ES2875894T3 - Procedimiento de detección y de identificación directa por vía óptica de un microorganismo en una muestra biológica - Google Patents

Procedimiento de detección y de identificación directa por vía óptica de un microorganismo en una muestra biológica Download PDF

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Abstract

Procedimiento de detección de al menos un microorganismo presente en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento esencialmente las siguientes etapas: a) Poner en contacto en un primer recipiente, dicha muestra con al menos un medio de cultivo, b) Colocar dicho primer recipiente en condiciones adecuadas para permitir el crecimiento del o de los microorganismos, durante 6 a 48 horas; c) Poner en contacto en un segundo recipiente la totalidad o parte de la mezcla constituida por la muestra y el medio de cultivo, con un medio de reacción y un soporte de captura monobloque de dicho o dichos microorganismos, incluyendo dicho medio de reacción nutrientes, un sistema selectivo que permite aumentar la población de bacterias diana, un medio para revelar dicho o dichos microorganismos elegido de entre los colorantes y compuestos fluorescentes; d) Colocar el segundo recipiente en condiciones adecuadas para permitir el crecimiento del o de los microorganismos, e) Detectar, dentro de dicho segundo recipiente, la presencia del o de los microorganismos revelados por el medio de revelación y fijados sobre el soporte de captura, realizándose la detección en tiempo real.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de detección y de identificación directa por vía óptica de un microorganismo en una muestra biológica
La presente invención se refiere, en general, al campo del análisis, por ejemplo, del análisis biológico. Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de detección y de identificación directa de al menos un microorganismo por vía óptica en una muestra biológica, eventualmente enriquecida.
El análisis microbiológico requiere técnicas precisas y cuyo tiempo de obtención del resultado debe ser lo más corto posible.
En el campo médico, es necesario prever y diagnosticar el riesgo de infección: cuanto más rápido y preciso sea el diagnóstico, más eficaz es la atención de los pacientes y menor el riesgo de transmisión. El enfoque es similar para la salud animal.
En el campo agroalimentario, el problema es idéntico. Sin embargo, distingue:
• los microorganismos patógenos y sus toxinas, cuya investigación se aplica a materias primas, productos intermedios, productos acabados comercializados,
• los microorganismos no patógenos, utilizados como indicadores de calidad del proceso productivo, desde las materias primas hasta los productos acabados, a lo largo de la cadena, y
• las bacterias de interés tecnológico tales como los fermentos.
La detección rápida y precisa de sospechas de contaminación permite controlarlas y así emprender acciones correctivas.
Técnicamente, el análisis microbiológico puede implementar una o más fases de enriquecimiento previo y/o de enriquecimiento, una o más fases de detección, una o más fases de enumeración de microorganismos. Para aplicaciones específicas tales como el control microbiológico agroalimentario, también puede ser necesaria una fase de confirmación, con el fin de cumplir con las normas vigentes en este campo.
En la actualidad, no existe ningún método para detectar un microorganismo diana en una gran cantidad inicial de muestra, sin recurrir a una etapa de enriquecimiento.
La fase de enriquecimiento recurre a medios de cultivo, selectivos o no, cuyo objetivo es promover el crecimiento de microorganismos diana en muestras biológicas o medioambientales, limitando el crecimiento de las floras que no son diana. Los medios se utilizan a menudo en recipientes del tipo bolsa de plástico estéril, en los que se ponen en contacto con muestras alimentarias o ambientales, con el fin de volver a poner en suspensión y enriquecer los microorganismos buscados. Esta fase es necesaria con el fin de satisfacer las necesidades como la de revelar la potencial presencia inicial de al menos un microorganismo diana en una cantidad muy variable y eventualmente muy grande de muestra, por ejemplo, de 25 gramos (g) a 375 g diluidos en 225 a 3375 mililitros (mL) en el medio de cultivo. Al final de esta etapa de enriquecimiento, se toma una parte alícuota (de 5 microlitros (pl) a 5 mL) para implementar la etapa de detección de los microorganismos diana. Ahora bien, en esta parte alícuota, es necesario tener una cantidad suficiente de microorganismos diana para asegurar su detección sistemática. Entonces puede ser necesaria una etapa de enriquecimiento secundario o subcultivo. Vimont y col. (microbiología veterinaria, Elsevier BV, NL, vol 123 no 1 -3, 20 de julio de 2007, página 274-281) describe el estudio de diferentes condiciones de enriquecimiento que permiten el crecimiento simultáneo de Escherichia coli productoras de toxinas Shiga y de la microflora bacteriana habitualmente presente en las heces de ganado bovino.
La fase de detección se basa históricamente en el cultivo de microorganismos en medio de agar, para poner en evidencia los caracteres metabólicos de los microorganismos buscados. Convencionalmente se utilizan sustratos enzimáticos específicos. Estos sustratos enzimáticos generalmente se componen de dos partes, una primera parte específica de la actividad enzimática a revelar, también llamada parte diana, y una segunda parte que actúa como marcador, llamada parte marcadora, generalmente constituida por un cromóforo o fluoróforo. Al elegir estos sustratos, dependiendo de si hay o no reacción, es posible caracterizar la naturaleza de un microorganismo o discriminar entre diferentes grupos de microorganismos. Así, la aparición o desaparición de una coloración o de una fluorescencia será la firma de un género o de un tipo de microorganismos. A este respecto, el uso de medios cromógenos permite la detección e identificación simultánea de los gérmenes buscados. Simplifica el proceso y reduce significativamente el tiempo necesario para obtener el resultado. Como ejemplo concreto, se citarán los medios ChromID® del solicitante. Estos medios cromógenos se basan en la detección de caracteres metabólicos específicos de los gérmenes buscados como, por ejemplo, la actividad enzimática beta-glucuronidasa para Escherichia coli.
Otra de las tecnologías utilizadas para las pruebas de detección son los inmunoensayos. Recurren a las características inmunogénicas de los microorganismos buscados. De forma no exhaustiva, se pueden citar las técnicas de inmunofluorescencia, las técnicas ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), por competición o de tipo sándwich. Estas técnicas recurren a una etapa de revelación llamada indirecta que emplea un anticuerpo secundario conjugado a una enzima para su posterior detección a través de un sustrato específico de esta última.
El documento EP-B-1.440.316 describe, por ejemplo, un dispositivo que permite la detección de los microorganismos. Este dispositivo consta de un soporte sólido sobre el que se adhieren asociados de capturas específicas de los microorganismos diana, tales como anticuerpos. A continuación, el soporte de captura se coloca en diferentes recipientes que comprenden la muestra a analizar y los distintos reactivos para realizar una reacción ELISA. Esta etapa denominada de revelación indirecta implica (después de la etapa de enriquecimiento) a continuación, llevar a cabo diversas etapas de tratamiento (muestreo, calefacción, centrifugación, lavados, etc.) de la muestra antes de la etapa de filtración/detección, que tienen por consecuencia la mayor complejidad del protocolo operativo, la degradación de la practicidad del análisis y el aumento del tiempo de generación de los resultados.
Finalmente, las técnicas de biología molecular, basadas en los caracteres genómicos de los microorganismos buscados, también se utilizan para detectar e identificar los microorganismos diana. A modo de ejemplo, se citarán técnicas de amplificación clásicas, tales como la PCR (Polymerase Chain Reaction (“Reacción en cadena de Polimerasa”)) y la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification (“Amplificación Basada en Secuencia de Ácido Nucleico”)), que pueden ser acopladas a técnicas de detección en tiempo real conocidas para el experto en la técnica. Sin embargo, estas técnicas requieren una tediosa etapa de preparación de la muestra, que consiste en aislar los microorganismos, realizar la lisis para liberar los ácidos nucleicos y finalmente purificar estos últimos. Esto también tiene un efecto directo sobre la complejidad del protocolo operativo, la degradación de la practicidad del análisis y el aumento del tiempo necesario para generar los resultados.
La fase de confirmación, por su parte, está más particularmente ligada al análisis microbiológico en el campo agroalimentario. De hecho, cuando el resultado de los métodos desarrollados anteriormente es positivo, es necesario confirmar la presencia del patógeno buscado. Esto requiere una prueba adicional y el uso de un principio de detección diferente al utilizado durante el primer análisis. Las técnicas descritas anteriormente se utilizan mediante elección para la confirmación.
Por tanto, la identificación completa y precisa de un microorganismo en una muestra requiere el encadenamiento de varias etapas: enriquecimiento, eventualmente subcultivo, detección y confirmación. La estandarización de las pruebas utilizadas de forma rutinaria ha permitido automatizar los métodos de detección, que sin embargo siguen llevando mucho tiempo en su implementación. Un inconveniente del estado de la técnica es, de hecho, que estas etapas se llevan a cabo secuencialmente y requieren un gran número de manipulaciones que consumen mucho tiempo, lo que afecta al tiempo necesario para generar los resultados.
El documento FR 2928656 describe un procedimiento para la detección en tiempo real de microorganismos en un medio de cultivo por aglutinación. El documento WO2007/106936 describe un detector electroquímico que permite detectar un analito. Los documentos EP 0446972 y WO96/39533 describen un instrumento y un consumible que permiten la detección de microorganismos en una muestra, comprendiendo dicho consumible un medio de cultivo y un “sensor” de pH o de concentración de CO2.
Debido a los problemas técnicos planteados por el estado de la técnica considerado anteriormente, uno de los objetivos esenciales de la presente invención es proporcionar un método simplificado para la detección, identificación y confirmación de los microorganismos presentes en muestras, en particular agroalimentarias.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la detección e identificación de microorganismos, que permita reducir el tiempo y el coste necesarios para el análisis de la muestra.
En lo sucesivo, terminologías, tales como "objetivo u objetivos" y/o "modo de realización" se refieren a la divulgación y no forman parte de la invención más que si caen dentro del campo de aplicación de las reivindicaciones. El alcance de la protección está definido únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Estos objetivos entre otros se resuelven mediante la presente invención, que se refiere en primer lugar a un procedimiento de detección, de al menos un microorganismo, comprendiendo dicho procedimiento esencialmente las siguientes etapas:
a) Poner en contacto en un primer recipiente, dicha muestra con al menos un medio de cultivo,
b) Colocar dicho primer recipiente en condiciones adecuadas para permitir el crecimiento del o de los microorganismos, durante 6 a 48 horas;
c) Poner en contacto la totalidad o parte de la mezcla constituida por la muestra y el medio de cultivo con un medio de reacción y un soporte de captura monobloque de dicho o de dichos microorganismos en un segundo recipiente, incluyendo dicho medio de reacción nutrientes, un sistema selectivo que permite aumentar la población de bacterias diana, un medio de revelación de dicho o de dichos microorganismos elegido de entre los colorantes y compuestos fluorescentes;
d) Detectar en el interior de dicho primer o segundo recipiente la presencia del o de los microorganismos revelados por el medio de revelación y fijados sobre el soporte de captura, realizándose la detección en tiempo real.
Según la invención, el método incluye una etapa intermedia c') que consiste en colocar el segundo recipiente en condiciones adecuadas para permitir el crecimiento del o de los microorganismos.
Según un modo de realización particular, el procedimiento según la invención incluye una etapa adicional e) que consiste en confirmar la detección del o de los microorganismos detectados. Preferiblemente, la etapa e) de confirmación se lleva a cabo con ayuda de un medio de detección, idéntico o diferente del medio de revelación usado para la detección.
Ventajosamente, al menos un ligando de enlace, específico o no específico, del o de los microorganismos se fija sobre el soporte de captura. Según un modo de realización preferido de la invención, el ligando de enlace específico se toma del grupo que comprende: anticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos Fab', aptámeros, proteínas de fagos, ya sean recombinantes o no, los fagos o cualquier otro ligando bien conocido del experto en la técnica.
El soporte de captura puede ser cualquier soporte capaz de permitir la revelación de microorganismos. Se citarán los soportes monobloque, eventualmente porosos. Puede ser simplemente un soporte inerte, tal como una placa de material plástico o de fibra de vidrio. Según la invención, el soporte es un soporte monobloque. El soporte de captura puede sensibilizarse ventajosamente con un ligando de enlace, eventualmente específico. El soporte de captura también puede ser un soporte monobloque comprimible.
Ventajosamente, el soporte puede estar protegido mediante una película protectora.
Según otro modo de realización particular, es posible realizar la detección y la confirmación con la misma tecnología.
Según la invención, la detección del microorganismo o microorganismos se realiza en tiempo real.
Según un modo particular del procedimiento según la invención, el primer y/o el segundo recipiente es una bolsa de homogeneización. También pueden ser recipientes rígidos tales como matraces, botellas o recipientes para pastillas.
Según otro modo de realización particular del procedimiento según la invención, la etapa de detección se puede realizar con ayuda de un dispositivo de lectura. Un dispositivo de lectura de este tipo puede consistir, por ejemplo, en una cámara que apunta sobre el soporte de captura, permitiendo la grabación o análisis de imágenes de dicho soporte.
Los propósitos y ventajas de la presente invención se comprenderán mejor a la luz de la descripción detallada que sigue, en relación con el dibujo en el que:
La figura 1 es una representación esquemática de las diversas etapas del procedimiento según un primer modo de realización de la invención.
La figura 2 es una representación esquemática de un medio de captura sensibilizado.
La figura 3 es una representación esquemática del soporte de captura sensibilizado, representado en la figura 2, después de un análisis cuyo resultado es positivo.
Según un primer modo de realización de la presente divulgación, el procedimiento para detectar, o incluso identificar, un microorganismo consiste en utilizar una bolsa de homogeneización de plástico y estéril, denominada convencionalmente bolsa Stomacher®. Una bolsa de este tipo está referenciada con 10 en la figura 1A. Esta bolsa 10 consta de dos láminas de plástico sustancialmente rectangulares, unidas entre sí por tres de sus lados, de manera que delimitan un espacio interior destinado a recibir el medio de cultivo y la muestra a analizar. Incluye de manera accesoria un filtro 12 de forma sustancialmente rectangular y unido a las hojas, por un lado, separando el espacio interior en dos.
Durante la etapa A, la bolsa 10 de homogeneización, cerrada, se incuba con una muestra alimentaria 14, que consiste aquí en una muestra de queso de leche cruda. Esta muestra alimentaria 14 se sumerge en un medio 16 de enriquecimiento, que puede ser selectivo o no. La incubación se puede realizar a temperaturas entre 25 y 44 °C durante 6 a 48 horas.
A continuación, se extrae una fracción del medio de enriquecimiento de la bolsa 10 de homogeneización y se transfiere durante la etapa B a un recipiente secundario, que aquí está constituido por un tubo 20. Este tubo 20 incluye un medio 22 de reacción. Dicho medio 22 de reacción puede consistir en un diluyente (por ejemplo, caldo de sal de triptona) capaz de mantener la integridad de los microorganismos diana y de al menos un medio de revelación. El medio de revelación puede ser un colorante capaz de colorear los microorganismos presentes en la fracción de medio de enriquecimiento transferida y obtenidos de la muestra alimenticia 14. El medio de revelación también puede ser un compuesto fluorescente que hace fluorescentes a los microorganismos. En el caso de que se desee realizar un subcultivo en el tubo 20, el medio de reacción podrá contener, además de nutrientes, un sistema selectivo que permita aumentar la población de bacterias diana.
Según un ejemplo particular, el medio de revelación se basa en la reducción del cloruro de trifenil 2-3-5-tetrazolio (TTC) por microorganismos. Simultáneamente con el crecimiento de los microorganismos, el TTC (incoloro en su forma no reducida) es internalizado por dichos microorganismos, luego reducido dentro del citoplasma por estos últimos a trifenilformazano (rojo) coloreando así dichos microorganismos en rojo y permitiendo entonces su revelación sobre el soporte. Se pueden utilizar otras sales de tetrazolio (CTC, MTT, etc.). Además, se pueden añadir al medio de reacción compuestos que permitan acelerar la reacción de reducción de las sales de tetrazolio.
También se puede considerar utilizar colorantes membranosos, tales como el violeta de genciana o la fucsina.
En el caso de que el medio de revelación sea un compuesto fluorescente, puede tratarse de naranja de acridina o diacetato de fluoresceína.
En la etapa C, se coloca un soporte 24 de captura sensibilizado en el tubo 20 y se mantiene sumergido en el medio 22 de reacción por cualquier medio adecuado. El soporte 24 de captura sensibilizado se hace práctico con al menos un ligando de enlace específico de un microorganismo diana a detectar. El soporte de captura puede estar constituido por cualquier soporte capaz de permitir la fijación de ligandos de enlace específicos y bien conocidos por el experto en la técnica. A modo de ejemplo no limitativo, se puede fabricar un soporte de captura adecuado de poliestireno irradiado, tal como el comercializado por la empresa Nunc/Thermo Scientific (Cat. No. 472230). Un soporte de captura de este tipo se ha representado esquemáticamente en la figura 2, con la referencia 24. La parte inferior puede estar ventajosamente y según un modo de realización preferido, dividida en dos. La zona 241 de referencia se puede sensibilizar con una solución de ligandos de enlace (anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos Fab’ o Fab'2, aptámeros, proteínas de fagos), mientras que la parte superior 242 queda virgen de cualquier ligando de enlace y por tanto desempeña un papel de control negativo. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para sensibilizar los soportes mediante ligandos de enlace específicos.
Según una alternativa del procedimiento según la divulgación, puede ser ventajoso realizar una etapa de subcultivo, una vez que el soporte 24 de captura se ha sumergido en el medio 22 de reacción. Este subcultivo consiste en incubar el tubo 20 durante 1 a 18 horas, a temperaturas comprendidas entre 25 y 44 °C. Según esta alternativa, los microorganismos se colorean simultáneamente a su crecimiento gracias al medio de revelación contenido en el medio de reacción. El análisis se puede hacer entonces en tiempo real.
Una vez que la captura de una cierta cantidad de microorganismos diana coloreado o fluorescente (caso de una muestra positiva) es efectiva, se produce un cambio de las propiedades ópticas del soporte por aparición de una coloración o fluorescencia en éste (es decir, transducción de la señal biológica). Esta coloración o fluorescencia del soporte de captura es entonces detectable a simple vista o mensurable mediante el uso de un autómata de lectura, tal como una cámara. El soporte de captura se ha representado esquemáticamente en la figura 3, después de análisis, cuyo resultado es positivo. Como puede verse, la zona 241 aparece coloreada debido a la fijación de los microorganismos diana sobre los ligandos de enlace específicos. La zona 242 que desempeña el papel de testigo negativo, por su parte, sigue siendo del color inicial del soporte de captura.
Para facilitar la lectura, es preferible que el soporte de captura sensibilizado ya no esté en contacto con el medio de reacción. Para ello, se puede considerar, por ejemplo, retirar el soporte 24 de captura de dicho medio de reacción por cualquier medio adecuado, esto se ha representado claramente en la etapa D, en la figura 1. Como se explicó anteriormente, la lectura se puede realizar en punto final, en líneas de puntos o en tiempo real.
Según otra alternativa del procedimiento según la divulgación, el soporte de captura consiste en partículas sensibilizadas, es decir, que portan un ligando de enlace específico o inespecífico del microorganismo o microorganismos a detectar. La detección se pone entonces en evidencia preferiblemente por aparición de una coloración o fluorescencia de las partículas sensibilizadas inicialmente incoloras, por medio de los microorganismos diana unidos a estas últimas, durante la reacción.
Según un modo de realización particular, las partículas sensibilizadas pueden ser partículas magnéticas. Entonces, la lectura se puede realizar de forma manual y visual, mediante un sistema de imantación que permitirá la recogida de las partículas magnéticas sobre las que se capturan los microorganismos coloreados o fluorescentes, en forma de montones contra la pared del recipiente. Un desplazamiento del sistema de imantación verticalmente hacia arriba permite eliminar el montón de partículas magnéticas del medio de reacción y así facilitar el análisis. También se puede considerar sumergir el sistema de imantación directamente en el recipiente, con el fin de recoger las partículas magnéticas sobre las que se fijan los microorganismos. En este caso, las partículas magnéticas se adhieren directamente sobre el sistema de imantación que entonces se vuelve coloreado o fluorescente.
Según otro modo de realización del procedimiento según la divulgación, el medio de reacción y el soporte de captura, como se describió anteriormente, se añaden directamente al primer recipiente al final de la etapa de enriquecimiento. Por tanto, la etapa de detección se realiza en dicho primer recipiente sin transferir toda o parte de la mezcla constituida por el medio de cultivo y la muestra a analizar hacia un segundo recipiente. Antes de esta etapa de detección, opcionalmente se puede realizar un subcultivo para aumentar la población de microorganismos diana.
Cabe señalar que, ventajosamente, el soporte de captura se puede proteger con ayuda de una película protectora. El propósito de esta película es impedir el ensuciamiento del medio de captura. De hecho, es probable que tal ensuciamiento reduzca el rendimiento de captura de dicho soporte. Una película de este tipo puede colocarse de forma permanente sobre el soporte de captura. Alternativamente, puede tratarse de una película que tenga la capacidad de disolverse después de un cierto tiempo de contacto con el medio de cultivo líquido.
El procedimiento según la invención es particularmente ventajoso porque al final del análisis, sólo los recipientes identificados como positivos con ayuda del sistema de detección (descrito más adelante) se abren con el fin de realizar análisis complementarios de confirmación del presunto resultado obtenido. La etapa de confirmación puede realizarse mediante una tecnología diferente a la implementada en el procedimiento según la invención.
El objetivo de los ejemplos que se presentan a continuación es presentar diferentes modos de realización del procedimiento según la invención y los resultados obtenidos. No limitan en modo alguno la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Detección óptica de Salmonella Napoli, mediante el uso de un soporte sensibilizado, en una muestra alimentaria en subcultivo en un medio de reacción
El objetivo de este experimento es detectar directamente la presencia de la bacteria diana Salmonella Napoli en una muestra alimentaria en subcultivo en un medio de reacción, mediante el uso de un soporte sensibilizado, de poliestireno irradiado, comercializado por la empresa Nunc/Thermo Scientific. (Cat. No.472230) y representado en las Figuras 2 y 3.
Como se detalla a continuación, la detección se efectúa durante la fase de reacción mediante la inmersión del soporte de captura sensibilizado con una proteína de fago recombinante específica de Salmonella en un tubo que contiene la muestra enriquecida, diluida a 1/100ésima en el medio de reacción.
Protocolo:
Etapa 1: Nueva puesta en suspensión de las muestras en el medio de enriquecimiento primario
Se preparan dos muestras de la siguiente manera:
Muestra A: En una bolsa de homogeneización, 25 g de queso de leche cruda contaminados con 5 unidades formadoras de colonias (UFC) de Salmonella Napoli se vuelven a suspender en 225 mL de Agua con Peptona Tamponada (EPT) (bioMérieux, Ref 42043), complementados con 1 ml de Suplemento SPT (bioMérieux, Ref 42650);
Muestra B: En una bolsa de homogeneización, 25 g de queso de leche cruda no contaminados por Salmonella Napoli se vuelven a suspender en 225 mL de EPT (bioMérieux, Ref 42043) complementados con 1 mL de Suplemento SPT (bioMérieux, Ref.42650);
Etapa 2: Después de 16 horas de incubación, transferencia de una parte alícuota de 0,1 mL de la bolsa de homogeneización al tubo de reacción
0.1 mL de la bolsa de homogeneización Muestra A es transferido al tubo de reacción que contiene 10 mL de SX2 (bioMérieux, Ref.42121) y 1,6 g/L de TTC (bioMérieux, Cat. Núm. 04568088). Así se obtiene la Muestra A'.
Se realiza una operación análoga para la Muestra B.
Etapa 3: inmersión de los soportes sensibilizados en los tubos de reacción antes del subcultivo y reacción
El soporte de captura sensibilizado se coloca en cada tubo (Muestras A 'y B'). A continuación, los tubos se cierran y se incuban en una estufa a 37°C durante 6 h.
Etapa 4: Lectura de los soportes de captura al final del período de incubación
Al final de la incubación (6h a 37 °C) y después de la reducción no específica del TTC por todas las bacterias presentes en la muestra (es decir, que pertenecen a la flora anexa y a la flora diana), el medio de reacción se ha coloreado de rojo. Asimismo, para poder observar el soporte de captura que revela la positividad o negatividad de la muestra analizada, se inclinan los tubos para aislar dicho soporte de captura del medio de reacción.
De acuerdo con el plan experimental, el soporte de captura dispuesto en la muestra A' aparece de color rojo, lo que confirma que la muestra A’ es positiva mientras que el soporte de captura dispuesto en la muestra B' permanece incoloro, confirmando que la muestra B' es negativa. El análisis de estas mismas muestras por el método VIDAS® SPT, comercializado por el solicitante (ref. 30707) arrojó resultados similares, confirmando así los resultados obtenidos por lectura óptica del medio de captura sensibilizado.
Ejemplo 2: Detección óptica de Salmonella Napoli en una muestra biológica enriquecida, mediante el uso de un soporte sensibilizado sumergido en un medio de reacción
El propósito de este experimento es detectar directamente la presencia de la bacteria diana Salmonella Napoli en una muestra alimenticia enriquecida, mediante el uso de un soporte sensibilizado, de poliestireno irradiado, comercializado por la empresa Nunc/Thermo Scientific (Cat. No.472230) y representado en las figuras 2 y 3.
Como se detalla a continuación, la detección se efectúa durante la fase de reacción mediante la inmersión del soporte de captura sensibilizado con una proteína de fago recombinante anti-Salmonella en un tubo que contiene la muestra enriquecida, se diluida al 1/2 en el medio de reacción.
Protocolo:
Etapa 1: Volver a poner en suspensión muestras en el medio de enriquecimiento primario
Se preparan dos muestras de la siguiente manera:
Muestra A: En una bolsa de homogeneización, se vuelven a poner en suspensión 25 g de carne picada contaminada por Salmonella Napoli en 225 mL de EPT (bioMérieux, Ref. 42043) complementados con 1 mL de Suplemento SPT (bioMérieux, Ref 42650);
Muestra B: En una bolsa de homogeneización, se vuelven a poner en suspensión 25 g de carne picada no contaminada por Salmonella Napoli en 225 mL de EPT (bioMérieux, Ref 42043) complementados con 1 mL de Suplemento SPT (bioMérieux, Ref 42650);
Etapa 2: Después de 16 horas de incubación, transferencia de una parte alícuota de 1 mL de la bolsa de homogeneización al tubo de reacción.
1 mL de la bolsa de homogeneización de la Muestra A se transfiere al tubo de reacción que contiene 1 mL de sal triptona (bioMérieux, Ref 42076) complementado con 10 |jL de violeta de genciana (bioMérieux, Ref 55545). Se obtiene así la Muestra A'.
Se realiza una operación similar para la muestra B.
Etapa 3: inmersión de los soportes sensibilizados en los tubos de reacción antes de la reacción
El soporte de captura sensibilizado se coloca en cada tubo (Muestras A' y B'), como se describe a continuación. Luego, los tubos se cierran a continuación durante el período de reacción.
Etapa 4: Lectura de los soportes de captura al final del período de reacción
Al término de la reacción (40 min a temperatura ambiente), todas las bacterias presentes en la muestra (es decir, que pertenecen a la flora anexa y a la flora diana) se colorean en violeta. También para poder observar el soporte de captura que revela la positividad o negatividad de la muestra analizada, se inclinan los tubos para aislar dicho soporte de captura del medio de reacción.
De acuerdo con el plan experimental, el medio de captura dispuesto en una muestra A' aparece de color violeta, lo que confirma que la muestra A’ es positiva mientras que el soporte de captura dispuesto en la muestra B' permanece incoloro, confirmando que la muestra B' es negativa. El análisis de estas mismas muestras por el método VIDAS® SPT, comercializado por el solicitante (ref. 30707) condujo a resultados similares, confirmando así los resultados obtenidos mediante una lectura a simple vista del medio de captura sensibilizado.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de detección de al menos un microorganismo presente en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento esencialmente las siguientes etapas:
a) Poner en contacto en un primer recipiente, dicha muestra con al menos un medio de cultivo,
b) Colocar dicho primer recipiente en condiciones adecuadas para permitir el crecimiento del o de los microorganismos, durante 6 a 48 horas;
c) Poner en contacto en un segundo recipiente la totalidad o parte de la mezcla constituida por la muestra y el medio de cultivo, con un medio de reacción y un soporte de captura monobloque de dicho o dichos microorganismos, incluyendo dicho medio de reacción nutrientes, un sistema selectivo que permite aumentar la población de bacterias diana, un medio para revelar dicho o dichos microorganismos elegido de entre los colorantes y compuestos fluorescentes;
d) Colocar el segundo recipiente en condiciones adecuadas para permitir el crecimiento del o de los microorganismos,
e) Detectar, dentro de dicho segundo recipiente, la presencia del o de los microorganismos revelados por el medio de revelación y fijados sobre el soporte de captura, realizándose la detección en tiempo real.
2. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, que incluye una etapa adicional que consiste en confirmar la detección del o de los microorganismos detectados.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la etapa de confirmación se realiza utilizando un medio de detección, idéntico o diferente al medio de revelación utilizado para la detección.
4. Procedimiento de detección según una de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos un ligando de enlace específico o inespecífico del o de los microorganismos se fija sobre el soporte de captura monobloque.
5. Procedimiento de detección según la reivindicación anterior, en el que el ligando de enlace específico se toma del grupo que comprende: anticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos Fab', aptámeros, proteínas de fagos recombinantes o no, fagos.
6. Procedimiento de detección según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la detección del o de los microorganismos se realiza al final de la etapa de crecimiento de dicho o dichos microorganismos.
7. Procedimiento de detección según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer y/o el segundo recipiente es una bolsa homogeneizadora, un matraz, una botella o un recipiente para comprimidos.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte de captura es un soporte monobloque poroso.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el soporte de captura está protegido por una película protectora.
10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9, en el que el soporte de captura monobloque es un soporte comprimible.
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