ES2625065T3

ES2625065T3 - Método de detección de bacterias en la leche

Info

Publication number: ES2625065T3
Application number: ES12797927.6T
Authority: ES
Inventors: Sietze Sietzema
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: WO2013083754A1; EP2788765B1; EP2788765A1; US20140287428A1; CN104126123A; CA2858119A1; CN104126123B

Abstract

Método de detección de la presencia de bacterias en la leche, en donde la leche es puesta en contacto con una preparación que comprende una cantidad eficaz de al menos un tipo de anticuerpos, siendo dichos anticuerpos capaces de fijarse específicamente a las bacterias a detectar; antes o después de dicha puesta en contacto se colorean dichos anticuerpos con una preparación colorante, siendo dicha preparación colorante seleccionada de forma tal que los anticuerpos coloreados con la misma presentan un cambio de color o un cambio de la concentración de color al estar en contacto con dichas bacterias; y se determina la concentración de anticuerpos coloreados fijados a bacterias en dicha leche a partir de la presencia y/o de la intensidad relativa del cambio de color que se ocasiona al poner a dicha leche en contacto con dichos anticuerpos coloreados; caracterizado por el hecho de que dicha preparación comprende más de un tipo de anticuerpos, fijándose cada tipo de anticuerpos específicamente a un tipo distinto de bacterias o a una pluralidad de tales tipos de bacterias, en donde el cambio de color es detectado, cualitativa y/o cuantitativamente, sin separar las bacterias de la leche, usando un colorante fluorescente para anticuerpos y un citómetro de flujo como detector.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de deteccion de bacterias en la leche Antecedentes de la invencion

[0001] Ciertas bacterias ocasionan enfermedades, especialmente mastitis, en las vacas lecheras, cuya enfermedad puede afectar negativamente la calidad de la leche. Asf p. ej., la mastitis es una enfermedad infecciosa en la ubre o los pezones de una vaca individual, y en la leche producida por tales vacas estaran generalmente presentes bacterias de mastitis. Pueden ser varios los distintos tipos de bacterias que intervengan ocasionando mastitis, es decir que no hay un solo tipo o una sola cepa de bacteria de mastitis, sino muchos. Los tipos de bacterias que ocasionan mastitis generalmente vanan segun los casos.

[0002] Puesto que especialmente en las operaciones de produccion de productos lacteos a escala industrial los productos lacteos son generalmente producidos mezclando la leche de una pluralidad de vacas, dichos productos contendran cierta cantidad de germenes indeseables, como p. ej. bacterias productoras de mastitis, cuando algunas vacas esten infectadas, aunque la mayona de las vacas que generan la leche esten sanas. Sin embargo, no son predecibles a priori los tipos y las concentraciones de las celulas bacterianas comprendidas en la leche infectada que termine siendo mezclada con la leche finalmente reunida.

[0003] La mastitis es controlada por el gobierno en muestras de leche para el control del pago. Una concentracion demasiado alta de bacterias en la leche suministrada es una indicacion de mastitis, de forma tal que el productor de leche obtiene tan solo un precio mas bajo por unidad cuantitativa de leche suministrada. Tras varios suministros con una alta cuenta de celulas bacterianas, el suministro de leche puede ser incluso de hecho prohibido.

[0004] Cuando se produce mastitis, los veterinarios (o los productores de leche) vienen a menudo usando un coctel de antibioticos a fin de matar y/o desmembrar las bacterias, en la esperanza de que el coctel cubra el espectro bacteriano realmente presente, pero sin determinar inicialmente que tipos de bacteria estan de hecho interviniendo. En el peor de los casos se usan unos tras otros o bien simultaneamente antibioticos incorrectos, o antibioticos no espedficamente adecuados para ese tipo particular o esos tipos particulares de bacterias.

[0005] Este uso incontrolado de antibioticos viene ocasionando cada vez mas mutaciones bacterianas que presentan una incrementada inmunidad contra los antibioticos. Esta es una situacion peligrosa tambien para la salud publica.

Breve Exposicion de la Invencion

[0006] Es un importante objetivo de la invencion el de crear un metodo perfeccionado para detectar bacterias de distintos tipos en la leche, especialmente en un sistema de deteccion (total o al menos parcialmente) automatica. En realizaciones preferidas, la invencion permite la deteccion selectiva y espedfica de bacterias o tipos de bacterias, y prominentemente entre los mismos, de bacterias productoras de mastitis. La invencion permite tal deteccion espedfica tambien cuando esta presente en la leche mas de un tipo de bacteria, puesto que permite la deteccion de varios distintos tipos de bacterias consecutiva o simultaneamente. El metodo inventivo ademas hace posible determinar el tipo o los tipos de bacterias que este/n ocasionando la infeccion, tal como p. ej. la mastitis, a fin de estar en condiciones de seleccionar y dosificar los antibioticos correctos a administrar a la vaca.

Estos y otros objetivos son alcanzados por el contenido definido en las reivindicaciones adjuntas.

[0007] Mas espedficamente, un metodo perfeccionado para detectar bacterias en la leche incorpora los pasos definidos en la reivindicacion 1. La leche es puesta en contacto con una preparacion que comprende una cantidad eficaz de mas de un tipo de anticuerpos, fijandose cada tipo a un distinto tipo de bacterias a detectar, o a una pluralidad de tales tipos; antes o despues de dicha puesta en contacto, dichos anticuerpos son coloreados con una preparacion colorante, siendo dicha preparacion colorante seleccionada de forma tal que los anticuerpos coloreados con la misma presentan una diferencia de concentracion de color y/o un cambio de color al quedar en contacto con dichas bacterias. La concentracion de anticuerpos coloreados fijados a las bacterias en dicha leche es determinada a partir de la presencia y en su caso de la intensidad relativa del color producido poniendo a dicha leche en contacto con dichos anticuerpos coloreados sin separar las bacterias de la leche, usando un colorante fluorescente para anticuerpos y un citometro de flujo como detector. Estos pasos pueden usarse en cualquier secuencia adecuada, en donde generalmente, sin embargo, el paso de utilizar la concentracion de color producida combinando los anticuerpos coloreados con las bacterias necesariamente ira a continuacion del paso en poner en contacto a dichos anticuerpos y dichas bacterias.

En realizaciones preferidas, el metodo inventivo comprende:

a dicho metodo, en donde dichos anticuerpos son capaces de fijarse espedficamente a bacterias productoras de mastitis;

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a dicho metodo, en donde dicha preparacion comprende mas de dos, mas preferiblemente mas de tres, aun mas preferiblemente mas de cuatro y con la maxima preferencia cinco o mas tipos distintos de anticuerpos, fijandose cada tipo espedficamente a un distinto tipo de bacteria o a una pluralidad de tales tipos.

[0008] El cambio de color y/o el cambio de concentracion puede ser usado para determinar el tipo de celulas, especialmente bacterias, presente en la leche, y preferiblemente tambien para determinar la cantidad relativa de dichas celulas.

[0009] En la ciencia medica es del dominio publico la tecnica de detectar bacterias usando anticuerpos espedficos en tejidos y fluidos corporales. Son sin embargo de aplicacion a tales usos conocidos condiciones espedficas que situan a tales metodos conocidos aparte del metodo inventivo.

Descripcion Detallada

[0010] La mastitis redunda en una incrementada cantidad de bacterias por unidad de peso o volumen de leche. Las bacterias pueden ser contadas por el principio del citometro de flujo por medio del uso de tecnica de fluorescencia.

Tecnica de fluorescencia significa en este caso que las bacterias son combinadas (y por consiguiente se las hace reaccionar) con un anticuerpo adecuadamente coloreado y la combinacion es pasada por una celda de flujo donde bajo la influencia de luz de fluorescencia las celulas individuales combinadas con los anticuerpos dan un pulso de luz. El numero de pulsos de luz es detectado y esta en correlacion con el numero de celulas bacterianas.

[0011] Hay varios grupos de bacterias que producen mastitis. La invencion se basa en el hecho de que anticuerpos espedficos se fijan tan solo a tipos espedficos de bacterias. Con estos datos es posible identificar distintas bacterias por medio del uso de distintos anticuerpos.

Es posible usar un unico tipo de anticuerpo para detectar y medir la concentracion de basicamente un unico tipo de bacteria. Sin embargo, puesto que generalmente intervendra mas de un tipo de bacteria, y a menudo no hay informacion a priori de que clases de bacterias se encontraran, es preferible anadir hasta 5 (o incluso mas) clases distintas de anticuerpos a una muestra de leche. Preferiblemente, estos seran seleccionados para abarcar los tipos mas comunes de bacterias que se encuentran en la practica. Cada grupo de anticuerpos es previamente coloreado con un correspondiente numero (de hasta 5 o mas) de distintas soluciones colorantes espedficas. P. ej., el uso de 5 coloraciones distintas hace que sea posible que esten presentes 5 colores distintos, y estos pueden ser detectados individualmente por el espedfico Metodo 1 A.

Metodo 1 A

[0012] Cuando anticuerpos coloreados rodean bacterias (unidos o fijados a las mismas) en una muestra de leche, el color de la leche (o leche clarificada) cambia bajo la influencia de las bacterias. Este cambio de color puede ser detectado por un espedfico detector de colores.

[0013] Al pasar las bacterias por una celda de flujo provista de uno o varios distintos detectores de colores (luz de fluorescencia), el numero de bacterias puede ser contado sobre la base del cambio de color ocasionado por los anticuerpos coloreados.

Este cambio de color es dependiente del tipo de anticuerpos coloreados. Los anticuerpos que se usen pueden ser particularmente seleccionados para un tipo particular de bacteria, si el mismo es ya conocido. Generalmente es sabido que tipo o tipos de bacterias producen la mastitis, y la eleccion de anticuerpos coloreados estara generalmente basada en este conocimiento. De esta manera puede detectarse y medirse que tipo de bacteria esta produciendo en la vaca una enfermedad, como p. ej. la mastitis.

Metodo 1 B

[0014] Anticuerpos coloreados que se fijan a espedficas bacterias no coloreadas en una muestra de leche produciran bajo la influencia de luz de fluorescencia en un citometro de flujo un pulso de luz. Debido al hecho de que varios anticuerpos se fijaran a una sola bacteria, hay una diferencia en los pulsos de salida de luz entre un unico anticuerpo libre en la muestra de leche y pluralidades de anticuerpos en torno a las bacterias que pasan por el citometro de flujo, y por consiguiente las bacterias pueden ser detectadas por medio de la distinta intensidad de pulsos de luz producida.

Metodo 1 C

[0015] Usando el principio de anticuerpos fijados a bacterias, como se ha expuesto en el Metodo 1 A y en el Metodo 1 B, la deteccion puede ser tambien realizada filtrando la muestra de leche. Para detectar las bacterias en la muestra de leche rodeadas de anticuerpos (unidas o fijadas a los mismos), la muestra de leche puede ser microfiltrada de forma tal

que todas las bacterias, rodeadas o no rodeadas por anticuerpos, quedaran en la superficie del filtro. En la superficie del filtro puede usarse un microscopio o cualquier otro sistema de deteccion, de fluorescencia o no de fluorescencia, para identificar o reconocer las bacterias rodeadas de anticuerpos.

5 [0016] El citometro de flujo preferiblemente tiene 5 o mas detectores de colores distintos. Estos detectores reaccionan a

5 colores distintos. Cuando un flujo de bacterias coloreadas pasa por el objetivo del microscopio, habra un numero de pulsos en correspondencia con el numero de bacterias que pasan.

[0017] Cuando entre las bacterias coloreadas se detecten tambien pulsos (aprox. del mismo tamano) con distintos 10 colores, esto es una indicacion de reaccion de anticuerpos en una mastitis producida por distintas bacterias, y con ello puede hacerse la seleccion de antibioticos.

Claims

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EP 2788765

REIVINDICACIONES

Metodo de deteccion de la presencia de bacterias en la leche, en donde la leche es puesta en contacto con una preparacion que comprende una cantidad eficaz de al menos un tipo de anticuerpos, siendo dichos anticuerpos capaces de fijarse espedficamente a las bacterias a detectar;

antes o despues de dicha puesta en contacto se colorean dichos anticuerpos con una preparacion colorante, siendo dicha preparacion colorante seleccionada de forma tal que los anticuerpos coloreados con la misma presentan un cambio de color o un cambio de la concentracion de color al estar en contacto con dichas bacterias; y se determina la concentracion de anticuerpos coloreados fijados a bacterias en dicha leche a partir de la presencia y/o de la intensidad relativa del cambio de color que se ocasiona al poner a dicha leche en contacto con dichos anticuerpos coloreados; caracterizado por el hecho de que dicha preparacion comprende mas de un tipo de anticuerpos, fijandose cada tipo de anticuerpos espedficamente a un tipo distinto de bacterias o a una pluralidad de tales tipos de bacterias, en donde el cambio de color es detectado, cualitativa y/o cuantitativamente, sin separar las bacterias de la leche, usando un colorante fluorescente para anticuerpos y un citometro de flujo como detector.

El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichos anticuerpos son capaces de fijarse espedficamente a bacterias productoras de mastitis.

El metodo de la reivindicacion 2, en donde dicha preparacion comprende mas de dos, mas preferiblemente mas de tres, aun mas preferiblemente mas de cuatro y con la maxima preferencia cinco o mas tipos distintos de anticuerpos, fijandose cada tipo espedficamente a un tipo distinto de bacterias o a una pluralidad de tales tipos.

El metodo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cambio de color es usado para determinar el tipo o los tipos de bacterias en la leche, y preferiblemente tambien para determinar la cantidad relativa (concentracion) de dichas bacterias.