DE10018954B4 - Verwendung einer beschichteten Kunststoff-Festphase in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten - Google Patents

Abstract

Verwendung einer beschichteten Festphase in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, wobei die beschichtete Festphase erhältlich ist durch ein Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff-Festphase mit einer hydrophoben Substanz, umfassend die Schritte
– Herstellen einer Lösung, enthaltend die hydrophobe Substanz in einem organischen Lösungsmittel, das eine Aufweichung der Kunststoffoberfläche bewirkt, sowie weiterhin Wasser oder einen wässrigen Puffer,
– Inkubieren der Lösung mit der Kunststoff-Festphase und
– Entfernen der Lösung.

Description

• Die Erfindung betrifft die Verwendung einer beschichteten Festphase in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, wobei die beschichtete Festphase erhältlich ist durch ein Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff-Festphase mit einer hydrophoben Substanz, insbesondere einer Substanz, die als Antigen für ein immunologisches Nachweisverfahren eingesetzt werden kann.
• Festphasenimmunoassays zur Bestimmung von Analyten, beispielsweise Antikörpern in biologischen Proben, werden von vielen Anbietern kommerziell vertrieben. Dabei werden oftmals Kunststoff-Festphasen mit darauf immobilisierten Reagenzien, beispielsweise Antigenen verwendet. Bei manchen Tests treten Probleme hinsichtlich dieser immobilisierten Antigene auf. Einerseits müssen die immobilisierten Antigene resistent gegen Beanspruchungen sein und andererseits müssen die Antigene so präsentiert werden, dass sie von den nachzuweisenden Antikörpern erkannt werden. Diese beiden Anforderungen können oftmals nicht uneingeschränkt erfüllt werden.
• Antiphospholipid-Antikörper sind Autoantikörper, die in Plasma oder Serum durch Festphasen-Immunoassays bestimmt werden. Hierzu werden Festphasen mit darauf immobilisierten negativ geladenen Phospholipiden, meist Cardiolipin als Antigen, verwendet. Die Beschichtung der Festphase, z.B. einer Mikrotiterplatte mit Cardiolipin und anderen Phospholipiden ist in vielen Veröffentlichungen beschrieben (WO 91/15772; Pengo et al., Blood 70 (1987) 69 bis 76; Rombos et al., Acta Neurol Scand 81 (1990), 243 bis 245; Harris, Stroke 23, Suppl.I (1992), I-3 bis I-6; Vogel et al. Throm bosis Res, 62 (1991), 545 bis 566) und verläuft prinzipiell immer nach dem gleichen Verfahren: Eine alkoholische Lösung der Phospholipide wird in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert und das Lösungsmittel wird durch Verblasen mit Luft oder Stickstoff bis zur Trockene eingedampft. Die Platten werden anschließend mehrmals mit Phosphatpuffer gewaschen. Zur Blockierung wird adultes bovines Serum oder fötales Kälberserum verwendet. Die Beschichtung der Platten ist dann nach Trocknung abgeschlossen.
• Bei diesem Beschichtungsverfahren wird das Antigen jedoch nur schwach und somit reversibel gebunden. Dies hat die Auswirkung, dass die Antigenbeschichtung sehr instabil ist und selbst mechanisch durch mehrmaliges Waschen entfernt werden kann. Auch die Verwendung von Detergenzien während des späteren Analytnachweises, z.B. im Probenverdünner oder in der Waschlösung, die in vielen Testsystemen zur Reduktion von unspezifischen Bindungen benötigt wird, führt fast immer zu einem mindestens teilweisen Verlust der Phospholipidschicht und somit zu einer verringerten Testempfindlichkeit.
• In EP 0 550 875 B1 wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutische Wirkstoffe enthaltenden, vorgefertigten implantierbaren Vorrichtung aus einem polymeren Material beschrieben. Bei diesem Verfahren wird die vorgefertigte implantierbare Vorrichtung für eine bestimmte Zeitdauer mit einem organischen Lösungsmittel behandelt, wobei entweder der pharmazeutische Wirkstoff gleichzeitig vorliegt, oder nach einer bestimmten Zeitdauer ein in einem ähnlichen oder gleichen organischen Lösungsmittel gelöster pharmazeutischer Wirkstoff mit dem vorbehandelten Implantat behandelt wird und darauf das oder die organischen Lösungsmittel abgedampft und die behandelten Implantate danach ggf. sterilisiert werden. Das organische Lösungsmittel bewirkt eine Quellung des polymeren Materials. Der auf das polymere Material aufgebrachte pharmazeutische Wirkstoff soll nach Implantation mit einem gewünschten Freisetzungsprofil wieder aus dem Implantat gelöst werden. Nachteilig bei der in EP 0 550 875 B1 beschriebenen Vorgehensweise ist, dass nur eine relativ schwache, reversible Bindung der pharmazeutisch wirksamen Substanz erfolgt, so dass diese durch Diffusion in Gegenwart eines physiologischen Mediums wieder freigesetzt wird.
• In EP 0 405 284 A2 wird ein Verfahren zum Imprägnieren eines aus einem polymeren Material hergestellten Katheters mit einer pharmazeutischen Substanz beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Eintauchen des Katheters in eine gesättigte Lösung der pharmazeutischen Substanz in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel, Inkontaktbringen des Katheters bei oder nah überkritischen Druck- und Temperaturbedingungen des Lösungsmittels mit der gesättigten Lösung, und Verringern des Drucks von den überkritischen Druckbedingungen, um das Lösungsmittel vom Katheter zu entfernen, wobei die pharmazeutische Substanz im Katheter imprägniert bleibt. In EP 0 405 284 A2 wird die Imprägnierung eines Kunststoffmaterials mit pharmazeutischen Wirkstoffen beschrieben. Das in EP 0 405 284 A2 beschriebene Verfahren ist jedoch zur Herstellung einer Festphase, die zur Bestimmung eines Analyten verwendet werden kann, nicht geeignet. Insbesondere wird nach dem in EP 0 405 284 A2 beschriebenen Verfahren das Polymermaterial gequollen, um den Wirkstoff reversibel zu binden, da der Wirkstoff nach Einsetzen des Katheters wieder freigesetzt werden soll. Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass keine irreversible feste Bindung einer hydrophoben Substanz auf einer Festphase erfolgt.
• Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Beschichtung von Kunststoff-Festphasen bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist, aber dennoch auf einfache und kostengünstige Weise durchgeführt werden kann, und mit dem beschichtete Festphasen erhalten werden können, die zur Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten geeignet sind.
• Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung einer beschichteten Festphase in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, wobei die beschichtete Festphase erhältlich ist durch ein Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff-Festphase mit einer hydrophoben Substanz, umfassend die Schritte:
• – Herstellen einer Lösung, enthaltend die hydrophobe Substanz in einem organischen Lösungsmittel, das eine Aufweichung der Kunststoff-Oberfläche bewirkt, sowie weiterhin Wasser oder einen wässrigen Puffer
• – Inkubieren der Lösung mit der Kunststoff-Festphase und
• – Entfernen der Lösung.
• Das erfindungsgemäße Verfahren bewirkt durch Aufweichen der Kunststoff-Oberfläche eine verstärkte Bindung von hydrophoben Substanzen an eine Festphase, wobei dieses Aufweichen jedoch nicht zur Zerstörung der Oberfläche führt. Die mit diesem Verfahren immobilisierten Substanzen sind im Wesentlichen irreversibel an die Oberfläche der Kunststoff-Festphase gebunden. Die Beschichtung ist weitestgehend sowohl gegen mechanische Beanspruchungen als auch gegen die Einwirkung von Detergenzien resistent. Somit ist mehrfaches Waschen während des Nachweisverfahrens unproblematisch und führt zur Reduzierung von unspezifischen Bindungen und somit von falsch positiven Ergebnissen. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die erfindungsgemäß immobilisierten Substanzen überraschenderweise in einer der nativen Struktur ähnlichen Konformation vorliegen, sodass Analyten, z.B. Antikörper die immobilisierten Substanzen erkennen und mit hoher Affinität binden. Dies führt zu einer Verbesserung der Sensitivität und Spezifität der Nachweisverfahren.
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Beschichtung unterschiedlicher Kunststoff-Festphasen geeignet. Beispiele für geeignete Kunststoffe sind Polyvinylchlorid, Kunststoffe auf Polystyrolbasis wie etwa Polystyrol, Styroldivenylbenzol-Copolymer, Styrol-Maleinsäureanhydrid-Copolymer etc., Nylon, Polyacrylamid, Polyacrylnitril, Polypropylen, Polymethylenmethacrylat etc. Bevorzugt werden Festphasen auf Polystyrolbasis, insbesondere Polystyrol-Träger beschichtet.
• Die Festphase kann eine beliebige Form haben, z.B. die Form einer Platte, insbesondere einer Mikrotiterplatte, die Form eines Gefäßes, insbesondere eines Reaktionsgefäßes oder Röhrchens, oder eines Partikels, wie etwa Beads. Darüber hinaus können selbstverständlich auch andere Arten von Festphasen, z.B. faserartige oder membranartige Festphasen beschichtet werden.
• Die hydrophoben Substanzen, die auf der Festphase aufgebracht werden, sind vorzugsweise biologische Substanzen oder pharmazeutische Wirkstoffe, z.B. Lipide oder lipidartige Verbindungen wie etwa Phospholipide, Glycolipide, z.B. Ganglioside, Fettsäuren, Triglyceride, Steroide oder Gemische davon. Besonders bevorzugt verwendet man Phospholipide wie Cardiolipin, Phosphatidyl-Serin, Phosphatidyl-Inositol, Phosphatidyl-Ethanolamin, Phosphatidsäure, Phosphatidyl-Glycerophosphat oder Gemische davon. Am meisten bevorzugt verwendet man Cardiolipin.
• Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verwendung einer Lösung, die eine Aufweichung der Kunststoff-Oberfläche bewirkt. Hierzu kann die Lösung ein oder mehrere Lösungsmittel enthalten, die in der Lage sind, eine Kunststoff-Oberfläche anzugreifen, d.h. deren Beschaffenheit so zu modifizieren, dass eine Verbesserung der Antigenbindung bewirkt wird. Dabei können organische wasserunlösliche Lösungsmittel, wasserlösliche organische Lösungsmittel oder Gemische davon eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Ether wie Dimethoxyethan, Tetrahydrofuran, Ketone wie Aceton oder Methylethylketon, Ester wie Ethylacetat und Gemische davon. Besonders bevorzugt wird Dimethoxyethan eingesetzt.
• Die organische Lösung mit der zu beschichtenden Substanz und dem die Kunststoff-Oberfläche aufweichenden Lösungsmittel kann darüber hinaus noch weitere Komponenten, z.B. Alkohole, Wasser oder einen wässrigen Puffer enthalten. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Lösungen, die Gemische aus einer wässrigen Komponente und einer organischen Komponente enthalten. Das Volumenverhältnis von wässriger und organischer Komponente liegt vorzugsweise im Bereich von 10 : 90 bis 90 : 10, besonders bevorzugt im Bereich von 25 : 75 bis 75 : 25.
• Die die hydrophobe Substanz und das die Kunststoff-Oberfläche aufweichende organische Lösungsmittel enthaltende Lösung wird mit der Kunststoff-Festphase in Kontakt gebracht und für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreicht, um die Kunststoff-Oberfläche aufzuweichen, bei der jedoch keine Zerstörung der Kunststoff-Oberfläche erfolgt. Besonders bevorzugt beträgt die Inkubationsdauer 1 bis 4 h bei Raumtemperatur (18 bis 25 °C), besonders bevorzugt etwa 2 h.
• Nach dem Immobilisieren der hydrophoben Substanz kann die Kunststoff-Festphase mit weiteren Substanzen, beispielsweise hydrophilen Antigenen, wie etwa Proteinen beschichtet werden. Für den Nachweis von Anti-Phospholipid-Antikörpern erfolgt vorzugsweise eine nachfolgende Beschichtung mit einem Säuger β-2-Glycoprotein I, das in Form eines aufgereinigten Proteins (EP-A-0 474 849) oder in Form von zugesetztem Serum oder Serumfraktionen (Harris et al., Clin. exp. Immunol. 68 (1987), 215 bis 222)) eingesetzt werden kann.
• Anschließend kann gegebenenfalls eine Blockierung der Festphase zur Verhinderung unspezifischer Bindungen durchgeführt werden. Als Blockierungsreagienzen können die für diesen Zweck aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen, beispielsweise Rinderserumalbumin, Saccharide, lösliche Polymere etc. eingesetzt werden.
• Die Konzentration der auf der Festphase immobilisierten Substanz kann durch Variation von Konzentration der Beschichtungssubstanz und/oder Menge der Beschichtungslösung innerhalb breiter Bereiche eingestellt werden. Die Konzentration der Substanz in der Beschichtungslösung kann beispielsweise im Bereich zwischen 1 und 1000 μg/ml, insbesondere zwischen 5 und 100 μg/ml variiert werden. Pro Vertiefung einer Mikrotiterplatte können beispielsweise zwischen 10 μl und 300 μl Beschichtungslösung eingesetzt werden.
• Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten beschichteten Festphasen sind für einen langen Zeitraum von mehreren Jahren haltbar und können in einem Verfahren zur Bestimmung von Analyten in einer biologischen Probe eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden die beschichteten Festphasen in einem immunologischen Verfahren eingesetzt, z.B. zur Bestimmung von Antikörpern wie etwa Anti-Phospholipid- oder Anti-Gangliosid-Antikörpern.
• Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert werden.
• Beispiel
• 1. Materialien
• 1.1 Flachboden-Mikrotiterplatte
• Flachboden-Mikrotiterplatte (nunc, Kat.-Nr.: 446469) mit 12 Modulen zu 8 C-förmigen Vertiefungen aus Polystyrol.
• 1.2 Antigene
• Cardiolipin, Na-Salz in Ethanol (Sigma, Art.-Nr.: C 1649).
• β₂-Glycoprotein I (Heparin-Sepharose gereinigte Humanserumfraktion)
• 1.3 Beschichtungslösungen für Cardiolipin
• 50 mM Na₂CO₃/NaHCO₃-Puffer, pH 9,6
• Lösungsmittel: Dimethoxyethan (Aldrich E2740-8)
• 1.4 Beschichtungspuffer für β₂-Glycoprotein I
• Phosphatpuffer, pH 7,4
• 1.5 Blockierungspuffer (2-fach-Konzentrat)
• Phosphatpuffer, pH 7,3, 1 % Rinderserumalbumin, 2 % Lactose
• 2. Verfahren
• 2.1 Beschichtung der Festphase mit Cardiolipin
• Carbonatpuffer und Lösungsmittel werden im Verhältnis 49,5 % zu 50,5 % (Vol/Vol) portionsweise vermischt. Cardiolipin wird in diese Lösung in einer Endkonzentration zwischen 20 und 35 μg/ml eingebracht. Von der fertigen Lösung werden mindestens 120 μl in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte dispensiert. Die Platte wird 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sie gegen Verdunstung abgedeckt ist. Anschließend wird die Platte entleert.
• 2.2 Beschichtung mit β₂-Glycoprotein I
• 120 μl einer β₂-Glycoprotein I Lösung (5 μg/ml) werden in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte dispensiert. Die Platte wird 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
• 2.3 Blockierung, Trocknung und Verpackung
• 110 μl des zweifach konzentrierten Blockierungspuffers werden in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert. Die Platte wird 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend entleert und getrocknet. Die fertige Mikrotiterplatte wird zusammen mit einem Trockenbeutel in Aluminium-Verbundfolie eingeschweißt.

Claims (15)

1. Verwendung einer beschichteten Festphase in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, wobei die beschichtete Festphase erhältlich ist durch ein Verfahren zur Beschichtung einer Kunststoff-Festphase mit einer hydrophoben Substanz, umfassend die Schritte – Herstellen einer Lösung, enthaltend die hydrophobe Substanz in einem organischen Lösungsmittel, das eine Aufweichung der Kunststoffoberfläche bewirkt, sowie weiterhin Wasser oder einen wässrigen Puffer, – Inkubieren der Lösung mit der Kunststoff-Festphase und – Entfernen der Lösung.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine auf Polystyrolbasis beschichtete Festphase einsetzt.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase aus Mikrotiterplatten, Reaktionsgefäßen und Kügelchen ausgewählt wird.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophoben Substanzen aus Lipiden und lipidartigen Verbindungen ausgewählt werden.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophoben Substanzen aus Phospholipiden, Glycolipiden, Fettsäuren, Triglyceriden, Steroiden oder Gemischen davon ausgewählt werden.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophoben Substanzen aus Phospholipiden wie Cardiolipin, Phosphatidyl-Serin, Phosphatidyl-Inositol, Phosphatidsäure, Phosphatidyl-Glycerophosphat und Gemischen davon ausgewählt werden.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ausgewählt wird aus Ethern, Ketonen, Estern und Gemischen davon.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ausgewählt wird aus Dimethoxyethan, Tetrahydrofuran und Gemischen davon.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationsdauer 1 bis 4 h beträgt.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die eingesetzte Festphase mit einer weiteren Substanz beschichtet wurde.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Substanz ein Protein ist.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Substanz ein Säuger β₂-Glycoprotein I ist.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die eingesetzte Festphase zur Verhinderung einer unspezifischen Bindung blockiert wurde.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Antikörper ist.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Anti-Phospholipid- oder Anti-Gangliosid-Antikörper ist.