ES2266297T3 - Procedimiento y equipo de analisis para la deteccion de analitos en una muestra. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección de analitos en una muestra, caracterizado porque el procedimiento comprende las siguientes fases: - marcaje con fluorescencia, como mínimo, de una población de micropartículas, estando la población de micropartículas marcada, como mínimo, con un colorante fluorescente que sirve para la fluorescencia de codificación, y, como mínimo, con un colorante fluorescente que sirve para la fluorescencia de comparación; - enlace o conjugación de moléculas aceptoras a la población de micropartículas; - inmovilización de la población de micropartículas en un sustrato; - incubación de la población de micropartículas con la muestra; - marcaje del analito o analitos, como mínimo, con una fluorescencia de referencia; y - detección del analito o analitos mediante la comparación de las fluorescencias de las micropartículas con la fluorescencia de referencia.
Description
Procedimiento y equipo de análisis para la
detección de analitos en una muestra.
La presente invención se refiere a un
procedimiento eficaz y económico, para la detección de analitos en
una muestra, así como a un equipo de análisis.
A los efectos de la invención, con el término
analito se entienden estructuras químicas y/o biológicas, siendo
estructuras biológicas todas las moléculas, que son constituidas
por organismos, o bien absorbidas o liberadas por los mismos, y con
el término estructuras químicas se entienden todos los compuestos,
que son capaces de interaccionar con otras moléculas de manera que
resulta posible su detección. A los efectos de la presente
invención, una muestra es un producto extraído mediante toma de
muestra, o bien una parte o una pequeña cantidad del mismo cuya
naturaleza ha de ser analizada física, química y/o biológicamente.
Las muestras biológicas son, por ejemplo, una parte o una cantidad
pequeña de suero, sangre, orina, aire de la respiración, líquido
lacrimal o similar. Sin embargo, también son muestras, de acuerdo
con la invención, cantidades parciales tomadas de aguas residuales,
de residuos de procesos industriales, lodos u otros líquidos
medioambientales.
Según el estado de la técnica, se conocen
múltiples procedimientos para la detección de analitos. En el
ámbito del diagnóstico y la investigación biológica o clínica, los
analitos a examinar pueden ser, por ejemplo, proteínas, péptidos,
ácidos nucleicos, segmentos secuenciales, hidratos de carbono,
lípidos y/o estructuras antigénicas.
El valor informativo de un estudio paramétrico
puede ser ampliado y mejorado mediante la detección paralela de una
mayor cantidad de datos a partir de una sola muestra, el denominado
análisis multiparamétrico o análisis de múltiples ligandos. La
detección paralela requiere, por ejemplo, también una
miniaturización, mediante la cual se deja aumentar considerablemente
el número de parámetros y ligandos detectables. Con la tecnología
ADN miniaturizada es posible analizar más de 10^{6} parámetros
por cm^{2}, con lo que se consigue un grado de miniaturización de
menos de 10 \mum^{2}/parámetro en un chip. El posicionamiento
bidimensional de moléculas aceptoras (que interaccionan con los
ligandos) en un chip, por ejemplo, mediante litografía electrónica
u otros procedimientos como la técnica de impresión piezoeléctrica,
requiere que, para cada equipo reactivo, se ha de repetir el
procedimiento de posicionamiento sobre el sustrato para todas las
moléculas aceptoras del mismo modo, para asegurar su disposición
regular (el llamado "array") sobre el sustrato.
Sin embargo, los procedimientos costosos, que se
requieren para la litografía electrónica, sólo son aptos para
campos de aplicación especiales como estudios fármacogenéticos.
Como alternativa a los procedimientos
mencionados, se describen también, por lo tanto, según el estado de
la técnica, las micropartículas como un "array" de ADN. Un
"array" de micropartículas de este tipo se basa en que varias
suspensiones de poblaciones de micropartículas, que presentan
diferentes marcas discretamente fluorescentes, se conjugan con
moléculas aceptoras específicas (Lackner y otros, 1999, Medgen 11,
páginas 16-17). Una vez conjugadas las moléculas
aceptoras, se mezclan las suspensiones individuales de las
distintas poblaciones de micropartículas, y de esta mezcla se añade
una parte alícuota a la solución de la muestra, de manera que la
carga reactiva contiene partículas de cada una de las suspensiones.
Los ligandos a detectar en la solución de la muestra se adhieren de
forma específica, en función de los ligandos, a las
correspondientes moléculas aceptoras y, por lo tanto, siempre sólo
a micropartículas discretas de una población determinada.
Simultáneamente, o a continuación, un colorante fluorescente
receptor queda ligado a los ligandos, cuya longitud de onda de
emisión se diferencia suficientemente de la longitud de onda de
emisión de dicho colorante fluorescente receptor para marcar las
micropartículas. La fluorescencia para identificar las partículas,
así como la fluorescencia de referencia de las partículas ligadas a
los ligandos se analiza, a continuación, en el citómetro de
flujo.
Por las descripciones de las patentes
estadounidenses USA 5.326.692 y USA 5.073.498 se conocen
micropartículas, que contienen combinaciones de colorantes
fluorescentes y que se pueden utilizar para los procedimientos de
detección más diversos. La combinación de colorantes fluorescentes
permite influir de forma selectiva en la longitud de onda de
excitación y la longitud de onda de emisión mediante la
transferencia de energía entre los distintos colorantes
polimerizados. Además, mediante la combinación de diferentes
colorantes fluorescentes, es posible definir las poblaciones de
micropartículas de forma más apropiada en el citómetro de
flujo.
Para llevar a cabo este procedimiento de
medición por citómetro de flujo se necesitan, sin embargo,
relativamente muchas micropartículas por muestra, unas 5.000 hasta
10.000 por aceptor (Smith y otros, 1998, Clin Chem 44,
2054-2056), para poder detectar suficientes
micropartículas de una población dentro del volumen de medición.
Esto hace aumentar los costes de material, lo cual resulta
desventajoso, sobre todo, tratándose de sustancias de moléculas
aceptoras que, bioquímicamente, son difíciles de sintetizar y, por
lo tanto, son costosas.
Asimismo, la definición relativamente reducida
de las poblaciones de partículas por medio del citómetro de flujo
resulta desventajosa. Según Carson y otros (1999, J. Immunol
Methods 227, 41-52), mediante dos colorantes
fluorescentes solamente, es posible individualizar 64 poblaciones de
partículas. Oliver y otros (1998, Clin Chem 44,
2057-2060) describen, asimismo, que se necesitan
períodos de tiempo de medición relativamente largos de
aproximadamente 30 minutos hasta 1 hora por muestra, para detectar
de forma efectiva varios parámetros paralela y específicamente. Los
largos períodos de tiempo de medición provocan, en parte, una
modificación desventajosa de los ligandos y de los colorantes
fluorescentes. El objetivo de la invención es, por lo tanto, dar a
conocer un procedimiento eficaz y un equipo de análisis, que
permitan un período de tiempo de medición más breve así como una
mayor sensitividad, que sean económicos y que puedan ser utilizados
de forma rutinaria.
La presente invención resuelve este problema
técnico al dar a conocer un procedimiento para la detección de
analitos, comprendiendo dicho procedimiento los siguientes fases:
marcaje con fluorescencia de, como mínimo, una población de
micropartículas, comprendiendo dicha población de micropartículas,
como mínimo, un colorante fluorescente que sirve para la
codificación, y, como mínimo, un colorante fluorescente que sirve
para la comparación, enlace y/o conjugación de moléculas aceptoras
a la población de micropartículas, inmovilización de la población
de micropartículas en un sustrato, incubación de dicha población de
micropartículas junto con la muestra a analizar, marcaje del
analito o de los analitos con, como mínimo, un colorante
fluorescente, que sirve como referencia, y detección del analito o
analitos mediante comparación de las fluorescencias de la población
de micropartículas con la fluorescencia de referencia. El
procedimiento, según la invención, comprende varias fases, cuyo
orden puede ser modificado. Es posible, por ejemplo, que los
analitos sean marcados antes o después de su enlace con un
colorante fluorescente, que sirve de fluorescencia de
referencia.
Si se han de realizar análisis paralelos con el
procedimiento, según la realización, se marcarán, como mínimo, dos
poblaciones de micropartículas con colorantes fluorescentes. A los
efectos de la invención, las micropartículas son fracciones
heterogéneas y/o homogéneas de partículas microscópicas, con un
tamaño de 1-500 \mum, en especial,
1-100 \mum y, preferentemente,
1-10 \mum. En este caso, las micropartículas
pueden contener componentes orgánicos y/o inorgánicos. Las
micropartículas pueden ser, por ejemplo, polímeros que, tras la
emulsificación o la polimerización interfacial, se precipitan sobre
el material a envolver, por ejemplo, un colorante fluorescente. Las
micropartículas pueden estar formadas por poliésteres o ácido
polifosfórico, polivinilo o copolímeros de ácido poliacrílico. Sin
embargo, también se puede prever que las micropartículas estén
formadas por partículas de óxidos cerámicos como, por ejemplo,
dióxido de silicio, dióxido de titanio u otros óxidos metálicos. De
acuerdo con el procedimiento de la invención, por ejemplo,
proteínas, ácidos nucleicos, macromoléculas, lípidos o polipéptidos
reticulados como vesículo y similar, también son micropartículas a
los efectos de la invención. La fabricación de micropartículas se
da a conocer, por ejemplo, por las patentes estadounidenses USA
6.022.564, 5.840.674, 5.788.991 y 5.7543.261.
Por población de micropartículas se entiende, a
los efectos de la invención, micropartículas que son parecidas en
lo referente a su marcaje con el colorante o los colorantes
fluorescentes. Una población de micropartículas puede estar
compuesta, por ejemplo, por micropartículas que han sido marcadas
con un colorante fluorescente rojo, amarillo o azul y/o con
colorantes fluorescentes, que se diferencian por su tiempo de vida
de fluorescencia. Sin embargo, una población de micropartículas se
puede definir también por la proporción de colorantes fluorescentes
diferentes. En este caso, por ejemplo, todas las micropartículas
cuyo marcaje de fluorescencia comprende, por ejemplo, colorantes
fluorescentes verdes y rojos en proporción 1:1, pueden formar parte
de una población de micropartículas. Las micropartículas de una
población de micropartículas presentan, como mínimo, un colorante
fluorescente que sirve como fluorescencia de codificación y, como
mínimo, otro colorante fluorescente que sirve como fluorescencia de
comparación.
La fluorescencia de codificación sirve para el
análisis de las micropartículas. Las micropartículas pueden estar
marcadas con diferentes colorantes fluorescentes o con diferentes
intensidades de los colorantes fluorescentes. De este modo, se
generan poblaciones de micropartículas discretas, que pueden ser
identificadas con la ayuda de detectores. Además del colorante o
colorantes fluorescentes, que sirven como fluorescencia de
codificación, las micropartículas presentan, como mínimo, otro
colorante fluorescente que sirve como fluorescencia de comparación.
Mediante la fluorescencia de comparación, es posible referenciar
eficazmente la fluorescencia de codificación. Debido a que las
micropartículas están dotadas de fluorescencia de comparación y de
fluorescencia de codificación, las señales de fluorescencia pueden
estar interrelacionadas entre sí, compensando de esta manera
errores de medición.
Son colorantes fluorescentes, que sirven para
marcar las micropartículas, todas las sustancias, que pueden emitir
señales luminiscentes detectables. Sin embargo, también se pueden
utilizar colorantes que emiten rayos X o que presentan
fosforescencia. A los efectos de la invención, son colorantes
fluorescentes todos los compuestos orgánicos y/o inorgánicos
gaseosos, líquidos o sólidos, que están caracterizados porque, tras
ser excitados, vuelven a emitir la energía absorbida en forma de
radiación de la misma longitud de onda o de longitud de onda más
larga o más corta. Es decir, que se pueden utilizar también como
colorantes fluorescentes a los efectos de la invención puntos
cuánticos o pigmentos orgánicos o inorgánicos, capaces de producir
luminiscencia. Sin embargo, también se puede prever que las
micropartículas estén constituidas de tal manera que presentan una
fluorescencia propia, o bien que presenten tanto una fluorescencia
propia como también un marcaje de fluorescencia no propia. La
fluorescencia propia de las micropartículas puede ser producida,
por ejemplo, porque las micropartículas comprenden el mineral
fluorita. Como colorantes fluorescentes no propios, que sirven para
la fluorescencia de codificación y/o de comparación, se pueden
utilizar, por ejemplo: cloruro de dansilo, isotiocianato de
fluoresceína,
7-cloro-4-nitrobenzoxadiazol,
anhídrido acético de pireno-butirilo,
N-iodoacetil-N'-(5-ácido
sulfónico-1-naftil) etilendiamina,
1-anilinonaftaleno-8-sulfonato,
2-toluidinonaftaleno-6-sulfonato,
7-(p-metoxi-bencilamino)4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol,
formicina, ribonucleósido de 2-aminopurina,
eteno-adenosina, benzo-adenosina,
\alpha- y \beta-ácido parinárico y/o \Delta^{9,11,13,15}ácido
octaeca-tetraénico, cristales de
cadmio-selenita de uno o varios tamaños, y otros.
Como colorantes fluorescentes que sirven para la fluorescencia de
comparación se pueden utilizar, por ejemplo, los complejos de
metales de transición que contienen las siguientes sustancias:
rutenio (II), renio (I) u osmio e iridio como átomo central, y
diimino ligandos; profirinas fosforescentes con platino, paladio,
lutecio o estaño como átomo central; complejos fosforescentes de
las tierras raras como el europio, el disprosio o el terbio;
cristales fosforescentes como el rubí, Cr-YAG,la
alejandrita u óxidos mezclados fosforescentes como el germanato de
magnesio-fluoro o cristales de
cadmio-selenita, fluoresceína, aminofluoresceína,
aminometil-cumarina, rodamina, rodamina 6G, rodamina
B, tetrametil-rodamina, bromuro de etidio y/o
naranja de acridina. Como colorantes fluorescentes para la
fluorescencia de codificación se pueden utilizar, por ejemplo, las
sustancias siguientes:
Rutenio
(II)-(tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)/HPTS
Rutenio
(II)-(tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)/Fluoresceína
Rutenio
(II)-(tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)/Rodamina
B
Rutenio
(II)-(tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)/Rodamina
B-octadecil éster
Rutenio
(II)-(tris-4,7-difenil-1,10-fenantrolina)/Hexadecil-naranja
de acridina
Europio(III)-tris-teonil-trifluorometilacetonato/Hidroximetil-cumarina
Platino(II)-tetrafenilporfirina/Rodamina
B-octadecil éster
Platino(II)-tetrafenilporfirina/Rodamina
B
Platino(II)-tetrafenilporfirina/Naftofluoresceína
Platino(II)-tetrafenilporfirina/Sulforodamina
101
Platino(II)-octaetilporfirina/Eosina
Platino(II)-octaetilporfirina/Tionina
Platino(II)-octaetilcetoporfirina/Azul
de Nilo
Cr(III)-YAG/ Azul de Nilo
y
CR(III)-YAG/
Naftofluoresceína.
Aminocumarina/Aminofluoresceína
Aminocumarina/Rodamina 6G
Aminocumarina/Tetrametilrodamina
Aminocumarina/Naranja de acridina
Aminofluoresceína/Rodamina 6G
Aminofluoresceína/Tetrametilrodamina y
Aminofluoresceína/Bromuro de etidio.
Los colorantes fluorescentes pueden ser, por
ejemplo, polimerizados durante la fabricación de las
micropartículas, o bien son coinmovilizados posteriormente en las
micropartículas. Los colorantes fluorescentes pueden ser
introducidos, por ejemplo, directamente en una solución vehículo
para las micropartículas durante la fabricación de las mismas.
Mediante la polimerización de los colorantes fluorescentes, es
posible determinar exactamente la cantidad de colorantes
fluorescentes ligados a las micropartículas. Los colorantes
fluorescentes pueden estar polimerizados de tal manera que son
prácticamente inertes, o bien de manera que interaccionan con los
analitos. Además, es posible la incorporación de colorantes
fluorescentes como micropartículas en un vidrio
sol-gel que, a continuación, se hace hervir, se
pulveriza y se dispersa. Al utilizar colorantes fluorescentes
pulverizados, el colorante puede ser dispersado como capa
sensitiva, por ejemplo, en forma de revestimiento de la cara
exterior. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante enlace
covalente o electrostático de los colorantes fluorescentes con la
superficie de las micropartículas. Para adherir los colorantes
fluorescentes a la superficie de las micropartículas se pueden
utilizar, por ejemplo, grupos hidroxi, electrolitos anfífilos,
fosfolípidos y componentes iónicos.
De acuerdo con la invención, se prevé que las
micropartículas marcadas con fluorescencia se conjuguen con
moléculas aceptoras o se liguen a las mismas. De acuerdo con el
procedimiento de la invención, se acoplan moléculas aceptoras
específicas a cada población de micropartículas. Dichas moléculas
aceptoras pueden ser grupos funcionales como grupos amino,
carbonilo, tiol o hidroxilo, o también epítopos, parátopos,
hidratos de carbono, lectinas o secuencias de oligo- o
polinucleótidos. Los epítopos, que se utilizan para la
inmovilización, pueden ser determinantes antigénicos, que
interaccionan con la parte de un anticuerpo, que liga el antígeno,
o con un receptor. A los efectos de la invención, los parátopos
pueden ser, por ejemplo, las partes de un anticuerpo que
interaccionan de forma específica con estructuras antigénicas. Las
moléculas aceptoras pueden unirse a la correspondiente población de
micropartículas formando enlaces covalentes, no covalentes, iónicos
o mediante otras interacciones. De acuerdo con la invención, las
poblaciones de micropartículas se inmovilizan en un sustrato.
Debido a la inmovilización, las micropartículas se encuentran en un
estado, en el que su espacio de reacción está limitado. Por
inmovilización se entiende, a los efectos de la invención, todos
los métodos que llevan por vía biológica, química o física a la
limitación de la movilidad de las micropartículas. El sustrato,
sobre el que se inmoviliza dichas micropartículas, puede estar
formado, por ejemplo, por plaquitas de vidrio, membranas, tejidos
trenzados y/o fibrilas. La inmovilización de las micropartículas en
un sustrato se puede llevar a cabo de forma directa o a través de
un separador o "spacer". A los efectos de la presente
invención, son "spacer" o separadores todos los distanciadores
capaces, por ejemplo, de formar una cadena de carbono corta entre
la micropartícula y el sustrato. Se pueden utilizar, por ejemplo,
cadenas hidroxiladas para evitar interacciones hidrófobas
específicas. Sin embargo, también es posible inmovilizar las
micropartículas a través de moléculas aceptoras. Al ligar las
micropartículas con la ayuda de puntos de enlace propios, es
posible elegir con total libertad las moléculas aceptoras, dado que
el enlace con un posible sustrato no requiere de su mediación. Para
inmovilizar las micropartículas con la ayuda de las moléculas
aceptoras, se ha previsto que las moléculas aceptoras tengan las
propiedades necesarias para ello como, por ejemplo, la carga de la
molécula, grupos que se dejan modificar químicamente y/o afinidades
inmunológicas o con el ácido nucleico, o de hibridización y
similares. Debido a la inmovilización de las micropartículas con la
ayuda de las moléculas aceptoras, no se ha de realizar
obligatoriamente la inmovilización mediante "spacer" o
distanciador. Naturalmente, se puede prever también que las
micropartículas queden inmovilizadas en el substrato a través de
puntos de enlace en la superficie de dichas micropartículas.
De acuerdo con la invención, se incuba, como
mínimo, una población de micropartículas con la muestra a analizar.
Mediante la incubación de micropartículas inmovilizadas con la
muestra a analizar, es posible que analitos de la muestra
interaccionen con las moléculas aceptoras, que están ligadas a
dichas micropartículas. Por ejemplo, si las moléculas aceptoras son
anticuerpos ligados, los analitos podrán ligar, por ejemplo,
estructuras antigénicas a los mismos. Dado que las moléculas
aceptoras están ligadas a las micropartículas, se facilita, de esta
manera, que los analitos se adhieren a las micropartículas a través
de las moléculas aceptoras. De forma ventajosa, durante la
incubación de la población de micropartículas con la muestra a
analizar, se pueden crear condiciones de reacción que facilitan la
interacción eficaz entre los analitos y la población de
micropartículas. Entre estas condiciones de reacción puede estar,
por ejemplo, una temperatura elevada. Sin embargo, se puede también
agitar o mezclar la población de micropartículas con la muestra. El
número de poblaciones de micropartículas a inmovilizar sobre el
sustrato queda determinado, sobre todo, por el número de
especificidades de las moléculas aceptoras, que son necesarias para
caracterizar los analitos. A tal efecto, se mezclan, por ejemplo,
las suspensiones deseadas y, con la ayuda de un distribuidor, se
pipetean pequeñas partes alícuotas de la mezcla sobre el sustrato.
Las micropartículas sedimentan en la gota y entran en contacto con
la superficie del sustrato, pudiéndose adherir, distribuidas de
forma aleatoria en el sustrato, 1-1.000.000, en
especial, 1-100.000, preferentemente,
1-10.000 y, muy preferentemente,
1-1.000 o menos micropartículas de una población.
Habrá que evitar que la gota se seque sobre el sustrato, sobre
todo, si el secado de las moléculas aceptoras tiene consecuencias
negativas para el enlace deseado de los analitos.
De acuerdo con la invención, se ha previsto
marcar los analitos, como mínimo, con una fluorescencia de
referencia. Naturalmente, es posible marcar los analitos antes o
después de su enlace con las moléculas aceptoras. Como moléculas
fluorescentes se pueden utilizar, por ejemplo, isotiocianato de
fluoresceína, isotiocianato de tetrametilrodamina, rojo Texas,
7-amino-4-metil-cumarina-3-ácido
acético, ficoeritrina y/o cianinas y otros, o bien partículas
fluorescentes conjugadas con anticuerpos, que ligan el analito, por
ejemplo, con la ayuda de anticuerpos al analito. Es posible, por
ejemplo, marcar los analitos directamente con un colorante
fluorescente. Con el marcaje directo de los analitos, se puede
prescindir de los anticuerpos marcados con fluorescencia u otras
estructuras que llevan marcadores. El marcaje directo de los
ligandos puede realizarse especialmente mediante colorantes
fluorescentes, que emiten una señal fluorescente o que inhiben la
fluorescencia de otros marcadores. Sin embargo, los analitos
también pueden ser marcados con enzimas. Ejemplos para moléculas
marcadas con enzimas son la peroxidasa de rábano, la fosfatasa
alcalina y/o la glucosa oxidasa.
La detección del analito o de los analitos se
realiza, de acuerdo con el procedimiento de la invención, mediante
la comparación de las fluorescencias de la población de
micropartículas con la fluorescencia de referencia. En un análisis
por espectrometría de fluorescencia, por ejemplo, las intensidades
de las fluorescencias de la población de micropartículas y del
analito o de los analitos se pueden comparar de tal manera que se
pueden analizar, especialmente, tanto la identidad de la población
de micropartículas que contiene los analitos como también el número
de analitos ligados. De esta manera, se tiene, por ejemplo, más
información sobre qué analitos y cuántos han quedado ligados en
determinadas poblaciones de micropartículas discretas.
Se puede prever que la fluorescencia de
comparación no quede alterada por los analitos en sus parámetros,
mientras que, por ejemplo, la intensidad de la fluorescencia de
codificación se puede modificar en función de la concentración de
los analitos. Así se puede caracterizar la intensidad de la señal
de la población de micropartículas mediante una referencia interna,
en especial, sin que ello requiera otra fuente de excitación para
la fluorescencia o un segundo detector para determinar la
fluorescencia. La magnitud de referencia para referencia interna se
determina en base a la intensidad de la fluorescencia y/o del
transcurso de tiempo de la respuesta de la fluorescencia de
comparación. Es ventajoso que la fluorescencia de codificación y la
fluorescencia de comparación absorban luz en el mismo rango de
longitud de onda y, por lo tanto, sean susceptibles de ser
excitadas mediante la misma fuente de excitación. El procedimiento
permite que la fluorescencia de comparación no tenga que presentar
ninguna reacción específica para las moléculas a detectar, sino que
suministre una señal constante para la referencia. Sin embargo, es
posible también que tanto la fluorescencia de comparación como la
fluorescencia de codificación interaccionen con los analitos.
Naturalmente, se puede prever también que ni la fluorescencia de
comparación ni la fluorescencia de codificación interaccionen con
los analitos, de manera que las señales de fluorescencia se
modifican. De acuerdo con la invención, es posible que los
colorantes fluorescentes para la fluorescencia de codificación y
para la fluorescencia de comparación sean excitados simultánea y
conjuntamente por una fuente y detectados conjuntamente por un
detector. También se puede disponer que la fluorescencia de
comparación sirva para excitar la fluorescencia de referencia.
Según una variante de realización de la
invención, se prevé que las micropartículas se adhieran a
microplacas de ensayo, plaquitas de vidrio, membranas flexibles,
tejidos trenzados o fibrilas, en especial, de polipropileno y/o de
nitrocelulosa, vidrio y/o de fluoruro de polivinilideno (PVDF).
Como microplacas de ensayo se pueden utilizar, por ejemplo, placas
de microtitulación. De modo ventajoso, las microplacas presentan
unas dimensiones que permiten su uso en múltiples rutinas de
laboratorio. Muchos equipos para la medición de fluorescencia como,
por ejemplo, los microscopios de fluorescencia y similares, están
realizados de tal manera que las microplacas se pueden utilizar de
forma estandarizada. La inmovilización de las micropartículas en
recipientes de laboratorio especiales, por ejemplo, placas de
microtitulación, cápsulas Petri, placas multipocillo, multipozos,
cubetas y otros recipientes de cultivo y portaobjetos permite, por
lo tanto, de modo ventajoso, también la utilización de los medios y
aparatos de laboratorio existentes para incubar, congelar,
liofilizar, así como aparatos de laboratorio similares en
laboratorios clínicos o de investigación. Como microplacas se
pueden utilizar, por ejemplo, y de forma preferente, placas de
microtitulación con un fondo plano, transparente y no
fluorescente.
Según otra variante de realización de la
invención, se prevé la detección simultánea de varios analitos,
cargando los analitos a través de poblaciones de micropartículas
discretas con las correspondientes moléculas aceptoras
individuales. Así, por ejemplo, se pueden marcar poblaciones de
micropartículas que llevan cargas diferentes para mezclarlas a
continuación. Luego se contactan partes alícuotas de la mezcla de
poblaciones de micropartículas sobre un sustrato para inmovilizar
las micropartículas en el sustrato. A continuación, se incuba el
sustrato, ventajosamente, con la muestra, de manera que los
analitos quedan ligados a las moléculas aceptoras que cada
población de micropartículas tiene asignadas. La captación paralela
de varios parámetros mediante la detección simultánea de diferentes
analitos permite caracterizar varios analitos con un reducido coste
de material y de tiempo.
Sin embargo, se puede prever también que los
analitos queden ligados a través de una molécula de enlace o unión.
Dicha molécula de enlace puede unirse al analito, por ejemplo,
formando un enlace covalente o no covalente. La molécula de enlace
puede modular la movilidad de los analitos de tal manera que la
señal emitida por el analito o por el colorante fluorescente ligado
al analito se puede detectar eficazmente. Según otra variante de
realización de la invención, los analitos están marcados
específicamente con diferentes colorantes fluorescentes. Los
colorantes fluorescentes pueden distinguirse por el color de la
fluorescencia, por el tiempo de vida de fluorescencia o por su
intensidad. Ventajosamente, el marcaje con colorantes fluorescentes
de diferentes intensidades puede dar lugar a una población de
micropartículas discreta, que se puede detectar, por ejemplo, en el
microscopio de fluorescencia. El número posible de poblaciones
discretas depende, sobre todo, de los colorantes y de las técnicas
disponibles para marcar las micropartículas, así como del número de
colores discernibles en el equipo de medición y detección. Así
resulta ventajoso, por ejemplo, fabricar con dos colores
aproximadamente 60 hasta 100 diferentes poblaciones de
micropartículas discretas. Mediante la determinación más exacta de
las intensidades o añadiendo otro color, puede incrementarse
el número de poblaciones en aproximadamente 500 hasta 1000 poblaciones de micropartículas bien discernibles más.
el número de poblaciones en aproximadamente 500 hasta 1000 poblaciones de micropartículas bien discernibles más.
Según otra variante de realización de la
invención, los analitos están marcados con un colorante
fluorescente uniforme. Con este marcaje homogéneo de los analitos,
se puede determinar, ventajosamente, el número total de analitos
marcados y ligados a las micropartículas. El análisis de los
analitos se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la
asignación a poblaciones discretas a través del marcaje de las
micropartículas. Es preferente que los colorantes fluorescentes y/o
enzimas se encuentren en forma de monómero y/o polímero. Los
colorantes fluorescentes pueden ser, por ejemplo, compuestos
inorgánicos como los compuestos de los metales tierras raras o, por
ejemplo, compuestos de uranio o compuestos orgánicos. Sin embargo,
es posible utilizar también sustratos cromógenos, que son
especialmente quimioluminiscentes, en lugar del marcaje con
sustratos fluorescentes. Para la detección sensitiva de los
analitos, también se pueden unir micropartículas fluorescentes a
los analitos.
Según una realización especialmente preferente
de la invención, se prevé la detección de distintos anticuerpos en
una muestra serológica (véase la figura 1). Las micropartículas
fluorescentes de diferentes colores de conjugan con los
correspondientes antígenos diferentes como aceptores y son
inmovilizados en un sustrato a través de los antígenos. Durante la
subsiguiente incubación, los anticuerpos se adhieren ventajosamente
como analitos que provienen de un suero de paciente, a los
antígenos para los que son específicos. Los anticuerpos ligados se
detectan con la ayuda de un anticuerpo secundario que presenta una
fluorescencia de referencia. Para la evaluación, se mide la
fluorescencia de las micropartículas y la fluorescencia de
referencia, en especial, para cada elemento de imagen de un pocillo
de una placa de microtitulación.
La invención también comprende un equipo de
análisis, comprendiendo dicho equipo de análisis, como mínimo, una
población de micropartículas marcada con fluorescencia e
inmovilizada, capaz de ligar moléculas aceptoras específicas. De
acuerdo con la invención, las micropartículas inmovilizadas
comprenden, como mínimo, dos colorantes fluorescentes, que se
diferencian en cuanto a sus propiedades espectrales y/o en cuanto a
su tiempo de vida de fluorescencia, utilizándose un colorante para
la fluorescencia de codificación y otro colorante para la
fluorescencia de comparación. La fluorescencia de comparación sirve
para referenciar la fluorescencia de codificación. Ventajosamente,
en dicho equipo de análisis las señales de la fluorescencia de
codificación se pueden poner en relación con la fluorescencia de
comparación, compensando de esta manera errores de medición.
Mediante la fluorescencia de referencia se puede comprobar, por
ejemplo, de forma segura, si se encuentra una micropartícula o
varias micropartículas en el campo de medición. Los analitos a
analizar pueden presentar también, por ejemplo, una fluorescencia
de referencia y una fluorescencia de referencia. Ventajosamente, la
relación entre fluorescencia de codificación y fluorescencia de
referencia se puede detectar exactamente mediante la fluorescencia
de comparación. Con el equipo de análisis se puede conseguir,
ventajosamente, y a pesar de que se utilice un número pequeño de
micropartículas, una precisión de medición, que cumple, por
ejemplo, los requerimientos de la rutina clínica. Además, el equipo
de análisis puede estar compuesto de tal manera que, debido a las
micropartículas inmovilizadas, las fluorescencias se evalúan
mediante escáneres de fluorescencia y/o microscopios de
fluorescencia, lo que permite, por ejemplo, una gran precisión de
medición y rapidez de todo el proceso de evaluación de la
fluorescencia, en comparación, por ejemplo, con citómetros de
flujo. A los efectos de la invención, el ensayo puede estar montado
de tal manera que las micropartículas y las moléculas aceptoras se
hallan en estado sólido o disuelto en distintos recipientes de
reacción, y los colorantes fluorescentes y reactivos para la
inmovilización se guardan asimismo por separado. Para detectar un
analito se realizan, por ejemplo, la inmovilización y el marcaje
con fluorescencia de la población de micropartículas, así como el
enlace de las moléculas aceptoras a las micropartículas de tal
manera que la población de micropartículas inmovilizada y marcada
con fluorescencia, que tiene las moléculas aceptoras ligadas, se
encuentra en un recipiente de reacción. Es en este recipiente que,
a continuación, se introduce la muestra a analizar. Sin embargo,
es posible también montar el ensayo de tal manera que, de entrada,
todos los reactivos que se necesitan para la detección del analito
se encuentran en un recipiente de reacción. Con el equipo de
análisis, según la invención, es posible, de forma ventajosa,
analizar muestras biológicas y/o químicas. En muestras biológicas
como, por ejemplo, el suero, se pueden detectar parámetros
moleculares para caracterizar estados biomédicos complejos como el
estado inmunológico o la predisposición genética a desarrollar
determinadas enfermedades o la detección e influencia de la
expresión. Mediante la inmovilización de la población de
micropartículas, es posible caracterizar una muestra, por ejemplo,
en un breve lapso de tiempo, que presenta solamente un número
reducido de analitos a detectar o analitos competitivos.
Para determinar parámetros serológicos
diagnósticos, la invención comprende también la utilización de
poblaciones de micropartículas marcadas con fluorescencia, que
están conjugadas con moléculas aceptoras específicas como, por
ejemplo, anticuerpos humanos o animales contra agentes infecciosos,
antígenos, autoantígenos y alérgenos, puntos de enlace importantes
desde el punto de vista farmacológico en proteomas, genomas y otros
ácidos nucleicos como, por ejemplo, receptores de hormonas, puntos
de enlace con fármacos, puntos de enlace con péptidos, hidratos de
carbono y ADN y/o para llevar a cabo análisis de expresión de genes
importantes y de sus productos como, por ejemplo, proteínas
tumorales, antígenos HLA, así como para analizar polimorfismos de
nucleótido simple y mutaciones.
Las ventajas del procedimiento y del equipo de
análisis, de acuerdo con la invención, son, por ejemplo, que la
inmovilización de las poblaciones de micropartículas hace posible
la reducción de los números de partículas. Esto conduce,
ventajosamente, a una utilización más económica de las moléculas
aceptoras, en comparación con el procedimiento por citometría de
flujo. La detección de los analitos ligados, por ejemplo, a través
de micropartículas fluorescentes, puntos cuánticos o pigmentos
luminiscentes conduce una sensitividad hasta el nivel de las
moléculas individuales. Debido a la estructura en 3D, sobre todo,
de partículas porosas, se consigue una densidad de moléculas
aceptoras alta y constante, lo que también contribuye a que se
incremente la sensitividad y la reproducibilidad. De acuerdo con la
invención, el número de micropartículas por muestra y la duración
del proceso de medición de las micropartículas pueden reducirse,
incrementando la sensitividad del proceso de medición. La
utilización de la fluorescencia de comparación permite, sobre todo,
el reconocimiento muy sencillo de los campos de medición en los que
se ha inmovilizado solo una micropartícula, lo cual resulta una
importancia vital para la evaluación automática.
Debido a la inmovilización de las
micropartículas sobre sustratos estandarizados como placas de
microtitulación o portaobjetos, se pueden aprovechar, por ejemplo,
rutinas de laboratorio existentes como equipos automatizados para
ELISA.
Otras realizaciones ventajosas de la invención
resultan de la descripción.
A continuación, la descripción se ilustrará por
medio de ejemplos de realización, sin que la invención quede
limitada a las mismas.
Se han elaborado micropartículas de sílice
modificadas a nivel del grupo carboxi (sicastar®, 8 \mum
(micromod) o screenBEADS, 1 \mum (chemicell) con las siguientes
propiedades fluorescentes y adicionando cantidades diferentes de
colorantes fluorescentes a la mezcla de reacción:
Población de micropartículas A:
- Fluorescencia de comparación: Aminocumarina
- Fluorescencia de codificación: Aminofluoresceína 100%
Población de micropartículas B:
- Fluorescencia de comparación: Aminocumarina
- Fluorescencia de codificación: Aminofluoresceína 50%
\vskip1.000000\baselineskip
Población de micropartículas C:
- Fluorescencia de comparación: Aminocumarina
- Fluorescencia de codificación: Aminofluoresceína 0%
Mediante acoplamiento de carbodiimida, se han
acoplado mezclas de proteínas bacterianas de Borrelia burgdorferi a
la población de micropartículas A, de Yersinia enterocolitica a la
población de micropartículas B y de Chlamydia trachomatis a la
población de micropartículas C. A tal efecto:
1. Se disuelven 10 mg de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC) en 1 ml de agua destilada, se mezclan con 1 ml de suspensión
de gránulos o pequeñas esferas ("beads") (25 mg Bedas) y se
incuban durante 10 minutos a temperatura ambiente;
2. Se lavan los gránulos tres veces con 5 ml de
tampón MES pH 5,0;
3. Se disuelven 500 \mug de proteína
bacteriana en 1 ml de tampón MES 0,1 M (pH 5,0) y se incuban con
los gránulos activados bajo agitación a temperatura ambiente
durante 4 horas;
4. Los gránulos se lavan 3 veces en tampón MES
y, a continuación, se incuban en tampón MES + 0,2 M glicina durante
2 horas a temperatura ambiente bajo agitación;
5. Los gránulos son lavados tres veces en PBS y
absorbidas en 1 ml de PBS separadas en partes en 50 \mul y
congeladas a -20ºC hasta su posterior uso.
Para inmovilizar las poblaciones de
micropartículas preparadas en la superficie de las placas de
microtitulación (de 384 pocillos, poliestireno negro, fondo plano y
transparente), se procede a:
1. Descongelar una parte alícuota de cada
suspensión de partículas de las distintas poblaciones de
micropartículas, y mezclar y diluir en agua destilada 2 \mul de
cada suspensión mediante pipeta, de tal manera que se consigue una
densidad de partículas de 100 micropartículas de cada población por
1 \mul de agua;
2. Pipetear 1 \mul de la mezcla en el centro
de los pocillos de la placa de microtitulación;
3. Inmovilizar las micropartículas de las tres
poblaciones utilizadas mediante secado a 45ºC.
A continuación, se aclaran los pocillos tres
veces con PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T). Los sueros
humanos son pipeteados seguidamente en una dilución de 1:100 en
PBS-T en los pocillos preparados de la placa de
microtitulación donde se incuban durante 1 hora a temperatura
ambiente.
A continuación, se aclaran los pocillos tres
veces con PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T) y se incuba
en ellos un conjugado de antisuero IgG cabra antihumano y
ficoeritrina, previamente diluido en PBS-T 1:100,
durante 2 horas a temperatura ambiente. Una vez aclarado tres veces
con PBS-T, se procede a evaluar la fluorescencia
mediante un microscopio de fluorescencia Axiophot (Zeiss). Las
micropartículas inmovilizadas son fotografiadas con una cámara B/N
CCD, utilizando consecutivamente pares de filtros ópticos para las
siguientes longitudes de onda de emisión y de absorción: 390 nm/441
nm, 480 nm/520 nm y 480 nm/578 nm, respectivamente.
La evaluación se lleva a cabo realizando una
reducción de datos e incluyendo en la evaluación solamente aquellos
campos de medición, cuya intensidad de la fluorescencia de
referencia supera el valor umbral predeterminado. Una segunda
reducción de datos/compensación de errores se consigue, excluyendo
del cálculo todos los errores de medición situados un 20% por
encima y un 50% por debajo de la fluorescencia de comparación. El
cociente de la intensidad de la fluorescencia de codificación y de
la fluorescencia de comparación indica de qué población de
micropartículas se trata. Los cocientes, que difieren en más del
10% de la media de una clase, provocan que el campo de medición
quede excluido del cálculo. Para cada población de micropartículas
se dividen las fluorescencias de referencias de 20 campos de
medición entre las correspondientes fluorescencias de comparación.
De los cocientes resultantes de los 20 campos de medición, se
averigua la media. Son anticuerpos IgG humanos ligados en
proporción a la cantidad y que quedan ligados específicamente a los
antígenos bacterianos de esta población de micropartículas.
\newpage
Leyenda Fig.
1
Claims (6)
1. Procedimiento para la detección de analitos
en una muestra, caracterizado porque el procedimiento
comprende las siguientes fases:
- marcaje con fluorescencia, como mínimo, de una
población de micropartículas, estando la población de
micropartículas marcada, como mínimo, con un colorante fluorescente
que sirve para la fluorescencia de codificación, y, como mínimo,
con un colorante fluorescente que sirve para la fluorescencia de
comparación;
- enlace o conjugación de moléculas aceptoras a
la población de micropartículas;
- inmovilización de la población de
micropartículas en un sustrato;
- incubación de la población de micropartículas
con la muestra;
- marcaje del analito o analitos, como mínimo,
con una fluorescencia de referencia; y
- detección del analito o analitos mediante la
comparación de las fluorescencias de las micropartículas con la
fluorescencia de referencia.
2. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque las micropartículas
son inmovilizadas sobre microplacas de ensayo, plaquitas de vidrio,
membranas flexibles, tejidos trenzados, fibrilas, en especial, de
polipropileno y/o de nitrocelulosa, vidrio y/o PVDF.
3. Procedimiento, de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se
detectan simultáneamente varios analitos, cargando cada una de las
poblaciones de micropartículas con moléculas aceptoras
individuales.
4. Procedimiento, de acuerdo con una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se marcan
los analitos con fluorescencias de referencias diferentes o
idénticas.
5. Equipo de análisis para la detección de
analitos en una muestra, caracterizado porque el equipo de
análisis comprende, como mínimo, una población inmovilizada de
micropartículas, que está conjugada con moléculas aceptoras
específicas, comprendiendo la población de micropartículas, como
mínimo, una fluorescencia de codificación y, como mínimo, una
fluorescencia de comparación, que se diferencian en cuanto a sus
propiedades espectrales y/o en cuanto a su tiempo de vida de
fluorescencia.
6. Utilización de, como mínimo, una población de
micropartículas inmovilizadas y marcadas con fluorescencia, con
moléculas aceptoras conjugadas específicamente, comprendiendo dicha
población de micropartículas una fluorescencia de codificación y
una fluorescencia de comparación para la detección de analitos en
el diagnóstico clínica y/o medioambiental.
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