JP2015210167A - 免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料添加部12、標識物質保持部13、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部14及び吸収部15を含む免疫クロマト分析装置1であって、試料添加部12中に陰イオン性界面活性剤を含有し、被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置1によって上記課題を解決した。
【選択図】図1
Description
1.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置。
2.前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた1種である前記1記載の免疫クロマト分析装置。
3.前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する前記1又は2に記載の免疫クロマト分析装置。
4.前記被検出物質が血液中の糖化タンパク質である前記1〜3のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
5.前記血液中の糖化タンパク質がHbA1cである前記4に記載の免疫クロマト分析装置。
6.前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である前記1〜5のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
7.陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する、以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
8.前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する前記7に記載の方法。
9.前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を0.01〜5質量%含有することを特徴とする前記8に記載の方法。
10.前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する前記7〜9のいずれか1項に記載の方法。
11.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
試料添加部12に陰イオン性界面活性剤を乾燥保持するには、凍結乾燥、熱風乾燥、自然乾燥等の手段を適宜採用すればよい。
(1)検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
(1)工程においては、まず、検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を調製する。検体希釈液は、(3)工程における検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させるための展開液として作用することができる。検体希釈液は、展開性が良好でありかつ抗原抗体反応を阻害しないという観点から、非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。
検体含有液に含まれるHbA1cは、試料添加部12に含まれる陰イオン性界面活性剤によって、ヘモグロビンβ鎖N末端がタンパク質表面に露出し、毛細管現象により標識物質保持部13に到達する。
以下の手順で、図1に示すような免疫クロマト分析装置1を作製した。
(1)試料添加部12の作製
グラスファイバーパッド(ミリポア社製商品名グラスファイバーコンジュゲートパッド、サイズ縦32mm(検体含有液展開方向)、横150mm、厚さ0.43mm)に、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を、60μg/cm2の割合で均一に添加し、50℃で4時間乾燥することにより、試料添加部12を作製した。
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート(ミリポア社製、商品名:HF12250mm×25mm)を用いた。5質量%のスクロース及び5質量%のイソプロパノールを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で1.0mg/mlの濃度になるように抗HbA1cモノクローナル抗体、抗ヘモグロビンモノクローナル抗体または抗IgGモノクローナル抗体を希釈し、その希釈された溶液150μLを抗体塗布機(BioDot社製)によりメンブラン上に1mmの幅で別々の場所に塗布し、50℃で30分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部14上に抗HbA1c抗体塗布部16、抗ヘモグロビン抗体塗布部17、抗IgG抗体塗布部18をそれぞれ設けた。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:平均粒子径40nm)0.5mLに、Tris緩衝(pH8.5)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈した抗ヘモグロビンモノクローナル抗体0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、0.01質量%のPEG−SH(日本油脂株式会社製、商品名:SUNBRIGHT ME−200SH、分子量20000)を含むTris緩衝液(pH8.5)を0.1ml加え(添加後のPEG−SH濃度:0.001質量%)、室温で10分間静置した。その後、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行い、上清を除去した後、1質量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液 220μlに100μlの25質量%トレハロース水溶液を含むリン酸緩衝液(pH9.0)を加えたものを8mm×100mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部13を作製した。次に、プラスチック製粘着シート11上に、上記作製した試料添加部12、標識物質で標識された標識物質保持部13、クロマトグラフ媒体部14を貼り合わせ、汎用の吸収部15をさらに貼り合わせ、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置1を作製した。この時、一装置あたりに含有するSDSの量は、96μgであった。
非イオン性界面活性剤としてTritonX−100(SIGMA 社製、商品名)とTween20(和光純薬社製、商品名)との1:5の質量比の混合物:1.2質量%
バッファーとしてのBicine緩衝液:50mM
無機塩として塩化カリウム:0.6質量%
添加剤としてカゼインナトリウム:2.0質量%
残量:水
健康成人男性及び糖尿病男性患者それぞれの指先を穿刺することにより、各種HbA1c濃度を有する血液を採取した。
前記血液と前記検体希釈液とを、前者:後者として(容量比)、1:1000で混合し、検体含有液を調製した。
上記のようにして作製した免疫クロマト分析装置1の試料添加部12に、前記検体含有液110μlを供給し、10分後の抗HbA1c抗体塗布部16における赤色の発色シグナルを目視で確認した。結果を表1に示す。
なお表中の評価基準は以下の通りである。
−:赤色の発色を確認できないもの
±:赤色の発色は確認できるが非常に色が薄いもの
+:赤色の発色を確認できるもの
++:強い赤色の発色を確認できるもの
+++:非常に強い赤色の発色が確認できるもの
実施例1において、試料添加部12の構成素材をグラスファイバーパッドから、セルロースファイバーパッド(旭化成せんい社製商品名SR−601)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、試料添加部12の構成素材をグラスファイバーパッドから、ポリエチレンテレフタレート(PET)パッド(旭化成せんい社製商品名ベンリーゼ A−01)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、試料添加部12の構成素材をグラスファイバーパッドから、ニトロセルロースメンブレン(ミリポア社製商品名HF120)に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、SDSを添加しない試料添加部を用い、下記の組成を有するN末端露出剤を含有する抽出液に血液を添加し2分間静置して調製した試料液10μlと、下記の組成を有する展開液100μlとを、それぞれ個別に試料添加部12に滴下したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表1に示す。
(抽出液の組成)
陰イオン界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム:1.0質量%
添加剤としてチオシアン酸ナトリウム:100mM
添加剤としてEDTA:5mM
残量:水
(展開液の組成)
非イオン性界面活性剤としてTritonX−100(SIGMA 社製、商品名)とTween20(和光純薬社製、商品名)との1:5の質量比の混合物:1.2質量%
バッファーとしてのBicine緩衝液:50mM
無機塩として塩化カリウム:0.6質量%
添加剤としてカゼインナトリウム:2.0質量%
残量:水
参考例1において、抽出液を用いずに、展開液に血液を添加したこと以外は、参考例1を繰り返した。結果を表1に示す。
参考例1において、抽出液を用いずに、展開液に表1に示す濃度のSDS及び血液を添加したこと以外は、参考例1を繰り返した。結果を表1に示す。
実施例1において、試料添加部12に添加するSDSの一装置あたりの含有量と検体希釈液に含有する非イオン界面活性剤の含有率とを表2に記載の値に変更したこと以外は、実施例1を繰り返した。結果を表2に示す。
11 プラスチック製粘着シート
12 試料添加部
13 標識物質保持部
14 クロマトグラフ媒体部
15 吸収部
16 抗HbA1c抗体が塗布された抗HbA1c抗体塗布部
17 抗ヘモグロビン抗体が塗布された抗ヘモグロビン抗体塗布部
18 抗IgG抗体が塗布された抗IgG抗体塗布部
1.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の一液のみを展開するための免疫クロマトグラフ分析装置。
2.前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた1種である前記1記載の免疫クロマトグラフ分析装置。
3.前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する前記1又は2に記載の免疫クロマト分析装置。
4.前記血液中の糖化タンパク質がHbA1cである前記3に記載の免疫クロマト分析装置。
5.前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である前記1〜4のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
6.陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる血液中の糖化タンパク質を検出する、以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体を検体希釈液で希釈した検体含有液の一液のみを試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程
7.前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する前記6に記載の方法。
8.前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を0.01〜5質量%することを特徴とする前記7に記載の方法。
9.前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する前記6〜8のいずれか1項に記載の方法。
10.試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して検体含有液の1液のみを展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体に含まれる被検出物質が血液中の糖化タンパク質であり、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
Claims (11)
- 試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置であって、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有し、
被検出物質を含む検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を展開するための免疫クロマト分析装置。 - 前記試料添加部が、グラスファイバー、セルロース及びポリエチレンテレフタレートからなる群から選ばれた1種である請求項1記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する請求項1又は2に記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記被検出物質が血液中の糖化タンパク質である請求項1〜3のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記血液中の糖化タンパク質がHbA1cである請求項4に記載の免疫クロマト分析装置。
- 前記陰イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である請求項1〜5のいずれか1項に記載の免疫クロマト分析装置。
- 陰イオン性界面活性剤を含有する試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置を用いて検体に含まれる被検出物質を検出する、以下の工程(1)〜(4)を含む免疫クロマト分析方法。
(1)検体を検体希釈液で希釈した検体含有液を試料添加部に添加する工程
(2)標識物質保持部に保持されている標識物質により被検出物質を認識させる工程
(3)検体及び標識物質を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
(4)展開された移動相中の被検出物質を検出部で検出する工程 - 前記検体希釈液中に、非イオン性界面活性剤を含有する請求項7に記載の方法。
- 前記検体希釈液中に前記非イオン性界面活性剤を0.01〜5質量%することを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記試料添加部中に前記陰イオン性界面活性剤を8〜800μg含有する請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 試料添加部、標識物質保持部、検出部が担持されたクロマトグラフ媒体部及び吸収部を含む免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とからなる免疫クロマト分析キットであって、
前記検体希釈液中に非イオン性界面活性剤を含有し、
前記試料添加部中に陰イオン性界面活性剤を含有する免疫クロマト分析キット。
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