Auswahl der entsprechenden Spalte von Sensorfeldern 601 auch die Auswahl der korrekten Zeile von Sensorfeldern 601 erforderlich. Im Weiteren wird beschrieben, wie eine Zeile von Sensorfeldern 601 auswählbar ist. Der in Fig. 6B gezeigte elektrische Knotenpunkt 608 ist mit dem Source-Bereich eines vierten Transistors 609a gekoppelt. Das an dem Source-Bereich des vierten Transistors 609a anliegende elektrische Signal kann nur dann zu dem Drain-Bereich des vierten Transistors
609a gelangen, wenn an dem Gate-Bereich des vierten Transistors 609a ein Spannungssignal anliegt und daher zwischen dem Source-Bereich und dem Drain-Bereich ein leitender Kanal ausgebildet ist, d.h. genau dann, wenn an der mit dem Gate-Bereich des vierten Transistors 609a gekoppelten ersten Zeilenauswahl-Leitung 603a ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt, also wenn an ZI ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt. Ist dies der Fall, so kann das an dem Source-Bereich des vierten Transistors 609a anliegende elektrische Signal zu dem Drain- Bereich des vierten Transistors 609a gelangen und kann von dort aus zu dem Source-Bereich des fünften Transistors 609b gelangen. Das an dem Source-Bereich des fünften Transistors 609b anliegende elektrische Signal kann genau dann zu dem
Drain-Bereich des fünften Transistors 609b gelangen, wenn die mit dem Gate-Bereich des fünften Transistors 609b gekoppelte zweite Zeilenauswahl-Leitung 603b mit einem elektrischen Signal mit einem logischen Wert „1" belegt ist. Das bedeutet, dass an der mit Z2 bezeichneten zweite Zeilenauswahl-Leitung 603b ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „1" anliegen muss. In diesem Falle gelangt das an dem Source- Bereich des fünften Transistors 609b anliegende elektrische Signal zu dem Drain-Bereich des fünften Transistors 609b und von dort aus zu dem Source-Bereich des damit gekoppelten sechsten Transistors 609c. Wiederum kann das an dem Source- Bereich des sechsten Transistors 609c anliegende elektrische Signal nur dann zu dem Drain-Bereich des sechsten Transistors 609c gelangen, wenn an dem Gate-Bereich des sechsten Transistors 609c ein Spannungssignal anliegt und daher zwischen dem Source-Bereich und dem Drain-Bereich ein leitender Kanal ausgebildet ist, d.h. wenn an der dritten Zeilenauswahl-Leitung 603c ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt, also wenn an Z3 ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt. Nur in diesem
Fall kann das an dem Source-Bereich des sechsten Transistors 609c anliegende elektrische Signal zu dem Drain-Bereich des sechsten Transistors 609c gelangen. Ist auch diese Bedingung erfüllt, so ist die dem ausgewählten Sensorfeld 601a zugehörige zweite Zeile von Sensorfeldern 601 ausgewählt.
Das ausgewählte Sensorfeld 601a ist also genau dann ausgewählt, wenn an der ersten Spaltenauswahl-Leitung 604a Sl und an der zweiten Spaltenauswahl-Leitung 604b S2 und an der dritten Spaltenauswahl-Leitung 604c S3 und an der ersten
Zeilenauswahl-Leitung 603a ZI und an der zweiten Zeilenauswahl-Leitung 603b Z2 und an der dritten
Zeilenauswahl-Leitung 603c Z3 jeweils ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „1" anliegt. Liegt auch nur an einer der sechs genannten Auswahl-Leitungen 603a, 603b, 603c, 604a, 604b, 604c ein elektrisches Signal mit einem logischen Wert „0" an, so ist das entsprechende Sensorfeld nicht ausgewählt. Sind sowohl Zeile als auch Spalte des ausgewählten Sensorfeldes 601a ausgewählt, so gelangt das von der Photodiode 605 detektierte elektrische Signal zu dem Mittel zum Erfassen des elektrischen Stroms 610 bzw. zu dem Mittel zum Erfassen der elektrischen Spannung 611. Dadurch ist ein bestimmtes ausgewähltes Sensorfeld 601a auswählbar und die Stärke des an der Detektions-Einrichtung 605 des ausgewählten Sensorfeldes 601a anliegenden elektrischen Sensorsignals auslesbar.
In Fig. 7 ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiels einer Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung 700 gezeigt, die im Weiteren näher erläutert wird. Die Fluoreszenz-Biosensorchip- Anordnung 700 weist einen Fluoreszenz-Biosensorchip 700a und eine elektromagnetische Strahlungsquelle 705 auf. Der Fluoreszenz-Biosensorchip 700a weist ein Substrat 701, sechs in dem Substrat 701 angeordnete Detektions-Einrichtungen 702 zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung eines ersten Wellenlängenbereichs, eine auf dem Substrat 701 angeordnete optische Filterschicht 703 zum Absorbieren und/oder Reflektieren von elektromagnetischer Strahlung eines zweiten Wellenlängenbereichs und eine auf der optischen Filterschicht 703 angeordnete Immobilisierungs-Schicht 704 zum Immobilisieren von Fängermolekülen auf. Die Detektions- Einrichtungen 702, die optische Filterschicht 703 und die Immobilisierungs-Schicht 704 sind in dem Fluoreszenz- Biosensorchip 700a integriert. Die elektromagnetische Strahlungsquelle 705 ist derart eingerichtet, dass mittels der elektromagnetischen Strahlungsquelle 705 ein Oberflächenbereich des Fluoreszenz-Biosensorchips 700a mit elektromagnetischer Strahlung eines dritten Wellenlängenbereichs bestrahlbar ist.
Wie in Fig. 7 gezeigt, weist der Fluoreszenz-Biosensorchip 700a eine Schaltkreis-Schicht 706 auf, die zwischen dem Substrat 701 und der optischen Filterschicht 703 angeordnet ist.
Die elektromagnetische Strahlungsquelle 705 ist ein Laser.
Gemäß dem in Fig. 7 gezeigten Ausführungsbeispiel der Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung 700 weist der Fluoreszenz-Biosensorchip 700a eine Vielzahl von Fängermolekülen 707 auf, die mit der Immobilisierungs-Schicht 704 gekoppelt sind, und die derart eingerichtet sind, dass an die Fängermoleküle 707 ein zu dem Fängermolekül 707 komplementäres nachzuweisendes Molekül 708 ankoppelbar ist. Jedes nachzuweisende Molekül 708 weist einen Fluoreszenzmarker 709 auf, der derart eingerichtet ist, dass er zumindest teilweise elektromagnetische Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs absorbiert und nach erfolgter Absorption elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängenbereichs emittiert. Zumindest ein Teil des dritten Wellenlängenbereichs liegt außerhalb des vierten Wellenlängenbereichs und zumindest ein Teil des vierten Wellenlängenbereichs liegt innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs. Zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs liegt außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs. Auch sind in Fig. 7 Moleküle 710 mit Fluoreszenzmarkern 711 gezeigt, die zu den Fängermolekülen 707 nicht komplementär sind und daher an diese nicht ankoppeln.
In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
[I] WO 99/38612
[2] WO 00/12759
[3] WO 99/27140
[4] Vo-Dinh, T (1998) "Development of a DNA biochip: principle and applications" Sensors and Actuators B51:52- 59
[5] Kong, SH, Correia, G, de Graaf, G, Bartek, M,
Wolfenbuttel, RF (1998) "CMOS compatible optical sensors with thin film interference filters : fabrication and characterization" Workshop on Semiconductor Advances on Future Electronics SAFE '98, 291-294
(http: //www. stw.nl/programmas/safe/safe98/proceedings/kon g.pdf )
[6] US 5 648 653
[7] DE 197 31 479 AI
[8] DE 199 40 752 AI
[9] DE 199 40 751 AI
[10] DE 100 38 080 AI
[II] JP 2000235035 A
[12] WO 01/03833 AI
[13] DE 199 47 616 AI Bezugszeichenliste
100 Fluoreszenz-Biosensorchip
101 Lichtquelle 101a Licht
102 Lichtquellenfilter
103 Biochip
104 Linse
105 Sensorfilter 106 CCD-Sensoranordnung
110 Fluoreszenz-Biosensorchip
111 Lichtquelle lila Licht
112 optisches Element 113 Lichtquellenfilter
114 Reflektor-Element
115 Probenhalter
116 Kavitäten
117 Sensorfilter 118 Photodetektoren 119 Biochip
200 Fluoreszenz-Biosensorchip
201 Substrat
202 Detektions-Einrichtung 202a Referenz-Detektions-Einrichtung
203 optische Filterschicht
204 Immobilisierungs-Schicht
205 Schaltkreis-Schicht 206 Fängermolekül 207 nachzuweisendes Molekül
208 Fluoreszenzmarker
209 Moleküle
210 Fluoreszenzmarker
211 von Fängermolekülen freier Oberflächenabschnitt 300 Fluoreszenz-Biosensorchip
301 p-dotiertes Silizium-Substrat
302 Detektions-Einrichtung
303 optische Filterschicht
304 integrierte Schaltkreiselemente 304a Siliziumdioxid-Bereich 304b n-dotierter Silizium-Bereich 304c n-dotierter Silizium-Bereich 305 Immobilisierungs-Schicht 306 Schaltkreis-Schicht
306a integrierte Schaltkreiselemente 307 Fängermolekül 307a Basen
308 nachzuweisendes Molekül 309 Fluoreszenzmarker
310 elektromagnetische Strahlung eines dritten Wellenlängen-Bereichs
311 elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängen-Bereichs 500 Fluoreszenz-Biosensorchip
501 p-dotiertes Silizium-Substrat
502 Detektions-Einrichtungen
503 optische Filterschicht
504 Siliziumdioxid-Bereich 505 Immobilisierungs-Schicht
506 Schaltkreis-Schicht
506a integrierte Schaltkreiselemente
507 Fängermolekül 507a Basen 508 nachzuweisendes Molekül 508a Basen
509 Fluoreszenzmarker
510 Isolations-Graben
511 absorbierendes Material 512 elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung
513 elektromagnetische Fluoreszenzstrahlung
514 Barriere-Schicht
515 Sensorfeld
516 Sensorfeld 600 Fluoreszenz-Biosensorchip
601 Sensorfeld
601a ausgewähltes Sensorfeld
602 Ansteuerschaltung
603 Zeilenauswahl-Leitungen 603a erste Zeilenauswahl-Leitung 603b zweite Zeilenauswahl-Leitung 603c dritte Zeilenauswahl-Leitung
604 Spaltenauswahl-Leitungen 604a erste Spaltenauswahl-Leitung 604b zweite Spaltenauswahl-Leitung 604c dritte Spaltenauswahl-Leitung
605 Photodiode
606 Pfeile 607a erster Transistor
607b zweiter Transistor
607c dritter Transistor
608 elektrischer Knotenpunkt
609a vierter Transistor 609b fünfter Transistor
609c sechster Transistor
610 Mittel zum Erfassen des elektrischen Stroms
611 Mittel zum Erfassen der elektrischen Spannung
700 Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung 700a Fluoreszenz-Biosensorchip
701 Substrat
702 Detektions-Einrichtung
703 optische Filterschicht
704 Immobilisierungs-Schicht 705 elektromagnetische Strahlungsquelle
706 Schaltkreis-Schicht
707 Fängermolekül
708 nachzuweisendes Molekül
709 Fluoreszenzmarker 710 Moleküle
711 Fluoreszenzmarker

Claims

Patentansprüche
1. Fluoreszenz-Biosensorchip
• mit einem Substrat; • mit mindestens einer in oder auf dem Substrat angeordneten Detektions-Einrichtung zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung;
• mit einer auf dem Substrat angeordneten optischen Fi1terschicht; • mit einer auf der optischen Filterschicht angeordneten Immobilisierungs-Schicht zum Immobilisieren von Fängermolekülen;
• wobei die Detektions-Einrichtung, die optische Filterschicht und die Immobilisierungs-Schicht in dem Fluoreszenz-Biosensorchip integriert sind.
2. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 1, bei dem das Substrat aus Silizium-Material hergestellt ist.
3. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die mindestens eine Detektions-Einrichtung eine Photodiode aufweist, die derart eingerichtet ist, dass damit elektromagnetische Strahlung eines ersten Wellenlängenbereichs detektierbar ist.
4. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 3, bei dem die optische Filterschicht derart eingerichtet ist, dass die optische Filterschicht elektromagnetische Strahlung eines zweiten Wellenlängenbereichs reflektiert und/oder absorbiert, wobei zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs liegt.
5. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die optische Filterschicht mindestens ein Bandfilter und/oder mindestens ein Kantenfilter aufweist.
6. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 5, bei dem das Bandfilter ein dielektrisches Interferenzfilter mit einer Schichtenfolge aus mindestens zwei Materialien ist, wobei ein erstes Material einen hohen Brechungsindex und ein zweites Material einen niedrigen Brechungsindex aufweist.
7. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 5, bei dem das Kantenfilter ein aus einem organischen Material hergestelltes Farbfilter ist.
8. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 6, bei dem das erste Material eines oder eine Kombination der chemischen Elemente und Verbindungen
Titanoxid
Siliziumnitrid
Hafniumoxid
Zirkoniumoxid
Aluminiumoxid
Poly-Silizium
Indium-Zinn-Oxid und
Siliziumdioxid st.
9. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 6 bis 8, bei dem das zweite Material eines oder eine Kombination der chemischen Elemente und Verbindungen
Titanoxid Siliziumnitrid Hafniumoxid Zirkoniumoxid Aluminiumoxid Poly-Silizium Indium-Zinn-Oxid, und Siliziumdioxid st.
10. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Immobilisierungs-Schicht eines oder eine Kombination der Materialien
• Siliziumdioxid
• Siliziumnitrid
• Gold und/oder • organisches Material aufweist.
11. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, der ferner eine Schaltkreis-Schicht zwischen dem Substrat und der optischen Filterschicht aufweist,
• wobei in die Schaltkreis-Schicht mindestens ein elektrisches Bauelement integriert ist;
• wobei die Schaltkreis-Schicht mit der mindestens einen Detektions-Einrichtung elektrisch gekoppelt ist.
12. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 11, bei dem die Schaltkreis-Schicht derart eingerichtet ist, dass mittels der Schaltkreis-Schicht die mindestens eine Detektions-Einrichtung elektrisch ansteuerbar ist.
13. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit einer Vielzahl von Fängermolekülen, die mit der Immobilisierungs-Schicht gekoppelt sind, und die derart eingerichtet sind, dass an jedes der Fängermoleküle ein zu dem Fängermolekül komplementäres nachzuweisendes Molekül ankoppelbar ist.
14. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 13, bei dem die Fängermoleküle
• Nukleinsäuren • Peptide
• Proteine oder
• niedermolekulare Verbindungen sind.
15. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 13 oder 14, bei dem ein Oberflächenabschnitt der Immobilisierungs-Schicht frei von Fängermolekülen ist, so dass an der mindestens einen unterhalb dieses Oberflächenabschnittes angeordneten Detektions-Einrichtung ein Rauschsignal abnehmbar ist.
16. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem jedes nachzuweisende Molekül mindestens einen Fluoreszenzmarker aufweist,
• wobei der Fluoreszenzmarker derart eingerichtet ist, dass er elektromagnetische Strahlung eines dritten Wellenlängenbereichs absorbiert und nach erfolgter Absorption elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängenbereichs emittiert;
• wobei zumindest ein Teil des dritten Wellenlängenbereichs außerhalb des vierten Wellenlängenbereich liegt;
• wobei zumindest ein Teil des vierten Wellenlängenbereichs innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs liegt.
17. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 16, bei dem der Fluoreszenzmarker eines der Materialien
Coumarin
FITC
Cy2
Alexa Fluor 488
BODIPY 493
Rhodamine 123 R6G
TET
JOE
HEX
BODIPY 530
Alexa 532
R-Phycoerythrin
TRITC
Cy3
TAMRA
Texas Red
ROX
BODIPY 630 und
Cy5 st,
18. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 1 bis
17, bei dem in mindestens einen Oberflächenbereich des Fluoreszenz-Biosensorchips mindestens ein Isolations-Graben zum optischen Isolieren benachbarter Detektions-Einrichtungen eingebracht ist, welcher mindestens eine Isolations-Graben sich durch die Immobilisierungs-Schicht hindurch bis in einen Bereich der optischen Filterschicht hineinerstreckt, derart, dass unterhalb jedes Bereichs zwischen zwei benachbarten Isolations-Gräben jeweils eine Detektions-Einrichtung angeordnet ist.
19. Fluoreszenz-Biosensorchip nach Anspruch 18, bei dem mindestens ein Teil der Oberfläche des mindestens einen Isolations-Grabens mit einer Schicht aus einem absorbierenden Material bedeckt ist oder bei dem mindestens einer der Gräben mit einem absorbierenden Material gefüllt ist, wobei das absorbierende Material derart eingerichtet ist, dass es elektromagnetische Strahlung zumindest des jeweiligen Wellenlängenbereichs bzw. der jeweiligen Wellenlängenbereiche absorbiert oder reflektiert.
20. Fluoreszenz-Biosensorchip nach einem der Ansprüche 11 bis 19, bei dem in mindestens einem Bereich der Schaltkreis-Schicht eine Barriere-Schicht aus einem absorbierenden Material vorgesehen ist, derart, dass unterhalb jedes Bereichs zwischen zwei benachbarten Barriere-Schichten jeweils eine Detektions-Einrichtung angeordnet ist, wobei das absorbierende Material derart eingerichtet ist, dass es elektromagnetische Strahlung zumindest des jeweiligen Wellenlängenbereichs bzw. der jeweiligen Wellenlängenbereiche absorbiert oder reflektiert.
21. Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung
• mit einem Fluoreszenz-Biosensorchip, der aufweist o ein Substrat; o mindestens eine in oder auf dem Substrat angeordnete Detektions-Einrichtung zum Erfassen von elektromagnetischer Strahlung eines ersten Wellenlängenbereichs ; o eine auf dem Substrat angeordnete optische
Filterschicht zum Absorbieren und/oder Reflektieren von elektromagnetischer Strahlung eines zweiten
Wellenlängenbereichs ; o eine auf der optischen Filterschicht angeordnete Immobilisierungs-Schicht zum Immobilisieren von Fängermolekülen; o wobei die Detektions-Einrichtung, die optische
Filterschicht und die Immobilisierungs-Schicht in dem Fluoreszenz-Biosensorchip integriert sind; und
• mit einer elektromagnetischen Strahlungsquelle, die derart eingerichtet ist, dass mittels der elektromagnetischen Strahlungsquelle ein
Oberflächenbereich des Fluoreszenz-Biosensorchips mit elektromagnetischer Strahlung eines dritten Wellenlängenbereichs bestrahlbar ist.
22. Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung nach Anspruch 21, bei dem die elektromagnetische Strahlungsquelle ein Laser eine Leuchtdiode eine Gasentladungslampe oder eine Glühlampe st.
23. Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung nach Anspruch 21 oder 22, bei welcher der Fluoreszenz-Biosensorchip einer Vielzahl von Fängermolekülen aufweist, die mit der Immobilisierungs- Schicht gekoppelt sind, und die derart eingerichtet sind, dass an die Fängermoleküle ein zu dem Fängermolekül komplementäres nachzuweisendes Molekül ankoppelbar ist.
24. Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung nach Anspruch 23, bei dem die nachzuweisenden Moleküle und/oder die
Fängermoleküle einen Fluoreszenzmarker aufweisen,
• wobei der Fluoreszenzmarker derart eingerichtet ist, dass er zumindest teilweise elektromagnetische Strahlung des dritten Wellenlängenbereichs absorbiert und nach erfolgter Absorption elektromagnetische Strahlung eines vierten Wellenlängenbereichs emittiert;
• wobei zumindest ein Teil des dritten Wellenlängenbereichs außerhalb des vierten Wellenlängenbereichs liegt; • wobei zumindest ein Teil des vierten
Wellenlängenbereichs innerhalb des ersten Wellenlängenbereichs liegt.
25. Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung nach Anspruch 21, die derart eingerichtet ist, dass zumindest ein Teil des ersten Wellenlängenbereichs außerhalb des zweiten Wellenlängenbereichs liegt.
26. Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, bei dem die elektromagnetische Strahlungsquelle derart ausrichtbar ist, dass die von der elektromagnetischen
Strahlungsquelle emittierte elektromagnetische Strahlung unter einem vorgebbaren Winkel zur Normalen-Richtung der optischen Filterschicht einfällt.
27. Fluoreszenz-Biosensorchip-Anordnung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, bei dem die elektromagnetische Strahlungsquelle derart eingerichtet ist, dass die von der elektromagnetischen Strahlungsquelle emittierte elektromagnetische Strahlung in Pulsen emittierbar ist, und bei dem die Detektions- Einrichtungen derart eingerichtet sind, dass die von den Fluoreszenzmarkern emittierte elektromagnetische Strahlung in den Zeitintervallen zwischen den Pulsen mittels der Detektions-Einrichtungen detektierbar ist.
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