CN107936116A - 高效价抗csfv单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

高效价抗csfv单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法。该方法将猪瘟病毒浓缩和纯化时，先采用切向流超滤，然后过琼脂糖凝胶过滤层析柱；筛选抗CSFV单克隆抗体时，先采用猪瘟抗体检测试纸检测，再采用IPMA检测，最后采用间接ELISA的方法筛选。公开了依据所述高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法所制备的杂交瘤细胞株。公开了依据所述高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法所制备的抗CSFV单克隆抗体。将所述抗CSFV单克隆抗体在CSFV定性或定量检测中的应用。并利用所述抗CSFV单克隆抗体检测CSFV的阻断 ELISA试剂盒。本发明的方法能够用于大批量样本检测，低成本、既简单又快速且灵敏。

Description

高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体涉及一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法。
背景技术
猪瘟（classical swine fever，CSF）在中国被列为一类传染病，病原是猪瘟病毒。猪瘟病毒是有囊膜的单股正链 RNA病毒，属于黄病毒科、瘟病毒属，其分子量约为 4×106，病毒粒子大小大约在40～70nm，略呈圆形或椭圆形，具有脂蛋白囊膜，从电镜照片中可观察到囊膜围绕着等轴的核心，内部核心直径大约30nm，核衣壳呈二十面体对称，6～8nm类似穗样的纤突结构存在于病毒粒子的表面，同种属成员的还包括羊边界病病毒和牛黏膜病病毒。
CSFV是单股正链RNA病毒，具有感染性，而且本身就可作为mRNA，仅含有一个大的开放阅读框，其两端为高度保守的非编码区，而且5′端无甲基化帽子结构，3′端无多聚腺苷酸尾巴，ORF编码一个多聚蛋白前体包含有3898个氨基酸残基的，在宿主细胞和病毒自身的酶共同裂解作用下可裂解为12种蛋白，包括4种结构蛋白和8种非结构蛋白。其中编码病毒结构蛋白的基因靠近基因组5′端，分别为C、E0、E1、E2。
E2囊膜糖蛋白编码373个氨基酸残基，位于CSFV多聚蛋白的第690～1062位氨基酸残基，编码E2蛋白的结构基因是与病毒毒力有关的基因，它是一种中和性抗原蛋白，除了能够诱导机体产生中和抗体，还能够激发产生保护性免疫应答，它是CSFV诱导机体产生中和抗体的主要抗原蛋白。E2蛋白由 3～8个氨基酸残基组成的抗原表位根据结构的差别，分为两种抗原表位，分别为连续性及不连续性。连续性抗原表位见于 T细胞表位和部分 B细胞表位，又称为线性表位，不连续抗原表位只见于 B细胞抗原表位，又称为构象型表位。CSFV与BVDV和BDV的区别主要表现在E2蛋白上。
E0蛋白的分子量约为44～48 kDa。E0以分子质量约 100 kDa的同源二聚体的形式出现在CSFV感染的细胞或病毒粒子中，感染CSFV的细胞会分泌大量的E0到细胞培养液中。E0蛋白的C末端氨基酸和N末端氨基酸分别为Ala-494和Glu-268。E0蛋白没有跨膜结构，其C末端存在一个膜锚定结构，但与囊膜结合力较弱，很容易从囊膜上游离下来，该膜锚定结构对子代病毒的感染性至关重要。E0蛋白位于CSFV的表面，E0的一些抗原表位是暴露在外的，它既是一种结构蛋白，而且还是一种功能性蛋白，存在大量重要的抗原表位。E0蛋白具有RNase活性，能够降解病毒和细胞的RNA，它是一种尿嘧啶特异的核酸酶，可以表现出多种生物活性。RNase除了能够降解RNA外，还具有神经毒性，抗蠕虫、抗肿瘤，免疫调节等作用。E0蛋白在病毒入侵易感细胞时发挥着重要作用，例如CSFV通过E0和E2两个囊膜糖蛋白分别作用于细胞表面的不同受体来完成对SK-6细胞的感染。E0吸附细胞的能力被抑制后，病毒粒子就得依靠E1和E2介导进入宿主细胞内。E0同E2囊膜糖蛋白一样均可诱发猪产生抗CSFV的中和性抗体。
目前， RT-PCR、巢式RT-PCR、限制性片段长度-巢式RT-PCR（RFLP）、实时定量 PCR、RT-LAMP等检测方法均已用于检测猪瘟病毒。然而，此类方法成本高，不适合大批量样品的检测；比较烦琐而且费时费力，无法在基层推广应用。
因此，急需一种用于大批量样本检测的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法，以便于低成本、既简单又快速且灵敏的测定猪瘟病毒抗原。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
经长期研究发现，目前兽用单克隆抗体的制备中，免疫原含有较多的动物组织、细胞成分和培养基中的蛋白质等杂质都易使接种者产生过敏等不良的反应，因此需要通过纯化技术去除如培养基中的杂蛋白、糖脂类及核酸等大部分生物源性杂质，完成免疫活性成分的浓缩富集和纯化工作，这样可大大地降低甚至避免接种后发生的副反应发生率，更加安全有效。
本发明具体技术方案如下：
设计一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备免疫原：培养猪瘟病毒后，采用先切向流超滤，后过琼脂糖凝胶过滤层析柱的方法将猪瘟病毒浓缩和纯化；
（2）以所述浓缩和纯化后的免疫原免疫小鼠；
（3）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
（4）采用先猪瘟抗体检测试纸检测，再IPMA检测结合间接ELISA的方法筛选阳性杂交瘤细胞进行克隆；
（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。
优选的，在步骤（1）中，所述切向流超滤时，真空泵进口压力为0.1MPa，回流压力为0.05MPa，样品反复被50kDa超滤膜截留收集于收样杯中，直至浓缩体积至20mL。
优选的，在步骤（1）中，所述琼脂糖凝胶过滤层析柱为Sepharose 4 Fast Flow，流速为0.3 mL/min。
优选的，所述间接ELISA的方法包括以下步骤：
a. 包被：使用0.05M CBS将 E0-E2融合蛋白包被于96孔板，每孔100µL，4℃包被过夜；
b. 封闭：用5%脱脂奶封闭，37℃作用1h，PBST洗涤三次；
c. 样品：使用PBS稀释杂交瘤上清等进行检测，每孔100µL，37℃，30min后，PBST洗涤三次；
d. 酶标二抗的反应：每孔加入100µL 1：1000倍稀释的羊抗猪或抗鼠的酶标二抗，37℃，30min后，PBST洗涤三次；
e. 显色与终止：将TMB显色试剂每孔加入100µL，显色5min后加入2M H2SO4终止反应，测定OD450值。
将所述高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法制备的抗CSFV单克隆抗体在CSFV定性或定量检测中的应用。
由所述制备方法制备的抗CSFV单克隆抗体所制备的检测CSFV的阻断ELISA试剂盒。
优选的，其中抗原包被的浓度为0.625～5μg/mL，待检血清稀释度为1：1～50。
优选的，其中封闭液为5%脱脂奶、1%BSA、1%OVA、2%明胶中的至少一种。
优选的，其中酶标单抗的浓度为1：2000～16000，酶标单抗的孵育时间为0.5～2h。
优选的，其中底物显色的作用时间为5～20min。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明的方法中凝胶过滤层析技术操作条件较温和、操作方法较简单且具有较好的重复性。
2.本发明的方法中凝胶过滤层析技术操作简单，方便操作人员对样品峰进行收集；且成本低，只需一台蠕动泵和一台紫外检测器便可进行，不需要价格昂贵的液相色谱系统。
3.本发明的方法采用超滤结合琼脂糖凝胶柱，可有高效去除如培养基中的杂蛋白、糖脂类及核酸等大部分生物源性杂质，完成对病毒的免疫活性成分的浓缩富集和纯化工作。
4.本发明的方法首先采用猪瘟抗体检测试纸筛选，一次性、短时间可以筛除与细胞血清等发生的非特异性的反应，从而提高了筛选效率，检测后再用 E0-E2融合蛋白包被的间接 ELISA进一步验证出反应特异且反应性强的杂交瘤细胞，同时用 IPMA筛选，得到即能与 E0-E2融合蛋白反应的又能与 CSFV反应的单克隆抗体细胞株。
5.本发明的方法建立了猪瘟抗体检测试纸、 IPMA和间接 ELISA的方法相结合的方式进行筛选，多种筛选方法相结合提高了筛选的阳性率及特异性。
6.本发明的方法筛选到既能与猪瘟病毒反应又能与E2 蛋白发生特异性反应的单克隆抗体细胞株，同时具有高效价的单抗。
7.本发明使用HRP直接标记单抗可减少因酶标二抗间接反应带来的非特异性反应。
8.本发明的方法能够用于大批量样本的检测，低成本、既简单又快速且灵敏。
附图说明
图1为Sepharose 4FF凝胶纯化CSFV 图谱图；
图2为TFF-SEC 提纯后的病毒鉴定图；
其中，M：蛋白质分子量标准；1:图1 中的第二个峰；2：图1中的第一个峰；
图3为病毒提纯过程中的NS5A 基因检测图；
其中，1：病毒浓缩前的收集上清；2：超滤截留物；3：超滤滤出液；4：琼脂糖凝胶分子筛后的第一个峰；5：琼脂糖凝胶分子筛后的第二个峰；
图4为切向流膜包与琼脂糖凝胶分子筛提纯后的病毒活性鉴定图；
其中，A: 纯化后的CSFV 感染PK-15 后的IFA 结果；B: 未感染CSFV 的正常PK-15 细胞；
图5为切向流膜包与琼脂糖凝胶分子筛提纯猪瘟病毒的电镜图；
图6为胶体金试纸检测抗体效价结果图；
图7为IPMA 检测8 株腹水分别与猪瘟SM株反应性图；
图8为8 株腹水分别与E0-E2 蛋白的反应性图；
图9为8 株腹水分别与E2 原核蛋白的反应性图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：免疫原的制备
1. 猪瘟 SM株病毒的增殖
用含10%胎牛血清的DMEM营养液培养PK-15细胞，待细胞长约80%时，弃掉生长液，用D-Hank′s液洗涤两遍，接种500μL CSFV病毒液，37℃吸附1h后弃掉病毒液，加入5 mL 2% DMEM维持液，置于37℃CO2培养箱中培养，在病毒感染 60h时收集病毒培养上清，大量收集病毒培养上清液约500mL，放置于-80℃保存备用。
2. 病毒的浓缩与纯化
（1）收集500mL病毒培养上清液经5000rpm/min，离心10min去除较大的细胞碎片；
（2）使用美国Pall公司微滤、超滤系统对猪瘟SM毒株的细胞培养液进一步去除细胞碎片等杂质，切向流超滤（TFF）系统主要包括两部分：上游连接有膜包一端的收集样杯和下游连接有滤出废液一端的废液收集杯；
超滤膜包使用前先用超纯水润洗并平衡后再进行样品的超滤操作，整个流程按照低压快速的标准进行，真空泵进口压力0.1MPa，回流压力0.05MPa，样品会反复被50 kDa超滤膜截留收集于收样杯中，直至浓缩体积至20mL，作为凝胶过滤柱层析分离的猪瘟病毒样品，试验过程中的滤出废液取样-20℃冻存待检；
（3）使用 GE公司的琼脂糖凝胶 Sepharose 4 Fast Flow（4FF）过滤层析柱纯化猪瘟病毒粒子，琼脂糖凝胶过滤柱柱长约150cm，直径约2cm，上样体积不超过柱面积的10%，在使用前用PBS缓冲液平衡整个柱子，流速设定在0.3 mL/min，同时采用伯乐的生物液相色谱系统实时监控OD280吸光度，分别收集出现两个峰的样品进行检测，整个操作均在4℃环境下进行；
（4）为了确定超滤结合琼脂糖凝胶过滤层析方法（TFF-SEC）相结合的纯化方法的有效性，采用荧光定量PCR 的方法分别对超滤浓缩前病毒培养上清液、浓缩后以及滤出的废液，琼脂糖凝胶层析分子筛后的对应的两个峰收集的样品进行定量，从基因水平评价超滤结合琼脂糖凝胶分子筛技术纯化CSFV 的效果；通过测定TCID50分析此方法处理后的是否能够保证病毒活性，同时经磷钨酸负染后电镜观察处理后的病毒粒子，并用SDS-PAGE和Westernblot对纯化后的病毒进行分析。
结果如下：
从图1中可看到，琼脂糖凝胶过滤层析先出现一个小峰，即大分子物质未通过琼脂糖孔径先行洗脱出来，后出现一个大峰，即小分子物质（细胞培养介质中的杂质），经后续的荧光定量RT-PCR 检定小峰洗脱物即为CSFV 颗粒，大峰洗脱物为细胞代谢物、血清、氨基酸等小分子杂质。
将琼脂糖凝胶分子筛后的两个峰分别用猪阳性多抗进行验证，如图2所示，第一个出现的峰（小峰）与第二个峰（大峰）相比，能明显的看到猪瘟病毒的E1（31～33 kDa）以及衣壳蛋白C（14 kDa）条带。
如图3所示：超滤浓缩后的病毒活性为98.5%，TCID50/mL 从起初的5.5×10-4.25浓缩至3.4×10-6.35，琼脂糖凝胶分子筛的病毒活性达86.2%，如图4所示，具有很好的感染性，TCID50/mL 为3.0×10-6.25。
如图5所示：用透射电镜观察纯化后的结果显示整个视野比较清晰，看不到明显的杂质，图像清晰。在100,000倍镜下可见到大量呈椭圆形的CSFV粒子，病毒直径为40～60nm，在300,000 倍透射电子显微镜下可见轮廓比较清晰的CSFV粒子。
3. 免疫荧光试验（IFA）及免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）
将长满细胞瓶的PK-15细胞用0.25%胰酶进行消化，按一定的细胞数量进行铺板，每孔100µL，次日，用D-Hank′s进行洗涤两次，以一定的比例使用2% DMEM培养基稀释CSFV，每孔100µL感染18h，使用预冷的甲醇溶液按每孔100µL的量加入96孔板中，室温固定10～20min；弃固定液，每孔加入200µL 5%脱脂奶37℃封闭1h，洗涤两次。取100µL适度稀释的一抗加入每孔，37℃作用1h后，同上洗涤；每孔加入100µL 1:100倍稀释的HRP或FITC标记的羊抗小鼠或羊抗猪抗体，37℃反应1h后，同上洗涤；IFA直接在荧光显微镜下通过检测是否有绿色荧光点来判定阴阳性结果，而IPMA的结果需要每孔加入100µL AEC显色液进行显色，使用DDW终止显色，显微镜下观察试验结果。
4. 间接 ELISA
采用间接 ELISA法分别对融合后的细胞上清及单抗的效价进行测定。操作如下：
（1）包被：使用0.05M CBS（pH 9.6）将 E0-E2融合蛋白包被于96孔板，100µL/孔，4℃包被过夜，PBST洗涤三次；
（2）封闭：用5%脱脂奶封闭，37℃作用1h，同上洗涤；
（3）样品：使用PBS稀释腹水或杂交瘤上清等进行检测，同时设立阴阳性对照，每孔100µL，37℃，30min后，同上洗涤；
（4）酶标二抗的反应：每孔加入100µL 1:1000倍稀释的羊抗猪或抗鼠的酶标二抗，37℃，30min后，同上洗涤；
（5）显色与终止：将TMB显色试剂的3号液和4号液等比例混合，100µL/孔，显色5min后加入2M H2SO4终止反应，立即测定其OD450值；
结果判定：
阳性血清OD450值在1.0左右，阴性血清OD450值在0.1左右，说明试验成立。样品的OD450值与阴性对照的OD450值的比值大于或等于 2.2，结果可判定为阳性，其它则为阴性。
5. 动物免疫
将上述纯化的猪瘟病毒皮下多点注射免疫5只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，将抗原与等体积弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合后，首免、二免和三免的免疫剂量均为200μL /只。免疫间隔为三周，三免后14d左右采血测定抗体效价，使用猪瘟抗体试纸条检测小鼠的猪瘟抗体效价高低。
经过三次的病毒免疫，五只小鼠均尾静脉采血，采用猪瘟抗体试纸检测结果显示，小鼠免疫后的试纸效价最高为1:6400，超免后效价为1:12800（如图6所示），其余小鼠免疫后效价分别为1:1600、1:3200、1:1600、1:3200，继续进行四免后再进行抗体效价测定，选择最高效价的老鼠进行超免后再次融合，超免采用腹腔注射，剂量为100μL /只，所用抗原不含佐剂。
实施例二：杂交瘤细胞株的建立
1. 细胞融合
复苏冻存的SP2/0细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。保证融合前的细胞生长状态最好，用2%台盼蓝染色对生长状态良好的SP2/0进行计数，细胞融合时所需的SP2/0细胞数约为2～5×107。
在超免后第 4d开始进行细胞融合，首先收集融合小鼠的血清为阳性对照。然后再将处死并用75%酒精消毒的小鼠仰卧固定在石蜡板上准备无菌操作。首先使小鼠腹腔暴露，无菌取出脾脏。将脾脏置于120目尼龙网上，去除脾脏周围的结缔组织后，将脾脏充分研磨，用GNK溶液洗涤脾脏细胞两次，制备成单细胞悬液，然后2%台盼蓝染色计数，小鼠脾脏细胞的数目大约在1～2.5×108。将小鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5:1混合在一起，添加GNK溶液至40mL，离心后，吸取1mL 50% PEG-1500（pH8.0）逐滴入管中，保持在37℃水浴中操作，然后由慢到快的速度添加15mL GNK溶液，添加速度分为三个阶段：1mL（30s），3mL（30s），11mL（30s），再补加GNK溶液至40mL，37℃水浴中静置5min后1000rpm离心10min，加入适量HAT/1640培养基，轻轻吹打使细胞均匀分散，以200µL/孔加到96孔细胞培养板上，将融合细胞铺至15块96孔细胞培养板中，然后置于37℃，5% CO2培养箱中进行培养，7～10天后使用HT培养基进行半量换液。
结果如下：
在融合后第6天观察可见融合细胞透亮聚集在一起，待长至孔1/3～2/3 时即10 天左右时，可以用微量移液器吸取少量杂交瘤细胞上清进行阴阳性检测。
2. 阳性克隆的筛选鉴定与克隆
用猪瘟抗体检测试纸条对大量的杂交瘤细胞孔进行初步筛查，同时设有阳性小鼠血清、阴性小鼠血清、不相关的单抗上清及HT培养基空白对照等。将初步筛选的阳性克隆转孔到铺有饲养细胞的24孔细胞培养板中。当杂交瘤细胞占24孔细胞培养板底部约60%时，可进行复检。复检后的强阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆。亚克隆时，用台盼蓝染色法对杂交瘤细胞进行计数，使用HT培养基对细胞作连续稀释，使细胞终浓度控制在0.5个细胞/孔。将克隆的细胞按100µL/孔的量加至铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，补加培养液于每孔中，然后置于37℃、5% CO2培养箱中培养。两个星期左右，观察各板单克隆细胞生长情况，此时大多数孔应无细胞，大部分是单克隆，极少数孔可能存在两个甚至多个克隆。将生长起来的各孔进行筛选检测后，挑取阳性单克隆细胞转入24孔细胞培养板进行扩大培养，并将有效的阳性单克隆制备腹水。为保证单克隆的均一性，对此步筛选出的阳性单克隆细胞株再次通过有限稀释法进行克隆化3～5次。3. CSFV单克隆抗体腹水的大量制备及效价测定
首先将无菌的液体石蜡注入8周龄左右的BALB/c雌性鼠腹腔，每只鼠注射0.5mL，7～10天后即可使用，腹水注射前，将细胞瓶中的单克隆阳性细胞，1200rpm离心5min，沉淀以无菌PBS洗涤并离心，以200µL PBS重悬细胞，细胞数量约0.5～1.0×107，然后进行腹腔注射。注射后每日观察腹水产生情况及小鼠精神状况，大约7～10天在小鼠腹部会出现明显肿胀且腹部皮肤紧绷时采集腹水，5000rpm离心5min以去除细胞沉淀与其它杂质，用间接ELISA方法测定腹水的抗体效价，剩余腹水进行分装并保存于-80℃。
结果如下：
先采猪瘟抗体检测试纸初筛，阳性率在60%，由于阳性孔较多，又采用间接ELISA 方法再一次筛选出反应性较强的融合细胞孔，反应强阳性比率约20%，采用有限稀释法对选择出来29个强阳性细胞株进一步亚克隆，克隆结果出现100%的阳性率时，说明亚克隆到能够稳定分泌单克隆抗体的细胞。这29株单克隆抗体分别命名为24A3、21D11、9A6、3A9、19A8、20D4、10F1、13H8、8C3、15A10、19D2、11E12、1F8、37H9、46E2、41D11、50H6、42A5、22A2、7A4、9B7、36B2、36B11、31E12、17E12、17E9、18G2、15F4、9B7。随机挑选8 株单克隆细胞株进一步大量生产腹水，分别为21D11、9A6、3A9、19A8、10F1、13H8、15A10、11E12。如图7所示，经过IPMA 试验反复验证，同时用正常PK-15细胞为对照，此8 株腹水均与猪瘟SM 强毒株反应。
4. 单克隆抗体Ig亚类和型的鉴定
10倍稀释待检的 8株单克隆细胞培养上清，分别取50μL稀释后的8株细胞培养上清依次加入各个反应孔中，然后加入50μL的羊抗小鼠Ig-HRP于对应的孔中，混匀后室温放置1h，洗涤3次后，加入TMB底物溶液显色5 min后加入等体积的终止液终止整个反应，用酶标仪测定各孔的 OD450值。
结果如下：
19A8、10F1 为IgG1，其余均为IgG2，其中11E12、9A6、3A9、13H8 为IgG2a，15A10、21D11为IgG2b。
5. MAbs的特异性和亲和力
（1）Westem-blot检测8株腹水分别与猪瘟病毒原核表达蛋白E0-E2融合蛋白及 E2蛋白的反应性，一抗分别为1:500稀释的8株腹水，室温作用1h后加入用 PBS稀释为1:1000的HRP标记的羊抗鼠IgG，作用条件与一抗相同，洗涤后AEC液显色。
（2）IPMA测定8株腹水与猪瘟SM毒株的反应性，采用间接 ELISA方法测定其与E0-E2融合蛋白的反应性。
（3）将冻存的8株单克隆细胞复苏，连续传代4个月，每五代收集一次杂交瘤细胞上清液，采用间接ELISA方法测定其抗体效价，观察不同代次间的杂交瘤细胞分泌抗体是否稳定。
（4）使用相加ELISA鉴定单抗9A6、15A10、11E12所识别的表位是否相同。测定前首先确定各株单抗与1.0μg/mL E2蛋白反应的饱和度，然后以此稀释度的单抗与E2蛋白进行反应，再使用羊抗鼠IgG-HRP作用TMB进行显色读取OD450值，计算相加指数 AI=[(2×A1+2/(A1+A2)-1)×100%；若AI>40%，说明单抗识别不同表位，AI<40%则表明单抗识别相同表位。
结果如下：
如图8 和图9所示：21D11、9A6、3A9、19A8、10F1、13H8、15A10、11E12均与E0-E2蛋白反应，不与无关蛋白反应，特异性较好；其中只有三株腹水9A6、15A10、11E12均与E2 蛋白反应，且15A10、11E12 的特异性较强。
采用IPMA 方法对21D11、9A6、3A9、19A8、10F1、13H8、15A10、11E12 8 株腹水与猪瘟SM 强毒株的效价进行测定，分别将8 株腹水进1：100、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000 稀释，分别与感染猪瘟SM 毒株及未感染的PK-15 反应，结果如表1所示：
表1 CSFV MAbs 的IPMA 效价测定
。
采用间接ELISA 方法对稳定单克隆细胞株扩大培养后的细胞上清以及腹水所得的效价测定结果见表2，细胞培养上清效价均在1：1.6×103，制备的8株腹水均具有较高的效价，其中11E12 mAb的效价能够达到1：1.28×106。
表2 抗体效价测定
。
利用叠加ELISA 将两次测定后的结果平均后得出E2单抗11E12和15A10识别相同的表位，单抗9A6识别与其余两株E2单抗表位不同的另一表位。如表3所示：
表3 CSFV E2 单抗识别的差异表位筛选
。
实施例三：猪瘟病毒结构蛋白E2 单克隆抗体阻断ELISA 方法
1. 小鼠腹水 IgG的纯化
将具有较高的效价且特异性地分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的 11E12杂交瘤细胞株制备的腹水使用辛酸硫酸铵沉淀法提取BALB/c小鼠的腹水IgG。继而使用 Pierce Protein GColumns (Thermo Scientific)对 IgG进行纯化，纯化后进行蛋白含量测定。
2. 辣根过氧化物酶（HRP）标记 IgG
采用简易过碘酸钠法将纯化的腹水 IgG与 HRP进行偶联。
3. 阻断 ELISA方法
纯化的E0-E2融合蛋白用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释成一定浓度后包被96孔ELISA板，37℃，2h；用pH 7.4的PBST洗涤3次后加入合适的封闭液进行封闭，洗涤3次后加入适当比例稀释的待检血清，l00 μL /孔，室温，2h后洗涤3次，加入与待检血清等体积的11E12-HRP，37℃，1h后洗涤3次，显色反应按ELISA常规操作进行，显色后立即读OD450值。
结果显示：
对单抗11E12 进行酶标后的单抗酶标物11E12-HRP 的ELISA 效价为1：5.0×105以上，IPMA效价1：8000。
4. 最优反应条件的选择
（1）抗原包被浓度及待检血清稀释度
应用棋盘滴定法对最优条件进行确定，首先将抗原蛋白E0-E2分别稀释至终浓度为5.0，2.5，1.25，0.625 μg/mL。CSFV阳性血清和阴性血清分别作1:1、1:2、1:5、1:10、1:50稀释以棋盘交叉式加入E0-E2蛋白包被孔中，试验结果重复3次。计算各组阳性血清的阻断率，公式为：
Inhibition(%)=（阴性OD450均值―阳性OD450值）/阴性OD450均值。
结果如表4所示，E0-E2蛋白最佳包被浓度为5.0μg/mL，血清稀释度1：1。
表4 抗原最佳包被浓度和待检血清最佳稀释度
。
（2）封闭液
分别选用5%脱脂奶、1%BSA、1%OVA和2%明胶这四种常用的封闭液进行封闭，包被抗原及稀释阴阳性血清，阻断 ELISA方法测定OD450值。
结果如表5所示，阻断效果最好的封闭液为1% BSA。
表5 封闭液旳确定
。
（3）封闭时间
分别选用 37℃、1h及 2h和 4℃、12h及18h各两个不同温度各两个时间段进行封闭。抗原包被浓度及阴阳性血清稀释度和封闭液均采用上述的最佳条件进行，阻断 ELISA方法测定OD450值。
结果如表6所示，以含1%BSA的PBST作为封闭液，从表6的结果可以看出，37℃ 封闭的效果好于4℃，且37℃封闭1h 时的阻断率较高，因此，37℃、1h 为最佳的封闭条件。
表6 封闭时间和温度的确定
。
（4）待检血清作用时间
设立待检血清的作用条件包括两个温度，每个温度包括两个时间段，分别是 37℃ 1h、2h和 4℃ 1h、2h，抗原包被浓度及阴阳性血清稀释度、封闭液及封闭时间均采用上述的最佳条件进行，阻断 ELISA方法测定OD450值。
结果如表7所示，待检血清的最优反应条件是37℃作用2h。
表7待检血清最佳作用时间及温度的确定
。
（5）酶标单抗工作浓度
设定1：2000、1：4000、1：8000、1：16000这4个不同的酶标单抗工作浓度，按照上述确定的最佳工作条件进行反应，阳性血清阻断率最高时的酶标单抗工作浓度为最佳的工作浓度。
结果如表8所示，稀释度为1：2000和1：4000时测定的阻断率相差不大，但为了节省单抗11E12的使用量，选择稀释倍数高的1：4000为酶标单抗11E12的最佳稀释度。
表8 酶标单抗最佳稀释度的确定
。
（6）酶标单抗孵育时间
设定不同的酶标单抗作用时间：37℃分别作用0.5 h、1h、1.5 h和2h，按照上述确定的最佳工作条件进行反应，选择阳性血清阻断率较高时所使用的酶标单抗作用时间。
结果如表9所示，11E12-HRP作用1 h时比其余时间作用条件下的阻断率大。
表9 酶标单抗最佳稀释度的确定
。
（7）底物最佳显色时间旳选择
按照上述最佳优化反应条件进行试验，在加入TMB显色液后，分别在显色5min、10min、15min和20min时终止反应，读取OD450，比较各个显色时间的阳性阻断率，确定最佳的显色时间。酶标抗体按最佳条件作用后，洗涤ELISA板，加入酶作用底物，37℃分别作用5min、l0min、15min，用2mol/L的H2SO4 100μL /孔终止后读数，计算各组阳性血清阻断率，以确定最佳底物作用时间。
结果如表10所示，优化确定的底物作用时间为5min 时结果最好。
表10 底物最佳反应时间的确定
。
（8）临界值
取40份商品化ELISA试剂盒检测及IPMA检测均为阴性的猪临床血清进行E2单抗阻断ELISA检测，计算阻断率的均值和标准方差，确定最佳临界值。公式为：Inhibition(%)=（阴性OD450均值―阳性OD450值）/阴性OD450均值。
结果如表11所示，利用Blocking-ELISA对40份CSFV阴性猪血清进行检测后，得出PI的平均数（X）=7.48%，标准方差（SD）=12.45；根据公式Positive cut-off value= X +3SD得出阳性临界值为34.89%，根据Negative cut-off value= X +2SD 得出阴性临界值为27.41%。
表11 阻断ELISA临界值的确定
。
5. 猪瘟抗体阻断ELISA的性能测定
（1）特异性试验
检测几种常见的猪病毒病阳性血清：BVDV、PRRSV、PCV2、FMDV、JEV及PRV阳性血清，检验本研究建立的猪瘟单抗阻断ELISA法同这些病毒抗体有无交叉反应。
结果如表12所示，建立的猪瘟单抗阻断ELISA 与其它阳性血清无交叉反应。
表12 阻断ELISA临界值的确定
。
（2）敏感性试验
选取强阳性、弱阳性、阴性不同抗体水平的50份CSFV阳性血清（IDEXX公司的猪瘟抗体试剂盒的检测），按照本研究建立的猪瘟单抗阻断ELISA的最优条件进行检测，并设阴阳性对照。
结果如表13所示，分别用建立的阻断ELISA和商品化IDEXX阻断ELISA试剂盒进行检测100份临床送检血清，比较两者的符合率和相对敏感性。结果建立的阻断ELISA与商品化IDEXX 阻断ELISA 试剂盒符合率为93.02%，同时也具有良好的敏感性。利用IPMA对可疑的6份样品进行再次检测的结果显示，6 份可疑样品中存在4 份阳性样品。
表13单抗阻断ELISA 与商品化试剂盒的应用对比
。
（3）重复性试验
取CSFV阳性临床血清3份和1份阴性血清，同一酶标板内每份血清各做3个重复，并分别使用3个批次的酶标板进行检测，最后分别计算批内和批间变异系数（CV %），确定ELISA的重复性。
将6 份血清样品分三次试验在同种条件下检测，每个样品重复3次，所得阻断ELISA的批内CV为1.15%～6.81%，批间CV为1.39%℃～9.06%，重复性良好。
6. 临床应用
应用建立的CSFV单抗阻断ELISA检测方法分别对一个免疫后猪场及另外一个未免疫猪场送检血清进行了检测，并随机抽取河南省不同地区随机送检的399份临床血清进行检测，结果表明本研究建立的单抗阻断ELISA 可满足临床应用；从表14可看出，免疫后的猪场送检血清样品中的阳性率高达97.8%，而未免疫猪场的抗体阳性率则达6%，说明猪场采用的疫苗免疫能够有效的诱导产生特异性抗体，进而能够在预防CSFV感染或流行。
表14阻断ELISA 对猪场送检血清中CSFV 抗体的检测结果
。
从表15可看出，最高PI为94.11%，总体阳性率在81.70%，该Blocking-ELISA方法能够很好的应用于对强阳性血清的PI 检测。
表15阻断ELISA 对猪场送检血清中CSFV 抗体的检测结果
。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims (10)

1.一种高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备免疫原：培养猪瘟病毒后，采用先切向流超滤浓缩，后过琼脂糖凝胶过滤层析柱的方法将猪瘟病毒纯化；
（2）以所述浓缩和纯化后的免疫原免疫小鼠；
（3）融合所述小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；
（4）采用先猪瘟抗体检测试纸检测，再IPMA检测结合间接ELISA的方法筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆；
（5）对阳性克隆进行克隆化培养，得猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；
（6）将所述杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔生产单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述切向流超滤时，真空泵进口压力为0.1MPa，回流压力为0.05MPa，样品反复被50kDa超滤膜截留收集于收样杯中，直至浓缩体积至20mL。
3.根据权利要求1所述的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述琼脂糖凝胶过滤层析柱为Sepharose 4 Fast Flow，流速为0.3 mL/min。
4.根据权利要求1所述的高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述间接ELISA的方法包括以下步骤：
a. 包被：使用0.05M CBS将 E0-E2融合蛋白包被于96孔板，每孔100µL，4℃包被过夜；
b. 封闭：用5%脱脂奶封闭，37℃作用1h，PBST洗涤三次；
c. 样品：使用PBS稀释杂交瘤上清等进行检测，每孔100µL，37℃，30min后，PBST洗涤三次；
d. 酶标二抗的反应：每孔加入100µL 1：1000倍稀释的羊抗猪或抗鼠的酶标二抗，37℃，30min后，PBST洗涤三次；
e. 显色与终止：将TMB显色试剂每孔加入100µL，显色5min后加入2M H2SO4终止反应，测定OD450值。
5.一种权利要求1所述高效价抗CSFV单克隆抗体的制备方法制备的抗CSFV单克隆抗体在CSFV定性或定量检测中的应用。
6.一种由权利要求1所述制备方法制备的抗CSFV单克隆抗体所制备的检测CSFV的阻断ELISA试剂盒。
7.根据权利要求6所述检测CSFV的阻断 ELISA试剂盒，其特征在于，其中抗原包被的浓度为0.625～5μg/mL，待检血清稀释度为1：1～50。
8.根据权利要求6所述检测CSFV的阻断 ELISA试剂盒，其特征在于，其中封闭液为5%脱脂奶、1%BSA、1%OVA、2%明胶中的至少一种。
9.根据权利要求6所述检测CSFV的阻断 ELISA试剂盒，其特征在于，其中酶标单抗的浓度为1：2000～16000，酶标单抗的孵育时间为0.5～2h。
10.根据权利要求6所述检测CSFV的阻断 ELISA试剂盒，其特征在于，其中底物显色的作用时间为5～20min。
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