CN103436497A

CN103436497A - 一种猪细小病毒毒株

Info

Publication number: CN103436497A
Application number: CN2013102353906A
Authority: CN
Inventors: 崔保安; 陈红英; 吴宇阳; 陈龙彪; 魏战勇; 李新生
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103436497B

Abstract

本发明公开了一种猪细小病毒毒株，猪细小病毒（Parvoviridae），CCTCCNO：V201313。本发明采用PCR方法对河南地区采集的疑似PPV病料进行PCR检测，通过接种猪睾丸（ST）细胞分离到1株病毒，命名为HP104。通过观察细胞病变、生物学特性研究、电镜观察病毒的形态等途径证实分离的病毒为猪细小病毒。本发明将猪细小病毒HP104株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂，然后接种健康豚鼠，28天后检测到HI抗体水平达到128，而对照组豚鼠猪细小病毒抗体呈阴性。说明河南分离株PPVHP104具有良好的免疫原性。

Description

一种猪细小病毒毒株

技术领域

本发明涉及一种猪细小病毒毒株的制备方法。

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。能够导致受感染母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪，同时还会引起仔猪皮炎症状、非化脓性心肌炎和消瘦性综合征。猪细小病毒又常同猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害。

一些科研工作者曾经做过河南地区猪细小病毒的流行病学调查，发现很多猪场都有PPV 抗体阳性猪存在，说明河南地区PPV的感染情况比较严重，给河南地区养猪业造成了重大的经济损失。在当前情况下，对河南地区存在的猪细小病毒进行研究也就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪细小病毒毒株，分类命名：猪细小病毒，拉丁文学名：Parvoviridae，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2013年5月28日,保藏编号CCTCC NO：V201313。

本发明的技术方案是：一种猪细小病毒毒株，猪细小病毒（Parvoviridae），CCTCC NO：V201313。

本发明的有益效果是：本发明采用PCR方法对河南地区采集的疑似PPV病料进行PCR检测，通过接种猪睾丸（ST）细胞分离到1株病毒，命名为HP104。通过观察细胞病变、生物学特性研究、电镜观察病毒的形态等途径证实分离的病毒为猪细小病毒。

本发明将猪细小病毒HP104株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂，然后接种健康豚鼠，28天后检测到HI抗体水平达到128，而对照组豚鼠猪细小病毒抗体呈阴性。说明河南分离株PPV HP104具有良好的免疫原性。

附图说明

图1为组织病料中PPV的PCR扩增结果，其中M. DNA Marker DL 2000; 1. 病料中的PPV的PCR扩增产物; 2. 阴性对照；

图2为HP104株电镜照片；

图3为猪细小病毒HP104全基因组各片段PCR扩增结果，M. DNA Marker DL2000; 1. P1/P2扩增结果; 2. P3/P4扩增结果; 3. P5/P6扩增结果; 4. P7/P8扩增结果;5.阴性对照；

图4为重组质粒PCR鉴定结果，M. DNA Marker DL2000; 1. P1/P2扩增片段; 2. P3/P4扩增片段; 3. P5/P6扩增片段; 4.P7/P8扩增片段;5.阴性对照；

图5为PPV不同分离株基因的核苷酸序列同源性分析

图6为PPV全基因序列系统发育进化树。

具体实施方式

一种猪细小病毒毒株，猪细小病毒（Parvoviridae），CCTCC NO：V201313。

一猪细小病毒毒株HP104的分离鉴定和生物学特性的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料组织和细胞株

病料组织采自河南省新乡市某猪场病死仔猪的胎衣、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结。河南省新乡市某猪场1000头母猪，2012年9月有10头初产母猪流产、死产，母猪无明显症状，而断奶仔猪被毛粗糙、精神沉郁。根据发病情况，怀疑是PPV感染）猪睾丸（ST）细胞购自中国兽药监察所（冻存）。

1.1.2 HA试剂的配制

0.01 M PBS液的配制：取氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸二氢钠1.15 g，磷酸氢二钾0.2 g，溶于800 mL三蒸水中充分溶解后定容至1000 mL，调pH值到7.4，高压灭菌后4℃保存备用。

抗凝剂（3.8%柠檬酸钠）的配制：称取柠檬酸钠3.8g，加灭菌蒸馏水至100 mL，装瓶备用。

0.6%豚鼠红细胞悬液制备：按常规方法心脏采集健康豚鼠血液（每毫升血液加入抗凝剂0.2 mL），将血液注入离心管中，经2000 rpm 离心10min，用移液器吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞用PBS液洗涤，如此反复洗涤三次，第三次离心10 min后弃上清液，加PBS配制成0.6%的红细胞悬液。

1.2 引物设计

从GenBank中下载多条具有代表性的猪细小病毒基因组序列，利用DNAStar软件寻找非结构蛋白NS1基因中的序列。应用Primer premier 5.0 软件设计出扩增195 bp的引物P1和P2，用于检测PPV。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

P1 5'- CCA AAA ATG CAA ACC CCA ATA-3'

P2 5'- ATCT GGC GGT GTT GGA GTT AAG-3'

1.3 病料的PCR检测和处理

1.3.1 病料的PCR检测

采用蛋白酶K法提取病料组织(死胎胎衣、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结)DNA。以病料组织DNA为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为2×PCR Taq Mix聚合酶12 μL，模板DNA 3 μL，引物P1和P2各0.5 μL，补超纯水至25 μL。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95℃预变性5 min；94℃1 min，53℃50 s，72℃50 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。反应结束后，取5 µL PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 µg/mL EB）进行电泳检测PCR结果。

如果PCR检测结果为阳性，则将PCR产物回收纯化并连接到T载体上，经连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的PCR和酶切鉴定等过程，对鉴定的阳性克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成，

1.3.2 病料的处理

将PCR检测为阳性的病料组织按1：5(w/V)加入含青霉素l 000 U/mL和链霉素1 000 U/mL的灭菌PBS液，经研钵研磨后，放入-20℃冰箱中，反复冻融3次，再用0.22 µm的细菌滤器过滤除菌。

1.4病毒的培养与增殖

将处理后的病料按培养液量的1/10同步接种到ST细胞中，置于5%CO₂37℃恒温培养箱中培养72 h。收获接毒细胞，反复冻融3次收集病毒，8000 rpm离心30min去除细胞碎片，此为第1代毒，命名为PPV HP104。按10%接毒量盲传至细胞出现了较稳定的细胞病变（CPE），此后按培养液体积的2%接毒，用同样的方法将该毒株连续传代到第25代。

1.5细胞病变观察

将状态良好长成单层的ST细胞用0.25%胰酶按常规方法消化后，同步接种PPV HP104第10代细胞培养物，置于5%CO₂37℃恒温培养箱中培养。逐日观察细胞病变直至收获病毒。

1.6 病毒滴度TCID₅₀的测定

将消化吹散的ST细胞悬液加入EP管中，取PPV HP104第10、15、20、25代细胞培养物分别连续倍比稀释10^-1～10^-10，在细胞培养箱中孵育1h后接种到96孔板中，每孔200 µL，每个稀释度各作6个重复，逐日观察细胞病变情况，并按照Reed-Muench法计算病毒滴度TCID₅₀。

1.7 病毒血凝效价的测定

在96孔“V”型微量反应板上，加入50 µL PBS液于反应板的第1孔至第12孔，再加50µL PPV HP104第10、15、20、25代细胞培养物于每排第1孔，按倍比稀释至第11孔，弃去50 μL，第12孔为阴性对照孔，加50 μL 0.6%的豚鼠红细胞悬液于每孔。在微量震荡器上摇匀10 s，放置37℃温箱静置1 h，以50%红细胞凝集为终点，样品出现凝集终点的最高稀释度为该病毒液HA效价。

1.8 理化特性研究

取5只灭菌的离心管，在超净台内分别加入3 mL PPV HP104第20代细胞液。第1管加入终浓度为4.8%的分析纯氯仿混合振荡，置于4℃ 作用10 min，随后用500 rpm的速度离心5 min，然后吸取上层液体；第2管用0.1 mol/L的盐酸调pH至3.0，于37℃水浴作用2 h，再用5.6%的NaHCO3溶液将pH值调回至7.2；第3管置于56℃水浴中作用30 min；第4管加入1%的胰蛋白酶置37℃水浴作用1 h后，用灭活胎牛血清终止其作用；第5管不处理作为正常对照。然后分别ST传代细胞按常规方法测定其TCID₅₀。

1.9 形态学观察

取PPV HP104第25代细胞培养物在-20℃反复冻融3次，用超声波将其处理3次，每次5 min，在4℃ 条件下12 000 rpm 离心1 h，取上清液用1N NaOH把pH调至8.0；缓缓加入PEG-6000至10%， 0.5M NaCL，搅拌1 h后放置在4℃过夜，过夜后 20 000 rpm离心1 h，沉淀物用少量TEI液溶解， 20 000 rpm离心30 min，取上清后以50 000 rpm离心2.5 h，然后将上清弃去，用少量TEI把沉淀物溶解， 12 000 rpm离心15 min，上清液就是浓缩的PPV病毒液，取2 µL涂在柱上，用电镜进行观察照相。

2 结果

2.1病料的PPV检测结果和测序结果

从疑似PPV感染的病料组织中提取DNA，进行PCR扩增，扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测表明，获得了1条约200 bp的的特异性带(图1)，与预期片段大小相符。

阳性克隆测序结果表明PCR扩增片段长度为195bp，与预期结果相符合。将阳性片段序列与Genbank中已发表的多株猪细小病毒序列进行核苷酸同源性比较后，发现同源性可达到100％。测序结果如下：

ccaaaaatgc aaaccccaat aaatacacca acagactctc agatttccac atcagtgaaa 60

acttcgccag cggacaacaa ctacgcagca actccaatac aggaggacct ggatttagct 120

ttagccttgg agccgtggag cgagccaaca acaccaactt tcaccaacct gcacttaact 180

ccaacaccgc cagat 195

2.2 PPV HP104株的分离培养与细胞病变观察

将处理后的病料接种于ST细胞，盲传至第5代细胞出现轻微的CPE，第10代时细胞出现了较稳定的CPE。正常的ST细胞紧密地贴壁生长，接毒第10代后细胞内颗粒增多，随后出现病毒蚀斑，蚀斑周围细胞圆缩，接着大片脱落，细胞拉网，很多细胞发生裂解、破碎，部分细胞碎片仍贴附在细胞培养瓶壁上。

2.3 病毒滴度TCID₅₀结果

分别对PPV HP104不同代次的病毒液进行TCID₅₀测定，通过倒置显微镜观察，接毒后3天待细胞出现脱落、拉网等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID₅₀，结果见表1。

表1 TCID₅₀测定结果(TCID₅₀/0.1mL)

通过表1可知，随着病毒的传代增殖，PPV HP104 株的TCID₅₀值有所升高，到20代时趋于稳定。

2.4 病毒血凝效价的测定结果

从表2可知，随着病毒的传代增殖，PPV HP104株病毒液的血凝效价有所升高，到15代时趋于稳定。

表2 血凝效价测定结果

2.5 PPV HP104株理化特性的研究

从表3可以看出，分离获得的病毒对分析纯氯仿有较强的抵抗力，属于无囊膜病毒；能够耐受pH3.0的盐酸处理2 h，对酸有较强的抵抗力；能够耐受56℃水浴处理30 min，对热有较强抵抗力；能够耐受1%的胰蛋白酶处理1 h，对胰蛋白酶也有较强的抵抗力。这些理化特性均符合猪细小病毒的理化特性。

表3 理化特性的检测结果

处理方法	发明组TCID₅₀/0.1mL	对照组TCID₅₀ /0.1mL	对数差值
				耐氯仿发明	10^-8.4	10^-8.5	0.1
耐酸发明	10^-8.2	10^-8.5	0.3
				耐热发明	10^-8.2	10^-8.5	0.3
耐胰酶发明	10^-8.4	10^-8.5	0.1

2.6 病毒形态学观察结果

将PPV HP104株的细胞毒做适当处理后，置电镜下观察。可在细胞核内看到大小均一、近似球形的病毒粒子，大小约23～26nm，与已报道的PPV形态基本吻合，未见其它形态的病毒粒子（图2）。

PPV的培养最好以猪源细胞进行培养，特别是猪肾原代细胞，其次是传代细胞。本发明选用ST细胞进行PPV的增殖，出现较为明显的细胞病变，并能达到较高的病毒滴度。由于PPV的增殖是在细胞周期的晚S期和早G2期，即细胞生长的旺盛期，因此病毒的最佳接毒时间是在传代细胞的同时进行，即同步接毒。本发明采用同步接毒的方法进行接毒，此时病毒的增殖量比较高，病变稳定明显，与张超范等的研究报道相一致。

本发明对分离的PPV HP104 株传代增殖并对不同代次的病毒滴度TCID₅₀和病毒血凝效价进行测定，结果显示HP104株的TCID₅₀以及血凝效价随着病毒的传代增殖有所升高并趋于稳定，说明该毒株具有遗传稳定性。通过对HP104株理化特性研究，结果表明该毒株经氯仿、56℃热处理、pH3.0的酸处理和胰酶处理过程后，经ST细胞培养观察，其对细胞的感染力无明显改变，引起的CPE与李刚明等的研究报道一致，说明该毒株对上述理化因素均不敏感。经电镜观察，可见有圆形、23～26nm大小的病毒粒子，与已知的猪细小病毒粒子形态基本吻合。以第25代细胞毒DNA为模版，进行PCR扩增，其产物与预期大小相一致，与其它PPV 毒株同源性较高。因此，本发明成功筛选出一株病毒滴度和血凝效价高、稳定，且细胞病变明显的猪细小病毒毒株，并对其生物学特性进行了研究。

二猪细小病毒毒株HP104的全基因组克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 菌种及载体

基因工程菌DH5α由本实验室制备并保存；pGEM-T Easy Vector System购自宝生物工程有限公司。

1.1.2 病毒株

猪细小病毒毒株HP104，保藏编号CCTCC NO：V201313。

1.2 引物设计

根据Genbank公布的PPV序列，同时参考顾帅等人设计的引物，我们优化设计了4对相互重叠片段的引物（表4），用于扩增包括全部编码区在内的PPV全基因序列。引物送由上海生工生物工程有限公司合成。

表4 PPV扩增引物

1.3 病毒DNA的提取及全基因序列的分段扩增

采用蛋白酶K法提取病毒DNA。以PPV HP104株DNA为模板，进行PCR扩增反应，通过对PCR扩增条件优化，确定如下扩增方案：

片段P1/P2的扩增体系如下： Ex Taq DNA聚合酶25 μL，模板DNA 6 μL，上、下游引物各1 μL，补超纯水至50 μL。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95℃预变性5 min；94℃1 min，58.9℃50 s，72℃50 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。

片段P3/P4的扩增体系如下： Ex Taq DNA聚合酶25 μL，模板DNA 6 μL，上、下游引物各1 μL，补超纯水至50 μL。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95℃预变性5 min；94℃1 min，52.6℃50 s，72℃50 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。

片段P5/P6的扩增体系如下： Ex Taq DNA聚合酶25 μL，模板DNA 6 μL，上、下游引物各1 μL，补超纯水至50 μL。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95℃预变性5 min；94℃1 min，60℃50 s，72℃50 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。

片段P7/P8的扩增体系如下： Ex Taq DNA聚合酶25 μL，模板DNA 6 μL，上、下游引物各1 μL，补超纯水至50 μL。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95℃预变性5 min；94℃1 min，52.4℃50 s，72℃50 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。扩增完成后用电泳方法对产物进行检测。

1.4 PPV全基因组序列各片段的克隆和鉴定

如果PCR检测结果为阳性，则将PCR产物回收纯化并连接到T载体上，经连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的PCR鉴定等过程，对鉴定的阳性克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成。

1.5 PPV全基因组序列的测定与分析

在上海生物工程有限公司提交测序结果后，将四段序列进行拼接得到HP104全基因序列。用DNAStar软件将HP104全序列与Genbank上已发表的序列进行比较和分析。所参照的毒株均为Genbank上收录的典型毒株（如表5）。

表5 所用毒株登录号

2结果

2.1猪细小病毒HP104各片段的扩增结果

对猪细小病毒HP104各片段进行扩增，四段重叠片段的理论长度分别为1611bp、1485bp、680bp和1858bp，扩增片段经过琼脂糖凝胶电泳检测结果如下，表明扩增产物大小与预期相符（如图3）。

2.2各克隆片段重组质粒的PCR鉴定

则将PCR产物回收纯化并连接到T载体上，经过连接产物的转化后，对重组质粒进行提取和PCR鉴定，结果如图4所示。

2.3 PPV HP104的测序与拼接

用DNAStar软件将四段序列进行拼接，得到猪细小病毒HP104株全基因序列。拼接结果表明，猪细小病毒HP104全基因序列为4679bp，如下。

aggtggagcctaacactataaatacagttgcttagttcagttagttcctttctgcttcag 60

actgcacttcgctccagagacacagctacaaactacactcagctactgcagcatggcagc 120

gggaaacacttactcggaagaggtactaaaagctaccaactggcttcaagataatgctca 180

aaaagaagcattctcttatgtatttaaaacacaaaaagtcaatctaaatggaaaagaaat 240

tgcttggaataactacaacaaagatacaacagatgcggaaatgatagacctacaaagagg 300

agcagaaacatcatgggaccaggcaacagacatggaatgggaatcagaaatcgacagcct 360

cacaaaacggcaagtactgatttttgactctcttgttaaaaaatgtctctttgaaggtat 420

attgcaaaagaacctaagtccaagtgactgctactggttcatacagcatgaacatggtca 480

agatactggctatcactgccatgtactactaggtggaaaaggcttacaacaagcaatggg 540

aaaatggttcagaaaacaattaaacaatttatggagtagatggttaataatgcaatgcaa 600

agtacctctaacaccagttgaaagaataaaattaagggaattagcagaggatggtgagtg 660

ggtatcgctactaacctacactcacaaacaaactaaaaaacaatatacaaaaatgactca 720

ttttggaaatatgattgcttactacttcctaaataaaaaaagaaagacaactgaaagaga 780

gcatggatattatctcagctcagattctggcttcatgacaaatttcttaaaagaaggcga 840

gagacacttagtcagtcacctatttactgaagcaaataaacctgaaactgtggaaacaac 900

ggttactacagctcaggaagccaaaagaggcagaatacaaacaaaaaaagaagtaagcat 960

aaaatgcacaataagagacttggttaataaaagatgtactagcatagaagactggatgat 1020

gacagatccagacagttatatagaaatgatggctcaaaccggaggagaaaatttaatcaa 1080

aaatacactagaaataacaactcttactctagcaagaacaaaaacagcatatgacttaat 1140

acttgaaaaggcaaaaccaagcatgctaccaacatttaatattagcaatacaagaacatg 1200

taaaatattcagcatgcacaattggaactacattaaagtctgccatgctataacttgtgt 1260

actaaacagacaaggaggaaaaagaaatacaattctatttcatgggccagcatcaacagg 1320

aaaaagtataattgctcaacacattgcaaacttagttggtaatgttggttgctacaatgc 1380

agccaatgttgaactttccatttaatgactgtacaaataaaaacttaatatggattgaag 1440

aagcaggaaacttctctaaccaagtaaaccaattcaaagccatatgttcaggtcaaacaa 1500

ttagaattgaccaaaaaggtaaaggaagcaaacaaattgaaccaactcctgtaataatga 1560

ctacaaatgaagacataactaaagttagaataggatgcgaggaaagaccagaacatacac 1620

aaccaataagagacagaatgttaaacatacacctaaccagaaaactgccaggtgattttg 1680

gacttttagaagaaactgaatggccactaatatgtgcttggttggtaaagaaaggttacc 1740

aagcaacaatggctagctatatgcatcattggggaaatgtacctgattggtcagaaaaat 1800

gggaggagccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaacagactctcagatttccacat 1860

cagtgaaaacttcgccagcggacaacaactacgcagcaactccaatacaggaggacctgg 1920

atttagctttagccttggagccgtggagcgagccaacaacaccaactttcaccaacctgc 1980

acttaactccaacaccgccagattcagcaatacggacaccaagtccaacttggtcggaaa 2040

tagaaaccgacataagagcctgctttggtgaaaactgtgcacccacaacaaaccttgaat 2100

aaggtaggatggcgcctcctgcaaaaagagcaagaggtaagggtagttttaagggggtgg 2160

tgggcatacatataaaactaactgcaaataatttttttatatattacaggactaactcta 2220

ccaggatacaaataccttggtccaggaaactcactagaccaaggagaaccaactaatcca 2280

tcagacgccgcagcaaaagaacacgacgaagcctacgacaaatacataaaatctggaaaa 2340

aatccatacttctacttctcagcagctgatgaaaaattcataaaagaaactgaacacgca 2400

aaagactacggaggtaaaattggacattacttcttcagagcaaagcgtgcctttgctcca 2460

aaactctcagaaacagactcaccaactacatctcaacaaccagaggtaagaagatcgccg 2520

agaaaacacccagggtctaaaccaccaggaaaaagacctgctccaagacatatttttata 2580

aacttagctaaaaaaaaagctaaagggacatctaatacaaactctaactcaatgagtgaa 2640

aatgtggaacaacacaaccctattaatgcaggcactgaattgtctgcaacaggaaatgaa 2700

tctgggggtgggggcggcggtggcgggggtaggggtgctgggggggttggtgtgtctaca 2760

ggtagtttcaataatcaaacagaatttcaatacttgggggagggcttggttagaatcact 2820

gcacacgcatcaagactcatacatctaaatatgccagaacacgaaacatacaaaagaata 2880

catgtactaaattcagaatcaggggtggcgggacaaatggtacaagacgatgcacacaca 2940

caaatggtaacaccttggtcactaatagatgctaacgcatggggagtgtggttcaatcca 3000

gcggactggcagttaatatccaacaacatgacagaaataaacttagttagttttgaacaa 3060

gaaatattcaatgtagtacttaaaacaattacagaatcagcaacctcaccaccaaccaaa 3120

atatataataatgatctaactgcaagcttaatggtcgcactagacaccaataacacactt 3180

ccatacacaccagcagcacctagaagtgaaacacttggtttttatccatggttacctaca 3240

aaaccaactcaatacagatattacctatcatgcatcagaaacctaaatccaccaacatac 3300

actggacaatcacaacaaataacagactcaatacaaacaggactacacagtgacattatg 3360

ttctacacaatagaaaatgcagtaccaattcatcttctaagaacaggagatgaattctcc 3420

acaggaatatatcactttgacacaaaaccactaaaattaactcactcatggcaaacaaac 3480

agatctctaggactgcctccaaaactactaactgaacctaccacagaaggagaccaacac 3540

ccaggaacactaccagcagctaacacaagaaaaggttatcaccaaacaattaataatagc 3600

tacacagaagcaacagcaattaggccagctcaggtaggatataatacaccatacatgaat 3660

tttgaatactccaatggtggaccatttctaactcctatagtaccaacagcagacacacaa 3720

tattatgatgatgaaccaaatggtgctataagatttacaatgggttaccaacatggacac 3780

ttaaccacatcttcacaagagctagaaagatacacattcaatccacaaagtaaatgtgga 3840

agagctccaatgcaacaatttaatcaacaggcaccactaaacctagaaaatacaaataat 3900

ggaacacttttaccttcagatccaataggagggaaatctaacatgcatttcatgaataca 3960

ctcaatacatatggaccattaacagcactaaacaatactgcacctgtatttccaaatggt 4020

caaatatgggataaagaacttgatacagatctaaaacctagactacatgttacagctcca 4080

tttgtttgtaaaaacaatccaccaggacaactatttgtaaaaatagcaccaaacctaaca 4140

gatgatttcaatgctgactctcctcaacaacctagaataataacttattcaaacttttgg 4200

tggaaaggaacactaacattcacagcaaaaatgagatccagtaatatgtggaaccctatt 4260

caacaacacacaacaacagcagaaaacattggtaaatatattcctacaaatattggtggc 4320

ataaaaatgtttccagaatattcacaacttataccaagaaaattatactagaaataactc 4380

tgtaaataaaaactcagttacttggttaatcatgtactactatcattgtatacttcaata 4440

aaaataaattgtaaaatcaataaaactaagttacttagtttctgtatacctatactagaa 4500

ataactctgtaaataaaaactcagttacttggttaatcatgtactactatcattgtatac 4560

ttcaataaaaataaattgtaaaatcaataaaactaagttacttagtttctgtataccaat 4620

tatccccaaaaaacaataaaattttaaaaagaaacaagctctcatgtgtttactattaa 4679

2.4 PPV 不同毒株全基因的核苷酸序列同源性分析

利用DNAStar 序列分析软件对PPV HP104 株的核苷酸全序列及GenBank 中登录的另外20 株PPV 全序列进行同源性比较（如图5）。由表可知，HP104 株与其他PPV 毒株全基因组序列同源性介于91.4%～99.8%之间；HP104 株与NADL-2株同源性较高，为99.8%，与BQ 株、ZJ株和YL株同源性较低，为91.4%。

2.5 PPV 全基因组系统进化树的构建

利用DNAStar 序列分析软件对HP104 株分离株的全序列及GenBank 中登录的另外20 株PPV 全序列进行同源性比较，并生成系统进化发育树(如图6)，由图可知，PPV HP104株与NADL-2株亲缘关系最近，属于弱毒株，而与与SR-1 株亲缘关系较远。

3结论与讨论

猪细小病毒是引起猪繁殖障碍的主要病原之一，常引起仔猪皮炎症状、非化脓性心肌炎和消瘦性综合征等。由于该病毒常常与其它病毒和细菌共同感染或继发感染，使感染病猪的繁殖障碍情况加剧，因此其危害非常巨大。目前在我国猪细小病毒疫苗非常成熟有效，因此猪细小病毒感染在一定程度上得到了控制，但在部分地区仍有发生和流行，给局部地区造成了危害。因此了解目前猪细小病毒在我国的遗传变异情况是至关重要的，可以对猪细小病毒的流行状况进行准确的把握，对于该病毒的防控是非常有意义的。

猪细小病毒不同毒株有着不同毒力和临床表现，PPV毒株按致病性与组织嗜性可分为4个类型，分别以强毒株NADL-8，弱毒株NADL-2，Kresse株和AF-83株为代表，其中NADL-8株和Kresse株是强毒株，对猪的危害较大。弱毒株NADL-2对妊娠母猪和胎儿都无致病性，可以作为弱毒疫苗来使用。AF-83为肠炎型毒株，与猪的腹泻有关。虽然已经分离出多种类型的PPV毒株，但目前认为只有一个血清型。

猪细小病毒的全基因片段约5000bp，用一对引物扩增其全基因序列比较困难。本实验通过参考顾帅等人设计的引物，再加上自己的设计与优化，合成了四对引物对PPV全基因序列进行分段扩增，通过序列拼接成功获得PPV HP104株的全基因序列。利用DNAStar 序列分析软件对HP104 株分离株的全序列及GenBank 中登录的其它PPV 毒株全序列进行同源性比较和进化树分析，发现PPV HP104株与NADL-2株亲缘关系最近，应该属于弱毒株。而与与SR-1 株亲缘关系较远。这对于了解河南地区猪细小病毒的流行情况提供了科学的参考依据。

三猪细小病毒毒株HP104在ST细胞和PK-15细胞上培养特性比较

1 材料与方法

1.1材料

猪睾丸细胞（ST）购自中国兽药监察所，3株猪肾细胞（PK-15）分别来源于中国兽药监察所、中国农科院和南京农业大学（冻存）。

1.2 方法

1.2.1猪细小病毒在ST细胞上的传代培养

将已分离的PPV HP104接种于ST细胞上，连续接毒培养5代。接毒培养5代后，分别对这5代PPV进行HA和TCID₅₀的测量。具体方法参照本论文发明一中的方法。

1.2.2猪细小病毒在不同PK-15细胞系上的传代培养

将已分离的PPV HP104分别接种于三株PK-15细胞上，连续接毒培养5代。接毒培养5代后，分别对三种PK-15细胞的5代PPV进行HA和TCID₅₀的测量。具体方法参照本论文发明一中的方法。

2结果

2.1猪细小病毒在ST细胞上的传代培养结果

2.1.1 PPV HP104株在ST细胞上的增殖病变观察

正常的ST细胞紧密的贴壁生长，接毒后ST细胞内颗粒增多，接着大片脱落，很多细胞发生裂解、破碎，部分细胞碎片仍贴附在细胞培养瓶壁上。

2.1.2 病毒滴度TCID₅₀结果

分别对ST细胞培养的PPV HP104 五个代次的病毒液TCID₅₀进行测定，通过倒置显微镜观察，接毒后3天待细胞出现脱落、拉网等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID₅₀，结果见表6。

表6 TCID₅₀测定结果(TCID₅₀/0.1mL)

通过表6可知， PPV HP104 株经过ST细胞增殖后毒力效价稳定在10^8.5TCID₅₀/0.1mL。

2.1.3 病毒血凝效价的测定结果

通过表7可知， PPV HP104 株经过ST细胞增殖的HA稳定在2¹⁰。

表7 血凝效价测定结果

2.2猪细小病毒在不同PK-15细胞系上的传代培养结果

2.2.1 PPV HP104株在PK-15细胞上稳定的细胞病变观察

所选用的3株PK-15细胞形态大致相同，正常的PK-15细胞紧密的贴壁生长，接毒后PK-15细胞逐渐变大，细胞内颗粒增多，随后出现病毒蚀斑，蚀斑周围细胞圆缩，接着大片脱落，细胞拉网，很多细胞发生裂解、破碎，部分细胞碎片仍贴附在细胞培养瓶壁上。

2.2.2 病毒滴度TCID₅₀结果

分别对PK-15细胞培养的PPV HP104 五个代次的病毒液TCID₅₀进行测定，通过倒置显微镜观察，接毒后3天待细胞出现脱落、拉网等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID₅₀，结果见表8。

表8 TCID₅₀测定结果(TCID₅₀/0.1mL)

通过表8可知，随着病毒的传代增殖，PPV HP104在农科院PK-15细胞上增殖的TCID₅₀值比较稳定，维持在10^4.2TCID₅₀/0.1mL。在中监所PK-15细胞上和南农PK-15细胞上增殖的TCID₅₀值逐渐下降。

2.2.3病毒血凝效价的测定结果

表9 血凝效价测定结果

通过表9可知，PPV HP104 株在农科院PK-15细胞上增殖的HA稳定在2¹⁰。在中监所PK-15细胞上增殖的HA会稍微下降，在南农PK-15细胞上增殖的HA会大幅下降，直到变为0。

3 结论与讨论

PPV的复制需要借助于宿主细胞蛋白质和核酸的合成体系，因此PPV在处于分裂期的细胞中才能增殖，细胞源DNA合成酶为PPV的复制提供了基础。PPV在猪原代细胞(原代猪肾细胞，猪睾丸细胞等)，传代细胞(PK-15、ST等细胞)，甚至牛肾原代细胞以及人的某些传代细胞(Hela、Hep-2等细胞)上都能生长繁殖，但是不同的分离株对细胞的适应性也不同。 PPV在传代细胞上引起的细胞病变主要表现为细胞圆缩、溶解以及在感染细胞的核内出现包涵体。

在实验室增殖培养PPV过程中，经常使用的细胞是传代PK-15细胞和传代ST细胞，在现已发表的有关PPV增殖的文章中，基本上都是使用这两种细胞。在本实验室对这两种细胞的实际培养过程中，发现这两种细胞对血清、培养液等条件要求不高，因此非常容易培养。同时发现PPV在这两种细胞上的适应性也很好。可以说PK-15细胞和ST细胞是PPV理想的增殖细胞。

为了比较PPV在PK-15细胞和ST细胞上的增殖效果，本发明将猪细小病毒河南分离株PPV HP104在1株ST细胞和3株PK-15细胞上同时进行传代增殖培养，然后对不同细胞增殖的病毒液进行HA和TCID₅₀的测定。结果发现在不同来源的PK-15细胞中，PPV HP104的增殖效果差别很大，在农科院PK-15细胞上的增殖效果比其它两种PK-15细胞好。PPV HP104在传代ST细胞和PK-15细胞上的增殖的最大差别在于病毒的毒力效价TCID₅₀，其中以ST细胞的增殖效果最好。这样的发明结果带给我们的启示是在PPV的增殖培养过程中，传代细胞株的选择是非常重要的。只有选择了对的细胞株，才能达到预期的增殖效果。

四猪细小病毒毒株HP104免疫豚鼠血清学

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和细胞株

ST细胞购自中国兽药监察所（冻存）。

1.1.2 发明动物

10只体重400g左右健康青年豚鼠，购自郑州大学医学院发明动物中心。

1.1.3 25%白陶土悬液的配制

取白陶土25g，置离心管中，加入适量15mol/L盐酸溶液，充分摇匀，以2000rpm×10分钟离心弃上清，再加入1 mol/L盐酸溶液，摇匀。如此反复3次，最后取沉淀的白陶土用100ml PBS配制成25%悬液，用5mol/L NaOH溶液调pH值为至7.2后，15磅20分钟高压消毒灭菌，存放于4℃备用，保存期不超过4个月。

1.1.4血凝素工作液配制及检验

将已经测定好凝集价的抗原按一定比例稀释成4个血凝单位（即4 HA），然后将配制的稀释液分别以1ml的量加入PBS液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml中，使最终稀释度为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7。然后从每一稀释度中取50μl ，加入0.6%豚鼠红细胞50μl，充分震荡，37℃放置1h。如配制的抗原液刚好为4HA，则1∶4稀释度将给出凝集终点；如高于或低于4HA，则应根据检验结果将血凝素稀释度做适当调整，使工作液确为4 HA。

1.2 方法

1.2.1 病毒的增殖

常规培养ST细胞，用DMEM培养液加10%胎牛血清作为ST细胞的培养液；在细胞传代时同步接种猪细小病毒HP104株第20代病毒液，置于5%CO₂，37℃恒温培养箱中培养，培养24 h后倒掉细胞培养上清液, 换成不含胎牛血清的DMEM培养液，继续培养48 h，待贴壁细胞出现80%的CPE时收获病毒。将收获的病毒反复冻融三次，8000 rpm离心30min去除细胞碎片，冻于-80 ℃保存备用。

1.2.2 病毒滴度TCID₅₀和血凝效价的测定

将大量培养的病毒液进行TCID₅₀ 和HA的测定，测定方法按照发明一中的方法。收获的病毒原液冻融后,每毫升含毒量不应低于10⁷TCID₅₀。

1.2.3病毒的灭活及其灭活检验

1.2.3.1 灭活时间的确定

取3ml 10%的甲醛溶液加到100mL HP104病毒液中，使其终浓度为0.3%，混匀，放入37℃温箱中进行灭活，其间每隔2 h摇动病毒悬液一次。分别于24 h、36 h、48 h取出病毒液进行灭活检验，同时设不加甲醛溶液的病毒液对照组。

1.2.3.2 灭活病毒液的检测

将不同灭活时间段取出的病毒液和不加甲醛的对照组同步接种到ST细胞上，连续盲传3代，期间观察细胞病变；盲传3代后反复冻融3次收集病毒液，检测培养液血凝活性来判断灭活效果。

将灭活病毒液接种于普通肉汤和普通营养琼脂中，37℃培养24～48 h，观察有无细菌生长。

1.2.4猪细小病毒乳化剂的制备

向100ml灭活病毒液里加5ml吐温-80并混匀，与倍量白油乳化剂混合，搅拌大约三分钟，使之混匀并形成水包油包水的油乳剂型。

1.2.5猪细小病毒乳化剂的检验

按兽用生物制品质量标准检验。

1.2.5.1外观检测

肉眼观察猪细小病毒乳化剂的外观。

1.2.5.2冷水表面发明

取一清洁吸管，吸取乳化剂缓慢滴于冷水中，观察油滴是否扩散。

1.2.5.3粘稠度检验

取口径为1.2 mm的l mL吸管于室温下吸满l mL乳化剂，以吸管呈垂直状态时自然流出0.4 mL油乳剂所需的时间作为判定标准。

1.2.5.4稳定性检验

将乳化剂加满5 mL小离心管，3000 rpm离心15 min，以不分层为稳定性良好；37℃放置21d，观察是否有破乳、分层现象。

1.2.5.5无菌检验

将制成的乳化剂接种于普通肉汤，普通营养琼脂，血琼脂培养基，37℃培养观察3天，无菌生长为合格。

1.2.6 免疫豚鼠血清学发明

1.2.6.1 豚鼠发明

将10只豚鼠分为乳化剂注射组和阴性对照组两组，每组5只。注射组每只豚鼠注射0.5ml猪细小病毒乳化剂，阴性对照组每只豚鼠注射0.5ml生理盐水。28天后取10只豚鼠的血清进行HI测定。

1.2.6.2 猪细小病毒血凝抑制抗体效价（HI）测定

1.2.6.2.1 待检血清的处理

取100μl待检血清，56℃水浴灭活30分钟后，加入300μl 25%白陶土悬液，混匀后室温作用30分钟，10000r/min离心5分钟，吸取上清，加入100μl 20%豚鼠红细胞泥，振荡混匀后37℃作用1小时，6000r/min离心5分钟，收集上清即为1׃4稀释后的血清样品。

1.2.6.2.2 发明操作

在96孔血凝反应板每孔加入50μl生理盐水，红细胞对照孔加100μl，随后在第1孔中加入经处理的待检血清50μl，混匀后取出50μl加到第2孔中，依此类推，直到第10孔，弃去50μl，此时待检血清的稀释度分别为1:8、1:16、…、1:4096。除红细胞对照孔外，每孔再加入4×血凝单位的猪细小病毒液50μl，此时第11孔即为病毒对照孔，振荡后37℃作用1小时，然后每孔加入0.6%豚鼠红细胞悬液50μl，振荡混匀后置室温作用2h，观察结果。

1.2.6.2.3 结果判定

以能抑制50%红细胞凝集的血清最高稀释倍数作为被检血清的血凝抑制抗体效价。

2 结果

2.1病毒滴度TCID₅₀和血凝效价的测定结果

常规培养ST细胞，接毒后通过倒置显微镜观察，待细胞出现脱落、拉网等明显的CPE后，统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID₅₀，结果得出纯化后的HP104株TCID₅₀ 为10^8.5/0.1 mL，血凝效价为2¹⁰。

2.2 病毒灭活效果检验

2.2.1病变观察

用0.3%甲醛灭活病毒，分别将经甲醛灭活24 h、36 h、48 h的病毒液取出，在ST细胞上盲传3代的同时观察细胞病变，灭活24 h、36 h的病毒液在ST细胞上出现了病变，只有48h灭活的病毒液没有产生细胞病变。

2.2.2灭活病毒液的血凝性检验

分别将灭活24 h、36 h、48 h的病毒液取出，在ST细胞上盲传3代后收集病毒液，反复冻融3次，2000 rpm离心10 min，取上清进行血凝效价的测定。灭活24 h和48h的病毒液的血凝效价均为为2⁹，与灭活前比较有所下降，而灭活48 h的病毒液血凝效价均为2⁰，

2.2.3灭活病毒液的无菌检测

取灭活后的病毒液分别接种于琼脂平板与营养肉汤中，37℃培养24～28 h后观察无细菌生长，符合生物制品规程要求。

2.4 猪细小病毒乳化剂的鉴定

2.4.1 外观检测

乳化剂摇匀后外观呈乳白色均质乳剂，静置后，下层略带淡红色乳液。符合质量标准。

2.4.2 冷水表面发明

制备的乳化型为水包油包水型。将制备的乳化剂滴于冷水表面，结果为先不扩散，再缓慢向四周散去。

2.4.3 黏度测定

用l mL吸管(下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)在25℃室温下吸满1 mL乳化剂，垂直放出0.4 mL需2 S。在2～6 S范围内，说明黏度合格，适合于注射用。

2.4.4 稳定性测定

将乳化剂经3000 rpm离心15 min后无分层和破乳现象，37℃放置21d后也无破乳、分层现象，说明其具有一定的稳定性。

2.5猪细小病毒血凝抑制抗体效价（HI）测定结果

表10 HI测定结果

如表10所示，在给豚鼠注射猪细小病毒乳化剂28天后，通过用HI方法检测其抗体水平，达到128，而阴性对照组豚鼠体内猪细小病毒抗体呈阴性。

3 结论与讨论

猪细小病毒病作为一种主要的繁殖障碍疾病，对母猪和仔猪的危害都很大。现在国内规模化猪场的存栏母猪及种猪场的种猪都需要针对该病进行预防接种。灭活疫苗的接种免疫是控制该疾病的主要手段。灭活疫苗作为预防PPV常用疫苗，具有安全有效等优点，在国内得到了广泛的应用。

良好、稳定、特异性高的病毒抗原对发明的后续工作是十分重要的，本发明采用的病毒抗原是本发明分离鉴定并保存的PPV HP104株。经过发明证明，该株病毒具有良好的稳定性、特异性和重复性，可应于抗体的检测。本发明在细胞接毒培养24 h后换维持液，且维持液中不添加胎牛血清，大大降低了病毒培养物中胎牛血清的含量。PPV HP104株病毒滴度和血凝效价在20代时已基本稳定，经测定，纯化后病毒液的TCID₅₀为10^-8.5/0.1mL，血凝效价为2¹⁰。

甲醛是最为常用的灭活剂，其对动物机体的影响较小。本发明中的猪细小病毒液经0.3%甲醛灭活48h后，将灭活病毒液接种ST细胞培养盲传3代，ST细胞未出现CPE，通过灭活效果的检测，最终确定0.3%的甲醛灭活48 h就能能将猪细小病毒HP104株完全灭活。

在对豚鼠的免疫发明中，我们选用了健康状况良好，并且体重达到标准的豚鼠。在实际的操作过程中，要特别注意豚鼠的饲养问题，要尽量避免豚鼠在饲养过程中发生接触外源病毒和生病死亡的现象。实验结果表明，在给豚鼠接种28天后，用HI方法检测其血清中的PPV抗体水平达到128，而阴性对照组豚鼠体内猪细小病毒抗体阴性，表明分离的猪细小病毒HP104具有很好的免疫原性。

<110> 河南农业大学

<120> 一种猪细小病毒毒株

<160> 2

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(21)

<400> 1

ccaaaaatgcaaaccccaata 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(22)

<400> 2

atctggcggtgttggagttaag 22

<210> 3

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(195)

<400> 3

ccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaacagactctcagatttccacatcagtgaaa 60

acttcgccagcggacaacaactacgcagcaactccaatacaggaggacctggatttagct 120

ttagccttggagccgtggagcgagccaacaacaccaactttcaccaacctgcacttaact 180

ccaacaccgccagat 195

<210> 4

<211> 4679

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(4679)

<400> 4

aggtggagcctaacactataaatacagttgcttagttcagttagttcctttctgcttcag 60

actgcacttcgctccagagacacagctacaaactacactcagctactgcagcatggcagc 120

gggaaacacttactcggaagaggtactaaaagctaccaactggcttcaagataatgctca 180

aaaagaagcattctcttatgtatttaaaacacaaaaagtcaatctaaatggaaaagaaat 240

tgcttggaataactacaacaaagatacaacagatgcggaaatgatagacctacaaagagg 300

agcagaaacatcatgggaccaggcaacagacatggaatgggaatcagaaatcgacagcct 360

cacaaaacggcaagtactgatttttgactctcttgttaaaaaatgtctctttgaaggtat 420

attgcaaaagaacctaagtccaagtgactgctactggttcatacagcatgaacatggtca 480

agatactggctatcactgccatgtactactaggtggaaaaggcttacaacaagcaatggg 540

aaaatggttcagaaaacaattaaacaatttatggagtagatggttaataatgcaatgcaa 600

agtacctctaacaccagttgaaagaataaaattaagggaattagcagaggatggtgagtg 660

ggtatcgctactaacctacactcacaaacaaactaaaaaacaatatacaaaaatgactca 720

ttttggaaatatgattgcttactacttcctaaataaaaaaagaaagacaactgaaagaga 780

gcatggatattatctcagctcagattctggcttcatgacaaatttcttaaaagaaggcga 840

gagacacttagtcagtcacctatttactgaagcaaataaacctgaaactgtggaaacaac 900

ggttactacagctcaggaagccaaaagaggcagaatacaaacaaaaaaagaagtaagcat 960

aaaatgcacaataagagacttggttaataaaagatgtactagcatagaagactggatgat 1020

gacagatccagacagttatatagaaatgatggctcaaaccggaggagaaaatttaatcaa 1080

aaatacactagaaataacaactcttactctagcaagaacaaaaacagcatatgacttaat 1140

acttgaaaaggcaaaaccaagcatgctaccaacatttaatattagcaatacaagaacatg 1200

taaaatattcagcatgcacaattggaactacattaaagtctgccatgctataacttgtgt 1260

actaaacagacaaggaggaaaaagaaatacaattctatttcatgggccagcatcaacagg 1320

aaaaagtataattgctcaacacattgcaaacttagttggtaatgttggttgctacaatgc 1380

agccaatgttgaactttccatttaatgactgtacaaataaaaacttaatatggattgaag 1440

aagcaggaaacttctctaaccaagtaaaccaattcaaagccatatgttcaggtcaaacaa 1500

ttagaattgaccaaaaaggtaaaggaagcaaacaaattgaaccaactcctgtaataatga 1560

ctacaaatgaagacataactaaagttagaataggatgcgaggaaagaccagaacatacac 1620

aaccaataagagacagaatgttaaacatacacctaaccagaaaactgccaggtgattttg 1680

gacttttagaagaaactgaatggccactaatatgtgcttggttggtaaagaaaggttacc 1740

aagcaacaatggctagctatatgcatcattggggaaatgtacctgattggtcagaaaaat 1800

gggaggagccaaaaatgcaaaccccaataaatacaccaacagactctcagatttccacat 1860

cagtgaaaacttcgccagcggacaacaactacgcagcaactccaatacaggaggacctgg 1920

atttagctttagccttggagccgtggagcgagccaacaacaccaactttcaccaacctgc 1980

acttaactccaacaccgccagattcagcaatacggacaccaagtccaacttggtcggaaa 2040

tagaaaccgacataagagcctgctttggtgaaaactgtgcacccacaacaaaccttgaat 2100

aaggtaggatggcgcctcctgcaaaaagagcaagaggtaagggtagttttaagggggtgg 2160

tgggcatacatataaaactaactgcaaataatttttttatatattacaggactaactcta 2220

ccaggatacaaataccttggtccaggaaactcactagaccaaggagaaccaactaatcca 2280

tcagacgccgcagcaaaagaacacgacgaagcctacgacaaatacataaaatctggaaaa 2340

aatccatacttctacttctcagcagctgatgaaaaattcataaaagaaactgaacacgca 2400

aaagactacggaggtaaaattggacattacttcttcagagcaaagcgtgcctttgctcca 2460

aaactctcagaaacagactcaccaactacatctcaacaaccagaggtaagaagatcgccg 2520

agaaaacacccagggtctaaaccaccaggaaaaagacctgctccaagacatatttttata 2580

aacttagctaaaaaaaaagctaaagggacatctaatacaaactctaactcaatgagtgaa 2640

aatgtggaacaacacaaccctattaatgcaggcactgaattgtctgcaacaggaaatgaa 2700

tctgggggtgggggcggcggtggcgggggtaggggtgctgggggggttggtgtgtctaca 2760

ggtagtttcaataatcaaacagaatttcaatacttgggggagggcttggttagaatcact 2820

gcacacgcatcaagactcatacatctaaatatgccagaacacgaaacatacaaaagaata 2880

catgtactaaattcagaatcaggggtggcgggacaaatggtacaagacgatgcacacaca 2940

caaatggtaacaccttggtcactaatagatgctaacgcatggggagtgtggttcaatcca 3000

gcggactggcagttaatatccaacaacatgacagaaataaacttagttagttttgaacaa 3060

gaaatattcaatgtagtacttaaaacaattacagaatcagcaacctcaccaccaaccaaa 3120

atatataataatgatctaactgcaagcttaatggtcgcactagacaccaataacacactt 3180

ccatacacaccagcagcacctagaagtgaaacacttggtttttatccatggttacctaca 3240

aaaccaactcaatacagatattacctatcatgcatcagaaacctaaatccaccaacatac 3300

actggacaatcacaacaaataacagactcaatacaaacaggactacacagtgacattatg 3360

ttctacacaatagaaaatgcagtaccaattcatcttctaagaacaggagatgaattctcc 3420

acaggaatatatcactttgacacaaaaccactaaaattaactcactcatggcaaacaaac 3480

agatctctaggactgcctccaaaactactaactgaacctaccacagaaggagaccaacac 3540

ccaggaacactaccagcagctaacacaagaaaaggttatcaccaaacaattaataatagc 3600

tacacagaagcaacagcaattaggccagctcaggtaggatataatacaccatacatgaat 3660

tttgaatactccaatggtggaccatttctaactcctatagtaccaacagcagacacacaa 3720

tattatgatgatgaaccaaatggtgctataagatttacaatgggttaccaacatggacac 3780

ttaaccacatcttcacaagagctagaaagatacacattcaatccacaaagtaaatgtgga 3840

agagctccaatgcaacaatttaatcaacaggcaccactaaacctagaaaatacaaataat 3900

ggaacacttttaccttcagatccaataggagggaaatctaacatgcatttcatgaataca 3960

ctcaatacatatggaccattaacagcactaaacaatactgcacctgtatttccaaatggt 4020

caaatatgggataaagaacttgatacagatctaaaacctagactacatgttacagctcca 4080

tttgtttgtaaaaacaatccaccaggacaactatttgtaaaaatagcaccaaacctaaca 4140

gatgatttcaatgctgactctcctcaacaacctagaataataacttattcaaacttttgg 4200

tggaaaggaacactaacattcacagcaaaaatgagatccagtaatatgtggaaccctatt 4260

caacaacacacaacaacagcagaaaacattggtaaatatattcctacaaatattggtggc 4320

ataaaaatgtttccagaatattcacaacttataccaagaaaattatactagaaataactc 4380

tgtaaataaaaactcagttacttggttaatcatgtactactatcattgtatacttcaata 4440

aaaataaattgtaaaatcaataaaactaagttacttagtttctgtatacctatactagaa 4500

ataactctgtaaataaaaactcagttacttggttaatcatgtactactatcattgtatac 4560

ttcaataaaaataaattgtaaaatcaataaaactaagttacttagtttctgtataccaat 4620

tatccccaaaaaacaataaaattttaaaaagaaacaagctctcatgtgtttactattaa 4679。

Claims

1.一种猪细小病毒毒株，其特征在于，猪细小病毒（Parvoviridae），CCTCC NO：V201313。