CN104115010A - 通过光学路径检测和直接鉴定生物学样品中的微生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及分析领域，例如生物学分析。更具体地，本发明涉及一种检测至少一种存在于样品中的微生物的方法，所述方法主要包括下述步骤：a)在第一容器中，使所述样品与至少一种培养基接触；b)将第一容器放置于合适的条件下以允许一种或多种微生物的生长；c)在所述第一容器中或在第二容器中，使一些或全部包含所述样品与所述培养基的混合物与反应混合物和用于捕获所述微生物基材接触，所述反应混合物包含用于检测所述微生物的检测剂；d)在所述第一或第二容器中，检测通过检测剂所检测到的并固定在捕获基材上的微生物的存在。

Description

通过光学路径检测和直接鉴定生物学样品中的微生物的方法
本发明大体上涉及分析领域，例如生物学分析。更具体地，本发明涉及一种通过光学路径在生物学样品中检测和直接鉴定至少一种微生物的方法，任选地，所述生物学样品是富集的。
微生物学分析需要精确的方法，其中获得结果的时间需要尽量缩短。
在医学领域，预测和诊断感染的风险是必需的：诊断越快越精确，对病人的管理越有效，从而使传染的风险最小化。对于动物健康，方法是相似的。
在食品工业中有相同的问题。然而，在下列目标之间是有区别的：
-病原微生物及其毒素，其研究应用于原材料、中间产物和销售的最终产品，
-非病原微生物，其用作生产流程质量的指示物，从原材料到最终产品，贯穿生产链，以及
-技术上感兴趣的细菌，例如酵母。
快速而精确地检测可疑污染物，使得控制它们并实施矫正措施成为可能。
技术上，微生物学分析可以采用一或多个预富集和/或富集步骤，一或多个检测步骤，以及一或多个微生物计数步骤。对于特殊应用例如食品工业中的微生物学控制，可能也需要确认步骤，以便符合本领域的有效标准。
目前，没有不采用富集步骤，而在大初始量的样品中检测目标微生物的方法。
所述富集步骤采用选择性或非选择性培养基，其目的是促进生物学样品或环境样品中的目标微生物生长，同时限制非目标群(flora)的生长。培养基通常在消毒的塑料袋型的容器中使用，在其中所述培养基与食物样品或环境样品接触，从而对待测微生物进行重悬和富集。为了符合检测一些样品中的至少一种目标微生物的潜在的初始存在的要求，这一步是必需的，所述一些样品通常是可变的并且范围是很大的，例如25克(g)至357g稀释到225至3375毫升(mL)的培养基中。在富集步骤结束时，取一份富集产物(从5微升(μL)至5mL)实施检测目标微生物的步骤。现在，这一份富集产物必须包含足够量的目标微生物以确保其被系统地检测到。于是可能需要二次富集或再次培养的步骤。
从前，检测步骤是基于在琼脂培养基上培养微生物，以检测待测微生物的代谢特征。常规地，使用特定的酶底物。这些酶底物一般包含两部分，第一部分具有待测的酶活性的特异性，也称为目标部分，第二部分作为标记物，称为标记部分，通常包含发色团或荧光团。基于这些底物的选择，取决于是否有反应，可以表征微生物的特性或区分不同组的微生物。因此，染色或荧光的出现与否将是一个属或一类微生物的标志。在这方面，使用产色的培养基使得可以对待测微生物同时进行检测和鉴定。其简化了流程并极大缩短了获得结果的时间。举一个具体的实例，申请人的培养基。这些产色的培养基基于检测待测微生物的特定代谢特征，例如用于大肠杆菌(Esherichia coli)的β-葡萄糖醛酸酶酶活性。
免疫分析构成用于检测测试的另一种技术。其使用待测微生物的免疫特性。非穷举地，例如荧光免疫技术，ELISA(酶交联免疫吸附试验)技术，竞争性的或三明治型的。这些技术采用一种叫做间接检测的步骤，所述间接检测采用与酶缀合的二抗，通过所述酶的特异性底物进行后续检测。
例如文献EP-B-1 440 316描述了一种用于检测微生物的装置。该装置包括固体基材，其上固定了目标微生物特异性的捕获伴侣(partner)，例如抗体。随后将捕获基材置于包含待分析样品和进行ELISA反应的各种反应试剂的各种容器中。
这一称作间接检测的步骤涉及(在富集步骤之后)在筛选/检测步骤之前对样品执行各种处理步骤(取样、加热、离心、洗涤等)，结果导致操作方案更加复杂，分析更不方便，增加获得结果的时间。
最后，基于待测微生物的基因组特性，也采用分子生物学技术检测和鉴定目标微生物，例如，常规扩增技术诸如PCR(聚合酶链式反应)和NASBA(基于核苷酸序列的扩增)，其可以和本领域技术人员已知的实时检测技术结合。然而，这些技术所需的制备样品的步骤是费力的，其包括分离微生物，将其裂解以释放核苷酸，以及最后纯化核酸。这也对操作方案的复杂性有直接影响，使分析更不方便，增加获得结果的时间。
确认步骤尤其与食品工业中的微生物学分析有关。实际上，当之前开发的方法结果呈阳性时，需要确认待测病原的存在。这需要进行额外的测试并使用与第一次分析中所用的不同的检测原理。上述技术用于有空闲时进行确认。
因此完全且精确地鉴定样品中的微生物需要几个连续步骤：富集、任选地再次培养、检测和确认。标准化常规使用的测试使检测方法可以自动化进行，但仍需要花费很长时间。现有技术的缺点实际上是这些步骤顺序执行且需要大量费时的操作，因此影响获得结果的时间。
考虑到上述提到的现有技术存在的技术问题，本发明的一个主要目的是提供一种检测、鉴定和确认存在于样品中，尤其是食物样品中，的微生物的简化的方法。
本发明的另一个目的是提供一种检测和鉴定微生物的方法，其可以减少样品分析所必需的时间和成本。
其中，这些目的通过本发明实现。本发明首先涉及检测至少一种微生物的方法，所述方法主要包含以下步骤：
a)在第一容器中，使所述样品与至少一种培养基接触，
b)将第一容器放置于合适的条件下以使得一种或多种微生物的生长，
c)在所述第一容器中或在第二容器中，使一些或所有包含样品与培养基的混合物与反应混合物和基材接触用来捕获所述一种(多种)微生物，所述反应混合物包含用于检测所述微生物的检测剂(means)，
d)在所述第一或第二容器中，检测通过检测剂(detecting means)所检测到的并固定到捕获基材上的一种或多种微生物的存在。
根据一个具体的实施方式，本发明的方法包括中间步骤c’)，其包括将第一或第二容器放置于合适的条件下以使得一种或多种微生物生长。
根据另一个具体的实施方式，本发明的方法包括附加步骤e)，其包括对所检测到的一种或多种微生物的确认检测。优选地，确认步骤e)使用与检测步骤相同或不同的检测剂来实施。
有利地，将一种或多种微生物的至少一种特异性或非特异性的结合伴侣固定在捕获基材上。根据本发明的一个优选实施方式，所述特异性的结合伴侣选自：抗体、Fab片段、Fab’片段、适体(aptamer)、重组或非重组噬菌体蛋白质、噬菌体或本领域技术人员已知的任何其他配体。
所述捕获基材可以是能够检测所述微生物的任何合适的基材。尤其是微粒基材，任选地，其是磁性的，或单片基材，任选地，其是孔状的。所述基材可以非常简单地是惰性基材，例如由塑料或玻璃纤维制成的板。有利地，所述捕获基材可以用结合伴侣进行敏化，任选地，所述结合伴侣是特异性的。所述捕获基材也可以是可压缩的单片基材。
有利地，基材可以用保护膜保护。
根据另一个具体的实施方式，可以用相同的技术实行检测和确认。
优选地，对一种或多种微生物实施实时检测。然而，作为另一个选择，可以在结束点，在所述微生物的生长步骤结束时对一种或多种微生物实施检测。
根据本发明方法的一个具体的实施方式，所述第一和/或第二容器是均质化袋。它们也可以是刚性容器，如烧瓶、瓶或平板容器。
根据本发明方法的另一个具体的实施方式，所述检测步骤可以使用读取器实施。这种读取器可以包括，例如，对着捕获基材的照相机，其用于记录或分析支持物的图像。
根据下面给出的详细描述结合附图将会更好地理解本发明的目的和优点，其中：
-图1是本发明第一实施方式的方法的不同步骤的示意图。
-图2是敏化的捕获基材的示意图。
-图3是图2中敏化的捕获基材分析后呈阳性结果的示意图。
根据本发明的第一实施方式，用于检测或鉴定微生物的方法包括采用灭菌的塑料均质化袋，通常称为袋。这种袋在图1A中标记为10。袋10包含两个大致是矩形的塑料片，其三条边接合在一起，以限定内部空间，用来接纳培养基和待分析样品。所述袋10还包含大致是矩形的滤器12，连接于片的一侧，把内部空间一分为二。
在步骤A中，关闭的均质化袋10与食物样品14一起温育，所述食物样品在此种情况下包含未用巴氏法灭菌的奶酪样品。该食物样品14浸没于富集培养基16中，所述培养基可以是选择性的或非选择性的。可以在25到44℃的温度温育6到48小时。
在步骤B中，随后取均质化袋10中的一部分富集培养基并转移到第二容器中，此处包括管20。管20包含反应混合物22。所述反应混合物22包含能够维持目标微生物完整性的稀释剂(例如胰蛋白胨盐液体培养基)以及至少一种检测剂。所述检测剂可以是一种染料，其能够将从食物样品14中获取的、存在于所转移的部分富集培养基中的微生物染色。所述检测剂也可以是能够使所述微生物发荧光的荧光化合物。当我们希望在管20中进行再次培养时，反应混合物除了含有营养剂，还可以含有选择系统，其使得目标细菌的种群数量可以增加。
根据一个具体的实施例，所述检测剂是氯化三苯基2-3-5四氮唑(TTC)，其会被微生物还原。随着微生物的生长，TTC(在非还原状态下无色)被所述微生物内吞，然后在细胞质中被细胞质还原成三苯基甲瓒(红色)，从而将所述微生物染成红色，这样就能够在所述基材上检测所述微生物。也可以使用其他四氮唑盐(CTC，MTT等)。此外，可以在反应混合物中添加加快四氮唑盐还原反应的化合物。
也可以考虑使用细胞膜染色剂，例如龙胆紫或品红。
在检测剂是荧光化合物的情况下，其可以是吖啶橙或荧光素二乙酸酯。
在步骤C中，将敏化的捕获基材24放于管20中，并通过任何合适手段浸没于反应混合物22中。用待测的目标微生物的至少一种特异性结合伴侣对所述敏化的捕获基材24进行功能化。所述捕获基材可以含有任何适用于固定特异性结合伴侣的且为本领域技术人员所熟知的基材。作为一个非限制性实例，合适的捕获基材可由经辐射的聚苯乙烯，例如Nunc/ThermoScientific公司销售的产品(Cat.No.472230)，制成。在图2中图示了这种类型的捕获基材，标记为24。根据一优选的实施方式，有利地，下面部分可以分为两个区域。标记为241的区域可以用结合伴侣(多克隆抗体、单克隆抗体、Fab’或Fab’2片段、适体、噬菌体蛋白质)进行敏化，而上部242保持空白不结合任何伴侣，从而发挥阴性对照的作用。用特异性结合伴侣敏化基材的技术是本领域技术人员所熟知的。
根据本发明方法的一种替代方法，捕获基材24浸没于反应混合物22之后，实施再次培养的步骤可能是有利的。再次培养包括将管20在25到44℃的温度温育1到18小时。根据这种替代方法，由于反应混合物中含有检测剂，使得微生物染色的强度随着其生长同时增加。分析可以实时实施。
有效地捕获一定量的染色的或发荧光的目标微生物(在样品为阳性的情况下)之后，通过基材上的着色或荧光的出现，基材的光学特性发生改变(即生物学信号转导)。随后，捕获基材的着色或荧光可以肉眼观察或使用例如照相机的自动读取器测量。图3图示了在具有阳性结果的分析后捕获基材的示意图。可以看到，区域241由于在特异性结合伴侣上固定目标微生物而显色。作为阴性对照的部分，即区域242，仍然具有捕获基材的初始颜色。
为了有助于读取，优选地，敏化的捕获基材应该不再与反应混合物接触。为此，可以设想，例如，通过任何合适的手段从所述反应混合物移除捕获基材24，如图1步骤D中所清楚显示的。如上所述，可以在结束点进行读取，如虚线所示或实时读取。
根据本发明方法的另一替代方法，所述捕获基材包括敏化颗粒，即包含一种或多种待测微生物的特异性或非特异性结合伴侣。优选地，检测由初始无色的敏化颗粒着色或荧光的出现进行指示的，所述着色或荧光的出现由于在反应中目标微生物与所述敏化颗粒结合而产生的。
根据一具体实施方式，所述敏化颗粒可以是磁性颗粒。读取可以使用能够聚集磁性颗粒的磁化系统手动且可视地进行，所述磁性颗粒上捕获了染色的或发荧光的微生物，所述磁性颗粒在容器壁上成簇聚集。将磁化系统垂直向上移动使得磁性颗粒簇能够从反应混合物中移除，从而帮助分析。也可以设想将磁化系统直接浸没于容器中，以收集其上固定有微生物的磁性颗粒。在这种情况下，所述磁性颗粒将会直接固定在磁化系统上，随后显色或发荧光。
根据本发明方法的另一实施方式，如上所述的反应混合物和捕获基材在富集步骤结束时直接添加到所述第一容器中。由此，所述检测步骤在所述第一容器中进行，而不需将部分或全部包含培养基和待分析样品的混合物转移到第二容器。在检测步骤之前，任选地，可以实施再次培养以增加目标微生物的种群数量。
有利地，应该注意的是，所述捕获基材可以用保护膜保护。使用该膜的目的是防止捕获基材污染。实际上，这种污染会影响所述基材的捕获性能。这种膜可以永久置于捕获基材上。或者，其可以是一种与液体培养基接触一段时间后能偶溶解的膜。
本发明的方法是特别有利的，因为在分析结束时，只打开通过检测系统(下面描述的)鉴定为阳性的容器以实施附加的分析来确定获得的假定结果。确认步骤可以采用与本发明方法不同的技术手段来实施。
下面介绍的实施例的目的是呈现根据本发明方法的不同实施方式和所获得的结果。其并不以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：通过敏化基材光学检测食物样品中的那不勒斯沙门氏菌(Salmonella Napoli)，所述食物样品在反应混合物中进行再次培养
本实验的目的是直接检测食物样品中目标细菌那不勒斯沙门氏菌的存在，所述食物样品在反应混合物中再次培养，所述检测通过敏化基材进行，所述敏化基材如图2和3所示，且由Nunc/Thermo Scientific公司销售的经辐射的聚苯乙烯(Cat.No.472230)制成。
如下所述，在反应步骤的期间通过将捕获基材浸没于含有富集样品的管中进行检测，所述基材以具有沙门氏菌特异性的重组噬菌体蛋白质进行敏化，所述富集样品在反应混合物中稀释到1/100。
方案：
步骤1：在初级富集培养基中重悬样品
如下制备两组样品：
样品A：在均质化袋中，将具有5集落形成单位(CFU)的那不勒斯沙门氏菌的25g未用巴氏消毒法消毒的奶酪重悬于225mL Buffered PeptoneWater(BPW)(bioMérieux，Ref.42043)中，并补充1ml SupplementSPT(bioMérieux，Ref.42650)；
样品B：在均质化袋中，将没有那不勒斯沙门氏菌污染的25g未用巴氏消毒法消毒的奶酪重悬于225mL BPW(bioMérieux，Ref.42043)中，并添加1ml Supplement SPT(bioMérieux，Ref.42650)。
步骤2：温育16小时后，将0.1mL每份的样品从均质化袋中转移到反应管中
将0.1mL样品A从均质化袋中转移到含有10mL SX2(bioMérieux，Ref.42121)和1.6g/L的TTC(bioMérieux，Cat.No.04568088)的反应管中。由此得到样品A’。
对样品B实施相似的操作。
步骤3：在再次培养和反应之前将敏化基材浸没于反应管中
将敏化的捕获基材放到各管中(样品A’和B’)。然后再次关闭管，在37℃温箱中温育6h。
步骤4：在温育时间结束时读取捕获基材
在温育结束时(37℃，6h)以及由样品中存在的所有细菌(即属于附加群和目标群)非特异性还原TTC后，反应混合物变成红色。因此，为了观察捕获基材，显示所分析的样品是阳性还是阴性，将管倾斜以便从反应混合物中分离所述捕获基材。
根据实验设计，置于样品A’中的捕获基材呈现红色，确认样品A’是阳性的；而置于样品B’中的捕获基材保持无色，确认样品B’是阴性的。通过申请人销售的(ref.30707)方法分析这些相同的样品，导致相同的结果，从而确认通过光学读取敏化捕获基材而获得的结果。
实施例2：通过将敏化基材浸没于反应混合物，在富集的生物学样品中光学检测那不勒斯沙门氏菌。
本实验的目的是直接检测富集的食物样品中目标细菌那不勒斯沙门氏菌的存在，所述检测通过敏化基材的方法进行，所述敏化基材如图2和3所示，且由Nunc/Thermo Scientific公司销售的经辐射的聚苯乙烯(Cat.No.472230)制成。
如下所述，在反应步骤的期间通过将捕获基材浸没于含有富集样品的管中进行检测，所述基材以抗沙门氏菌的重组噬菌体蛋白质进行敏化，所述富集样品在反应混合物中稀释到1/2。
方案：
步骤1：在初级富集培养基中重悬样品
如下制备两组样品：
样品A：在均质化袋中，将由那不勒斯沙门氏菌污染的25g切碎的牛排重悬于225mL的Buffered Peptone Water(BPW)(bioMérieux，Ref.42043)中，并添加1mlSupplement SPT(bioMérieux，Ref.42650)；
样品B：在均质化袋中，将没有拿破力(Napoli)沙门氏菌污染的25g切碎的牛排重悬于225mL的BPW(bioMérieux，Ref.42043)中，并添加1ml添加剂SPT(bioMérieux，Ref.42650)。
步骤2：温育16小时之后，将1-mL每份的样品从均质化袋中转移到反应管中
1mL样品A从均质化袋中转移到含有1mL胰蛋白胨盐(bioMérieux，Ref.42076)并加有10μL龙胆紫(bioMérieux，Ref.55545)的反应管中。由此得到样品A’。
对样品B实施相似的操作。
步骤3：在反应之前将敏化基材浸没于反应管中
如下所述，将敏化的捕获基材放到各管中(样品A’和B’)。然后反应期间再次关闭管，
步骤4：在温育时间结束时读取捕获基材
在反应结束时(室温下40min)，样品中存在的所有细菌(即属于附加群和目标群)被染成紫色。因此，为了能够观察捕获基材，显示分析的样品是阳性还是阴性，将管倾斜以便从反应混合物中分离所述捕获基材。
根据实验设计，置于样品A’中的捕获基材呈现紫色，确认样品A’是阳性的；而置于样品B’中的捕获基材保持无色，确认样品B’是阴性的。通过申请人销售的(ref.30707)方法，分析这些相同的样品，导致相同的结果，因此确认通过肉眼读取敏化的捕获基材所获得的结果。

Claims (14)

1.检测至少一种存在于样品中的微生物的方法，所述方法主要包括下述步骤：
a)在第一容器中，使所述样品与至少一种培养基接触，
b)将所述第一容器放置于合适的条件下以使得一种或多种微生物生长，
c)在所述第一容器中或在第二容器中，使一些或所有包含样品与培养基的混合物与反应混合物和用于捕获所述微生物的基材接触，所述反应混合物包含用于检测所述微生物的检测剂；
d)在所述第一或第二容器中，检测通过检测剂所检测到的并固定在捕获基材上的一种或多种微生物的存在。
2.根据前述权利要求所述的方法，包括中间步骤c’)，其包括将所述第一或第二容器放置于合适的条件下以使得一种或多种微生物生长。
3.根据前述权利要求之一所述的方法，包括附加步骤e)，其包括对所检测到的一种或多种微生物的确认检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其中确认步骤e)使用与用于检测的检测剂相同或不同的检测剂实施。
5.根据前述权利要求之一所述的检测方法，其中将所述微生物的至少一种特异性或非特异性结合伴侣固定在捕获基材上。
6.根据前述权利要求所述的检测方法，其中所述特异性结合伴侣选自：抗体、Fab片段、Fab’片段、适体、重组或非重组噬菌体蛋白质、噬菌体。
7.根据前述权利要求之一所述的方法，其中实时实施对一种或多种微生物的检测。
8.根据前述权利要求之一所述的检测方法，其中在所述微生物的生长步骤结束时实施对一种或多种微生物的检测。
9.根据前述权利要求之一所述的检测方法，其中所述第一和/或第二容器是均质化袋、烧瓶、瓶或平板容器。
10.根据前述权利要求之一所述的方法，其中所述捕获基材是单片基材或微粒基材，任选地，所述基材是多孔的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述捕获基材被保护膜保护。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中微粒支持物包括敏化颗粒。
13.根据前述权利要求所述的方法，其中所述敏化颗粒是磁性的。
14.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述单件捕获基材是可压缩的基材。
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