CN101634654A - 一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法及其应用装置 - Google Patents

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姜新
崔玉君
邵传明
张鹏
顾贵波
崔漓波
葛宝伟
李微荞
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Abstract

一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法及其应用装置属农业领域兽医专业。本发明就是提供一种适于现场使用的病毒血凝抑制试验工作液的生产方法及其应用装置。本发明包括柠檬酸钠100g－300g、葡萄糖400g－600g、氯化钠150－170g、氯化铬1－5g、叠氮钠10g－20g，加入1000ml水中，以NaOH调pH至7.0。本发明的装置，包括箱体，箱体是由箱盖、具有提手的箱底组成，其结构要点箱盖的挡板内设置有平板玻璃；箱底上设置有检测工具盒，检测工具盒内设置有分隔，分隔内设置有药剂瓶、微量吸液器、血凝反应板、离心管、离心管架、吸管、平皿、具有灯泡的鸡白痢检测器。

Description

一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法及其应用装置
技术领域：
本发明属农业领域兽医专业，特别涉及含血凝素(HA)的动物病毒抗体监测用的血凝抑制试验工作液的生产方法及其应用装置的改进。
背景技术：
含血凝素的动物病毒如鸡新城疫、禽流感、鸡产蛋下降综合症都是严重危害养殖业发展的病毒性传染病。通过免疫监测确定最佳免疫时机，适时免疫接种是当前控制这几种重大传染病发生的最好方法。血凝抑制(HI)试验是目前国际动物卫生组织(OIE)推荐的进行鸡新城疫和禽流感等抗体检测的金标准，也是中华人民共和国国家标准规定的含血凝素病毒的抗体检测标准。但是，这种HI试验需要用SPF(无特定病原)或不免疫公鸡血制备1％鸡红细胞悬液(指示剂)。SPF鸡的饲养需要有专门的SPF鸡舍和严格的饲养条件；不免疫鸡的饲养也存在着发生疫病的风险，且禽流感等疫病不免疫需经省级兽医行政主管部门批准；采血时需要用阿氏(Alsevers)液(主要成份为抗凝剂)，需要离心红细胞配制1％红细胞悬液。洗涤用PBS或生理盐水，需要10ml×6转子和1.5×24(或12)转子的小型离心机各一台；需要分离血清，除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；整个试验大约需要4个小时。通常测试步骤如下：
(1)、血清分离：
用2ml或5ml注射器，被检鸡翅静脉采血2-3ml，室温静置数小时或离心2000r/min 10min左右至析出血清。
(2)、1％红细胞悬液制备：
采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2，0.01mol/l.PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成体积分数为1％红细胞悬液，4℃保存备用。
(3)、抗原滴定与校正：
血凝试验(HA)操作术式
Figure S2008100124668D00021
注：第12孔为红细胞对照。
能使红细胞完全凝集(100％凝集，++++，不流淌)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位(HAU)。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。如果抗原标定错误，将直接影响试验结果，甚至如果抗原小于4个单位时整个试验都不成立，要从头再来。因此抗原稀释为4个单位后，一般还要进行校正。
(4)、HAU抗原校正：
Figure S2008100124668D00031
(5)、血凝抑制试验(HI)操作术式：
Figure S2008100124668D00032
注：第11孔为4HAU抗原对照，第12孔为红细胞对照。
现有测试方法存在以下缺点：方法繁杂、反应时间长、所用器材较多、采血困难等问题，因此，只用于小型化验室，不适于现场应用。
发明内容：
本发明就是提供一种适于现场使用的病毒血凝抑制试验工作液的生产方法及其应用装置。
本发明的病毒血凝抑制试验工作液的生产方法如下：
本发明包括柠檬酸钠100g-300g、葡萄糖400g-600g、氯化钠150-170g、氯化铬1-5g、叠氮钠10g-20g，加入1000ml水中，以NaOH调pH至7.0。
一种病毒血凝抑制试验工作液的应用装置，包括箱体，箱体是由箱盖、具有提手的箱底组成，其结构要点箱盖的挡板内设置有平板玻璃；箱底上设置有检测工具盒，检测工具盒内设置有分隔，分隔内设置有药剂瓶、微量吸液器、血凝反应板、离心管、离心管架、吸管、平皿、具有灯泡的鸡白痢检测器。
本发明的有益效果：
本发明的病毒血凝抑制试验工作液的生产方法是一种固定抗体稀释抗原的方法，预先将抗原在实验室进行标定，试验时只需采取被检鸡的一滴全血，省略了现有标准HI法的制备红细胞悬液、分离被检血清、标定抗原等一系列繁琐的准备工作和相应的设备与器材，鸡采血量从1毫升以上降至0.05毫升(1滴)，解决了现有方法雏鸡采血困难的问题；可将现有标准法的4小时以上缩短为本法的40分钟以内，又不影响试验结果的敏感性和特异性。可以装配成试剂盒，适用于现场室温下各日龄及各种类型养殖场鸡含血凝素病毒的抗体监测。
本发明的病毒血凝抑制试验工作液的应用装置：
(1)适于现场使用：
打开箱盖、可一目了然看到各种检测工具，取拿很是方便、实用；本检测应用装置采血容易，只需要一滴，而且反应时间较短，所用器材较少，因此携带方便；一个检测应用装置就相当于一个小型化验室，在普通养鸡户就可以应用。
(2)一机多用：
可检测鸡新城疫、禽流感、产蛋下降综合症、传染性法氏囊炎及鸡白痢等五种重大传染病。禽流感、鸡新城疫、产蛋下降综合症抗体监测所需时间从4小时以上降至40分钟以内，反应结果维持时间可长达十几个小时稳定不变(常规方法仅能维持不足20分钟)，鸡采血量从1毫升以上降至0.05毫升，除本盒外不需要其它的仪器设备；检测鸡传染性法氏囊炎抗体灵敏度可增加一个以上；由于在本检测装置中加入了光源，增加了检测鸡白痢凝集反应的清晰度，易于结果观察和最终诊断。
本发明的病毒血凝抑制试验工作液为专用工作液，具有反应稳定、清晰、准确等优点，可以长期保存使用，使用时用蒸馏水或去离子水20倍稀释即可。
应用本发明的病毒血凝抑制试验工作液进行的α全血血凝抑制试验方法术式：
(1)、抗原的标定
抗原只需每批标定一次，且如果抗原标定错误还可以根据重新标定的结果改正HI试验结果，不会前功尽弃。
(2)、将工作原液倒入100ml瓶内，加水至100ml，抗原按标注量用工作液稀释。
(3)、根据被检鸡数将稀释好的工作液移入离心管中，每管1ml。
(4)、针刺被检鸡翅下静脉，待出血后用微量吸液器吸取0.05ml，移入装有工作液的试管内反复抽吸3-5次将血液混合后备用。
用本发明进行免疫监测操作术式表
本发明与国内外同类现行技术指标的比较
Figure S2008100124668D00062
附图说明：
图1是本发明的应用装置的结构示意图。
具体实施方式：
水可为去离子水或蒸馏水。
本发明还包括磷酸二氢钾0-16g或磷酸氢二钠0-58g或氯化钾0-4g。
实施例1：
本发明的血凝抑制试验工作液的配制：将200g柠檬酸钠加入1000mL水中，水浴溶化后，再加入葡萄糖500g、氯化钠(NaCl)170g、氯化铬(CrCl3·6H2O)2g、叠氮钠(NaN3)10g，用NaOH调pH至7.0。
使用时作20倍稀释。
实施例2：
本发明的血凝抑制试验工作液的配制：将200g柠檬酸钠加入1000mL水中，水浴溶化后，再加入葡萄糖500g、氯化钠(NaCl)160g、磷酸二氢钾(KH2PO4)4g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)58g、氯化钾(KCl)4g、氯化铬(CrCl3·6H2O)2g、叠氮钠(NaN3)10g，用NaOH调pH至7.0。
使用时作20倍稀释。
实施例3：
本发明的血凝抑制试验工作液的配制：将200g柠檬酸钠加入1000mL水中，水浴溶化后，再加入葡萄糖500g、氯化钠(NaCl)170g、磷酸二氢钾(KH2PO4)13.6g、氯化铬(CrCl3·6H2O)2g、叠氮钠(NaN3)10g，用NaOH调pH至7.0。
使用时作20倍稀释。
一种病毒血凝抑制试验工作液的应用装置，包括箱体1，箱体1是由箱盖13、具有提手2的箱底3组成，箱盖13的挡板16内设置有平板玻璃18；箱底3上设置有检测工具盒19，检测工具盒19内设置有分隔8，分隔8内设置有药剂瓶5、微量吸液器11、血凝反应板17、离心管15、离心管架14、吸管9、平皿4、具有灯泡7的鸡白痢检测器6。
挡板16可由箱盖13内两侧的拉带12固定；挡板16的下方可设置两个工具袋10，放置笔和记录本，方便记录。
应用实例：
通过固定抗体稀释抗原的方法建立禽流感的α微量全血血凝抑制试验快速免疫监测方法。分别用本发明的病毒血凝抑制试验工作液和现有标准方法(β血凝抑制试验)测定鸡新城疫疫苗免疫鸡的血清HI抗体，通过30次成对设计对比试验和30次重复试验，比较两种方法的差异。试验结果见表1和表2。
表1应用本发明的病毒血凝抑制试验工作液进行的检测试验与现有标准法检测结果比较
Figure S2008100124668D00081
Figure S2008100124668D00091
表2鸡新城疫快速免疫监测方法重复试验结果
Figure S2008100124668D00092
由表1可以看出，进行30次成对设计对比试验，快速法和现有标准法检测结果差异均不显著。证明α全血法与现有标准HI试验同样准确可靠；由表2可见，30次重复试验结果全部差异不显著。证明用本发明的工作液监测禽流感的血清抗体浓度是可行的。
下面以鸡白痢实例说明一次检测过程：
(1)取平板玻璃18，划出3×3cm的方块；
(2)在每个方块中心滴一滴(0.02ml)结晶紫抗原；
(3)针刺鸡翅静脉，利用微量吸液器11吸取与抗原相同体积的一滴血液滴于抗原旁；
(4)利用微量吸液器11将抗原与新鲜血液混匀；
(5)将鸡白痢检测器6插上电源，平板玻璃18在灯泡7上方轻轻晃动，在2分钟内出现凝集块者为阳性反应，无凝集块者为阴性反应。

Claims (8)

1、一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法，其特征在于，包括柠檬酸钠100g-300g、葡萄糖400g-600g、氯化钠150g-170g、氯化铬1g-5g、叠氮钠10g-20g，加入1000ml水中，以NaOH调pH至7.0。
2、根据权利要求1所述的一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法，其特征在于，还包括磷酸二氢钾0-16g或磷酸氢二钠0-58g或氯化钾0-4g。
3、根据权利要求1所述的一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法，其特征在于，本发明的血凝抑制试验工作液的配制：将200g柠檬酸钠加入1000mL水中，水浴溶化后，再加入葡萄糖500g、氯化钠170g、氯化铬2g、叠氮钠10g，用NaOH调pH至7.0。
4、根据权利要求1或2所述的一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法，其特征在于，本发明的血凝抑制试验工作液的配制：将200g柠檬酸钠加入1000mL水中，水浴溶化后，再加入葡萄糖500g、氯化钠160g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钠58g、氯化钾4g、氯化铬2g、叠氮钠10g，用NaOH调pH至7.0。
5、根据权利要求1或2所述的一种病毒血凝抑制试验工作液的生产方法，其特征在于，本发明的血凝抑制试验工作液的配制：将200g柠檬酸钠加入1000mL水中，水浴溶化后，再加入葡萄糖500g、氯化钠170g、磷酸二氢钾13.6g、氯化铬2g、叠氮钠10g，用NaOH调pH至7.0。
6、一种病毒血凝抑制试验工作液的应用装置，包括箱体(1)，箱体(1)是由箱盖(13)、具有提手(2)的箱底(3)组成，其特征在于箱盖(13)的挡板(16)内设置有平板玻璃(18)；箱底(3)上设置有检测工具盒(19)，检测工具盒(19)内设置有分隔(8)，分隔(8)内设置有药剂瓶(5)、微量吸液器(11)、血凝反应板(17)、离心管(15)、离心管架(14)、吸管(9)、平皿(4)、具有灯泡(7)的鸡白痢检测器(6)。
7、根据权利要求6所述的一种病毒血凝抑制试验工作液的应用装置，其特征在于挡板(16)由箱盖(13)内两侧的拉带(12)固定。
8、根据权利要求6所述的一种病毒血凝抑制试验工作液的应用装置，其特征在于挡板(16)的下方设置两个工具袋(10)。
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