CN102205120B - 一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细小病毒灭活疫苗(YBF01株)的生产方法。本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好猪细小病毒YBF01株接种ST细胞培养，收获细胞培养物，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂混合乳化制成。用于预防由猪细小病毒引起的猪细小病毒病。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

Description

一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法

技术领域本发明涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一。该病的主要特征是怀孕母猪发生流产、死产、胚胎死亡和胎儿木乃伊化，而母猪本身不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。本病一般呈地方性流行或散发，有时也呈现流行性或称为“暴发”，这种“暴发”多见于猪群初次感染，特别是初产母猪症状明显。目前该病已普遍存在于世界各地的猪群中，给养猪业造成了巨大经济损失。

为了减少猪细小病毒病对养猪业造成的损失，国内外许多学者进行了广泛的研究，在疫苗研制上也取得了一定的进展。国外Paul(Paul PS，Mengeling WL，Evaluation of a modifiedlive-virus vaccine for the prevention of porcine parvovirus induced reproductive disease inswine.Am.J.Vet.Res，1980，41(2)：2007-2011)，Fujisaki(Fujisaki，et.al，Establishment of the attenuatedstrain of porcine parvovirus parvovirus by serial at low temperature.Natl.Inat，Anim.Health，1982，(22)，1-7)，Akhiro(Akhiro，et.al，Establishment ofthe attenuated strain of porcine parvovirus forthe live vaccine and its biological-immunological characteristics)培育出了猪细小病毒弱毒活疫苗。

发明内容

本发明的目的是采用免疫原性良好的猪细小病毒(YBF01株)毒株接种于ST细胞(原始ST细胞购自中国兽医药品监察所，基础细胞库和生产用细胞库由本发明人鉴定、建立、保管和供应。该细胞无致瘤性或无致癌性，无细胞毒性，无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染。从现有代次(56代)可连续使用50代。)培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防由猪细小病毒引起的猪细小病毒病。

一、生产用毒株

1.毒种的来源

制造用猪细小病毒YBF01株，由本发明人2000年在山东省某猪场患病猪流产物分离的一株自然弱毒株(PPV-01株病毒)，用蚀斑克隆技术对该病毒分离株进行克隆，筛选到一株高增殖力毒株，命名为猪细小病毒(Porcine Parvovirus)YBF01株(简称PPV-YBF01株)该病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.4809。在对该毒株的理化特性及生物学特性进行系列研究、鉴定的基础上，制备了猪细小病毒灭活疫苗。

2.YBF01株病毒毒株的特点

(1)致细胞病变作用将YBF01株病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/0.1ml的种毒按1％的量接种于长势良好的ST细胞，置37℃培养72～96h，出现细胞圆缩、脱落，继而出现空洞、拉网等特异性病变。

(2)病毒含量将YBF01株毒种用细胞维持液(2％新生牛血清的MEM液，购自GIBCO)进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别接种于长势良好的ST细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种4孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃培养和观察7日，出现CPE者判为感染，计算TCID₅₀。每0.1ml病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀。

(3)红细胞凝集价种毒液对0.5％豚鼠红细胞血凝效价应不低于1∶256。

(4)毒力取怀孕30～50日猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)健康初产母猪4头，分别滴鼻和注射YBF01株种毒液各2.0ml，连续观察母猪至分娩，无流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍出现。该毒株毒力较弱，对妊娠母猪安全。

(5)免疫原性

对豚鼠的免疫原性用病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/0.1ml的YBF01株病毒液按常规方法制备油乳剂灭活疫苗，接种体重300～450g猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)豚鼠4只，各肌肉注射疫苗0.5ml。28日后，采血测定HI抗体效价，免疫豚鼠HI抗体效价均不低于1∶64。

对猪的免疫原性用病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/0.1ml的YBF01株病毒液按常规方法制备油乳剂灭活疫苗，接种猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)健康猪4头，各肌肉注射疫苗2.0ml。28日后，采血测定HI抗体效价，免疫猪HI抗体效价均不低于1∶128。

(6)特异性将YBF01株病毒液用细胞维持液稀释至200TCID₅₀/0.1ml与等量特异性猪细小病毒高免血清(本发明人采用常规方法自制)混匀，置37℃中和1小时，接种于长势良好的ST细胞(6孔细胞培养板)2孔，每孔0.5ml，置37℃作用1.5小时，补充维持液至4.0ml，设正常细胞作阴性对照，同时设未经特异性猪细小病毒高免血清中和的YBF01株病毒液作阳性对照，置37℃培养和观察7日，判定结果，阳性对照出现细胞病变，中和组和细胞阴性对照不出现细胞病变。

(7)纯净无菌生长，无支原体和外源病毒污染。

二、猪细小病毒灭活疫苗的生产方法

本发明所涉及的是一种猪细小病毒灭活疫苗，该疫苗含有经甲醛溶液灭活的YBF01株猪细小病毒(CGMMCC No.4809)及常规的矿物油佐剂。

其生产方法主要包括：

(1)将扩大培养的ST细胞种子细胞接种到转瓶中，37℃培养；按培养液1％的量将YBF01株猪细小病毒种子接入长势良好细胞贴壁达50％～80％弃去培养液的ST细胞，置37℃吸附1.5小时，加维持液继续培养；当细胞病变达80％以上时收获，冻融3次；

(2)取冻融后的病毒液测定病毒含量和红细胞凝集价，每0.1ml病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀，病毒液对0.5％豚鼠红细胞血凝效价不低于1∶256；

(3)按常规方法收获培养物经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成猪细小病毒灭活疫苗。

本发明的详细描述

一、疫苗制备

1.生产用毒种制备将毒种按1％的量接种于长势良好的ST细胞，37℃吸附1.5小时，加入维持液，置37℃培养72～96小时，当细胞病变达80％以上时收获，冻融3次，分装于灭菌容器内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。

2.细胞制备从液氮罐中取出结冻保存的ST种子细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml培养液的离心管中，1000r/min离心5min。用含20％新生牛血清的培养液(MEM液，购自GIBCO)悬浮细胞，置37℃培养，当长成良好单层时用胰酶-EDTA消化细胞。

3.抗原制备

(1)细胞单层培养将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中，37℃培养。

(2)接毒弃去培养液，按1％的量接种长势良好的ST细胞，置37℃吸附1.5小时，加维持液继续培养。

(3)观察与收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80％以上时收获，冻融3次。-20℃保存，应不超过30日。

4.病毒灭活将检验合格的病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，使甲醛的最终浓度为0.1％。经37℃搅拌灭活16小时。灭活后的病毒液置2～8℃保存，不超过30日。

5.疫苗制备

(1)油相制备取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加入司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30min，冷却后，导入贮油罐中备用。

(2)水相制备将检验合格的猪细小病毒抗原液96份与灭菌的吐温-80 4份导入水相制备罐中，开启搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌40分钟。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，3000r/min离心15min，析出后，水相不超过0.5ml。

(4)分装定量分装，加盖密封。

二、疫苗的安全试验

1.猪细小病毒灭活疫苗对靶动物非使用日龄的安全性试验用本发明人按本法试制的猪细小病毒灭活疫苗01、02、03批分别对4～6周龄健康仔猪16头和怀孕30～60日母猪8头进行肌肉注射，4ml/头，另1组注射生理盐水作对照。观察试验猪接种疫苗后的安全性，仔猪连续观察14日，母猪观察至分娩，统计母猪产仔情况。免后14日每组剖杀2头，观察疫苗吸收情况。结果表明，免疫组和对照组仔猪、妊娠母猪采食、精神、粪便均正常，注射部位未见肿胀、结节、发炎；免疫组母猪正常分娩，未见流产、死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障碍现象发生。说明我们试制的疫苗非使用日龄接种仔猪和妊娠母猪是安全的。详见表1、表2。

表1猪细小病毒灭活疫苗(YBF01株)接种仔猪的安全性试验

注：体温升高不超过1℃，稽留不超过2日；或减食不超过1日，判定为合格。如有1头猪体温超过1℃以上，但不超过1.5℃，且稽留不超过2日，也可判为合格。

表2猪细小病毒灭活疫苗(YBF01株)接种妊娠母猪的安全性试验

2.对最小使用日龄靶动物一次单剂量肌肉接种的安全性试验 用本发明人试制的2批(01、02)猪细小病毒疫苗对6月龄后备母猪12头和8月龄公猪8头分别肌肉注射疫苗，2ml/头，另1组注射生理盐水作对照。于免疫后4～6周对所有母猪进行配种，一直观察到母猪分娩，公猪连续观察21日，观察试验猪接种疫苗后的安全性。结果表明，免疫的8头后备母猪和4头公猪，采食、饮水、精神均未见异常，体温变化不明显，免疫母猪共产78头健仔，2头弱仔，2头弱仔病毒分离和PCR检测结果为阴性，说明本发明人采用本发明技术方案试制的疫苗一次单剂量肌肉接种6月龄母猪和8月龄公猪是安全的。详见表3、表4、表5。

表3一次单剂量肌肉接种最小使用日龄母猪的安全性试验结果

注：体温升高不超过1℃，稽留不超过2日；或减食不超过1日，判定为合格。如有1头猪体温超过1℃以上，但不超过1.5℃，且稽留不超过2日，也可判为合格。

表4试验母猪产仔情况

注：“#”表示这头弱仔进行病毒分离和PCR检测，结果均为阴性。

表5一次单剂量肌肉接种最小使用日龄公猪的安全性试验结果

注：体温升高不超过1℃，稽留不超过2日；或减食不超过1日，判定为合格。如有1头猪体温超过1℃以上，但不超过1.5℃，且稽留不超过2日，也可判为合格。

3.对靶动物单剂量重复接种的安全性试验取易感健康后备母猪、经产母猪和种公猪各4头作为免疫组，肌肉注射用本发明人试制的疫苗01批，并分别于首免后每隔2周重复接种同批疫苗，共重复2次，2ml/头/次，另各设对照组4头，肌肉注射生理盐水，2ml/头。于第3次免疫后4～6周母猪配种，观察疫苗单剂量重复接种对接种猪的安全性。结果表明，该疫苗对接种猪无不良影响，免疫的8头母猪正常产仔，共产79头，其中78头健仔，1头弱仔，但弱仔病毒分离和PCR检测为阴性，与对照组8头母猪相比，差异不显著。说明本发明人采用本发明技术方案试制的疫苗单剂量重复接种后备母猪、经产母猪和种公猪是安全的。详见表6、表7。

表6单剂量重复接种的安全性试验结果

表7试验母猪产仔情况

注：“*”表示对这头弱仔进行病毒分离和PCR检测，结果均为阴性。

4.对靶动物一次性超剂量接种的安全性试验用本发明人试制疫苗3批(01、02、03批)对健康易感后备母猪、经产母猪和种公猪各16头分别进行肌肉注射，各自随机分成4组，每组4头，4ml/头，另1组注射生理盐水作对照。种母猪于免疫后4～6周配种，每日观察母猪采食、精神状况，注射部位有无不良反应发生，母猪连续观察至产仔，公猪观察21日。结果表明，该疫苗对接种猪无不良影响，采食、饮水均未见异常，注射部位未见肿胀、结节、发炎，试验猪体温变化不明显，接种的后备母猪正常产仔，共产119头健仔，2头弱仔，与对照4头后备母猪相比，产仔未见差异。接种的经产母猪正常产仔，共产114头健仔，1头弱仔，与对照4头经产母猪相比，产仔未见差异。说明本发明人采用本发明技术方案试制的疫苗对后备母猪、经产母猪和种公猪一次性超剂量接种安全。详见表8、表9。

表8试验种母猪产仔情况

注：“*”表示对这头弱仔进行病毒分离和PCR检测，结果为阴性。

表9一次性超剂量接种的安全试验结果

注：体温升高不超过1℃，稽留不超过2日；或减食不超过1日，判定为合格。如有1头猪体温超过1℃以上，但不超过1.5℃，且稽留不超过2日，也可判为合格。

5.对非靶动物的安全性试验用本发明人试制疫苗3批(01、02、03批)分别对非靶动物进行注射，随机分成4组，，2～4日龄乳鼠20只皮下注射0.2ml/只、18～22g小鼠20只皮下注射0.5ml/只、300～450g健康青年豚鼠12只肌肉注射1.0ml/只、2.5kg左右的孕兔12只皮下注射2.0ml/只，另1组注射生理盐水作对照。仔细观察并记录有无疫苗引起的不良反应。结果表明，乳鼠、小鼠、豚鼠均健活，采食、精神、活动性未见异常，孕兔产仔正常，说明本发明人采用本发明技术方案试制的疫苗接种非靶动物安全。详见表10。

表10非靶动物安全性试验结果

6.对母猪免疫学功能的影响将健康后备母猪16头随机分成4组，每组4头。用本发明人试制猪细小病毒灭活疫苗01批肌肉免疫第1组，2ml/头；猪瘟脾苗肌肉免疫第2组，1头份/头；猪细小病毒灭活疫苗2ml/头和猪瘟脾苗1头份/头同时肌肉免疫第3组；第4组注射生理盐水作对照，2ml/头，四组猪均单独饲养。接种后第2、3、4、8、10、12周采血，分离血清，检测PPV HI抗体和CSFV(猪瘟病毒)ELISA抗体。每日观察并记录每头猪的体温、采食。结果表明，第1、2、3组免疫后的后备母猪体温、采食、饮水、精神状态均正常，猪细小病毒灭活疫苗与猪瘟脾苗同时免疫，对CSFV ELISA抗体影响不大，由此可见，猪细小病毒灭活疫苗(YBF01株)对猪瘟脾苗的免疫效果无影响。详见表11、表12。

表11猪细小病毒灭活疫苗和猪瘟脾苗单独免疫结果

注：PPV HI抗体效价≥7log₂为血清抗体阳性；CSF阻断率≥40％者，判为CSF抗体阳性。

表12猪细小病毒灭活疫苗和猪瘟脾苗同时免疫结果

注：PPV HI抗体效价≥4log₂为血清抗体阳性；CSFV阻断率≥40％者，判为CSFV抗体阳性。

三、免疫抗体与攻毒保护相关性试验

为了确定本发明人的猪细小病毒灭活疫苗的免疫抗体与共度保护的相关性，用本发明人试制的01批猪细小病毒灭活疫苗按不同剂量(0.25ml/头、0.5ml/头、0.75ml/头1.0ml/头)颈部肌肉注射健康易感后备母猪40头，随机分成4组，每组10头，另设10头非免疫对照组。免疫后4～6周分别配种，于妊娠第50日采血检测PPV HI抗体根据抗体水平由低到高编号，分别分为≤1∶8组(非免疫对照组)、1∶16组、1∶32组、1∶64组、1∶128组、≥1∶256组六个组，每组4头，分别攻击AV30标准株(购自中国兽医药品检查所，国内标准株)，每头肌肉注射2ml，滴鼻2ml，另外设2头健康猪作对照组，每日观察并记录母猪的采食、精神、粪便、妊娠和产仔情况。采集未吃初乳仔猪心血检测HI抗体效价，抽检健活仔猪脏器、异常胎猪或仔猪的脏器进行病毒分离和PCR检测。抗体检测结果，免疫剂量与抗体水平的高低呈线性关系，通过免疫不同的剂量使试验猪产生不同水平的抗体滴度。1∶8～1∶256每个抗体滴度至少有4头猪符合。攻毒保护结果，当PPV HI抗体滴度≥1∶128时全部保护，PPV HI抗体滴度为1∶64时2/4保护，PPV HI抗体滴度为1∶32时1/4保护，抗体滴度≤1∶16时全部发病。非免疫对照组猪抗体滴度≤1∶8，攻毒后4/4出现不同的繁殖障碍现象，攻毒保护率为0。健康对照组的2头后备母猪未发现任何异常，从而排除了饲养及环境因素对仔猪存活率的影响。结果详见表13、14、15。

由以上试验数据表明，PPV HI抗体效价与攻毒保护具有相关性，当PPV HI抗体滴度≥1∶128时，对猪细小病毒感染的保护率可达100％，当PPV HI抗体≤1∶64时，只有部分免疫母猪能抵抗猪细小病毒的攻击。

表13PPV HI抗体检测结果

表14疫苗免疫后抗体效价与攻毒保护结果(一)

表15疫苗免疫后抗体效价与攻毒保护结果(二)

注：病毒分离阳性率中的健仔阳性率分母是抽检健仔数，分子是病毒分离阳性数，异常仔阳性率分母是异常仔数或胎数，分子是病毒分离阳性数；PCR阳性率中的分母是活胎数，分子是猪细小病毒PCR检测阳性数；HI阳性率中的分母是异常仔数或胎数，分子是HI检测阳性数。

四、猪细小病毒灭活疫苗的保存期试验

用本发明人采用本发明技术方案试制的3批(01、02、03)猪细小病毒灭活疫苗(YBF01株)保存在不同温度下，定期取样测定性状、无菌检验、安全性、免疫效力、甲醛残留量，结果表明，该疫苗置室温条件下可保存9个月及置2～8℃可保存30个月，其性状、安全性和免疫效力基本不变，无菌生长，甲醛残留量符合生物制品通则的规定。详见表16、17、18、19、20、21。

表16三批灭活疫苗在室温条件下保存性状等测定结果

表17三批灭活疫苗置2～8℃保存的性状等测定结果

表18三批灭活疫苗置室温条件下保存的安全性检验结果

表19三批灭活疫苗置2～8℃保存的安全性检验结果

表20灭活疫苗保存期的测定结果(豚鼠效力检验)

表21猪免疫效力检验结果

疫苗批号

保存前

室温条件下保存9个月

2～8℃保存30个月

		的PPV HI(log2)	的PPV HI(log2)
				01	7，8，7，8	7，7，8，8	7，7，7，8
02	7，8，8，9	8，8，7，7	7，8，9，8
				03	7，7，7，8	7，7，7，7	7，7，8，8
对照	＜3	＜3	＜3

五、成品检验

1.性状

(1)外观乳白色乳剂。

(2)剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，呈油滴状不扩散。

(3)稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出水相不超过0.5ml。

黏度用1ml清洁吸管(下口内径1.2mm，上口内径2.7mm)，吸取25℃左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，在6秒以内。

2.无菌检验参照《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2006，本发明称《中国兽药典》)附录进行检验和判定，无菌生长。

3.安全性检验(下列方法任择其一)

用豚鼠检验用体重300～450g猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)豚鼠4只，各肌肉注射疫苗1.0ml，连续观察14日，无因疫苗引起的不良反应或死亡。

用猪检验用4～6周龄猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)健康仔猪4头，各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，连续观察14日，无因疫苗引起的不良反应或死亡。

4.效力检验(下列方法任择其一)

用豚鼠检验用体重300～450g猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)豚鼠4只，各肌肉注射疫苗0.5ml。28日后，连同对照豚鼠2只，采血，分离血清，测定HI抗体效价，对照豚鼠均应不高于1∶8，免疫豚鼠均不低于1∶64。

用猪检验用4～6周龄健康猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)仔猪4头，各颈部肌肉注射疫苗2.0ml。28日后，连同对照仔猪4头，采血，分离血清，测定HI抗体效价，对照猪均应不高于1∶8，免疫猪均不低于1∶128。

5.甲醛残留量测定按《中国兽药典》附录进行测定，符合兽用生物制品通则的规定。

六、疫苗的作用与用途用于预防猪细小病毒病。免疫期为6个月。

七、用法与用量深部肌肉注射。母猪于配种前4～6周首免，3周后加强免疫1次，2ml/头/次；种公猪初次免疫同母猪，以后每隔6个月免疫1次，2ml/头/次。

本发明的积极意义

本发明涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法。本发明所涉及的疫苗是采用免疫原性良好猪细小病毒YBF01株接种ST细胞培养，收获细胞培养物，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂混合乳化制成。用于预防由猪细小病毒引起的猪细小病毒病。此疫苗具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

实施例

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1

1.生产用种子制备将毒种按1％的量接种于长势良好的ST细胞，37℃吸附1.5小时，加入维持液，置37℃培养72～96小时，当细胞病变达80％以上时收获，冻融3次，分装于灭菌容器内，取样进行鉴定。注明收获日期、毒种代次等。详见表22。

表22种毒生产及检验结果汇总表

2.细胞制备从液氮罐中取出细胞管置37℃水浴中融化，将细胞移入装有10ml培养液的离心管中，1000r/min离心5分钟。用含20％新生牛血清的培养液悬浮细胞，置37℃培养，长成良好单层时用胰酶-EDTA消化细胞。

3.抗原制备

(1)细胞单层培养将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中，37℃培养。

(2)接毒弃去培养液，按1％的量接种长势良好的ST细胞，置37℃吸附1.5小时，加维持液继续培养。

(3)观察与收获接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。细胞病变达80％以上时收获，冻融3次。-20℃保存，应不超过30日(参见表23)。

表23抗原制备结果

疫苗批号

细胞名称

病毒代次

培养基

接种量

培养时间

收获数量

04

ST

E27

MEM

1％

73小时

4000ml

05

ST

E27

MEM

1％

73小时

5300ml

4.病毒灭活将检验合格的病毒液导入灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，使甲醛的最终浓度为0.1％。经37℃搅拌灭活16小时。灭活后的病毒液置2～8℃保存，不超过30日。

5.疫苗制备

(1)油相制备取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加入司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后，导入贮油罐中备用。

(2水相制备将检验合格的猪细小病毒抗原液96份与灭菌的吐温-804份导入水相制备罐中，开启搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份导入乳化罐中，开动电机低速搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌40分钟。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，3000r/min离心15分钟，析出后，水相不超过0.5ml。

(4)分装定量分装，加盖密封(参见表24)。

表24猪细小病毒灭活疫苗制备结果

实施例2

成品检验

1.性状

(1)外观观察疫苗的颜色、性状。

(2)剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，记录呈油滴状不扩散。

(3)稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，记录管底析出水相不超过0.5ml。

(4)黏度用1ml清洁吸管(下口内径1.2mm，上口内径2.7mm)，吸取25℃左右的疫苗1.0ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间。

2.无菌检验参照现行《中国兽药典》附录进行检验和判定。

3.安全性检验下列方法任择其一。

(1)用豚鼠检验用体重300～450g猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)豚鼠4只，各肌肉注射疫苗1.0ml，连续观察14日，观察有无因疫苗引起的不良反应或死亡。

(2)用猪检验用4～6周龄猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)健康仔猪4头，各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，连续观察14日，观察有无因疫苗引起的不良反应或死亡。

4.效力检验下列方法任择其一。

(1)用豚鼠检验用体重300～450g猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)豚鼠4只，各肌肉注射疫苗0.5ml。28日后，连同对照豚鼠2只，采血，分离血清，测定HI抗体效价。

(2)用猪检验用4～6周龄健康猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)仔猪4头，各颈部肌肉注射疫苗2.0ml。28日后，连同对照仔猪4头，采血，分离血清，测定HI抗体效价。

5.甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定。

表25猪细小病毒灭活疫苗(YBF01株)成品检验汇总表

Claims (2)

1.一种猪细小病毒灭活疫苗，其特征是该疫苗含有经甲醛溶液灭活的YBF01株猪细小病毒及常规的矿物油佐剂，该病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.4809。

2.一种如权利要求1所述猪细小病毒灭活疫苗的生产方法，其特征在于其生产方法主要包括：

（1）将扩大培养的ST细胞种子细胞接种到转瓶中，37℃培养；按培养液1%的量将YBF01株猪细小病毒种子接入长势良好细胞贴壁达50%～80%弃去培养液的ST细胞，置37℃吸附1.5小时，加维持液继续培养；当细胞病变达80%以上时收获，冻融3次；

（2）取冻融后的病毒液测定病毒含量和红细胞凝集价，每0.1ml病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀，病毒液对0.5%豚鼠红细胞血凝效价不低于1:256；

（3）将检验合格的病毒液经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成猪细小病毒灭活疫苗。