CN103861098A - 一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CGMCC No.8503的猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原。本发明的猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治两种疾病，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。

Description

一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一种高度接触性传染病。该病于1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。近几年，全国猪流行性腹泻呈爆发流行，给养殖业造成了巨大的经济损失。该病感染目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的猪传染性胃肠炎等疫苗，但临床应用效果不佳。

另外，仔猪黄痢是由特定O抗原型的致病性大肠埃希氏菌（E.coli）引起的初生仔猪的以下痢为特征的传染病。该病主要导致1周龄内（主要是1～3日龄）仔猪发病，以排出黄色水样粪便和渐进性死亡为特征，是影响规模化种猪场和农村散养猪仔猪成活率的重要疾病。但目前市场上并没有有效的预防猪流行性腹泻和仔猪黄痢的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明的猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是保藏编号为CGMCC No.8503的猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原。

所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

上述的二联疫苗中猪流行性腹泻病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位/ml、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml。

本发明的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）制备Vero细胞，生长液为含8%新生牛血清的MEM，当细胞长成单层后接种猪流行性腹泻病毒；

（2）取猪流行性腹泻病毒SD10株按1%接种量接种到Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

（3）接毒后，当细胞病变达75%以上时收获病毒液，反复冻融3次；

（4）取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

（5）将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入10%福尔马林溶液至终浓度为0.2%，37℃灭活18小时；

（6）按发酵罐容积70%（V/V）加入Minca液体培养基，同时按培养基0.1%（V/V）加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至35～37℃，按3%（V/V）向发酵罐中加入种子培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35%，培养5～7小时分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液；

（7）各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25分钟分别进行各纤毛抗原的提取；

（8）按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液；

（9）将（5）中的病毒溶液和（8）中的混合纤毛液例混合后，与疫苗佐剂混合制备成疫苗。

本发明的猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治两种疾病，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。

具体实施方式

本发明采用免疫原性良好的猪流行性腹泻病毒(SD10株)毒株接种于Vero细胞)培养，收获培养物灭活；采用C83549(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC192)、C83644(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC193)、C83710(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC194)菌株分别发酵培养制备大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛抗原，经灭活制成混合纤毛液，将细胞培养物与混合纤毛液混合，与氢氧化铝胶佐剂混合制成。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1猪流行性腹泻病毒SD10株的筛选

1.1猪流行性腹泻病毒SD10株的分离和鉴定在进行流行病学调查时，从山东莱西某猪场送检的腹泻猪小肠内容物中分离到一株猪流行性腹泻病毒（命名为SD10A1株），猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测阳性，盲传至第8代出现细胞病变，第16代出现规律、稳定的细胞病变，病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml，能够被抗猪流行性腹泻病毒特异性血清中和，传至第121代时，传代的病毒对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全，纯净，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒（猪瘟、猪细小病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合症、猪口蹄疫病毒）污染。将最终传代分离的SD10株（猪流行性腹泻病毒Porcine Epidemic Diarrhea Virus）进行保藏，于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。

1.2本毒株接种母猪后，母猪未见流产、早产等不良反应，所产仔猪未有腹泻发生。

1.3本发明毒株的病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml。

1.4本发明毒株安全性好，对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全。

1.5本发明毒株病毒液与冻干保护剂混合，经冷冻真空干燥制备的疫苗，免疫母猪后，所产仔猪能够100%抵抗强毒的攻击。

1.6克隆SD10株的ORF3基因,其全长为675bp,编码有224个氨基酸。通过在NCBI中进行blastn分析，结果分离的ORF3基因与已报道的猪流行性腹泻病毒的ORF3基因都存在3-5个氨基酸的差别。表明本发明所分离的SD10株与已有的猪流行性腹泻病毒都存在遗传上的差异，为一新的病毒株。

二、用筛选的SD10株制备疫苗

1.1疫苗的制备

1.2按照常规方法制备Vero细胞(Vero细胞购自美国ATCC)，生长液为含8%新生牛血清的MEM，培养细胞长成单层时接种SD10株病毒；

1.3取SD10株毒种（≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml）按1%接种长势良好的Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

1.4接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达75%以上时收获，反复冻融3次；

1.5取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

1.6将检验合格的细胞毒液与蔗糖牛奶冻干保护剂按常规方法制备成疫苗，共制备成了3批疫苗。

2.疫苗检验方法及结果

2.1性状检验3批活疫苗外观呈淡黄色海绵状疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，易与瓶壁脱离。

2.2无菌检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无菌生长。

2.3支原体检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无支原体生长。

2.4外源病毒检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均无猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒污染。

2.5剩余水分检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，剩余水分分别为2.5%、2.2%、2.4%。

2.6真空度检验3批活疫苗按照现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，均呈紫色辉光。

2.7安全检验取猪流行性腹泻中和抗体、抗原均为阴性的3日龄仔猪20头，随机分成4组，每组5头，口服10头份疫苗，临床观察14日，均5/5健活，未见不良反应发生。

2.8效力检验用细胞维持液将疫苗稀释为每1.0ml含1头份，再作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-64个稀释度，分别接种长势良好的Vero细胞（96孔细胞培养板），每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设细胞阴性对照孔。接种后，置37℃、含5%CO₂培养72～96小时，观察细胞病变，出现CPE者判为感染，计算TCID₅₀。3批活疫苗每头份病毒含量分别为10^5.5TCID₅₀、10^5.7TCID₅₀、10^5.5TCID₅₀，均不低于10^5.0TCID₅₀。

表1：3批活疫苗检验结果

上述的结果证明筛选的SD10株符合制备疫苗的标准，用筛选的SD10株与大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原来制备二联疫苗。

实施例2猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗的制备及检验

1.半成品制备

1.1按照常规方法制备Vero细胞，生长液为含8%新生牛血清的MEM，当细胞长成单层时接毒；

1.2取猪流行性腹泻病毒SD10株毒种（≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml）按1%接种长势良好的Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

1.3接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达75%以上时收获细胞，反复冻融3次；

1.4取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

1.5将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入10%福尔马林溶液至终浓度为0.2%，37℃灭活18小时；

1.6按发酵罐容积70%（V/V）加入改良Minca液体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司），同时按培养基0.1%（V/V）加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至35～37℃，按3%（V/V）向发酵罐中加入种子培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35%，培养5～7小时分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液。

1.7各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25分钟分别进行各纤毛抗原的提取。

1.8按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液。

1.9将（5）和（8）按照1;1混合后，与氢氧化铝胶佐剂按4:1混合，即制备成疫苗。

2.检验方法及结果

2.1性状静置后，上层为淡红色澄明液体，下层为黄白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

2.2无菌检验按照《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，3批活疫苗均无菌生长。

2.3安全检验用14日龄未吃初乳仔猪20头，随机分成4组，每组5头，第1、2、3组分别颈部肌肉注射猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗各4ml/头，观察14日，注射疫苗组的15头猪均健活，未见异常反应发生，对照组仔猪未见异常。

表2：疫苗性状、无菌检验、安全检验和甲醛残留量检测结果

2.4效力检验

2.4.1猪流行性腹泻疫苗部分用8头猪流行性腹泻抗体阴性、抗原阴产前30-45日龄妊娠母猪，随机分成4组，每组2头，第1、2、3组分别颈部肌肉注射猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗201001、201202、201203批，2头不注射作为对照组，每组各取5-7日龄未吃初乳仔猪5头，口服猪流行性腹泻强毒5ml/头，观察临床表现，根据发病结果判定疫苗的保护力。攻毒结果表明，免疫组分别4/5、5/5、5/5保护，对照组4/5发病,证明本发明制备的疫苗具有防护作用。

2.4.2大肠埃希氏杆菌疫苗部分的效力检验取成品疫苗5～10ml，于－20℃反复冻融8次，以3000r/min离心15min，取管底析出的水相测定K88、K99、987P三种纤毛的抗原单位，以析出的水相中，K88纤毛抗原≥300个抗原单位/ml、K99纤毛抗原≥150个抗原单位/ml、987P纤毛抗原≥150个抗原单位/ml判为疫苗效力检验合格。

表3：效力检验结果

2.5甲醛残留量检测3批灭活疫苗的检测结果分别为0.096%、0.087%、0.091%，均低于兽用生物制品通则的规定（0.2%）。

实施例3猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗的安全性试验

1.材料和方法

1.1单剂量试验用产前30-45日龄妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1组颈部肌肉注射二联灭活疫苗2ml/头，观察至产仔。

1.2单剂量重复试验用产前30-45日龄妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1组颈部肌肉注射二联灭活疫苗2ml/头，免疫后14日免疫组再次注射疫苗，批号和剂量同前，观察至产仔。

1.3一次超剂量试验用产前30-45日龄妊娠母猪6头，随机分成2组，每组3头，第1组颈部肌肉注射二联灭活疫苗4ml/头，观察至产仔。

2.结果

2.1单剂量试验结果免疫的3头妊娠母猪注射部位未见异常，妊娠未见异常，采食饮水精神未见异常。

2.2单剂量重复试验结果免疫的3头妊娠母猪注射部位未见异常，妊娠未见异常，采食饮水精神未见异常。

2.3一次超剂量试验结果免疫的3头妊娠母猪注射部位未见异常，妊娠未见异常，采食饮水精神未见异常。

实施例4猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗的效力试验

1.疫苗的效力试验

1.1.材料与方法用产前30-45日龄妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头，第1组颈部肌肉注射二联灭活疫苗2ml/头，产前20日加强免疫1次，2ml/头。

大肠埃希氏菌攻毒保护试验生产的仔猪正常哺乳至6～12小时后，用免疫组3窝仔猪同3窝对照一起，分别口服相应免疫疫苗型的攻毒菌株[大肠埃希氏菌菌株C83902（K88）、C83912（K99）、C83917（987P）株均购自中国兽医药品监察所]新鲜培养物5ml(含菌量为6～8×10⁹CFU/ml)，观察7天内攻毒仔猪和对照仔猪的大肠埃希氏菌性下痢的发生和致死情况。

猪流行性腹泻攻毒保护试验免疫组用3窝仔猪同3窝对照一起口服猪流行性腹泻强毒5ml，观察攻毒后仔猪的临床表现。

1.2.结果

1.2.1大肠埃希氏菌攻毒保护试验结果结果表明，与对照组相比，疫苗免疫母猪所产仔猪能够100%抵抗强毒菌液的攻击，没有出现死亡或者下痢。

表4：大肠埃希氏菌攻毒保护试验结果

1.2.2猪流行性腹泻攻毒保护试验结果结果表明，与对照组相比，疫苗免疫母猪所产仔猪能够100%抵抗强毒株的攻击。

表5：猪流行性腹泻攻毒保护试验结果

分组	攻毒保护率
		免疫组	100%
对照组	0%

2.子代通过母源抗体获得被动免疫力的效力和免疫期试验

2.1用实施例2制备二联灭活疫苗免疫购自青岛平度市某良种猪场的产前35～42天健康妊娠母猪（母猪血清中三种纤毛抗体的间接血凝效价均小于3（log2）），母猪产仔后，分别对正常哺乳的出生12小时、1日龄、2日龄、3日龄、4日龄、5日龄、6日龄、7日龄、10日龄仔猪分别口服相应效检强毒菌株C83902株、C83912株、C83917株新鲜培养物5ml(含菌量为6～8×10⁹CFU/ml)进行强毒攻击，每个型每次至少选择5头仔猪攻毒，同时选择5头相同条件的非免疫母猪所产仔猪同时攻毒作为对照。观察攻毒仔猪下痢和致死情况。攻毒试验表明，疫苗免疫后传递给子代的被动免疫力可以保护仔猪在整个哺乳期内不发病（结果详见表6）。

表6：被动免疫仔猪攻毒保护试验结果

注：表中分子表示攻毒后被保护仔猪数，分母表示攻毒仔猪总数。

2.2用实施例2制备的二联灭活疫苗免疫购自青岛平度市某良种猪场的产前35～42天健康妊娠母猪（母猪血清中三种纤毛抗体的间接血凝效价均小于3（log2）），母猪产仔后，分别对正常哺乳的出生12小时、3日龄、6日龄、10日龄仔猪分别口服相应效检强毒5ml，观察攻毒后的临床表现，统计攻毒保护率。结果表明对正常哺乳的出生12小时、3日龄、6日龄、10日龄仔猪均能100%抵抗强毒的攻击，对照组至少80%发病。

表7：猪流行性腹泻攻毒保护结果

仔猪攻毒日龄	免疫仔猪	对照仔猪
			12小时	5/5	0/5
1日龄	5/5	0/5
			2日龄	5/5	0/5
3日龄	5/5	1/5

注：表中分子表示攻毒后被保护仔猪数，分母表示攻毒仔猪总数。

上述的免疫实验的结果表明，本发明制备的疫苗能够有效的预防目前流行的猪流行性腹泻病毒的侵染，效果与目前使用的猪流行性腹泻病毒疫苗的效果相似。但对于SD10A1株的浸染的免疫能力上,本发明制备的疫苗具有更高的免疫效力,推测是由SD10A1株及由SD10A1株传代获得的SD10株相比于已有的猪流行性腹泻病毒的遗传差异导致的。

Claims (6)

1.一种猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌二联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其特征在于，所述的抗原是猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原。

2.如权利要求1所述的二联疫苗上述的二联疫苗，其特征在于所述的猪流行性腹泻病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/ml。

3.如权利要求1所述的二联疫苗上述的二联疫苗，其特征在于所述的猪流行性腹泻病毒是保藏编号为CGMCC No.8503的猪流行性腹泻病毒SD10株。

4.如权利要求1所述的二联疫苗上述的二联疫苗，其特征在于所述的K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位/ml、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml。

5.如权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

6.权利要求1所述的二联疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备Vero细胞，生长液为含8%新生牛血清的MEM，当细胞长成单层后接种猪流行性腹泻病毒；

（2）取猪流行性腹泻病毒SD10株按1%接种量接种到Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

（3）接毒后，当细胞病变达75%以上时收获病毒液，反复冻融3次；

（4）取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于10^5.0TCID₅₀；

（5）将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入10%福尔马林溶液至终浓度为0.2%，37℃灭活18小时；

（6）按发酵罐容积70%（V/V）加入Minca液体培养基，同时按培养基0.1%（V/V）加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至35～37℃，按3%（V/V）向发酵罐中加入种子培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35%，培养5～7小时分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液；

（7）各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中；采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25分钟分别进行各纤毛抗原的提取；

（8）按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液；

（9）将（5）中的病毒溶液和（8）中的混合纤毛液例混合后，与疫苗佐剂混合制备成疫苗。