CN114410757A

CN114410757A - 应用数字pcr对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法

Info

Publication number: CN114410757A
Application number: CN202210328289.4A
Authority: CN
Inventors: 赵硕; 阚飙; 张京云; 吴斌
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-04-29

Abstract

本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法。所述方法包括检测经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、thyA或recA中一种或多种基因的拷贝数，根据检测结果判断所述霍乱弧菌VBNC状态细胞的量。本发明针对霍乱弧菌VC1376、thyA或recA三个基因进行检测，结合数字PCR可以有效反映出霍乱弧菌VBNC状态细胞的数量，具备较高的检测率和稳定性，同时检测限较低，这在VBNC状态细胞检测领域具有重要意义。

Description

应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法

技术领域

本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法。

背景技术

霍乱弧菌是革兰氏阴性菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。当细菌暴露于不利环境如低温、低营养、辐射、抗生素等时，细菌进入VBNC状态。在这种状态下，细菌不能在常规培养基上生长但是仍处于存活状态，这种状态被称为活的非可培养（VBNC）状态。而且当恢复到有利环境时，VBNC 细胞能够复苏到可培养状态。

VBNC细胞的鉴定、检测和绝对定量对于微生物研究和疾病监测与防控都是必不可少的。因为它们不可培养的特性，传统的计数方法无法对VBNC细胞进行定量检测，例如传统的基于形态学和显微镜计数无法区分活、死细胞。现有技术中虽然有专利提出能够定量检测大肠杆菌VBNC状态，但是不能连续动态监测定量VBNC拷贝数，而且不适用于霍乱弧菌VBNC状态的检测与鉴定。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种定量检测霍乱弧菌VBNC状态细胞的方法。通过VC1376、thyA或recA基因对霍乱弧菌VBNC状态细胞进行检测，可以准确反应其实际数量。

第一方面，本发明提供一种定量检测霍乱弧菌VBNC状态细胞的方法，包括：

检测经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、thyA或recA中一种或多种基因的拷贝数，根据检测结果判断所述霍乱弧菌VBNC状态细胞的量。

进一步地，VC1376包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或，thyA包括如SEQID NO.2所示的核苷酸序列；和/或，recA蛋白包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。全基因组序列参照NC_002505.1 Vibrio cholerae O1 biovar El Tor str. N16961chromosome I, complete sequence。

进一步地，采用如下引物对检测VC1376蛋白的拷贝数：

VC1376-F：5’-TAACATAATAAGGAAGAAGTGGAT-3’，

VC1376-R：5’-ACAGTCAGAAGCAGAGAA-3’；

采用如下引物对检测thyA蛋白的拷贝数：

thyA-F：5’- ACATGGGACGCGTGTATGG-3’，

thyA-R：5’- ATATGACCACCATCAGGCTTAGC-3’；

采用如下引物对检测recA蛋白的拷贝数：

RecA-F：5’- GTGCTGTGGATGTCATCGTTGTTG-3’，

RecA-R：5’-CCACCACTTCTTCGCCTTCTTTGA-3’。

进一步地，通过qPCR或ddPCR检测经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、thyA和recA基因的拷贝数。

进一步地，所述qPCR的反应程序为：

95℃，3 min; 95℃，5 s，50°C 30s对于VC1376，54℃ 30s对于thyA，55℃ 30s对于recA，循环40次；

所述ddPCR的反应程序为95℃，5min； 95℃，30s，50℃ 30s对于VC1376，54℃ 30s对于thyA，55℃ 30s对于recA； 4℃，5min，90℃，5min。

进一步地，所述PMA处理包括如下流程：

将所述待检测霍乱弧菌样本置于4℃条件下，采用20~30mM的PMA处理20~30分钟，然后采用卤素灯在冰上照射15~25分钟。

优选地，所用PMA浓度为20μM；和/或，PMA处理时间为20分钟。

第二方面，本发明提供一种引物组合，包括如下三对引物中的任意一种或多种：

i）VC1376-F：5’-TAACATAATAAGGAAGAAGTGGAT-3’，

VC1376-R：5’-ACAGTCAGAAGCAGAGAA-3’；

ii）thyA-F：5’- ACATGGGACGCGTGTATGG-3’，

thyA-R：5’- ATATGACCACCATCAGGCTTAGC-3’；

iii）RecA-F：5’- GTGCTGTGGATGTCATCGTTGTTG-3’，

RecA-R：5’-CCACCACTTCTTCGCCTTCTTTGA-3’。

本发明进一步提供包括所述引物组合的试剂盒。

本发明进一步提供所述引物组合或所述试剂盒在检测霍乱弧菌VBNC状态细胞中的应用。

本发明具备如下有益效果：

一个霍乱弧菌VBNC细胞具有一个VC1376（编码GGDEF家族蛋白）、一个thyA（编码胸苷酸合酶）基因和一个recA（编码ATP 结合蛋白Uup）基因。因此，本发明运用染色体上的此三个单拷贝基因来分别计算活菌的量。基于此，本发明提供VC1376、thyA和recA基因拷贝数来对VBNC细胞进行定量检测。

本发明采用荧光定量PCR(qPCR)和数字PCR(ddPCR)，用霍乱弧菌单拷贝基因来对其VBNC发展状态进行量化，并且通过加入叠氮溴化丙锭(PMA)处理以区分死细胞和活细胞。结果显示两种PCR方法均可用于量化DNA拷贝数，但是ddPCR 显示出比qPCR更高的准确性和灵敏度。并且数字PCR直接计数，无需建立标准曲线。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的不同浓度PMA，不同处理时间的活菌计数结果。

图2为本发明实施例3提供的依据三个基因VC1376、thyA和recA对霍乱弧菌VBNC处理第70天的总菌和活菌进行qPCR和ddPCR检测的结果。

图3为本发明实施例4提供的在霍乱弧菌 C6706菌株的VBNC状态发育过程中，通过qPCR 和ddPCR对活细胞进行计数的结果示意图；其中，A为霍乱弧菌 C6706菌株的可培养细胞计数结果，*表示可培养细胞计数<1菌落形成单位/mL。；B-D为经过PMA处理后，检测VC1376、thyA 和recA的DNA拷贝数/mL；E-F为通过qPCR和ddPCR 测量的DNA拷贝数/mL 的变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、试验材料

本发明所用霍乱弧菌材料为霍乱弧菌O1埃尔托型菌株C6706。

从-80℃冰箱去除该菌株，其保存于含20%甘油的冻存液中。三区划线于普通琼脂LB平板（Oxoid, Basingstoke, UK）上37℃过夜培养，取单菌落用于后续实验。用普通琼脂平板平板计数，37℃过夜培养后读取形成的菌落数。每个梯度的计数均重复三次。

2、VBNC状态霍乱弧菌的制备

首先制备人工海水（ASW），将海盐（sea salt， USA）以 40g/L 溶于去离子水中，然后经0.22μm 的滤膜（Millipore， USA）过滤制成。

挑取一个C6706菌株的单克隆，在LB中重悬，然后在37℃条件下以200转/分钟摇动培养过夜。后以1：50的体积比例重悬于新鲜的LB中，并以200转/分钟的速度与37℃摇动培养至OD₆₀₀=1.0（细菌浓度大约为1×10⁹CFU/mL）。接下来，采用ASW将该培养物离心洗涤三遍。然后用ASW稀释至大约1×10⁷CFU/mL制成鲜活细菌悬液，以备后续实验使用。

采用1.5ml的EP管装满培养物并且排除空气，即将霍乱弧菌置于4°C缺氧条件下的ASW中，检测时每个基因设置3个重复（3个1.5mL的EP管）。

3、PMA处理流程

使用PMA (Biotium, USA)联合qPCR或ddPCR计数VBNC状态活细胞。PMA 是propidium iodide 类似化合物，不能通过完整的细胞膜，只可结合膜破损的细胞的 DNA。PMA的另一个特点是可以和双链DNA共价结合，从而阻止DNA在PCR过程中的解链。因此，膜破损的细胞在PCR过程中得不到复制，而完整的细胞的DNA可以进行扩增从而产生荧光信号。进而实现活死菌的区分。此外，由于荧光定量PCR和数字PCR的灵敏性和特异性，这种方法可以快速，方便和客观的区分死菌和活菌。

本申请将PMA（Biotium，USA）溶于一定体积的超纯水（Gibco，USA）中至20mM的储存液浓度，并避光保存于-20℃备用。根据制造商的说明，将一定体积的PMA加入500μL上述各种菌悬液中。

3.1 为了优化在室温中PMA的处理条件，PMA 应用的终浓度分别为5，10，20，40，80和160μM。本发明对PMA避光孵育的时间也进行了优化。孵育时间分别为5，10，20和30分钟。然后置于650W 的卤素灯（Kerun，China）放置于其20cm下方照射15分钟。在光处理的过程中，培养物被置于冰上以避免照射产生的热量导致细菌死亡。在过处理之后，混匀后吸取200μL 产物经过离心沉淀，用于后续的实验。

结果如图1所示，其中的A显示随着PMA使用浓度的升高和孵育时间的延长，被判断为活菌的细胞所占的比例逐渐下降。通过对比PMA处理前细菌拷贝计数，在使用PMA浓度为5μM时，被判断为活细胞的细菌所占的比例从孵育5分钟时的100.11%下降到孵育30分钟时的54.08%。在10μM 时，该比例从89.31%下降到50%；在20μM时，从38.25%下降到28.31；在40μM时从41.82%下降到16.29%；80μM时从26.47%下降到5.92%；160μM时从7.67%下降到 0.31%。与其他的使用浓度不同，当使用20μM的使用浓度时，即使孵育时间延长至30分钟，活菌计数的差异并没有统计学意义。结合图1中关于死菌和活菌的研究结果，本发明认为使用20μM的PMA孵育20分钟可以作为VBNC计数的最优条件。

具体得到的处理方式如下将200μL的细胞置于4°C下，用20μM PMA在黑暗中处理20分钟，然后用650 w双端卤素灯在冰上暴露15分钟。

4、PCR检测

使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)从经PMA处理（PMA+）和未经过PMA处理（PMA-）的细胞悬浮液（200μL）中分离DNA，每次采用200μL洗脱缓冲液为。纯化DNA后用NanoDrop2000c分光光度计(Thermo, USA)定量。DNA样本保存在−20°C冰箱。

本发明中qPCR和ddPCR检测所用引物如下表1所示：

表1 检测用引物序列

qPCR扩增反应体系如下（20μL）：

1μL的模板DNA、Premix Ex Taq (TaKaRa，中国大连)、针对霍乱弧菌O1单拷贝基因VC1376、thyA或recA的正、反引物各0.25μM（表1）和超纯水。

qPCR反应程序如下（LightCycler 96系统）：

热循环条件为:95℃，3 min; 95℃，5 s，50°C 30s（VC1376），54℃ 30s（thyA），55℃ 30s（recA），循环40次。最后进行溶解曲线分析（从65℃每5sec升温0.5℃至95℃）。每次qPCR进行3次重复。

从纯化的霍乱弧菌O1 El Tor菌株C6706中提取DNA，按顺序稀释制成标准曲线。

ddPCR的体系、程序和数据分析按照说明书（EvaGreen®）进行，具体地：

ddPCR体系（20µL）：10 μL EvaGreen Supermix、1μL DNA、每个引物0.2µM，其余为ddH₂O。以ddH₂O为阴性对照。

ddPCR流程：使用Bio-Rad自动液滴发生器产生液滴。使用Bio-Rad C1000 Touch™热循环器进行热循环，反应程序为:95℃,5min; 95℃，30s，50℃ 30s（VC1376），54℃ 30s（thyA），55℃ 30s（recA）; 4℃，5min，90℃，5min。反应后，使用QX200™液滴阅读器分析液滴。使用Bio-Rad QuantaSoft™软件进行数据分析。

实施例2

本实施例针对qPCR和ddPCR定量的灵敏度进行研究，具体方法如下：

通过平板计数确定霍乱弧菌C6706菌株的平均浓度约为1.3

10⁷ CFU/mL。从霍乱弧菌菌株C6706中提取DNA通过连续10倍稀释制备，浓度为10ng/µL至1fg/µL。之后通过实施例1中的方法进行检测得到如下表所示的结果：

表2 qPCR和ddPCR定量检测3种蛋白的编码基因的检测结果

*，每个反应中的 DNA 量。

UD，未检测到。上限，测定信号饱和上线（反应混合物中 > 20,000 个拷贝）。

结果可以看出qPCR的检测VC1376、thyA和recA三个单拷贝基因的检测下限Cq值分别为35.58±0.24、35.02 ±0.96和34.06±0.61。

而ddPCR的具备更低的检测下限，对于1fg/µL的DNA，分别检测到VC1376、thyA和recA三个单拷贝基因的检测下限0.03±0.02、0.07± 0.01和0.08±0.02拷贝/µL。因此可以看出，ddPCR的灵敏度是qPCR的10倍。ddPCR的荧光标记曲线反应饱和度为100pg/µL（即>20,000个阳性液滴）。两种 PCR 方法在定量范围内均表现出良好的线性，三个基因R²值均在0.992和0.999之间。

实施例3

本实施例通过如实施例1中所示的三对基因的引物，针对霍乱弧菌C6706菌株VBNC状态细胞第70天的基因拷贝数进行检测，检测方法如实施例1中所示，具体针对经过PMA处理（PMA+）和未经过PMA处理（PMA-）的霍乱弧菌C6706菌株VBNC状态细胞分别进行qPCR和ddPCR检测，得到如图2所示结果：ddPCR定量总细胞（PMA-）的结果显示，使用VC1376、thyA、recA定量结果分别为6.18±0.10、6.29±0.13和6.20±0.19 log₁₀ DNA 拷贝/mL。

根据qPCR和ddPCR定量总细胞（PMA-）和活细胞（PMA+）的结果差异来评估细胞活力损失，qPCR结果显示采用VC1376、thyA和recA评估的细胞活力损失分别为0.7、0.58 和1.13log₁₀DNA拷贝/mL，ddPCR结果显示采用VC1376、thyA和recA评估的细胞活力损失分别为0.78、0.74 和 0.81 log₁₀DNA拷贝/mL。

进一步量化细胞活力损失率得到如下表所示结果：

表3通过qPCR和ddPCR对霍乱弧菌VBNC第70天定量细胞活力损失

结果显示，qPCR采用VC1376、thyA和recA对VBNC细胞比例进行检测的结果为13.09%、38.91% 和 9.30%，数据之间差距较大，一致性较低，而ddPCR表现出更优的一致性，VC1376、thyA和recA对VBNC细胞进行检测比例分别为16.09%、18.06% 和 15.61%。

实施例4

本实施例针对VBNC发展过程中的活细胞进行定量检测，具体以70天为限，在第 0、10、20、30和70天采用qPCR和ddPCR进行检测，同样针对PMA+和PMA-的结果进行检测。

得到如图3所示结果，A中显示可培养细胞计数（在LB琼脂平板上测定）逐渐减少并在30天后降至零。B-D中均显示出无论是总细胞还是活细胞数量均是在0-70的过程中缓慢下降。而从E和F中可以看出约从6.09-7.01 log₁₀ DNA拷贝/mL降至5.21-6.23 log₁₀ DNA拷贝/mL。此外，从整体的检测结果可以看出，ddPCR的检测结果要略低于qPCR，但是qPCR结果显示出了更高的方差，因此可以看出ddPCR相较于qPCR而言具备更高的重复性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法

<130> KHP221111780.3YS

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taacataata aggaagaagt ggatgctcaa acatgtgcgc gtgattgtgc ccttgctggt 60

actgttgttt tctctgcttc tgactgt 87

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acatgggacg cgtgtatgga gttcagggta gagcttgggc taagcctgat ggtggtcata 60

t 61

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgctgtgga tgtcatcgtt gttgactcag tagcggcttt gacaccaaaa gcggaaattg 60

aaggcgaaat gggcgatagc cacatgggtc tgcaagcgcg tatgttgtcg caagcaatgc 120

gtaaactgac gggtaacctc aagcaatcca actgtatgtg tatcttcatc aaccaaattc 180

gtatgaagat tggtgtgatg tttggtaacc cagaaactac cactggcggt aacgcactga 240

aattctacgc ttctgttcgt ttggatattc gccgtactgg cgcaatcaaa gaaggcgaag 300

aagtggtgg 309

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taacataata aggaagaagt ggat 24

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acagtcagaa gcagagaa 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acatgggacg cgtgtatgg 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atatgaccac catcaggctt agc 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgctgtgga tgtcatcgtt gttg 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaccacttc ttcgccttct ttga 24

Claims

1.应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，VC1376包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或，thyA包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；和/或，recA包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用如下引物对检测VC1376的拷贝数：

VC1376-F：5’-TAACATAATAAGGAAGAAGTGGAT-3’，

VC1376-R：5’-ACAGTCAGAAGCAGAGAA-3’；和/或，

采用如下引物对检测thyA的拷贝数：

thyA-F：5’- ACATGGGACGCGTGTATGG-3’，

thyA-R：5’- ATATGACCACCATCAGGCTTAGC-3’；和/或，

采用如下引物对检测recA的拷贝数：

RecA-F：5’- GTGCTGTGGATGTCATCGTTGTTG-3’，

RecA-R：5’-CCACCACTTCTTCGCCTTCTTTGA-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过荧光定量PCR或数字PCR检测经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、thyA和recA基因的拷贝数。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述qPCR的反应程序为：

95℃，3 min; 95℃，5 s，50°C 30s，54℃ 30s，55℃ 30s，循环40次；和/或，

所述ddPCR的反应程序为95℃,5min; 95℃，30s，50℃，54℃ 30s，55℃ 30s; 4℃，5min，90℃，5min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMA处理包括如下流程：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所用PMA浓度为20mM；和/或，PMA处理时间为20分钟。

8.一种引物组合，其特征在于，包括如下三对引物中的任意一种或多种：

i）VC1376-F：5’-TAACATAATAAGGAAGAAGTGGAT-3’，

VC1376-R：5’-ACAGTCAGAAGCAGAGAA-3’；

ii）thyA-F：5’- ACATGGGACGCGTGTATGG-3’，

thyA-R：5’- ATATGACCACCATCAGGCTTAGC-3’；

iii）RecA-F：5’- GTGCTGTGGATGTCATCGTTGTTG-3’，

RecA-R：5’-CCACCACTTCTTCGCCTTCTTTGA-3’。

9.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的引物组合。

10.权利要求8所述的引物组合，或权利要求9所述的试剂盒在检测霍乱弧菌VBNC状态细胞中的应用。