CN102925414B

CN102925414B - 猪乙型脑炎病毒株及其应用

Info

Publication number: CN102925414B
Application number: CN201210398407.5A
Authority: CN
Inventors: 张道华; 唐波; 张雪花; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2032-10-19
Also published as: CN102925414A

Abstract

本发明提供一种猪乙型脑炎病毒株及其应用，属于生物技术领域。本发明提供猪乙型脑炎病毒JEV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCCNO.4247。另外，本发明提供一种疫苗组合物，包括灭活的猪乙型脑炎病毒JEV-JS株和兽药学上可接受的佐剂。本发明还提供所述猪乙型脑炎病毒JEV-JS株在制备预防由猪乙型脑炎病毒所致疾病药物中的应用。本发明从各地猪场分离的猪源乙型脑炎流行毒株中筛选出猪乙型脑炎病毒JEV-JS株，可作为灭活疫苗生产毒株，该毒株具有良好的免疫原性，可以用作疫苗用毒株。采用本发明制备的猪乙型脑炎灭活疫苗可用于预防乙型脑炎病毒引起的母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎及其它猪的乙型脑炎病。

Description

猪乙型脑炎病毒株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株猪乙型脑炎病毒株及其应用。

背景技术

乙型脑炎病是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus）引起的一种人、兽共患传染病。该病主要分布在远东和东南亚地区，经蚊传播，多见于夏秋季。由于全球气候变暖，在我国南方地区，该病的发生已无明显季节性。猪乙型脑炎病主要表现为公猪睾丸炎、母猪繁殖障碍等，其中母猪繁殖障碍症状有妊娠母猪流产、产死胎、弱仔等。多数猪呈隐性感染并表现病毒血症的形式。该病的流行会给养猪业带来巨大的经济损失，每年给我国养猪业造成数十亿元的经济损失。患猪乙型脑炎病的病畜以及隐性感染的家畜在病毒血症阶段都可成为传染源，其中猪是最主要的传染源。猪对乙型脑炎病毒的自然感染率高，而且每年因屠宰而种群更新快，自然界总保持着大量的易感猪，构成猪→蚊→猪传播环节。由于猪是我国数量最多的家畜，猪感染乙型脑炎后的病毒血症成为人类乙型脑炎的重要传染源。因此猪乙型脑炎的防制在公共卫生方面具有重要意义。防制猪乙型脑炎病最经济、有效的方法是接种疫苗。

我国预防猪群流行性乙型脑炎的疫苗主要是地鼠肾细胞减毒活疫苗，该疫苗的种毒株来源于JEV SA14-14-2株，虽然已证实该毒株在人类应用的安全性和有效性得到广泛认可，但是在猪群中广泛接种人用乙脑减毒活疫苗的合理性、潜在的危害性越来越引起人们的关注。该活疫苗免疫原性不强，免疫猪抗体水平较低，缺乏快速、有效的疫苗效力评估方法。

发明内容

本发明的目的是提供一株猪乙型脑炎病毒株，该毒株对目前流行的猪乙型脑炎病毒有很好的免疫原性。

本发明的另一目的是提供一种疫苗组合物，该疫苗组合物免疫猪抗体水平较高。

本发明提供猪乙型脑炎病毒JEV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4247。

所述猪乙型脑炎病毒JEV-JS株的保藏信息如下：

分类命名：日本脑炎病毒

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所

保藏日期：2010年10月21日

保藏编号：CGMCC NO.4247

由于日本脑炎病毒，又称为乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus），本发明分离到的毒株来源于猪，故在本文件中将上述毒株称为猪乙型脑炎病毒JEV-JS株。

另外，本发明提供一种疫苗组合物，包括灭活的猪乙型脑炎病毒JEV-JS株和兽药学上可接受的佐剂。

该疫苗组合物还包括兽药学上可接受载体。

本发明还提供所述猪乙型脑炎病毒JEV-JS株在制备预防由猪乙型脑炎病毒所致疾病药物中的应用。所述疾病为母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎。

本发明从各地猪场分离的猪源乙型脑炎流行毒株中筛选出猪乙型脑炎病毒JEV-JS株，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，该毒株具有良好的免疫原性，可以用作疫苗用毒株。采用本发明制备的猪乙型脑炎灭活疫苗可用于预防乙型脑炎病毒引起的母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎及其它猪的乙型脑炎病。

附图说明

图1显示猪乙型脑炎灭活疫苗免疫仔猪前后血清ELISA抗体水平。

图2显示猪乙型脑炎灭活疫苗免疫后备母猪前后血清ELISA抗体消长规律。

具体实施方式

实施例1 猪乙型脑炎病毒的获得和特性测定

1.病毒分离

采集我国江苏地区某一养猪场的母猪流产胎儿脑组织作为含毒材料。先将含毒材料无菌操作置于乳钵中，然后加入灭菌生理盐水5ml,反复磨细；再按每毫升加入青霉素200U和链霉素200U混匀,将其放入-20 ℃冰箱内反复冻融3次，每次快冻快融以使其病毒能从破碎的细胞中释放出来；将其12000 r/min 离心10min；取上清接种至BHK21细胞（购买自ATCC，即美国模式培养物集存库），培养并盲传3代。将第3代培养物脑内接种小鼠增殖病毒。采集3-14日内发病或死亡的鼠脑，继续脑内接种小鼠连续传代2代，采集死亡鼠脑组织接种BHK21细胞，72小时后出现明显的细胞病变时，将培养物冻融后，获得病毒液。

2.病毒鉴定

提取本实施例标题1中所获病毒液中的RNA，具体步骤如下：取病毒液200μL，1：3比例加入TRIZOL，混匀，室温放置10min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置10min；4℃，12000转离心15min；取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置30min；4℃，12000转离心10min；弃上清，加入75%的乙醇1000μL洗涤；4℃，7500转离心5min；弃上清，干燥10min；15μL DEPC水溶解沉淀并作为模板进行反转录。

设计一对E蛋白基因区域引物进行RT-PCR鉴定，上游引物JEV-F（SEQ ID NO:1）: CACCTGAAATGTAGGCTG；下游引物JEV-R（SEQ ID NO:2）: GAAGACCCCTCCAATAGA。

反转录体系总体积20μL：dNTP 2μL，模板5μL，下游引物（JEV-R）2μL，H₂0 3μL，5×RT-Buffer 4μL， 65℃5min后迅速冰浴2min；加入DTT（二硫苏糖醇） 2μL，HPRI（RNA酶抑制剂） 1μL，37℃放置2min；加入M-MLV（鼠白血病逆转录酶）1μL，37℃放置50min；70℃放置15min，获得cDNA，-20℃保存放置。所有酶和试剂盒均购自TaKaRa公司。

PCR扩增的反应体系为50ul。其中cDNA模板5μL, Buffer 5μL,Mg²⁺ 3μL, dNTP 2μL, 上游引物JEV-F 1μL, 下游引物JEV-R 1μL, Taq DNA聚合酶 0.5μL，H₂0 32.5μL。反应程序：94℃ 预变性5min；进入循环：94℃ 90s，51℃ 90s，72℃ 90s，35个循环；72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。所有酶和试剂盒均购自TaKaRa公司。

将PCR扩增出的目的片段进行测序，结果显示片段为471bp，具体序列如SEQ ID NO:3所示。在NCBI进行BLAST分析，发现测序的目的片段与已发表的部分JEV E基因相似率达99%，证明此毒株确定为猪乙型脑炎病毒。结果见表1。

表1目的片段序列分析比对

序列号	种类	相似率
			GQ260632.1	Japanese encephalitis virus strain YL0806e envelope protein gene, partial cds	99%
GQ260626.1	Japanese encephalitis virus strain TPC0706a envelope protein gene, partial cds	99%
			EU683895.1	Japanese encephalitis virus strain TN207 polyprotein gene, partial cds	99%
AY303792.1	Japanese encephalitis virus strain T1P1-L4, complete genome	99%
			AB196926.1	Japanese encephalitis virus genomic RNA, complete genome, clone:JEV-AT31	99%
AF254453.1	Japanese encephalitis virus strain T1P1 complete genome	99%
			AF254452.1	Japanese encephalitis virus strain CH1392 complete genome	99%
AF069076.1	Japanese encephalitis virus JaGAr 01 complete genome	99%
			U44969.1	Japanese encephalitis virus NT80 envelope protein gene, partial cds	99%

SEQ ID NO:3

CTTTTCCTATAGAGTTGAAGACCCCTCCAATAGAGCCAAAGTCCCAGGCTGTGTCACCCAACGCTGCCAGTCTCTGAGCTCCCTTCAAAGTTGTTGAAAAGGCTTTGCCCAGCGCGCTTCCAGCTTTGTGCCAATGGTGGTTGATCTGCTTGTCTCCCCTTCCAACTACGATGTAGGAGTCTCCGAAGGGGGGTTCCATCTCGACCAGCACCTTTGAATTGGCACTGGAAGTCGCGACGAAGGGGTTCACTGTCACCAGCCGCCCAACGGGGGTCATGTCATTGAGGCTCGCAACGGAGACAATCGGAATTTTGCAGGGGCCATCACTCCCAGAGTAGGAGAGTTCAATGACAACTGTTCCGTGACCAGTGTCCGCCGGATTTTTCGCGAACGAGAATTTTTCTGTGCACATGCCATAGGTTGTGCCTTTCAGAGCCAGTTTGTCCATTTTCAGCCTACATTTTCAGGTGA

将本实施例步骤1所得病毒液中含有的病毒命名为猪乙型脑炎病毒JEV-JS株，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏。

3、病毒培养

当BHK21细胞生长覆盖率达80%，去生长液。按感染复数为0.002 -0.005接种本实施例标题1所得病毒液，加入维持液于35℃培养。培养48-60h，显微镜下观察，细胞达75%CPE(细胞病变)时，收获猪乙型脑炎病毒JEV-JS株病毒液（缩写为JEV-JS株病毒液）。所述维持液为含有2%新生牛血清（FBS）的DMEM液（Gibco公司）。

4、病毒检测

取本实施例标题3所得JEV-JS株病毒液进行下述检测：

（1）无菌检验：取JEV-JS株病毒液接种T.G小管及G.A斜面各2支，每支接种量为0.2ml，接种后的T.G小管、G.A斜面分别取1支置37℃培养，其它则置于25℃培养，观察3-5日。无菌生长为合格。培养5日后观察均无细菌、霉菌生长，证明分离到的JEV-JS株中不含有细菌和霉菌。

（2）病毒含量：将JEV-JS株病毒液用DMEM液作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度，每个稀释度分别接种至生长良好的BHK21细胞培养板(96孔)，每孔接种量为0.1ml，然后向各孔分别加入0.1ml含2%（体积浓度）小牛血清的DMEM液，同时设立DMEM液阴性对照孔，35℃下培养，观察细胞病变（CPE），计算TCID₅₀。结果显示：该病毒的滴度为每毫升≥10^7.5TCID₅₀。

（3）小鼠脑内致病力试验：分别进行3批小鼠重复实验。具体操作：用DMEM液将JEV-JS株病毒液作10倍系列稀释，取10^-6、10^-7和10^-8三个稀释度，脑内接种体重为 10-12g的清洁级小鼠各10 只，接种量为每只0.03ml，接种后 72 小时内出现的死亡小鼠不计。观察至接种后 14 日，记录发病和死亡小鼠数。计算LD₅₀，结果见表2。

表2 小鼠脑内致病力试验结果

JEV-JS株病毒液的稀释度	第1批	第2批	第3批
				10^-6	10/10	10/10	10/10
10^-7	10/10	10/10	10/10
				10^-8	2/10	3/10	2/10
LD₅₀平均值	10^8.3	10^8.4	10^8.5

注：表2中“/”左边的数字为死亡的小鼠数量，“/”右边的数字为接种病毒的小鼠总量。

（4）腹腔接种致病力试验：分别进行3批小鼠重复实验。具体操作：用DMEM液将JEV-JS株病毒液作10倍系列稀释，取10^-3、10^-4和10^-5三个稀释度，分别腹腔接种体重为 10-12g的清洁级小鼠 10 只，接种量为每只0.2ml，同时右侧脑内注射DMEM液0.03ml。接种后 72小时内出现的死亡小鼠不计。观察至接种后14 日，记录发病和死亡小鼠数。计算LD₅₀。结果见表3。

表3小鼠腹腔接种致病力试验结果

	第1批	第2批	第3批
				10^-3	10/10	10/10	10/10
10^-4	8/10	8/10	9/10
				10^-5	5/10	4/10	6/10
LD₅₀平均值	10^4.8	10^4.7	10^5.0

注：表3中“/”左边的数字为死亡的小鼠数量，“/”右边的数字为接种病毒的小鼠总量。

实施例1中的结果表明该毒株接种BHK21细胞具有很高的病毒滴度，对10-12g小鼠具有很高的神经毒力。

实施例2 制备含灭活猪乙型脑炎病毒JEV-JS株的疫苗组合物

1、BHK21细胞种子繁殖及扩大培养

从液氮罐中取出冻存的BHK21细胞管，迅速置37℃水浴融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。弃上清液，用含10%FBS（新生牛血清）的DMEM液悬浮细胞，之后加入细胞培养瓶中，于37℃、5%CO₂条件下培养。当细胞覆盖率达100%时，用0.1%胰酶-EDTA液消化细胞。按体积比1：3-5传代培养。

2、病毒培养

将细胞生长覆盖率达80%的BHK21细胞培养物，去生长液。按感染复数为0.2-0.5%接种JEV-JS株病毒液，加入含2%FBS的DMEM液，35℃培养。当显微镜下观察到细胞达75% CPE时，收获病毒液，当病毒含量达到10^6.5TCID₅₀/0.1ml为合格。

3、病毒液的灭活

在病毒含量合格的病毒液中加入甲醛，使甲醛的终浓度达到0.1%（体积浓度），于37℃作用24小时，其间每隔1小时搅拌或振摇一次，获得灭活后的病毒液。灭活结束后置2-8℃，可保存1个月。

4、灭活检验

将灭活后的病毒液用DMEM液1：10稀释后，接种生长致密的BHK21细胞培养板(6孔)，接种量为每孔0.1ml，另外，每孔加入含2%小牛血清的DMEM液2ml，同时设立阴性对照孔，35℃下培养，观察细胞病变（CPE）。盲传3代，如果无细胞病变（CPE）则表明灭活完全。

5、制备含灭活猪乙型脑炎病毒JEV-JS株的疫苗组合物

水相：由灭菌的吐温-80与灭活病毒液按体积比例4：96混合均匀组成。

油相：由司本-80与注射用白油按照体积比为6：94混匀并灭菌。

乳化：按照体积比为3：1将油相和水相进行混合并乳化，制备灭活疫苗。乳化质量能够达到规定的质量标准。

该疫苗组合物（简称为猪乙型脑炎灭活疫苗）用于预防乙型脑炎病毒引起的母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎及其它猪的乙型脑炎病。本疫苗的接种途径是颈部肌肉注射。

实施例3 猪乙型脑炎灭活疫苗的安全检验

每批疫苗用30-45日龄乙型脑炎抗体阴性健康仔猪、健康初孕母猪各5头，每头肌肉注射2头份（4ml）猪乙型脑炎灭活疫苗（按照实施例2方法制备），另设置不接种疫苗的同类型猪作对照组。

接种后观察14d，所有试验猪观察指标包括体温、精神、食欲等局部和全身反应，结果见表4。通过表4可以看出：所有试验猪精神、体温、食欲等均未见异常。疫苗接种仔猪未见疫苗接种引起的异常反应；疫苗接种怀孕母猪正常妊娠，无流产发生（每批中对照组的结果一致，所以未在表中列出）。因此该猪乙型脑炎灭活疫苗是安全的。

表4灭活疫苗安全检验结果

实施例4 猪乙型脑炎灭活疫苗的免疫原性试验

以实施例2中制备的猪乙型脑炎灭活疫苗，来进行下面的实验。

1、小鼠免疫原性试验：用9-11g清洁级小鼠40只，分为4组，每组10只。一组为对照组，注射无菌PBS缓冲液；另外三组腹腔接种接种猪乙型脑炎灭活疫苗，接种剂量分别为0.2ml/只、0.1ml/只和0.05ml/只，间隔5天后用同等剂量加强免疫一次；7天后用病毒含量为2×10³ LD₅₀/ 0.2ml的JEV-JS株病毒液进行强毒腹腔接种攻击，并用空针刺小鼠脑部。自攻毒之日起逐日观察至14天判定结果（3日内死亡不计）。结果：对照组小鼠全部死亡，免疫组80%以上健活。结果表明该JEV-JS株具有良好的免疫原性，可以用作疫苗用毒株。

2、仔猪免疫原性测定：用猪乙型脑炎灭活疫苗肌注40日龄健康仔猪，分0.5 ml/只、1 ml /只、2ml/只共3个剂量组，每组4头；另设对照组3头，注射生理盐水2ml/头。免疫后1、2、3、4周分别采血分离血清，用猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒（购自武汉科前动物生物制品有限责任公司）检测血清ELISA抗体的OD₆₃₀值，OD₆₃₀﹥0.32为阳性。结果见图1，该结果显示所有剂量组仔猪免疫疫苗后1周抗体均很快上升且处于较高水平，表明该JEV-JS株具有良好的免疫原性。

3、后备母猪免疫原性试验：将健康易感后备母猪20头进行分组试验，分为4组，每组5头，其中一组为对照组，其他3组为免疫组。免疫组，在配种前45天肌注猪乙型脑炎灭活疫苗，接种剂量分别0.5ml/只、1 ml/只、2 ml/只，间隔2周后分别用同等剂量疫苗加强免疫一次。对照组，注射生理盐水2ml/头。免疫后2周、4周、2月、4月、6月、8月后采血分离血清，用猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒（购自武汉科前动物生物制品有限责任公司）检测ELISA抗体读取OD₆₃₀值，OD₆₃₀﹥0.32为阳性。

结果见图2，该疫苗免疫后备母猪2周后ELISA抗体全部转阳，2周-4个月抗体处于较高水平，至免疫后8个月抗体仍全部为阳性。该结果表明该JEV-JS株具有较好的免疫原性，免疫后抗体水平高，可以用作疫苗用毒株。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 猪乙型脑炎病毒株及其应用

<130> 20121018

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> JEV-F

<400> 1

cacctgaaat gtaggctg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> JEV-R

<400> 2

gaagacccct ccaataga 18

<210> 3

<211> 471

<212> DNA

<213> 猪乙型脑炎病毒JEV-JS株

<400> 3

cttttcctat agagttgaag acccctccaa tagagccaaa gtcccaggct gtgtcaccca 60

acgctgccag tctctgagct cccttcaaag ttgttgaaaa ggctttgccc agcgcgcttc 120

cagctttgtg ccaatggtgg ttgatctgct tgtctcccct tccaactacg atgtaggagt 180

ctccgaaggg gggttccatc tcgaccagca cctttgaatt ggcactggaa gtcgcgacga 240

aggggttcac tgtcaccagc cgcccaacgg gggtcatgtc attgaggctc gcaacggaga 300

caatcggaat tttgcagggg ccatcactcc cagagtagga gagttcaatg acaactgttc 360

cgtgaccagt gtccgccgga tttttcgcga acgagaattt ttctgtgcac atgccatagg 420

ttgtgccttt cagagccagt ttgtccattt tcagcctaca ttttcaggtg a 471

Claims

1.猪乙型脑炎病毒JEV-JS株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.4247。

2.一种疫苗组合物，其特征在于：包括灭活的猪乙型脑炎病毒JEV-JS株和兽药学上可接受的佐剂，所述猪乙型脑炎病毒JEV-JS株的保藏号是：CGMCC NO.4247。

3.根据权利要求2所述疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物还包括兽药学上可接受载体。

4.猪乙型脑炎病毒JEV-JS株在制备预防由猪乙型脑炎病毒所致疾病药物中的应用，所述猪乙型脑炎病毒JEV-JS株的保藏号是：CGMCC NO.4247。

5.根据权利要求4所述猪乙型脑炎病毒JEV-JS株在制备预防由猪乙型脑炎病毒所致疾病药物中的应用，其特征在于所述疾病为猪乙型脑炎病毒引起的母猪繁殖障碍、公猪睾丸炎。