WO2001079847A1 - Verfahren zur beschichtung von kunststoff-festphasen - Google Patents

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Stefan Janetzky
Wigbert Berg
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Orgentec Diagnostika Gmbh
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
    • G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides

Definitions

  • the invention relates to a method for coating a plastic solid phase with a hydrophobic substance, in particular a substance that can be used as an antigen for an immunological detection method.
  • Solid phase immunoassays for the determination of analytes for example antibodies in biological samples, are commercially available from many suppliers.
  • Solid plastic phases with reagents immobilized thereon, for example antigens are often used. Some tests have problems with these immobilized antigens.
  • the immobilized antigens must be resistant to stress and, on the other hand, the antigens must be presented in such a way that they can be recognized by the antibodies to be detected. These two requirements can often not be fully met.
  • Antiphospholipid antibodies are autoantibodies that are determined in plasma or serum by solid-phase immunoassays.
  • solid phases with negatively charged phospholipids mostly cardiolipin as antigen, are used.
  • the coating of the solid phase for example a microtiter plate with cardiolipin and other phospholipids, has been described in many publications (WO 91/1572; Pengo et al., Blood 70 (1 987) 69 to 76; Rombos et al., Acta Neurol Scand 81 ( 1 990), 243 to 245; Harris, Stroke 23, Suppl. 1 (1 992), I-3 to I-6; Vogel et al.
  • Thrombosis Res, 62 (1 991), 545 to 566) and always runs in principle following the same procedure: An alcoholic solution of the phospholipids is pipetted into the wells of a microtiter plate and the solvent is evaporated to dryness by blowing with air or nitrogen. The plates are then washed several times with phosphate buffer. Adult bovine serum or fetal calf serum is used for blocking. The coating of the plates is then completed after drying.
  • the antigen is only weakly and therefore reversibly bound. This has the effect that the antigen coating is very unstable and can even be removed mechanically by washing it several times.
  • the object on which the present invention is based was therefore to provide a method for coating solid plastic phases which does not have the above-mentioned disadvantages of the prior art, but can nevertheless be carried out in a simple and inexpensive manner.
  • the method according to the invention brings about an increased binding of hydrophobic substances to a solid phase, but this softening does not lead to the destruction of the surface.
  • the substances immobilized with this method are essentially irreversibly bound to the surface of the plastic solid phase.
  • the coating is largely resistant to both mechanical stress and the action of detergents. Repeated washing during the detection process is therefore unproblematic and leads to a reduction in non-specific bindings and thus in false positive results.
  • Another advantage of the method according to the invention is that the substances immobilized according to the invention are surprisingly in a conformation similar to the native structure, so that analytes, e.g. Antibodies recognize the immobilized substances and bind them with high affinity. This leads to an improvement in the sensitivity and specificity of the detection methods.
  • the method according to the invention is suitable for coating different plastic solid phases.
  • suitable plastics are polyvinyl chloride, plastics based on polystyrene such as polystyrene, styrene-divinylbenzene copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer etc., nylon, polyacrylamide, polyacrylonitrile, polypropylene, polymethylene methacrylate etc.
  • Solid phases based on polystyrene, in particular polystyrene carriers, are preferably coated ,
  • the solid phase can have any shape, e.g. the shape of a plate, in particular a microtiter plate, the shape of a vessel, in particular a reaction vessel or tube, or a particle, such as
  • Solid phases for example fibrous or membrane-like solid phases, are coated.
  • the hydrophobic substances which are applied to the solid phase are preferably biological substances or pharmaceutical active substances, e.g. Lipids or lipid-like compounds such as phospholipids, glycolipids, e.g. Gangliosides, fatty acids, triglycerides, steroids or mixtures thereof.
  • Phospholipids such as cardiolipin, phosphatidyl serine, phosphatidyl inositol, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidic acid, phosphatidyl glycerophosphate or mixtures thereof are particularly preferably used. Cardiolipin is most preferably used.
  • an essential feature of the method according to the invention is the use of a solution which softens the plastic surface.
  • the solution may contain one or more solvents that are capable of attacking a plastic surface, i.e. to modify their properties in such a way that the antigen binding is improved.
  • Organic water-insoluble solvents, water-soluble organic solvents or mixtures thereof can be used.
  • suitable solvents are ethers such as dimethoxyethane, tetrahydrofuran, ketones such as acetone or methyl ethyl ketone, esters such as ethyl acetate and mixtures thereof. Dimethoxyethane is particularly preferably used.
  • the organic solution with the substance to be coated and the solvent softening the plastic surface can also contain other components, for example alcohols, water or an aqueous buffer.
  • the use of solutions which contain mixtures of an aqueous component and an organic component is particularly preferred.
  • the volume ratio of aqueous and organic component is preferably in the range from 1: 90 to 90: 10, particularly preferably in the range from 25: 75 to 75: 25.
  • the solution containing the hydrophobic substance and the organic solvent softening the plastic surface is brought into contact with the plastic solid phase and incubated for a period of time sufficient to soften the plastic surface, but during which the plastic surface is not destroyed ,
  • the incubation period is particularly preferably 1 to 4 h at room temperature (18 to 25 ° C.), particularly preferably approximately 2 h.
  • the plastic solid phase can be coated with further substances, for example hydrophilic antigens, such as proteins.
  • hydrophilic antigens such as proteins.
  • a subsequent coating with a mammalian? -2-glycoprotein I is preferably carried out, which is in the form of a purified protein (EP-A-0 474 849) or in the form of added serum or serum fractions (Harris et al., Clin. exp. Immunol. 68 (1 987), 21 5 to 222)) can be used.
  • the solid phase can then optionally be blocked to prevent non-specific binding.
  • the blocking reagents used for this purpose from the prior art, for example bovine serum albumin, saccharides, soluble polymers, etc., can be used.
  • the concentration of the substance immobilized on the solid phase can be adjusted within wide ranges by varying the concentration of the coating substance and / or the amount of the coating solution.
  • the concentration of the substance in the coating solution can be varied, for example, in the range between 1 and 1000 ⁇ g / ml, in particular between 5 and 100 ⁇ g / ml. For example, between 10 ⁇ ⁇ and 300 ⁇ ⁇ coating solution can be used per well of a microtiter plate.
  • the coated solid phases produced by the method according to the invention are stable for a long period of several years and can be used in a method for the determination of analytes in a biological sample.
  • the coated solid phases are particularly preferably used in an immunological process, for example for the determination of antibodies such as anti-phospholipid or anti-ganglioside antibodies.
  • the present invention is further to be illustrated by the following example.
  • Cardiolipin, Na salt in ethanol (Sigma, Art. No .: C 1 649). ? 2 glycoprotein I (heparin-Sepharose purified human serum fraction)
  • Carbonate buffer and solvent are mixed in portions in a ratio of 49.5% to 50.5% (vol / vol).
  • Cardiolipin is introduced into this solution at a final concentration between 20 and 35 ⁇ g / ml. At least 1 20 / I of the finished solution are dispensed into each well of a microtiter plate. The plate is incubated for 2 hours at room temperature, covering it against evaporation. The plate is then emptied.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff-Festphase mit einer hydrophoben Substanz, insbesondere einer Substanz, die als Antigen für ein immunologisches Nachweisverfahren eingesetzt werden kann.

Description

Verfahren zur Beschichtung von Kunststoff-Festphasen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff- Festphase mit einer hydrophoben Substanz, insbesondere einer Substanz, die als Antigen für ein immunologisches Nachweisverfahren eingesetzt werden kann.
Festphasenimmunoassays zur Bestimmung von Analyten, beispielsweise Antikörpern in biologischen Proben, werden von vielen Anbietern kommerziell vertrieben. Dabei werden oftmals Kunststoff-Festphasen mit darauf immobilisierten Reagenzien, beispielsweise Antigenen verwendet. Bei manchen Tests treten Probleme hinsichtlich dieser immobilisierten Antigene auf. Einerseits müssen die immobilisierten Antigene resistent gegen Beanspruchungen sein und andererseits müssen die Antigene so präsentiert werden, dass sie von den nachzuweisenden Antikörpern erkannt werden. Diese beiden Anforderungen können oftmals nicht uneingeschränkt erfüllt werden.
Antiphospholipid-Antikörper sind Autoantikörper, die in Plasma oder Serum durch Festphasen-Immunoassays bestimmt werden. Hierzu werden Festphasen mit darauf immobilisierten negativ geladenen Phospholipiden, meist Cardiolipin als Antigen, verwendet. Die Beschichtung der Festphase, z.B. einer Mikrotiterplatte mit Cardiolipin und anderen Phospholipiden ist in vielen Veröffentlichungen beschrieben (WO 91 /1 5772; Pengo et al., Blood 70 ( 1 987) 69 bis 76; Rombos et al., Acta Neurol Scand 81 ( 1 990), 243 bis 245; Harris, Stroke 23, Suppl.l ( 1 992), I-3 bis I-6; Vogel et al. Thrombosis Res, 62 (1 991 ), 545 bis 566) und verläuft prinzipiell immer nach dem gleichen Verfahren: Eine alkoholische Lösung der Phospholipide wird in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert und das Lösungsmittel wird durch Verblasen mit Luft oder Stickstoff bis zur Trockene eingedampft. Die Platten werden anschließend mehrmals mit Phosphatpuffer gewaschen. Zur Blockierung wird adultes bovines Serum oder fötales Kälberserum verwendet. Die Beschichtung der Platten ist dann nach Trocknung abge- schlössen.
Bei diesem Beschichtungsverfahren wird das Antigen jedoch nur schwach und somit reversibel gebunden. Dies hat die Auswirkung, dass die Antigenbeschichtung sehr instabil ist und selbst mechanisch durch mehrmaliges Waschen entfernt werden kann. Auch die Verwendung von Detergenzien während des späteren Analytnachweises, z.B. im Probenverdünner oder in der Waschlösung, die in vielen Testsystemen zur Reduktion von unspezifischen Bindungen benötigt wird, führt fast immer zu einem mindestens teilweisen Verlust der Phospholipidschicht und somit zu einer verringerten Testempfindlichkeit.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Beschichtung von Kunststoff-Festphasen bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile der Standes der Technik nicht aufweist, aber dennoch auf einfache und kostengünstige Weise durchgeführt werden kann.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff-Festphase mit einer hydrophoben Substanz, umfassend die Schritte:
Herstellen einer Lösung, enthaltend die hydrophobe Substanz in einem organischen Lösungsmittel, das eine Aufweichung der Kunststoff-Oberfläche bewirkt,
Inkubieren der Lösung mit der Kunststoff-Festphase und Entfernen der Lösung.
Das erfindungsgemäße Verfahren bewirktdurch Aufweichen der Kunststoff- Oberfläche eine verstärkte Bindung von hydrophoben Substanzen an eine Festphase, wobei dieses Aufweichen jedoch nicht zur Zerstörung der Oberfläche führt. Die mit diesem Verfahren immobilisierten Substanzen sind im Wesentlichen irreversibel an die Oberfläche der Kunststoff-Festphase gebunden. Die Beschichtung ist weitestgehend sowohl gegen mechanische Beanspruchungen als auch gegen die Einwirkung von Detergenzien resistent. Somit ist mehrfaches Waschen während des Nachweisverfahrens unproblematisch und führt zur Reduzierung von unspezifischen Bindungen und somit von falsch positiven Ergebnissen. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die erfindungsgemäß immobilisierten Substanzen überraschenderweise in einer der nativen Struktur ähnlichen Konformationvorliegen, sodass Analyten, z.B. Antikörper die immobilisierten Substanzen erkennen und mit hoher Affinität binden. Dies führt zu einer Verbesserung der Sensitivität und Spezifität der Nachweisverfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Beschichtung unterschiedlicher Kunststoff-Festphasen geeignet. Beispiele für geeignete Kunststoffe sind Polyvinylchlorid, Kunststoffe auf Polystyrolbasis wie etwa Polystyrol, Styrol- divenylbenzol-Copolymer, Styrol-Maleinsäureanhydrid-Copolymer etc., Nylon, Polyacrylamid, Polyacrylnitril, Polypropylen, Polymethylenmethacrylat etc. Bevorzugt werden Festphasen auf Polystyrolbasis, insbesondere Polystyrol-Träger beschichtet.
Die Festphase kann eine beliebige Form haben, z.B. die Form einer Platte, insbesondere einer Mikrotiterplatte, die Form eines Gefäßes, insbesondere eines Reaktionsgefäßes oder Röhrchens, oder eines Partikels, wie etwa
Beads. Darüber hinaus können selbstverständlich auch andere Arten von Festphasen, z.B. faserartige oder membranartige Festphasen beschichtet werden.
Die hydrophoben Substanzen, die auf der Festphase aufgebracht werden, sind vorzugsweise biologische Substanzen oder pharmazeutische Wirkstoffe, z.B. Lipide oder lipidartige Verbindungen wie etwa Phospholipide, Glycolipide, z.B. Ganglioside, Fettsäuren, Triglyceride, Steroide oder Gemische davon. Besonders bevorzugt verwendet man Phospholipide wie Cardiolipin, Phosphatidyl-Serin, Phosphatidyl-Inositol, Phosphatidyl- Ethanolamin, Phosphatidsäure, Phosphatidyl-Glycerophosphat oder Gemische davon. Am meisten bevorzugt verwendet man Cardiolipin.
Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verwendung einer Lösung, die eine Aufweichung der Kunststoff-Oberfläche bewirkt. Hierzu kann die Lösung ein oder mehrere Lösungsmittel enthalten, die in der Lage sind, eine Kunststoff-Oberfläche anzugreifen, d.h. deren Beschaffenheit so zu modifizieren, dass eine Verbesserung der Antigenbin- dung bewirkt wird. Dabei können organische wasserunlösliche Lösungsmittel, wasserlösliche organische Lösungsmittel oder Gemische davon eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Ether wie Dimethoxyethan, Tetrahydrofuran, Ketone wie Aceton oder Methylethylke- ton, Ester wie Ethylacetat und Gemische davon. Besonders bevorzugt wird Dimethoxyethan eingesetzt.
Die organische Lösung mit der zu beschichtenden Substanz und dem die Kunststoff-Oberfläche aufweichenden Lösungsmittel kann darüber hinaus noch weitere Komponenten, z.B. Alkohole, Wasser oder einen wässrigen Puffer enthalten. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Lösungen, die Gemische aus einer wässrigen Komponente und einer organischen Komponente enthalten. Das Volumenverhältnis von wässriger und organischer Komponente liegt vorzugsweise im Bereich von 1 0 : 90 bis 90 : 1 0, besonders bevorzugt im Bereich von 25 : 75 bis 75 : 25. Die die hydrophobe Substanz und das die Kunststoff-Oberfläche aufweichende organische Lösungsmittel enthaltende Lösung wird mit der Kunststoff-Festphase in Kontakt gebracht und für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreicht, um die Kunststoff-Oberfläche aufzuweichen, bei der jedoch keine Zerstörung der Kunststoff-Oberfläche erfolgt. Besonders bevorzugt beträgt die Inkubationsdauer 1 bis 4 h bei Raumtemperatur ( 1 8 bis 25 °C), besonders bevorzugt etwa 2 h.
Nach dem Immobilisieren der hydrophoben Substanz kann die Kunststoff- Festphase mit weiteren Substanzen, beispielsweise hydrophilen Antigenen, wie etwa Proteinen beschichtet werden. Für den Nachweis von Anti- Phospholipid-Antikörpern erfolgt vorzugsweise eine nachfolgende Beschichtung mit einem Säuger ?-2-Glycoprotein I, das in Form eines aufgereinigten Proteins (EP-A-0 474 849) oder in Form von zugesetztem Serum oder Serumfraktionen (Harris et al., Clin. exp. Immunol. 68 (1 987), 21 5 bis 222)) eingesetzt werden kann.
Anschließend kann gegebenenfalls eine Blockierung der Festphase zur Verhinderung unspezifischer Bindungen durchgeführt werden. Als Blockie- rungsreagienzen können die für diesen Zweck aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen, beispielsweise Rinderserumalbumin, Saccharide, lösliche Polymere etc. eingesetzt werden.
Die Konzentration der auf der Festphase immobilisierten Substanz kann durch Variation von Konzentration der Beschichtungssubstanz und/oder Menge der Beschichtungslösung innerhalb breiter Bereiche eingestellt werden. Die Konzentration der Substanz in der Beschichtungslösung kann beispielsweise im Bereich zwischen 1 und 1000 μg/ml, insbesondere zwischen 5 und 100 μg/ml variiert werden. Pro Vertiefung einer Mikrotiter- platte können beispielsweise zwischen 10 μ\ und 300 μ\ Beschichtungslösung eingesetzt werden. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten beschichteten Festphasen sind für einen langen Zeitraum von mehreren Jahren haltbar und können in einem Verfahren zur Bestimmung von Analyten in einer biologischen Probe eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden die beschich- teten Festphasen in einem immunologischen Verfahren eingesetzt, z.B. zur Bestimmung von Antikörpern wie etwa Anti-Phospholipid- oder Anti- Gangliosid-Antikörpern.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert werden.
Beispiel
1 . Materialien
1 . 1 Flachboden-Mikrotiterplatte (nunc, Kat.-Nr.: 446469) mit 1 2 Modulen zu 8 C-förmigen Vertiefungen aus Polystyrol.
1 .2 Antigene
Cardiolipin, Na-Salz in Ethanol (Sigma, Art. -Nr.: C 1 649). ?2-Glycoprotein I (Heparin-Sepharose gereinigte Humanserumfraktion)
1 .3 Beschichtunqslösunαen für Cardiolipin 50 mM Na2CO3/NaHCO3-Puffer, pH 9,6
Lösungsmittel: Dimethoxyethan (Aldrich E2740-8)
1 .4 Beschichtunqspuffer für ??-Glvcoprotein I Phosphatpuffer, pH 7,4
1 .5 Blockierunqspuffer (2-fach-Konzentrat) Phosphatpuffer, pH 7,3, 1 % Rinderserumalbumin, 2 % Lactose 2. Verfahren
2.1 Beschichtunq der Festphase mit Cardiolipin
Carbonatpuffer und Lösungsmittel werden im Verhältnis 49,5 % zu 50,5 % (Vol/Vol) portionsweise vermischt. Cardiolipin wird in diese Lösung in einer Endkonzentration zwischen 20 und 35 μg/ml eingebracht. Von der fertigen Lösung werden mindestens 1 20 /I in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte dispensiert. Die Platte wird 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sie gegen Verdunstung abgedeckt ist. Anschließend wird die Platte entleert.
2.2 Beschichtunq mit ff,-Glvcoprotein I
1 20 μ\ einer ?2-Glycoprotein I Lösung (5 /g/ml) werden in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte dispensiert. Die Platte wird 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
2.3 Blockierung, Trocknung und Verpackung
1 1 0 vl des zweifach konzentrierten Blockierungspuffers werden in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platte wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend entleert und getrocknet. Die fertige Mikrotiterplatte wird zusammen mit einem Trockenbeutel in Aluminium- Verbundfolie eingeschweißt.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff-Festphase mit einer hydrophoben Substanz, umfassend die Schritte
Herstellen einer Lösung, enthaltend die hydrophobe Substanz in einem organischen Lösungsmittel, daseine Aufweichung der Kunststoff-Oberfläche bewirkt,
Inkubieren der Lösung mit der Kunststoff-Festphase und - Entfernen der Lösung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et, dass man eine Festphase auf Polystyrolbasis beschichtet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e ke n n ze i c h n et , dass die Festphase aus Mikrotiterplatten, Reaktionsgefäßen und
Beads ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, dass die hydrophoben Substanzen aus Lipiden und lipidartigen
Verbindungen ausgewählt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et, dass die hydrophoben Substanzen aus Phospholipiden, Glycolipiden, Fettsäuren, Triglyceriden, Steroiden oder Gemischen davon ausge- wählt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass die hydrophoben Substanzen aus Phospholipiden wie Cardiolipin, Phosphatidyl-Serin, Phosphatidyl-Inositol, Phosphatidsäure, Phosphatidyl-Glycerophosphat und Gemischen davon ausgewählt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et , dass das organische Lösungsmittel ausgewählt wird aus Ethern,
Ketonen, Estern, und Gemischen davon.
8. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass das organische Lösungsmittel ausgewählt wird aus Dimethoxyethan, Tetrahydrofuran und Gemischen davon.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Lösung weiterhin Wasser oder einen wässrigen Puffer enthält.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Inkubationsdauer 1 bis 4 h beträgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend das anschließende Beschichten der Festphase mit einer weiteren Substanz.
12. Verfahren nach Anspruch 11, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass die weitere Substanz ein Protein ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass die weitere Substanz ein Säuger /?2-Glycoprotein I ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend das anschließende Blockieren der Festphase zur Verhinderung einer unspezifischen Bindung.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend die Verwendung der beschichteten Festphasen in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten.
16. Verfahren nach Anspruch 15, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et, dass der Analyt ein Antikörper ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n e t , dass der Antikörper ein Anti-Phospholipid- oder Anti-Gangliosid-
Antikörper ist.
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