JP6120631B2 - 微生物検出装置の評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は環境評価技術に関し、特に固定化微生物及び微生物検出装置の評価方法に関する。
バイオクリーンルーム等のクリーンルームにおいては、微生物検出装置を用いて、飛散している微生物が検出され、記録される（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照。）。微生物の検出結果から、クリーンルームの空調機器の劣化具合を把握可能である。また、クリーンルームで製造された製品に、参考資料として、クリーンルーム内の微生物の検出記録が添付されることもある。光学式の微生物検出装置は、例えば、クリーンルーム中の気体を吸引し、吸引した気体に光を照射する。気体に微生物が含まれていると、光を照射された微生物が蛍光を発したり、散乱光を発生させたりするため、気体に含まれる微生物の数や大きさ等を検出することが可能となる。
長谷川倫男他，「気中微生物リアルタイム検出技術とその応用」，株式会社山武，azbil Technical Review 2009年12月号，p.2-7，2009年
微生物検出装置の精度を評価する際には、例えば、既知の種類で既知の数の、生きている微生物を微生物検出装置に導入し、微生物検出装置が導入された微生物を適切に検出するか否かを検査する。しかし、微生物検出装置に意図的に生きている微生物を導入することは、微生物検出装置を汚染することになる。また、非微生物粒子を用いて微生物検出装置を校正すると、微生物と、非微生物粒子と、の間の形状及び性質等の相違により、微生物検出装置を正確に評価できない場合がある。そこで、本発明は、微生物検出装置を安全かつ正確に評価可能な微生物検出装置の評価キット、微生物検出装置の評価キットの製造方法、及び微生物検出装置の評価方法を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、固定化微生物を含む、微生物検出装置の評価キットが提供される。また、本発明の態様によれば、微生物を固定化することを含む、微生物検出装置の評価キットの製造方法が提供される。さらに、本発明の態様によれば、固定化微生物を用意することと、固定化微生物を微生物検出装置で検出することと、を含む、微生物検出装置の評価方法が提供される。固定化微生物は溶媒中に分散していてもよい。溶媒は水であってもよい。固定化微生物はアルデヒドで固定されていてもよい。アルデヒドはホルムアルデヒドであってもよい。固定化微生物は、例えば蛍光を発する。なお、蛍光は、自家蛍光も含む。
本発明によれば、微生物検出装置を安全かつ正確に評価可能な微生物検出装置の評価キット、微生物検出装置の評価キットの製造方法、及び微生物検出装置の評価方法を提供可能である。
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
実施の形態に係る微生物検出装置の評価キットは、固定化微生物を含む。ここで、固定化微生物とは、例えば固定化試薬によってタンパク質が架橋されて、固定された微生物をいう。固定化試薬としては、例えばホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒド等のアルデヒドが使用可能である。
固定化される微生物の例としては細菌及び真菌が含まれる。細菌の例としては、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、表皮ブドウ球菌、枯草菌、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムが挙げられる。真菌の例としては、黒カビ等のアスペルギルスが挙げられる。ただし、固定化される微生物はこれらに限定されない。
固定化微生物は実質的に不活性であり、死滅しており、分裂及び増殖能を有しない。
固定化微生物は、例えば水等の溶媒中に分散している。本発明者は、微生物は固定化しても凝集せずに分散することを見出した。また、本発明者は、固定化微生物が、固定化される前と実質的に同様に蛍光を発することを見出した。例えば、微生物検出装置は、粒子の粒径等の大きさに依存する散乱光の特性、粒子が発する蛍光の強度、及び粒子が発する蛍光の波長等を用いて、粒子が微生物であるか否か、また粒子が微生物である場合は、微生物の種類が何であるかを判定する。固定化微生物は、凝集しないため、固定化される前と大きさが実質的に同じであり、固定化される前と実質的に同様に蛍光を発するから、固定化微生物を用いて、微生物検出装置を汚染することなく評価することが可能となる。また、固定化微生物は、固定化されているため、耐久性を有しており、取り扱いが用意である。
次に、実施の形態に係る微生物検出装置の評価キットで評価される、微生物検出装置の例について説明する。図１に示すように、微生物検出装置１は、例えば、クリーンルーム７０内に配置されている。クリーンルーム７０には、ダクト７１、並びにＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）及びＵＬＰＡ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）等の超高性能エアフィルタを有する噴き出し口７２を介して、清浄な空気等の気体が送り込まれる。
クリーンルーム７０内には、生産ライン８１、８２が配置されている。生産ライン８１、８２は、例えば精密機器、電子部品、又は半導体装置の生産ラインである。あるいは生産ライン８１、８２は、食品、飲料、又は医薬品の生産ラインである。例えば、生産ライン８１、８２において、輸液が点滴や注射器に充填される。あるいは、生産ライン８１、８２において、経口剤や漢方薬が製造される。またあるいは、生産ライン８１、８２において、栄養ドリンクやビールが容器に充填される。
生産ライン８１、８２は、通常、微生物及び非微生物粒子等をクリーンルーム７０内の気体に飛散させないよう管理されている。しかし、生産ライン８１、８２は、何らかの事情で、クリーンルーム７０内の気体に飛散する微生物及び非微生物粒子の発生源になる。また、生産ライン８１、８２以外の要因で、クリーンルーム７０内の気体に微生物及び非微生物粒子が飛散することもある。
微生物検出装置１は、例えば、図２及び図３に示す検出部２０を備える。検出部２０は、光源１０、光源１０で発せられた光を集光する集光レンズ１１、集光レンズ１１の焦点に向けて、クリーンルーム７０から吸引した気体を噴射するノズルを含む試料流路１２ａ、及び試料流路１２ａから噴射された気体が導入される試料流路１２ｃを備える。排風機や調圧器等によって、気体は、一定の流量で、図２に示す試料流路１２ａから試料流路１２ｃに流される。
光源１０としては、固体レーザ、ガスレーザ、半導体レーザ、及び発光ダイオード等が使用可能である。試料流路１２ａから噴射された気体に粒子が含まれていると、粒子は光を照射されて散乱光を発生させる。散乱光は、集光レンズ１３で集光され、散乱光検出器１４で検出される。散乱光検出器１４としては、フォトダイオード等が使用可能である。散乱光検出器１４は、散乱光を受光すると、電気的な散乱光検出信号を生成し、コンピュータシステム等の処理部に伝送する。
処理部は、散乱光検出信号の有無によって、粒子の有無を判断する。また、処理部は、散乱光検出信号の受信回数に基づき、粒子の数を計測する。さらに、散乱光の強度と、粒子の大きさと、は相関するため、処理部は、散乱光の強度に基づき、検出した粒子の粒径等の大きさを算出する。またさらに、粒子が微生物である場合、微生物の大きさは、微生物の種類によって異なる。そのため、処理部は、算出した大きさから、微生物の種類を特定してもよい。
また、試料流路１２ａから噴射された気体に、微生物等の蛍光性粒子が含まれていると、粒子は光を照射されて蛍光を発する。例えば、微生物に含まれるリボフラビン（ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）、フラビンヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）、ピリドキサミン（ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ）、ピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ピリドキシン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、及びフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）等が、蛍光を発する。蛍光は集光ミラー１５で集光され、図３に示す蛍光検出器１７で検出される。蛍光検出器１７の前には、蛍光以外の波長の光から蛍光検出器１７を遮蔽するフィルタ１６が配置されていてもよい。蛍光検出器１７としては、フォトダイオード等が使用可能である。蛍光検出器１７は、蛍光を受光すると、電気的な蛍光検出信号を生成し、処理部に伝送する。
処理部は、蛍光検出信号の有無によって、蛍光性粒子の有無を判断する。また、処理部は、蛍光検出信号の受信回数に基づき、蛍光性粒子の数を計測する。さらに、図４に示すように、微生物が発する蛍光の強度は、微生物の種類によって異なる。そのため、処理部は、検出した蛍光の強度から、微生物の種類を特定してもよい。
さらに、例えば、処理部は、散乱光及び蛍光を検出した場合は、検出した粒子が微生物粒子であると判定してもよい。また、処理部は、散乱光を検出したが蛍光を検出しなかった場合は、検出した粒子は非微生物粒子であると判定してもよい。さらにまた、処理部は、これらに限定されないが、米国特許６８８５４４０号公報及び米国特許７１０６４４２号公報に開示されている方法に従って、蛍光強度及び散乱光強度の両方に基づいて微生物の種類を特定してもよい。例えば図５に示すように、微生物の種類によって、粒径と、蛍光強度と、は相関がみられる。したがって、図５に示すようなグラフを予め取得することによって、蛍光強度及び粒径から微生物の種類を特定することが可能である。
微生物検出装置１は、蛍光を検出せず、散乱光のみによって微生物を検出し、微生物の種類を特定してもよい。同心円状の散乱光検出器を用いて、角度毎の散乱光強度を検出し、サポートベクターマシン（ＳＶＭ： Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ）等の統計手法により、微生物種類を特定することが可能である（例えば、Ｍｕｒｕｇｅｓａｎ Ｖｅｎｋａｔａｐａｔｈｉら著、「Ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」、ＡＰＰＬＩＥＤ ＯＰＴＩＣＳ、米国、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２００８年２月１０日、Ｖｏｌ．４７、Ｎｏ．５、６７８ないし６８６頁参照。）。
あるいは、微生物検出装置１は、複数の波長の励起光を気体に照射して蛍光スペクトルを検出し、気体に含まれる微生物を特定してもよい。例えば、波長が２６６ｎｍ及び３５５ｎｍの励起光を微生物に照射し、波長が３５０ｎｍ、４５０ｎｍ、及び５５０ｎｍの蛍光スペクトルを検出することによって、微生物を特定することが可能である（例えば、Ｖａｓａｎｔｈｉ Ｓｉｖａｐｒａｋａｓａｍら著、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＵＶ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｂｉｏａｒｅｒｏｓｏｌｓ」、ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ、米国、Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、２００４年９月２０日、Ｖｏｌ．１２、Ｎｏ．１９、４４５７ないし４４６６頁参照。）。
図１に示す微生物検出装置１が微生物を検出した場合は、クリーンルーム７０において除染作業等が行われる。
微生物検出装置１の微生物検出能力を正確に評価するためには、既知の種類、既知の数の微生物を微生物検出装置１に導入し、微生物検出装置１が検出した微生物の種類、数が、導入されたものと等しいか否かを検査することが好ましい。しかし、生きている微生物は、環境の変化に敏感であり、微生物検出装置１に導入する前後で特性が変化する場合がある。また、生きており増殖可能な微生物を、評価目的で微生物検出装置１に導入することは、微生物検出装置１及びクリーンルーム７０の汚染の原因になりうる。特に、カビ等は、飛散性が高い上に、汚染力が強い傾向にある。
そこで、従来、非微生物粒子を微生物検出装置１に導入して、微生物検出装置１を評価することが提案されている。しかし、非微生物粒子と、実際の微生物と、の間には、屈折率や大きさの違いがある場合があり、その場合、発生する散乱光の特性に違いが生じる。また、蛍光性の非微生物粒子と、実際の微生物と、の間には、蛍光の強度及び波長に違いがある場合もある。そのため、蛍光性の非微生物粒子によっては、微生物検出装置１の微生物検出能力を正確に評価できない場合が生じうる。また、大きさ及び蛍光特性に関して、特定の微生物に類似する非微生物粒子もあるが、複数種類の微生物毎に特性の類似する非微生物粒子を用意することは困難な場合もある。
これに対し、実施の形態に係る微生物検出装置の評価キットに含まれる固定化微生物は、上述したように、実質的に不活性であり、死滅しており、分裂及び増殖能を有していない。そのため、固定化微生物が、微生物検出装置１及びクリーンルーム７０に与える汚染の程度は限定的である。また、固定化微生物は、固定化される前と大きさが実質的に同じであり、固定化される前と実質的に同様に蛍光を発するから、所定の種類、所定の数の固定化微生物を微生物検出装置１に導入することにより、微生物検出装置１を安全かつ正確に評価することが可能である。さらに、固定化微生物は、固定化される前と、蛍光の減衰特性が同様であるから、蛍光の減衰特性に基づき、微生物を検出する微生物検出装置の評価にも使用可能である。
固定化微生物を微生物検出装置１に導入する際には、固定化微生物を気体中に散布し、散布された固定化微生物を含有する気体を微生物検出装置１に導入してもよい。あるいは、水等の溶媒に固定化微生物を分散させて溶液を調製し、ネブライザ等を用いて溶液から固定化微生物を含有するエアロゾルを生成し、微生物検出装置１に導入してもよい。固定化微生物は、架橋されているため、環境の変化が生じても、構造が破壊されにくい傾向にある。微生物検出装置が液中の微生物を検出可能である場合は、固定化微生物を含有する溶液を微生物検出装置に導入してもよい。
（実施例）
以下に本発明の実施の形態を説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。
以下に本発明の実施の形態を説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。
（固定化試薬の調製）
濃度が３７％のホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）溶液（シグマアルドリッチジャパン株式会社、２５２５４９−２５ＭＬ）を滅菌水で希釈し、濃度が８％又は１６％のホルムアルデヒド溶液を調製した。
濃度が３７％のホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）溶液（シグマアルドリッチジャパン株式会社、２５２５４９−２５ＭＬ）を滅菌水で希釈し、濃度が８％又は１６％のホルムアルデヒド溶液を調製した。
（微生物の入手）
入手した微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、略称Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １２２２８）、枯草菌芽胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、ＡＴＣＣ ９３７２）、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、ＡＴＣＣ ９１４２）、及びシュードモナス属（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、 ＡＴＣＣ １２６３３）であった。なお、ＡＴＣＣは、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の略である。大腸菌及びシュードモナス属は、グラム陰性菌である。表皮ブドウ球菌、及び枯草菌芽胞は、グラム陽性菌である。黒カビは真菌である。なお、枯草菌芽胞は、予め懸濁液として販売されているものを購入した。
入手した微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、略称Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １２２２８）、枯草菌芽胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、ＡＴＣＣ ９３７２）、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、ＡＴＣＣ ９１４２）、及びシュードモナス属（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、 ＡＴＣＣ １２６３３）であった。なお、ＡＴＣＣは、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の略である。大腸菌及びシュードモナス属は、グラム陰性菌である。表皮ブドウ球菌、及び枯草菌芽胞は、グラム陽性菌である。黒カビは真菌である。なお、枯草菌芽胞は、予め懸濁液として販売されているものを購入した。
（微生物の調製）
入手した枯草菌芽胞及び黒カビ以外の細菌微生物はトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）培地に植菌し、約３２℃の恒温層で一晩振とう培養した。次に、菌液をポアメディアＲトリプトソイ寒天（ＴＳＡ）培地に画線し、約３２℃の恒温層で約２４時間培養した。その後、培地から菌体をかき取り、滅菌水に懸濁した。さらに、懸濁液を２１００ｇで３分間遠心した後、上澄みを除去し、沈殿したペレットを滅菌水で懸濁し、微生物懸濁液を得た。
入手した枯草菌芽胞及び黒カビ以外の細菌微生物はトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）培地に植菌し、約３２℃の恒温層で一晩振とう培養した。次に、菌液をポアメディアＲトリプトソイ寒天（ＴＳＡ）培地に画線し、約３２℃の恒温層で約２４時間培養した。その後、培地から菌体をかき取り、滅菌水に懸濁した。さらに、懸濁液を２１００ｇで３分間遠心した後、上澄みを除去し、沈殿したペレットを滅菌水で懸濁し、微生物懸濁液を得た。
真菌である黒カビは、寒天プレートで胞子を形成させ、そこにスルホコハク酸ジオクチルナトリウム液を注いで、胞子を液中に分散させた。次に、胞子を含む溶液を回収した後、滅菌ガーゼでろ過して菌糸を取り除き、さらに１５００ｇないし１６００ｇで１０分間遠心することと、沈殿したペレットを滅菌水で懸濁することと、を３回繰り返し、微生物懸濁液を得た。
（固定化微生物の調製）
表皮ブドウ球菌及びシュードモナス属の場合は、濃度が８％のホルムアルデヒド溶液と、微生物懸濁液と、を、１：１の体積比で混合した。具体的には、体積が４００μＬ、濃度が８％のホルムアルデヒド溶液と、体積が４００μＬの微生物懸濁液と、を、混合した。
大腸菌、枯草菌芽胞、及び黒カビの場合は、濃度が１６％のホルムアルデヒド溶液と、微生物懸濁液と、を、１：１の体積比で混合した。具体的には、体積が４００μＬ、濃度が１６％のホルムアルデヒド溶液と、体積が４００μＬの微生物懸濁液と、を、混合した。
混合後、軽くピペッティングし、大腸菌の場合は、常温で１０分間放置した。表皮ブドウ球菌及びシュードモナス属の場合は、常温で５分間放置した。枯草菌芽胞の場合は、常温で２４時間放置した。黒カビの場合は、常温で１０分間放置した。その後、混合液を４７００ｒｐｍで３分間遠心すること、沈殿したペレットを滅菌水で懸濁することと、を２回繰り返し、溶媒としての滅菌水中に固定化微生物が分散しているサンプル溶液を得た。
表皮ブドウ球菌及びシュードモナス属の場合は、濃度が８％のホルムアルデヒド溶液と、微生物懸濁液と、を、１：１の体積比で混合した。具体的には、体積が４００μＬ、濃度が８％のホルムアルデヒド溶液と、体積が４００μＬの微生物懸濁液と、を、混合した。
大腸菌、枯草菌芽胞、及び黒カビの場合は、濃度が１６％のホルムアルデヒド溶液と、微生物懸濁液と、を、１：１の体積比で混合した。具体的には、体積が４００μＬ、濃度が１６％のホルムアルデヒド溶液と、体積が４００μＬの微生物懸濁液と、を、混合した。
混合後、軽くピペッティングし、大腸菌の場合は、常温で１０分間放置した。表皮ブドウ球菌及びシュードモナス属の場合は、常温で５分間放置した。枯草菌芽胞の場合は、常温で２４時間放置した。黒カビの場合は、常温で１０分間放置した。その後、混合液を４７００ｒｐｍで３分間遠心すること、沈殿したペレットを滅菌水で懸濁することと、を２回繰り返し、溶媒としての滅菌水中に固定化微生物が分散しているサンプル溶液を得た。
（コントロールの調製）
滅菌水と、微生物懸濁液と、を、１：１の体積比で混合した。具体的には、体積が４００μＬの滅菌水と、体積が４００μＬの微生物懸濁液と、を、混合した。混合後、軽くピペッティングし、大腸菌の場合は、常温で１０分間放置した。表皮ブドウ球菌及びシュードモナス属の場合は、常温で５分間放置した。枯草菌芽胞の場合は、常温で２４時間放置した。黒カビの場合は、常温で１０分間放置した。その後、混合液を４７００ｒｐｍで３分間遠心すること、沈殿したペレットを滅菌水で懸濁することと、を２回繰り返し、溶媒としての滅菌水中に固定化されていない微生物が分散しているコントロール溶液を得た。
滅菌水と、微生物懸濁液と、を、１：１の体積比で混合した。具体的には、体積が４００μＬの滅菌水と、体積が４００μＬの微生物懸濁液と、を、混合した。混合後、軽くピペッティングし、大腸菌の場合は、常温で１０分間放置した。表皮ブドウ球菌及びシュードモナス属の場合は、常温で５分間放置した。枯草菌芽胞の場合は、常温で２４時間放置した。黒カビの場合は、常温で１０分間放置した。その後、混合液を４７００ｒｐｍで３分間遠心すること、沈殿したペレットを滅菌水で懸濁することと、を２回繰り返し、溶媒としての滅菌水中に固定化されていない微生物が分散しているコントロール溶液を得た。
（顕微鏡観察）
サンプル溶液及びコントロール溶液をそれぞれスライドガラスに１．５μＬ滴下し、乾燥させた。その後、励起光フィルター（オリンパス、ＮＶ ＢＡ４５５）を備える顕微鏡（オリンパス、ＢＸ５１）を用いて、固定化微生物及び固定化されなかった微生物を明視野観察及び蛍光観察した。
サンプル溶液及びコントロール溶液をそれぞれスライドガラスに１．５μＬ滴下し、乾燥させた。その後、励起光フィルター（オリンパス、ＮＶ ＢＡ４５５）を備える顕微鏡（オリンパス、ＢＸ５１）を用いて、固定化微生物及び固定化されなかった微生物を明視野観察及び蛍光観察した。
（固定化された大腸菌の観察結果）
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された大腸菌の明視野観察画像を図６に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された大腸菌の蛍光観察画像を図７に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化された大腸菌の蛍光観察画像を図８に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化された大腸菌の蛍光観察画像を図９に示す。なお、図７、図８、及び図９の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された大腸菌の明視野観察画像を図６に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された大腸菌の蛍光観察画像を図７に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化された大腸菌の蛍光観察画像を図８に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化された大腸菌の蛍光観察画像を図９に示す。なお、図７、図８、及び図９の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化されなかった大腸菌の観察結果）
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった大腸菌の明視野観察画像を図１０に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像を図１１に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像を図１２に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像を図１３に示す。なお、図１１、図１２、及び図１３の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった大腸菌の明視野観察画像を図１０に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像を図１１に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像を図１２に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像を図１３に示す。なお、図１１、図１２、及び図１３の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化の有無と大腸菌の分散性）
図６及び図７に示した固定化された大腸菌の顕微鏡観察画像と、図１０及び図１１に示した固定化されなかった大腸菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、大腸菌は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
図６及び図７に示した固定化された大腸菌の顕微鏡観察画像と、図１０及び図１１に示した固定化されなかった大腸菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、大腸菌は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
（固定化の有無と大腸菌の粒径）
図６に示した明視野観察画像において、固定化された大腸菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．５μｍであった。また、図１０に示した明視野観察画像において、固定化されなかった大腸菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．４μｍであった。したがって、固定化された大腸菌の粒径は、固定化されなかった大腸菌の粒径と、ほぼ同じであった。
図６に示した明視野観察画像において、固定化された大腸菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．５μｍであった。また、図１０に示した明視野観察画像において、固定化されなかった大腸菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．４μｍであった。したがって、固定化された大腸菌の粒径は、固定化されなかった大腸菌の粒径と、ほぼ同じであった。
（固定化の有無と大腸菌の蛍光強度）
画像解析ソフトを用いて、サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された大腸菌の蛍光観察画像において、固定化された大腸菌の蛍光強度として画像における明度を測定したところ、平均蛍光強度は３５８７．５であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像において、固定化されなかった大腸菌の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は１６４９．２であった。固定化された大腸菌の平均蛍光強度の値と、固定化されなかった大腸菌の平均蛍光強度値と、は、微生物検出装置において、大腸菌とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
画像解析ソフトを用いて、サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された大腸菌の蛍光観察画像において、固定化された大腸菌の蛍光強度として画像における明度を測定したところ、平均蛍光強度は３５８７．５であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった大腸菌の蛍光観察画像において、固定化されなかった大腸菌の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は１６４９．２であった。固定化された大腸菌の平均蛍光強度の値と、固定化されなかった大腸菌の平均蛍光強度値と、は、微生物検出装置において、大腸菌とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
（固定化の有無と大腸菌の蛍光の減衰）
図７ないし図９に示した固定化された大腸菌の顕微鏡観察画像と、図１１ないし図１３に示した固定化されなかった大腸菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化された大腸菌の蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかった大腸菌の蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
図７ないし図９に示した固定化された大腸菌の顕微鏡観察画像と、図１１ないし図１３に示した固定化されなかった大腸菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化された大腸菌の蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかった大腸菌の蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
（固定化された表皮ブドウ球菌の観察結果）
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された表皮ブドウ球菌の明視野観察画像を図１４に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１５に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１６に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１７に示す。なお、図１５、図１６、及び図１７の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された表皮ブドウ球菌の明視野観察画像を図１４に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１５に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１６に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１７に示す。なお、図１５、図１６、及び図１７の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化されなかった表皮ブドウ球菌の観察結果）
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の明視野観察画像を図１８に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１９に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図２０に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図２１に示す。なお、図１９、図２０、及び図２１の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の明視野観察画像を図１８に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図１９に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図２０に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像を図２１に示す。なお、図１９、図２０、及び図２１の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化の有無と表皮ブドウ球菌の分散性）
図１４及び図１５に示した固定化された表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、図１８及び図１９に示した固定化されなかった表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、表皮ブドウ球菌は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
図１４及び図１５に示した固定化された表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、図１８及び図１９に示した固定化されなかった表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、表皮ブドウ球菌は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
（固定化の有無と表皮ブドウ球菌の粒径）
図１４に示した明視野観察画像において、固定化された表皮ブドウ球菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．５μｍであった。また、図１８に示した明視野観察画像において、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．６μｍであった。したがって、固定化された表皮ブドウ球菌の粒径は、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の粒径と、ほぼ同じであった。
図１４に示した明視野観察画像において、固定化された表皮ブドウ球菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．５μｍであった。また、図１８に示した明視野観察画像において、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の粒径を測定したところ、平均粒径は１．６μｍであった。したがって、固定化された表皮ブドウ球菌の粒径は、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の粒径と、ほぼ同じであった。
（固定化の有無と表皮ブドウ球菌の蛍光強度）
サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像において、固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は５７１９．０であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像において、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は６７８７．８であった。固定化された表皮ブドウ球菌の平均蛍光強度の値と、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の平均蛍光強度の値と、は、微生物検出装置において、表皮ブドウ球菌とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像において、固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は５７１９．０であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光観察画像において、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は６７８７．８であった。固定化された表皮ブドウ球菌の平均蛍光強度の値と、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の平均蛍光強度の値と、は、微生物検出装置において、表皮ブドウ球菌とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
（固定化の有無と表皮ブドウ球菌の蛍光の減衰）
図１５ないし図１６に示した固定化された表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、図１９ないし図２１に示した固定化されなかった表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
図１５ないし図１６に示した固定化された表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、図１９ないし図２１に示した固定化されなかった表皮ブドウ球菌の顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化された表皮ブドウ球菌の蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
（固定化された枯草菌芽胞の観察結果）
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された枯草菌芽胞の明視野観察画像を図２２に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された枯草菌芽胞の蛍光観察画像を図２３に示す。なお、図２３の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された枯草菌芽胞の明視野観察画像を図２２に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された枯草菌芽胞の蛍光観察画像を図２３に示す。なお、図２３の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化されなかった枯草菌芽胞の観察結果）
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった枯草菌芽胞の明視野観察画像を図２４に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった枯草菌芽胞の蛍光観察画像を図２５に示す。なお、図２５の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった枯草菌芽胞の明視野観察画像を図２４に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった枯草菌芽胞の蛍光観察画像を図２５に示す。なお、図２５の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化の有無と枯草菌芽胞の分散性）
図２２及び図２３に示した固定化された枯草菌芽胞の顕微鏡観察画像と、図２４及び図２５に示した固定化されなかった枯草菌芽胞の顕微鏡観察画像と、の比較から、枯草菌芽胞は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
図２２及び図２３に示した固定化された枯草菌芽胞の顕微鏡観察画像と、図２４及び図２５に示した固定化されなかった枯草菌芽胞の顕微鏡観察画像と、の比較から、枯草菌芽胞は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
（固定化の有無と枯草菌芽胞の粒径）
図２２に示した明視野観察画像において、固定化された枯草菌芽胞の粒径を測定したところ、平均粒径は２．０μｍであった。また、図２４に示した明視野観察画像において、固定化されなかった枯草菌芽胞の粒径を測定したところ、平均粒径は２．０μｍであった。したがって、固定化された枯草菌芽胞の粒径は、固定化されなかった枯草菌芽胞の粒径と、同じであった。
図２２に示した明視野観察画像において、固定化された枯草菌芽胞の粒径を測定したところ、平均粒径は２．０μｍであった。また、図２４に示した明視野観察画像において、固定化されなかった枯草菌芽胞の粒径を測定したところ、平均粒径は２．０μｍであった。したがって、固定化された枯草菌芽胞の粒径は、固定化されなかった枯草菌芽胞の粒径と、同じであった。
（固定化の有無と枯草菌芽胞の蛍光強度）
サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された枯草菌芽胞の蛍光観察画像において、固定化された枯草菌芽胞の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は９１８２．０であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった枯草菌芽胞の蛍光観察画像において、固定化されなかった枯草菌芽胞の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は７２６４．０であった。固定化された枯草菌芽胞の平均蛍光強度の値と、固定化されなかった枯草菌芽胞の平均蛍光強度の値と、は、微生物検出装置において、枯草菌芽胞とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された枯草菌芽胞の蛍光観察画像において、固定化された枯草菌芽胞の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は９１８２．０であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった枯草菌芽胞の蛍光観察画像において、固定化されなかった枯草菌芽胞の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は７２６４．０であった。固定化された枯草菌芽胞の平均蛍光強度の値と、固定化されなかった枯草菌芽胞の平均蛍光強度の値と、は、微生物検出装置において、枯草菌芽胞とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
（固定化された黒カビの観察結果）
固定化された黒カビの明視野観察画像を図２６に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された黒カビの蛍光観察画像を図２７に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化された黒カビの蛍光観察画像を図２８に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化された黒カビの蛍光観察画像を図２９に示す。なお、図２７、図２８、及び図２９の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
固定化された黒カビの明視野観察画像を図２６に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化された黒カビの蛍光観察画像を図２７に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化された黒カビの蛍光観察画像を図２８に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化された黒カビの蛍光観察画像を図２９に示す。なお、図２７、図２８、及び図２９の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化されなかった黒カビの観察結果）
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった黒カビの明視野観察画像を図３０に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像を図３１に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像を図３２に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像を図３３に示す。なお、図３１、図３２、及び図３３の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった黒カビの明視野観察画像を図３０に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像を図３１に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像を図３２に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像を図３３に示す。なお、図３１、図３２、及び図３３の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化の有無と黒カビの分散性）
図２６及び図２７に示した固定化された黒カビの顕微鏡観察画像と、図３０及び図３１に示した固定化されなかった黒カビの顕微鏡観察画像と、の比較から、黒カビは、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
図２６及び図２７に示した固定化された黒カビの顕微鏡観察画像と、図３０及び図３１に示した固定化されなかった黒カビの顕微鏡観察画像と、の比較から、黒カビは、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
（固定化の有無と黒カビの粒径）
図２６に示した明視野観察画像において、固定化された黒カビの粒径を測定したところ、平均粒径は３．２μｍであった。また、図３０に示した明視野観察画像において、固定化されなかった黒カビの粒径を測定したところ、平均粒径は３．５μｍであった。したがって、固定化された黒カビの粒径は、固定化されなかった黒カビの粒径と、ほぼ同じであった。
図２６に示した明視野観察画像において、固定化された黒カビの粒径を測定したところ、平均粒径は３．２μｍであった。また、図３０に示した明視野観察画像において、固定化されなかった黒カビの粒径を測定したところ、平均粒径は３．５μｍであった。したがって、固定化された黒カビの粒径は、固定化されなかった黒カビの粒径と、ほぼ同じであった。
（固定化の有無と黒カビの蛍光強度）
サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された黒カビの蛍光観察画像において、固定化された黒カビの蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は１８９００．３であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像において、固定化されなかった黒カビの蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は１７３４２．１であった。固定化された黒カビの平均蛍光強度の値と、固定化されなかった黒カビの平均蛍光強度の値と、は、微生物検出装置において、黒カビとみなされる蛍光強度の範囲内であった。
サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化された黒カビの蛍光観察画像において、固定化された黒カビの蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は１８９００．３であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかった黒カビの蛍光観察画像において、固定化されなかった黒カビの蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は１７３４２．１であった。固定化された黒カビの平均蛍光強度の値と、固定化されなかった黒カビの平均蛍光強度の値と、は、微生物検出装置において、黒カビとみなされる蛍光強度の範囲内であった。
（固定化の有無と黒カビの蛍光の減衰）
図２７ないし図２９に示した固定化された黒カビの顕微鏡観察画像と、図３１ないし図３３に示した固定化されなかった黒カビの顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化された黒カビの蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかった黒カビの蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
図２７ないし図２９に示した固定化された黒カビの顕微鏡観察画像と、図３１ないし図３３に示した固定化されなかった黒カビの顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化された黒カビの蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかった黒カビの蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
（固定化されたシュードモナス属の観察結果）
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化されたシュードモナス属の明視野観察画像を図３４に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像を図３５に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像を図３６に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像を図３７に示す。なお、図３５、図３６、及び図３７の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化されたシュードモナス属の明視野観察画像を図３４に示す。また、サンプル溶液を調製後、直ちに観察された固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像を図３５に示す。さらに、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像を図３６に、サンプル溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像を図３７に示す。なお、図３５、図３６、及び図３７の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化されなかったシュードモナス属の観察結果）
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかったシュードモナス属の明視野観察画像を図３８に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像を図３９に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像を図４０に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像を図４１に示す。なお、図３９、図４０、及び図４１の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかったシュードモナス属の明視野観察画像を図３８に示す。また、コントロール溶液を調製後、直ちに観察された固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像を図３９に示す。さらに、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約１日保存した後に観察された固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像を図４０に、コントロール溶液を調製してから冷暗所で約５日保存した後に観察された固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像を図４１に示す。なお、図３９、図４０、及び図４１の画像は、露出時間１．０秒で撮影された画像である。
（固定化の有無とシュードモナス属の分散性）
図３４及び図３５に示した固定化されたシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、図３８及び図３９に示した固定化されなかったシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、の比較から、シュードモナス属は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
図３４及び図３５に示した固定化されたシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、図３８及び図３９に示した固定化されなかったシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、の比較から、シュードモナス属は、固定化の有無による分散性の有意な違いがなく、固定化による凝集も実質的に生じていないことが明らかになった。
（固定化の有無とシュードモナス属の粒径）
図３４に示した明視野観察画像において、固定化されたシュードモナス属の粒径を測定したところ、平均粒径は０．７μｍであった。また、図３８に示した明視野観察画像において、固定化されなかったシュードモナス属の粒径を測定したところ、平均粒径は０．６μｍであった。したがって、固定化されたシュードモナス属の粒径は、固定化されなかったシュードモナス属の粒径と、ほぼ同じであった。なお、シュードモナス属は桿状であるため、同じ面積の円に換算した場合の径を、粒径として求めた。
図３４に示した明視野観察画像において、固定化されたシュードモナス属の粒径を測定したところ、平均粒径は０．７μｍであった。また、図３８に示した明視野観察画像において、固定化されなかったシュードモナス属の粒径を測定したところ、平均粒径は０．６μｍであった。したがって、固定化されたシュードモナス属の粒径は、固定化されなかったシュードモナス属の粒径と、ほぼ同じであった。なお、シュードモナス属は桿状であるため、同じ面積の円に換算した場合の径を、粒径として求めた。
（固定化の有無とシュードモナス属の蛍光強度）
画像解析ソフトを用いて、サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像において、固定化されたシュードモナス属の蛍光強度として画像における明度を測定したところ、平均蛍光強度は６９４．９であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像において、固定化されなかったシュードモナス属の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は２６５．９であった。固定化されたシュードモナス属の平均蛍光強度の値と、固定化されなかったシュードモナス属の平均蛍光強度値と、は、微生物検出装置において、シュードモナス属とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
画像解析ソフトを用いて、サンプル溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されたシュードモナス属の蛍光観察画像において、固定化されたシュードモナス属の蛍光強度として画像における明度を測定したところ、平均蛍光強度は６９４．９であった。また、コントロール溶液を調製後、直ちに露出時間０．５秒で撮影した固定化されなかったシュードモナス属の蛍光観察画像において、固定化されなかったシュードモナス属の蛍光強度を測定したところ、平均蛍光強度は２６５．９であった。固定化されたシュードモナス属の平均蛍光強度の値と、固定化されなかったシュードモナス属の平均蛍光強度値と、は、微生物検出装置において、シュードモナス属とみなされる蛍光強度の範囲内であった。
（固定化の有無とシュードモナス属の蛍光の減衰）
図３５ないし図３７に示した固定化されたシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、図３９ないし図４１に示した固定化されなかったシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化されたシュードモナス属の蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかったシュードモナス属の蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
図３５ないし図３７に示した固定化されたシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、図３９ないし図４１に示した固定化されなかったシュードモナス属の顕微鏡観察画像と、の比較から、固定化されたシュードモナス属の蛍光の減衰の傾向は、固定化されなかったシュードモナス属の蛍光の減衰の傾向と、ほぼ同じであった。
（固定化の有無と微生物の特性）
蛍光強度を測定した大腸菌と同時に観察した標準蛍光粒子の平均蛍光強度は１２８３２４．１であった。固定化された大腸菌の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化された大腸菌の標準化平均蛍光強度は、０．０２７９５６であった。固定化されなかった大腸菌の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化されなかった大腸菌の標準化平均蛍光強度は、０．０１２８５２であった。
蛍光強度を測定した大腸菌と同時に観察した標準蛍光粒子の平均蛍光強度は１２８３２４．１であった。固定化された大腸菌の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化された大腸菌の標準化平均蛍光強度は、０．０２７９５６であった。固定化されなかった大腸菌の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化されなかった大腸菌の標準化平均蛍光強度は、０．０１２８５２であった。
蛍光強度を測定した表皮ブドウ球菌と同時に観察した標準蛍光粒子の平均蛍光強度は１２５１８９．１であった。固定化された表皮ブドウ球菌の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化された表皮ブドウ球菌の標準化平均蛍光強度は、０．０４５６８３であった。固定化されなかった表皮ブドウ球菌の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化されなかった表皮ブドウ球菌の標準化平均蛍光強度は、０．０５４２２であった。
蛍光強度を測定した枯草菌芽胞と同時に観察した標準蛍光粒子の平均蛍光強度は１２６６０２．２であった。固定化された枯草菌芽胞の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化された枯草菌芽胞の標準化平均蛍光強度は、０．０７２５２７であった。固定化されなかった枯草菌芽胞の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化されなかった枯草菌芽胞の標準化平均蛍光強度は、０．０５７３７７であった。
蛍光強度を測定した黒カビと同時に観察した標準蛍光粒子の平均蛍光強度は１４１８９４．６であった。固定化された黒カビの平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化された黒カビの標準化平均蛍光強度は、０．１３３１９９であった。固定化されなかった黒カビの平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化されなかった黒カビの標準化平均蛍光強度は、０．１２２２１８であった。
蛍光強度を測定したシュードモナス属と同時に観察した標準蛍光粒子の平均蛍光強度は１２４２０２．９であった。固定化されたシュードモナス属の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化されたシュードモナス属の標準化平均蛍光強度は、０．００５５９５であった。固定化されなかったシュードモナス属の平均蛍光強度を、標準蛍光粒子の平均蛍光強度で割って得られた、固定化されなかったシュードモナス属の標準化平均蛍光強度は、０．００２１４１であった。
蛍光物質が発する蛍光の強度の測定結果は、顕微鏡装置の状態によって変動するため、観察される日時によって変動する場合がある。そのため、上述したように、同じ種類の標準蛍光粒子の蛍光強度をそれぞれの微生物と同時に測定し、微生物の蛍光強度を標準蛍光粒子の蛍光強度で割ることにより、異なる日時に微生物を蛍光観察したことによる蛍光強度の変動が除去される。
固定化された微生物と固定化されなかった微生物のそれぞれについて、粒径と、標準化平均蛍光強度と、をプロットすると、図４２に示すように、微生物の特性は、固定化の有無に関わらず、同様の傾向を示した。また、固定化の有無による微生物の特性の変動は、微生物の種類の違いによる特性の違いと比較して、わずかであった。
（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、実施の形態に係る固定化微生物で評価される微生物検出装置の微生物を検出する原理は、上記のものに限定されない。実施の形態に係る固定化微生物は、誘導泳動等の泳動の原理により微生物を検出する微生物検出装置、あるいはフローサイトメトリーの原理により微生物を検出する微生物検出装置の評価にも使用可能である。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、実施の形態に係る固定化微生物で評価される微生物検出装置の微生物を検出する原理は、上記のものに限定されない。実施の形態に係る固定化微生物は、誘導泳動等の泳動の原理により微生物を検出する微生物検出装置、あるいはフローサイトメトリーの原理により微生物を検出する微生物検出装置の評価にも使用可能である。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
１ 微生物検出装置
１０ 光源
１１ 集光レンズ
１２ａ 試料流路
１２ｃ 試料流路
１３ 集光レンズ
１４ 散乱光検出器
１５ 集光ミラー
１６ フィルタ
１７ 蛍光検出器
２０ 検出部
７０ クリーンルーム
７１ ダクト
７２ 噴き出し口
８１ 生産ライン
１０ 光源
１１ 集光レンズ
１２ａ 試料流路
１２ｃ 試料流路
１３ 集光レンズ
１４ 散乱光検出器
１５ 集光ミラー
１６ フィルタ
１７ 蛍光検出器
２０ 検出部
７０ クリーンルーム
７１ ダクト
７２ 噴き出し口
８１ 生産ライン
Claims (5)
- 固定化微生物を用意することと、
前記固定化微生物を溶媒中に分散させることと、
前記固定化微生物が溶媒中に分散している溶液からエアロゾルを生成することと、
前記エアロゾルを微生物検出装置に導入することと、
前記固定化微生物を前記微生物検出装置で検出することと、
を含み、
前記検出することが、
前記固定化微生物に光を照射することと、
前記固定化微生物が発した自家蛍光を受光することと、
を含み、
受光した前記自家蛍光の強度から、前記固定化微生物の種類を特定する、
微生物検出装置の評価方法。 - 前記検出することが、
前記固定化微生物に光を照射することと、
前記固定化微生物で生じた散乱光を受光することと、
を含み、
受光した前記散乱光の強度から算出される前記固定化微生物の大きさに基づき、前記固定化微生物の種類を特定する、
請求項１に記載の微生物検出装置の評価方法。 - 前記溶媒が水である、請求項１又は２に記載の微生物検出装置の評価方法。
- 前記固定化微生物がアルデヒドで固定された、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の微生物検出装置の評価方法。
- 前記アルデヒドがホルムアルデヒドである、請求項４に記載の微生物検出装置の評価方法。
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- 2013-03-22 JP JP2013060201A patent/JP6120631B2/ja active Active
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2014
- 2014-03-20 US US14/220,496 patent/US20140287455A1/en not_active Abandoned
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