JP2015135291A - 複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法及び蛍光検出装置の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】複数種類の粒子の蛍光強度を容易に比較可能な方法を提供する。
【解決手段】複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射するステップＳ１０２と、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定するステップＳ１０３と、測定された複数種類の粒子塊の蛍光強度を比較するステップＳ１０４と、を含む、複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。当該方法において、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面に対して励起光を斜入射させてもよい。また、励起光の進行方向に対して垂直方向から複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定してもよい。
【選択図】図１
【解決手段】複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射するステップＳ１０２と、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定するステップＳ１０３と、測定された複数種類の粒子塊の蛍光強度を比較するステップＳ１０４と、を含む、複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。当該方法において、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面に対して励起光を斜入射させてもよい。また、励起光の進行方向に対して垂直方向から複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定してもよい。
【選択図】図１
Description
本発明は光学技術に関し、特に複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法及び蛍光検出装置の評価方法に関する。
クリーンルームにおいては、粒子検出装置を用いて、飛散している粒子が検出され、記録される（例えば、特許文献１、２、３及び非特許文献１参照。）。光学式の粒子検出装置は、例えば、クリーンルーム中の気体を吸引し、吸引した気体に光を照射する。気体に微生物粒子や非微生物蛍光粒子が含まれていると、光を照射された気体中の単一粒子が蛍光を発する。粒子検出装置は、例えば、検出した蛍光強度から、粒子の種類を特定する。
単一粒子が発する蛍光の強度を比較することは、複数種類の粒子の特性を把握するために有用である。しかし、上述したような粒子検出装置は高価であり、単一粒子が発する蛍光を測定することは容易ではない。超高感度のフローサイトメータ（例えば、非特許文献２参照。）や大規模なチャンバを備えたバイオエアロゾル検出装置（例えば、非特許文献３参照。）を用いても細菌細胞のような細かな粒子の自家蛍光を測定可能であるが、これらも高価である。
これに対し、比較的安価である蛍光顕微鏡で一定の大きさを有す単一粒子の蛍光を測定することは可能である。しかし、例えば単一粒子が細菌細胞である場合、細菌細胞は極めて小さいため、蛍光顕微鏡による蛍光強度の解析は困難である。また、分光蛍光光度計で粒子の懸濁液の蛍光強度を測定し、単一粒子あたりの蛍光強度を算出するために、懸濁液の蛍光強度を懸濁液中の粒子数で割ることが提案されている（例えば、特許文献４及び非特許文献４、５参照。）。しかし、懸濁液中の粒子数を求めることは困難である。
長谷川倫男他，「気中微生物リアルタイム検出技術とその応用」，株式会社山武，azbil Technical Review 2009年12月号，p.2-7，2009年
ヤン、Ｌ．ら、「Detection and quantification of bacterial autofluorescence at the single-cell level by a laboratory-built high-sensitivity flow cytometer」、アナリティカル・ケミストリ、２０１２年、第８４巻、ｐ．１５２６−１５３２
アグラノブスキ、Ｖ．ら、「Real-Time Measurement of bacterial aerosols with the UVAPS: performance evaluation」、ジャーナル・オブ・エアロゾル・サイエンス、２００３年、第３４巻、ｐ．３０１−３１７
ブロンク、Ｂ．Ｖ．ら、「Variability of steady-state bacterial fluorescence with respect to growth conditions」、アプライド・スペクトロスコピ、１９９３年、第４７巻、ｐ．４３６−４４０
ダルテリオ、Ｒ．Ａ．ら、「The steady-state and decay characteristics of primary fluorescence from live bacteria」、アプライド・スペクトロスコピ、１９８７年、第４１巻、ｐ．２３４−２４１
本発明は、複数種類の粒子の蛍光強度を容易に比較可能な方法を提供することを目的の一つとする。なお、蛍光は、自家蛍光を含む。
本発明者は、鋭意研究の末、粒子塊の表面における蛍光強度と、単一粒子の蛍光強度と、が相関することを見出した。粒子塊の蛍光強度は、単一粒子の蛍光強度よりも強いため、粒子塊の蛍光強度を測定するほうが、単一粒子の蛍光強度を測定するよりも容易であり、コストもかからない。そのため、本発明者は、複数種類の単一粒子の蛍光強度を比較することに代えて、複数種類の粒子塊の表面における蛍光強度を比較すれば、複数種類の粒子の蛍光特性を容易に比較可能であることを見出した。
本発明の態様によれば、（ａ）複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射することと、（ｂ）複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定することと、（ｃ）測定された複数種類の粒子塊の蛍光強度を比較することと、を含む、複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法が提供される。
また、本発明の態様によれば、（ａ）複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射することと、（ｂ）複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定することと、（ｃ）蛍光検出装置で、複数種類の粒子塊のそれぞれを構成する単一粒子に励起光を照射することと、（ｄ）蛍光検出装置で、複数種類の単一粒子のそれぞれの蛍光強度を測定することと、（ｅ）複数種類の粒子塊の表面における蛍光強度と、蛍光検出装置で測定した複数種類の単一粒子の蛍光強度と、が相関するか確認することと、を含む、蛍光検出装置の評価方法が提供される。
本発明によれば、粒子の蛍光強度を容易に比較可能な方法を提供可能である。
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
（第１の実施の形態）
本発明の第１の実施の形態に係る複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法は、図１に示すように、複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射するステップＳ１０２と、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定するステップＳ１０３と、測定された複数種類の粒子塊の蛍光強度を比較するステップＳ１０４と、を含む。
本発明の第１の実施の形態に係る複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法は、図１に示すように、複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射するステップＳ１０２と、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定するステップＳ１０３と、測定された複数種類の粒子塊の蛍光強度を比較するステップＳ１０４と、を含む。
粒子塊は、例えば、図１のステップＳ１０１で、遠心分離装置等で同一種類の粒子を凝集させることにより形成される。粒子は、生物粒子及び非生物粒子を含む。生物粒子は、微生物及び細胞を含む。微生物は、細菌等及びカビ胞子を含む真菌等を含む。細菌の例としては、グラム陰性菌、及びグラム陽性菌が挙げられる。グラム陰性菌の例としては、大腸菌が挙げられる。グラム陽性菌の例としては、表皮ブドウ球菌、枯草菌芽胞、マイクロコッカス、及びコリネバクテリウムが挙げられる。カビ胞子を含む真菌の例としては、アスペルギルスが挙げられる。
非生物粒子は、ポリスチレン粒子等の樹脂粒子を含む。ポリスチレン粒子は、例えばポリスチレンからなる。あるいは、ポリスチレン粒子は、ポリスチレンと、添加物と、からなる。またあるいは、ポリスチレン粒子は、例えば９８質量パーセントのポリスチレンと、２質量パーセントのジビニルベンゼンと、からなる。
粒子が微生物である場合、粒子塊は微生物塊である。微生物塊は、同一種類の微生物から形成される。例えば、グラム陰性菌のみからなる微生物塊、グラム陽性菌のみからなる微生物塊、カビ胞子のみからなる微生物塊、大腸菌のみからなる微生物塊、表皮ブドウ球菌のみからなる微生物塊、枯草菌芽胞のみからなる微生物塊、マイクロコッカスのみからなる微生物塊、コリネバクテリウムのみからなる微生物塊、アスペルギルスのみからなる微生物塊が形成される。
粒子が細胞である場合、粒子塊は細胞塊である。細胞塊は、同一種類の細胞から形成される。
粒子が非生物粒子である場合、粒子塊は非生物粒子塊である。非生物粒子塊は、同一種類の非生物粒子から形成される。例えば、同一商品のポリスチレン粒子のみからなる非微生物粒子塊が形成される。
図２に示すように、複数種類の粒子塊のそれぞれ１は、例えば、透明な基板２上に塗布され、配置される。透明な基板は、例えば石英からなるスライドガラスである。粒子塊は、所定の厚みをもって、粒子塊を構成する粒子が密となる状態で、基板上に配置される。これにより、粒子塊の表面における粒子の密度が、ほぼ均一となる。粒子塊は、蛍光強度の測定の際に、励起光の透過を妨げる程度の厚みを有することが好ましい。
図１のステップＳ１０２及びステップＳ１０３で、表面における蛍光強度を測定される複数種類の粒子塊のそれぞれは、例えば微生物塊、細胞塊、又は非生物粒子塊である。あるいは、表面における蛍光強度を測定される複数種類の粒子塊は、微生物塊と細胞塊を含む。またあるいは、表面における蛍光強度を測定される複数種類の粒子塊は、微生物塊と非生物粒子塊を含む。さらにあるいは、表面における蛍光強度を測定される複数種類の粒子塊は、細胞塊と非生物粒子塊を含む。なお、複数種類の粒子塊は、別々に、表面における蛍光強度を測定される。また、励起光の強度、及び蛍光強度が測定される部分の面積等の蛍光強度の測定条件は、複数種類の粒子塊のそれぞれに対して同一であることが好ましい。
微生物及び細胞は、励起光を照射されると、微生物及び細胞に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及びフラビン等が、蛍光を発する。ＮＡＤＨ由来の蛍光の波長は、４８０ｎｍ近傍である。また、フラビン由来の蛍光の波長は、５３０ｎｍ近傍である。ポリスチレン粒子も励起光を照射されると蛍光を発し、その後退色する。なお、蛍光は、自家蛍光を含む。励起光は、可視光であっても、紫外光であってもよい。励起光が可視光である場合、励起光の波長は、例えば４００乃至４１０ｎｍの範囲内であり、例えば４０５ｎｍである。励起光が紫外光である場合、励起光の波長は、例えば３１０乃至３８０ｎｍの範囲内であり、例えば３４０ｎｍである。ただし、励起光の波長は、対象となる粒子によって任意選択される。
基板が透明である場合、図３に示すように、複数種類の粒子塊のそれぞれ１の基板２に接している表面における蛍光強度を測定してもよい。ここで、複数種類の粒子塊のそれぞれ１の表面に対して励起光源３から励起光を斜入射させ、励起光の進行方向に対して垂直方向から蛍光検出器４によって複数種類の粒子塊のそれぞれ１の表面における蛍光強度を測定する、表面測光法を採用すると、測定される蛍光強度が粒子塊１の厚みに実質的に影響されない。図４に示すように、複数種類の粒子塊のそれぞれ１の表面における蛍光強度は、複数種類の粒子塊のそれぞれ１の表面に焦点を有する光学系５を介して測定されてもよい。複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定する装置としては、蛍光分光光度計等が使用可能であるが、これに限定されない。
図５において、第１の粒子塊１１は、第１の粒子１１１からなる。第２の粒子塊１２は、第２の粒子１１２からなる。第１の粒子１１１は相対的に大きく、第２の粒子１１２は相対的に小さい。第１の粒子塊１１の表面の蛍光が測定される範囲の面積Ｓと、第２の粒子塊１２の表面の蛍光が測定される範囲の面積Ｓと、は、同じに設定される。
蛍光測定器から単一の第１の粒子１１１を見た場合の単一の第１の粒子１１１の投影面積をｓ111、単一の第１の粒子１１１が発する蛍光の単位面積あたりの強度（蛍光密度）をｄ111とすると、単一の第１の粒子１１１の蛍光強度ｉ111は、下記（１）式で与えられる。
ｉ111＝ｄ111×ｓ111 （１）
面積Ｓに含まれる第１の粒子１１１の数をｎ111とすると、第１の粒子塊１１の表面の面積Ｓの範囲内の蛍光強度Ｉ111は、下記（２）式で与えられる。
Ｉ111＝ｉ111×ｎ111＝ｉ111×Ｓ／ｓ111＝ｄ111×ｓ111×Ｓ／ｓ111
＝ｄ111×Ｓ （２）
ｉ111＝ｄ111×ｓ111 （１）
面積Ｓに含まれる第１の粒子１１１の数をｎ111とすると、第１の粒子塊１１の表面の面積Ｓの範囲内の蛍光強度Ｉ111は、下記（２）式で与えられる。
Ｉ111＝ｉ111×ｎ111＝ｉ111×Ｓ／ｓ111＝ｄ111×ｓ111×Ｓ／ｓ111
＝ｄ111×Ｓ （２）
蛍光測定器から単一の第２の粒子１１２を見た場合の単一の第２の粒子１１２の投影面積をｓ112、単一の第２の粒子１１２の蛍光密度をｄ112とすると、単一の第２の粒子１１２の蛍光強度ｉ112は、下記（３）式で与えられる。
ｉ112＝ｄ112×ｓ112 （３）
面積Ｓに含まれる第２の粒子１１２の数をｎ112とすると、第２の粒子塊１２の表面の面積Ｓの範囲内の蛍光強度Ｉ112は、下記（４）式で与えられる。
Ｉ112＝ｉ112×ｎ112＝ｉ112×Ｓ／ｓ112＝ｄ112×ｓ112×Ｓ／ｓ112
＝ｄ112×Ｓ （４）
ｉ112＝ｄ112×ｓ112 （３）
面積Ｓに含まれる第２の粒子１１２の数をｎ112とすると、第２の粒子塊１２の表面の面積Ｓの範囲内の蛍光強度Ｉ112は、下記（４）式で与えられる。
Ｉ112＝ｉ112×ｎ112＝ｉ112×Ｓ／ｓ112＝ｄ112×ｓ112×Ｓ／ｓ112
＝ｄ112×Ｓ （４）
上記（２）式及び（４）式の結果から明らかなように、表面測光法によれば、励起光を照射された粒子塊の表面の一定面積Ｓの範囲内の蛍光強度は、粒子塊を構成する粒子の数ｎ111，ｎ112や大きさｓ111，ｓ112に依存せず、蛍光密度ｄ111，ｄ112のみに依存すると近似可能である。なお、粒子が球等の対称的な形状を有しておらず、非対称的な形状を有していても、粒子塊を形成することで、形状の非対称性が打ち消しあい、粒子は対称的な形状を有するとみなしてもよい。
図１のステップＳ１０４で、複数種類の粒子塊の蛍光強度を比較する。例えば、第１の粒子塊の蛍光強度と、第２の粒子塊の蛍光強度と、第３の粒子塊の蛍光強度と、を比較する。第１の粒子塊の蛍光強度と、第２の粒子塊の蛍光強度と、第３の粒子塊の蛍光強度は、第１の粒子塊を構成する第１の粒子１つの蛍光強度と、第２の粒子塊を構成する第２の粒子１つの蛍光強度と、第３の粒子塊を構成する第３の粒子１つの蛍光強度に相関する。したがって、単一粒子の蛍光強度を測定しなくとも、第１の粒子塊の蛍光強度と、第２の粒子塊の蛍光強度と、第３の粒子塊の蛍光強度と、を比較することにより、第１の粒子１つの蛍光強度と、第２の粒子１つの蛍光強度と、第３の粒子１つの蛍光強度と、を比較したときの結果を予測することが可能となる。
上記例において、第１の粒子塊、第２の粒子塊、及び第３の粒子塊は、全て微生物塊であってもよいし、全て細胞塊であってもよいし、全て非微生物粒子塊であってもよい。あるいは、第１の粒子塊及び第３の粒子塊が非微生物粒子塊で、第２の粒子塊が微生物塊であってもよい。その他、複数の粒子塊の組み合わせは、種々選択可能である。
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施の形態に係る蛍光検出装置の評価方法は、図６に示すように、複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射するステップＳ２０２と、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定するステップＳ２０３と、蛍光検出装置で、複数種類の粒子塊のそれぞれを構成する単一粒子に励起光を照射するステップＳ２０５と、蛍光検出装置で、複数種類の単一粒子のそれぞれの蛍光強度を測定するステップＳ２０６と、複数種類の粒子塊の表面における蛍光強度と、蛍光検出装置で測定した複数種類の単一粒子の蛍光強度と、が相関するか確認するステップＳ２０８と、を含む。
本発明の第２の実施の形態に係る蛍光検出装置の評価方法は、図６に示すように、複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射するステップＳ２０２と、複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定するステップＳ２０３と、蛍光検出装置で、複数種類の粒子塊のそれぞれを構成する単一粒子に励起光を照射するステップＳ２０５と、蛍光検出装置で、複数種類の単一粒子のそれぞれの蛍光強度を測定するステップＳ２０６と、複数種類の粒子塊の表面における蛍光強度と、蛍光検出装置で測定した複数種類の単一粒子の蛍光強度と、が相関するか確認するステップＳ２０８と、を含む。
図６のステップＳ２０１ないしステップＳ２０４は、図１のステップＳ１０１ないしステップＳ１０４と同様である。例えば、第１の粒子塊の蛍光強度と、第２の粒子塊の蛍光強度と、第３の粒子塊の蛍光強度と、が測定され、比較される。図６のステップＳ２０５ないしステップＳ２０６で、評価の対象となる蛍光検出装置によって、第１の粒子塊を構成する第１の粒子１つの蛍光強度と、第２の粒子塊を構成する第２の粒子１つの蛍光強度と、第３の粒子塊を構成する第３の粒子１つの蛍光強度と、が測定される。
図７に示すように、評価の対象となる蛍光検出装置は、例えばエアロゾル検出装置２２０であり、エアロゾル検出装置２２０は、例えば試験室２０１に設置されている。試験室２０１は、骨格をなす例えばアルミニウム製のフレームと、フレームにはめ込まれた、側壁をなすポリカーボネート製の透明パネルと、を備えるチャンバである。試験室２０１には、例えば給気装置２１１Ａ、２１１Ｂが設けられている。給気装置２１１Ａ、２１１Ｂは、ＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）及びＵＬＰＡ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ａｉｒ Ｆｉｌｔｅｒ）等の超高性能エアフィルタを通して、試験室２０１内部に清浄な空気を送り込む。試験室２０１の側壁には、扉が設けられていてもよい。
粒子は、試験室２０１に設けられた噴霧装置２０２から、試験室２０１内部に放出される。噴霧装置２０２は、例えばジェット式ネブライザであり、所定の濃度で粒子を含む流体を保管する。噴霧装置２０２は、所定の流量で圧縮ガス等の気流を供給され、気流を、粒子を含む流体に吹きつけることによってエアロゾルを発生させ、試験室２０１内部に粒子を含む流体をミスト状にして噴霧する。なお、図７においては、噴霧装置２０２は試験室２０１内部に配置されているが、噴霧装置２０２を試験室２０１の外部に配置し、噴霧装置２０２が噴霧したエアロゾルを、配管等で試験室２０１内部に誘導してもよい。
試験室２０１内には、攪拌装置としての攪拌ファン２１０Ａ、２１０Ｂ、２１０Ｃ、２１０Ｄが配置されている。攪拌ファン２１０Ａ−２１０Ｄは、試験室２０１内部の空気を攪拌し、試験室２０１内部に散布された粒子の自重による自然沈降を防止する。
また、試験室２０１内には、清浄化装置としてのエアクリーナ２０６が配置されている。エアクリーナ２０６は、試験室２０１内部の空気等の気体に含まれる微粒子や微生物を除去して、気体を清浄化する。例えば、噴霧装置２０２から試験室２０１内に粒子を含む流体を噴霧する前に、エアクリーナ２０６を運転することによって、噴霧装置２０２が噴霧する粒子以外の微粒子や微生物をあらかじめ試験室２０１内部から除去することが可能である。なお、図７においては、エアクリーナ２０６は試験室２０１内部底面に配置されているが、エアクリーナ２０６を試験室２０１の壁面または天井部に配置してもよい。
エアロゾル検出装置２２０は、例えば図８の模式的な断面図に示すように、筐体２２１と、試験室２０１の内部から筐体２２１の内部に、空気を吸引する第１の吸引装置２２２と、を備える。第１の吸引装置２２２で吸引された空気は、筐体２２１内部のノズル２２３の先端から放出される。ノズル２２３の先端から放出された空気は、ノズル２２３の先端と対向して筐体２２１の内部に配置された第２の吸引装置２２４で吸引される。エアロゾル検出装置２２０は、レーザ等の光源２２５をさらに備える。光源２２５は、ノズル２２３の先端から放出され、第２の吸引装置２２４で吸引される空気に向けて、レーザ光２２６を照射する。
空気中に粒子が含まれる場合、レーザ光２２６を照射された粒子のそれぞれが、蛍光を発する。エアロゾル検出装置２２０は、蛍光検出器２２７をさらに備える。蛍光検出器２２７は、単一粒子が発した蛍光を検出し、蛍光強度を計測する。
図６のステップＳ２０７で、評価対象の蛍光検出装置で測定された第１の粒子１つの蛍光強度と、第２の粒子１つの蛍光強度と、第３の粒子１つの蛍光強度と、を比較する。さらに、ステップＳ２０８で、複数種類の粒子塊の表面における蛍光強度と、蛍光検出装置で測定した複数種類の単一粒子の蛍光強度と、が相関するか確認する。例えば、ステップＳ２０４で、第１の粒子塊の蛍光強度が最も高く、第２の粒子塊の蛍光強度が２番目に高く、第３の粒子塊の蛍光強度が最も弱いという結果が出た場合に、ステップＳ２０７で、単一の第１の粒子の蛍光強度が最も高く、単一の第２の粒子の蛍光強度が２番目に高く、単一の第３の粒子の蛍光強度が最も弱いという結果が出たか否かを確認する。
単一の第１の粒子の蛍光強度が最も高く、単一の第２の粒子の蛍光強度が２番目に高く、単一の第３の粒子の蛍光強度が最も弱いという結果が出た場合、相関があると判定する。単一の第１の粒子の蛍光強度が最も高く、単一の第２の粒子の蛍光強度が２番目に高く、単一の第３の粒子の蛍光強度が最も弱いという結果が出なかった場合、あるいは、いずれかの粒子の蛍光強度が測定できなかった場合、相関がないと判定する。さらに、相関があった場合は、エアロゾル検出装置は正常であり、第１ないし第３の粒子の蛍光の検出に適していると判定する。相関がなかった場合、エアロゾル検出装置は異常である、あるいは第１ないし第３の粒子の蛍光の検出に適していないと判定する。
なお、評価対象となる蛍光検出装置は、エアロゾル検出装置に限られない。評価対象となる蛍光検出装置は、単一粒子の蛍光を測定可能な全ての装置を含み、例えば、蛍光顕微鏡、微生物検出装置、ラマン分光光度計、及びフローサイトメータ等を含む。
（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、図９に示すように、基板３０２は不透明であってもよい。基板３０２が不透明である場合、複数種類の粒子塊のそれぞれ１の基板３０２に接していない表面における蛍光強度を測定する。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、図９に示すように、基板３０２は不透明であってもよい。基板３０２が不透明である場合、複数種類の粒子塊のそれぞれ１の基板３０２に接していない表面における蛍光強度を測定する。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
（微生物の入手）
入手した微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、略称Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １２２２８）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｌａｅ、ＡＴＣＣ ２７５６６）、及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、ＡＴＣＣ ５１４０３）であった。なお、ＡＴＣＣは、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の略である。
入手した微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、略称Ｅ．ｃｏｌｉ、ＡＴＣＣ １３７０６）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ １２２２８）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｌａｅ、ＡＴＣＣ ２７５６６）、及びコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、ＡＴＣＣ ５１４０３）であった。なお、ＡＴＣＣは、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の略である。
（微生物塊の調製）
−８０℃でストックされた大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスを３００ｍＬの三角フラスコ中１５０ｍＬのトリプトソイ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｆ：２１１８２５）に植菌し、定常期に達するまで３２℃で一夜、好気的に培養した。また、コリネバクテリウムについては、液体培地としてＲ培地（ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、麦芽エキス５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビーフエキス２ｇ、グリセリン ２ｇ、ツイーン８０ ５０ｍｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）、を使用した。培養液を遠心機（久保田商事株式会社 ２４１０）で２，１００ｇｘ１０分で遠心して集菌し、上清の培地を取り除いた後、ＰＢＳに再懸濁した。さらに同条件で遠心し、上清を取り除くことで洗浄した。同様に計３回洗浄を繰り返した。得られたペレットを微生物塊とした。
−８０℃でストックされた大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスを３００ｍＬの三角フラスコ中１５０ｍＬのトリプトソイ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｆ：２１１８２５）に植菌し、定常期に達するまで３２℃で一夜、好気的に培養した。また、コリネバクテリウムについては、液体培地としてＲ培地（ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、麦芽エキス５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビーフエキス２ｇ、グリセリン ２ｇ、ツイーン８０ ５０ｍｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）、を使用した。培養液を遠心機（久保田商事株式会社 ２４１０）で２，１００ｇｘ１０分で遠心して集菌し、上清の培地を取り除いた後、ＰＢＳに再懸濁した。さらに同条件で遠心し、上清を取り除くことで洗浄した。同様に計３回洗浄を繰り返した。得られたペレットを微生物塊とした。
（分光光度計による蛍光強度の測定）
上述した大腸菌からなる微生物塊、表皮ブドウ球菌からなる微生物塊、マイクロコッカスからなる微生物塊、及びコリネバクテリウムからなる微生物塊のそれぞれをスライドガラス上に十分量塗布した。スライドガラスを、蛍光の表面測定が可能な蛍光分光光度計ＦＰ８５００（日本分光株式会社）のフィルム測定ホルダに固定し装置にセットした。蛍光スペクトルの測定は、励起波長を４０５ｎｍとし、励起光源側に３９０−４１０ｎｍ透過のバンドパスフィルター、蛍光測定器側に４２０ｎｍカットオンのロングパスフィルターを使用して行われた。微生物塊のそれぞれの表面における蛍光強度は、４４０−７００ｎｍの範囲のピーク面積を計算して求めた。
上述した大腸菌からなる微生物塊、表皮ブドウ球菌からなる微生物塊、マイクロコッカスからなる微生物塊、及びコリネバクテリウムからなる微生物塊のそれぞれをスライドガラス上に十分量塗布した。スライドガラスを、蛍光の表面測定が可能な蛍光分光光度計ＦＰ８５００（日本分光株式会社）のフィルム測定ホルダに固定し装置にセットした。蛍光スペクトルの測定は、励起波長を４０５ｎｍとし、励起光源側に３９０−４１０ｎｍ透過のバンドパスフィルター、蛍光測定器側に４２０ｎｍカットオンのロングパスフィルターを使用して行われた。微生物塊のそれぞれの表面における蛍光強度は、４４０−７００ｎｍの範囲のピーク面積を計算して求めた。
（空中浮遊菌検出機による蛍光強度の測定）
−８０℃でストックされた大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスを１５ｍＬ容量のテストチューブ中３ｍＬのトリプトソイ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｅｆ：２１１８２５）に植菌し、３２℃で一夜、好気的に培養した。さらに、培養した菌液からトリプトソイ寒天培地（栄研化学株式会社、Ｅ−ＭＰ２５）上に画線し、３２℃で一夜、好気的に培養した。なお、コリネバクテリウムについては、液体培地としてＲ培地（ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、麦芽エキス５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビーフエキス２ｇ、グリセリン２ｇ、ツイーン８０ ５０ ｍｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）、寒天培地として羊血液寒天培地（栄研化学株式会社 Ｍ−５８）を使用した。培養終了後、寒天培地上のコロニーをかきとり、５ｍＬの滅菌蒸留水中に懸濁した。軽くボルテックスして細胞を分散させた後、２，１００ｇｘ３分で遠心して集菌し、上清を取り除くことで洗浄した。最終的に５ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁した。
−８０℃でストックされた大腸菌、表皮ブドウ球菌、及びマイクロコッカスを１５ｍＬ容量のテストチューブ中３ｍＬのトリプトソイ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｅｆ：２１１８２５）に植菌し、３２℃で一夜、好気的に培養した。さらに、培養した菌液からトリプトソイ寒天培地（栄研化学株式会社、Ｅ−ＭＰ２５）上に画線し、３２℃で一夜、好気的に培養した。なお、コリネバクテリウムについては、液体培地としてＲ培地（ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、麦芽エキス５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビーフエキス２ｇ、グリセリン２ｇ、ツイーン８０ ５０ ｍｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）、寒天培地として羊血液寒天培地（栄研化学株式会社 Ｍ−５８）を使用した。培養終了後、寒天培地上のコロニーをかきとり、５ｍＬの滅菌蒸留水中に懸濁した。軽くボルテックスして細胞を分散させた後、２，１００ｇｘ３分で遠心して集菌し、上清を取り除くことで洗浄した。最終的に５ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁した。
ＨＥＰＡフィルターユニットを設置した３ｍ3容量の密閉したチャンバ内で、ＨＥＰＡフィルターユニットを運転して内部の空気を清浄化した後、適当な濁度に調整した微生物の懸濁液のそれぞれをネブライザ（Ｓａｌｔｅｒ Ｌａｂｓ製 Ｒｅｆ：８９００）で、５Ｌ／分の流量で２０秒噴霧し、空中浮遊させた。次に３０秒間内部の空気を攪拌し、水滴を乾燥させるとともに微生物を均一に拡散させた。その後６０秒間、空中浮遊菌検出機（Ａｚｂｉｌ ＢｉｏＶｉｇｉｌａｎｔ社製ＩＭＤ−Ａ）で、浮遊する微粒子のそれぞれ１つずつが発する蛍光の蛍光強度を測定した。
（微生物塊の蛍光強度と、単一微生物の蛍光強度との相関）
図１０に示すように、微生物塊表面の単位面積あたりの蛍光強度は、単一微生物の蛍光強度と相関していた。
図１０に示すように、微生物塊表面の単位面積あたりの蛍光強度は、単一微生物の蛍光強度と相関していた。
（比較例）
実施例と同様に微生物の懸濁液を得た後、懸濁液の蛍光強度を測定した。図１１に示すように、濁度の測定値から単位細胞数あたりに換算した懸濁液の蛍光強度と、単一微生物の蛍光強度とは、相関していなかった。
実施例と同様に微生物の懸濁液を得た後、懸濁液の蛍光強度を測定した。図１１に示すように、濁度の測定値から単位細胞数あたりに換算した懸濁液の蛍光強度と、単一微生物の蛍光強度とは、相関していなかった。
１ 粒子塊
２ 基板
３ 励起光源
４ 蛍光検出器
５ 光学系
１１ 第１の粒子塊
１２ 第２の粒子塊
１１１ 第１の粒子
１１２ 第２の粒子
２０１ 試験室
２０２ 噴霧装置
２０６ エアクリーナ
２１０Ａ、２１０Ｂ、２１０Ｃ、２１０Ｄ 攪拌ファン
２１１Ａ、２１１Ｂ 給気装置
２２０ エアロゾル検出装置
２２１ 筐体
２２２ 吸引装置
２２３ ノズル
２２４ 吸引装置
２２５ 光源
２２６ レーザ光
２２７ 蛍光検出器
３０２ 基板
２ 基板
３ 励起光源
４ 蛍光検出器
５ 光学系
１１ 第１の粒子塊
１２ 第２の粒子塊
１１１ 第１の粒子
１１２ 第２の粒子
２０１ 試験室
２０２ 噴霧装置
２０６ エアクリーナ
２１０Ａ、２１０Ｂ、２１０Ｃ、２１０Ｄ 攪拌ファン
２１１Ａ、２１１Ｂ 給気装置
２２０ エアロゾル検出装置
２２１ 筐体
２２２ 吸引装置
２２３ ノズル
２２４ 吸引装置
２２５ 光源
２２６ レーザ光
２２７ 蛍光検出器
３０２ 基板
Claims (24)
- 複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射することと、
前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定することと、
測定された前記複数種類の粒子塊の蛍光強度を比較することと、
を含む、
複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。 - 前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面に対して前記励起光を斜入射させる、請求項１に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記励起光の進行方向に対して垂直方向から前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定する、請求項２に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面に焦点を有する光学系を介して、前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれが基板上に配置されている、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記基板が透明であり、前記複数種類の粒子塊のそれぞれの前記基板に接している前記表面における蛍光強度を測定する、請求項５に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記基板が石英からなる、請求項６に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 蛍光分光光度計で、前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれが微生物塊である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記複数種類の粒子塊が、微生物塊と、非生物粒子塊と、を含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれが細胞塊である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 前記複数種類の粒子塊が、細胞塊と、非生物粒子塊と、を含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の複数種類の粒子の蛍光強度の比較方法。
- 複数種類の粒子塊のそれぞれに励起光を照射することと、
前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定することと、
蛍光検出装置で、前記複数種類の粒子塊のそれぞれを構成する単一粒子に励起光を照射することと、
前記蛍光検出装置で、前記複数種類の単一粒子のそれぞれの蛍光強度を測定することと、
前記複数種類の粒子塊の表面における蛍光強度と、前記蛍光検出装置で測定した前記複数種類の単一粒子の蛍光強度と、が相関するか確認することと、
を含む、蛍光検出装置の評価方法。 - 前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面に対して前記励起光を斜入射させる、請求項１３に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記励起光の進行方向に対して垂直方向から前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定する、請求項１４に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面に焦点を有する光学系を介して、前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定する、請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれが基板上に配置されている、請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記基板が透明であり、前記複数種類の粒子塊のそれぞれの前記基板に接している前記表面における蛍光強度を測定する、請求項１７に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記基板が石英からなる、請求項１８に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 蛍光分光光度計で、前記複数種類の粒子塊のそれぞれの表面における蛍光強度を測定する、請求項１３ないし１９のいずれか１項に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれが微生物塊である、請求項１３ないし２０のいずれか１項に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記複数種類の粒子塊が、微生物塊と、非生物粒子塊と、を含む、請求項１３ないし２０のいずれか１項に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記複数種類の粒子塊のそれぞれが細胞塊である、請求項１３ないし２０のいずれか１項に記載の蛍光検出装置の評価方法。
- 前記複数種類の粒子塊が、細胞塊と、非生物粒子塊と、を含む、請求項１３ないし２０のいずれか１項に記載の蛍光検出装置の評価方法。
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