JPH09119926A - 尿検体の分析方法 - Google Patents
尿検体の分析方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 実務上の要求を満たし、特に細菌培養を行わ
ず、かつ尿検体を強制的に沈降させることなく生存細菌
と白血球とを同時に検出し、計数することを可能にす
る、同じ尿検体中における細菌と白血球の検出方法を提
供すること。 【解決手段】 生存細菌と白血球（ＷＢＣ）の両方を迅
速かつ同時に計数するため、（１）尿検体中に存在する
生存細菌と白血球（ＷＢＣ）を同一条件下で、細菌と白
血球を標識化および蓄積し、異なる蛍光成分にする細菌
の蛍光生存可能なマーカーで同時にラベル化し、（２）
蛍光マーカーの光電検出によってすべての蛍光成分を自
動的に計数し、かつ（３）一方で細菌の全数、他方で白
血球の全数を知るため、蛍光成分をそれらのサイズに基
づいて、蛍光生存細菌と蛍光白血数に同時に分類するこ
とから尿検体の分析方法。
ず、かつ尿検体を強制的に沈降させることなく生存細菌
と白血球とを同時に検出し、計数することを可能にす
る、同じ尿検体中における細菌と白血球の検出方法を提
供すること。 【解決手段】 生存細菌と白血球（ＷＢＣ）の両方を迅
速かつ同時に計数するため、（１）尿検体中に存在する
生存細菌と白血球（ＷＢＣ）を同一条件下で、細菌と白
血球を標識化および蓄積し、異なる蛍光成分にする細菌
の蛍光生存可能なマーカーで同時にラベル化し、（２）
蛍光マーカーの光電検出によってすべての蛍光成分を自
動的に計数し、かつ（３）一方で細菌の全数、他方で白
血球の全数を知るため、蛍光成分をそれらのサイズに基
づいて、蛍光生存細菌と蛍光白血数に同時に分類するこ
とから尿検体の分析方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、尿検体の分析方法
に関し、より詳細には、尿の特異な検査による尿路感染
（ＵＴＩ）の迅速診断方法に関する。
に関し、より詳細には、尿の特異な検査による尿路感染
（ＵＴＩ）の迅速診断方法に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】尿管感染
の場合に２つの実験室的試験、すなわち白血球（膿尿）
の計数と微生物（細菌尿）の培養が特に行われている。
これら２つのテストは独立した診断価値を示すものであ
る。すなわち膿尿のない細菌尿は組織の侵襲がなくて尿
中の細菌の集落化または検体の汚染を示し、細菌尿がな
い膿尿は感染がなくて炎症を示すか、ときに嫌気性細菌
の存在を表すものである。
の場合に２つの実験室的試験、すなわち白血球（膿尿）
の計数と微生物（細菌尿）の培養が特に行われている。
これら２つのテストは独立した診断価値を示すものであ
る。すなわち膿尿のない細菌尿は組織の侵襲がなくて尿
中の細菌の集落化または検体の汚染を示し、細菌尿がな
い膿尿は感染がなくて炎症を示すか、ときに嫌気性細菌
の存在を表すものである。
【０００３】しかしながらこれら２つの知見が臨床上、
共同できれば実験室的実務を緩和することになる。なぜ
なら、２つの知見が、異なった時間で異なるサンプルで
よく行われた２つの別々のテスト結果であるのが一般
で、その結果の比較と解釈が非常に難しいからである。
一般に膿尿は沈降によって濃縮された尿中の固形成分に
ついての顕微鏡的検査（拡大視野）として尿サンプル中
の白血球の数を測定することによって評価されている。
しかしこの方法は不正確で白血球の排泄率との相関が悪
く、再現性がなくかつ時間浪費である。不正確さの主な
原因は沈降法の結果であることが分かっており、その方
法では検査された容量と元サンプルの量の関係が悪い
（Am. J. Med., 1983, 53-58）。かわりに、血清化学分
析器で未希釈尿が白血球アルカリホスホターゼで分析で
きるが、この方法は感度が十分ではない。
共同できれば実験室的実務を緩和することになる。なぜ
なら、２つの知見が、異なった時間で異なるサンプルで
よく行われた２つの別々のテスト結果であるのが一般
で、その結果の比較と解釈が非常に難しいからである。
一般に膿尿は沈降によって濃縮された尿中の固形成分に
ついての顕微鏡的検査（拡大視野）として尿サンプル中
の白血球の数を測定することによって評価されている。
しかしこの方法は不正確で白血球の排泄率との相関が悪
く、再現性がなくかつ時間浪費である。不正確さの主な
原因は沈降法の結果であることが分かっており、その方
法では検査された容量と元サンプルの量の関係が悪い
（Am. J. Med., 1983, 53-58）。かわりに、血清化学分
析器で未希釈尿が白血球アルカリホスホターゼで分析で
きるが、この方法は感度が十分ではない。
【０００４】血球計を用いて未脱水尿中の白血球を計数
して得られた、より定量的な結果が排泄率と尿管感染に
より相関することが分かっている（Blum et al. J. Ge
n. Int. Med., 1992, 149-144）。しかしこれも時間が
かかり、かつ普通に利用できない。しかしこれらの方法
は、実行が難しく、費用がかかり、かつ通常の尿中にお
ける白血球の比較的低濃度で行うとき（ml当たり10,000
以下）、十分な感度ではない。
して得られた、より定量的な結果が排泄率と尿管感染に
より相関することが分かっている（Blum et al. J. Ge
n. Int. Med., 1992, 149-144）。しかしこれも時間が
かかり、かつ普通に利用できない。しかしこれらの方法
は、実行が難しく、費用がかかり、かつ通常の尿中にお
ける白血球の比較的低濃度で行うとき（ml当たり10,000
以下）、十分な感度ではない。
【０００５】細菌尿は、一般にＵＴＩの診断用標準方法
である培養によって検出される。しかしこのような手法
は費用がかかり、結果が容易に得られない。すなわち、
テストは陽性の結果を得るのに１〜２日を必要とし、陰
性結果を確かめるのに７日程も必要とするからである。
このような診断の遅延は、迅速な判断が速やかな処置を
させ、特に小さな子供や幼児の腎障害を避け得るので、
重要な欠点となる。
である培養によって検出される。しかしこのような手法
は費用がかかり、結果が容易に得られない。すなわち、
テストは陽性の結果を得るのに１〜２日を必要とし、陰
性結果を確かめるのに７日程も必要とするからである。
このような診断の遅延は、迅速な判断が速やかな処置を
させ、特に小さな子供や幼児の腎障害を避け得るので、
重要な欠点となる。
【０００６】尿中における細菌のより迅速な検出法とし
て、例えばグラム染色やＡＴＰ生物発光のようなものが
提案されている（Pezzlo et al., J. Clin. Microbio
l., 1989, 716-720)。しかしこれらの方法は、一般に培
養法の感度を示さず、実際に生存細菌に対する所望の検
出感度はml当たり10,000以下である。医薬用の所要検出
感度は、細菌と白血球（ＷＢＣ）に対して類似であり、
一般に迅速検出法では達せられない。
て、例えばグラム染色やＡＴＰ生物発光のようなものが
提案されている（Pezzlo et al., J. Clin. Microbio
l., 1989, 716-720)。しかしこれらの方法は、一般に培
養法の感度を示さず、実際に生存細菌に対する所望の検
出感度はml当たり10,000以下である。医薬用の所要検出
感度は、細菌と白血球（ＷＢＣ）に対して類似であり、
一般に迅速検出法では達せられない。
【０００７】上記の欠点を解消する観点で、ＵＴＩを検
出するため尿の迅速スクリーニングをする提案された多
くの方法がある。これらの方法には例えば次のものがあ
る。 −白血球と細胞の双方のエステラーゼ活性に反応する迅
速計量棒（dipstick） テスト（上記引用のBlum et al, Bachman et al., JAM
A, 1993, 270, 6, 1971-1974;上記引用のPezzlo et a
l）。しかしこのテストは白血球と細菌の区別を与えず
感度が制限される。例えば１０2〜１０3 ＣＦＵ／mlレ
ベルでの細菌尿はケースの５０％以下で検出される。
出するため尿の迅速スクリーニングをする提案された多
くの方法がある。これらの方法には例えば次のものがあ
る。 −白血球と細胞の双方のエステラーゼ活性に反応する迅
速計量棒（dipstick） テスト（上記引用のBlum et al, Bachman et al., JAM
A, 1993, 270, 6, 1971-1974;上記引用のPezzlo et a
l）。しかしこのテストは白血球と細菌の区別を与えず
感度が制限される。例えば１０2〜１０3 ＣＦＵ／mlレ
ベルでの細菌尿はケースの５０％以下で検出される。
【０００８】−グラム染色 −濾過法（上記引用のPezzloら） −白血球用の定量的鏡検。 計量棒分析、標準鏡検尿分析、血球計数法による細胞計
数およびグラム染色の結果と標準尿培養の結果とが比較
されている（上記Blumら）。標準尿検査（遠心分離した
検体の顕微鏡的分析）が、最も正確で簡単な方法で外来
症候女性の細菌尿を予測するものであった。生物発光法
とのさらなる比較が上記Pezzloらで示されている。
数およびグラム染色の結果と標準尿培養の結果とが比較
されている（上記Blumら）。標準尿検査（遠心分離した
検体の顕微鏡的分析）が、最も正確で簡単な方法で外来
症候女性の細菌尿を予測するものであった。生物発光法
とのさらなる比較が上記Pezzloらで示されている。
【０００９】最近の研究では未脱水の尿検体について定
量的に行われる目視鏡検によって白血球と細菌を計数す
ることが提案されている（Vickers et al., The Lance
t, 1991, 338, 8770, 767-770; Hiraoka et al., Scan
d. J; Clin. Lab, Invest., 1993, 53, 705-709）。こ
れらの研究で、目視同定が特異な染色を通常することな
く細菌と白血球になされたときに最良の結果が得られ
る。
量的に行われる目視鏡検によって白血球と細菌を計数す
ることが提案されている（Vickers et al., The Lance
t, 1991, 338, 8770, 767-770; Hiraoka et al., Scan
d. J; Clin. Lab, Invest., 1993, 53, 705-709）。こ
れらの研究で、目視同定が特異な染色を通常することな
く細菌と白血球になされたときに最良の結果が得られ
る。
【００１０】使い捨て計数チャンバーでの尿鏡検が球菌
を含む各種の細菌種によるＵＴＩの診断法として簡単、
鋭敏で、かつ時間とコストがセーブできる方法であると
平岡らは述べているが、この方法は次のごとくいくつか
の欠点がある。すなわち低濃度の細菌において培養法よ
り感度が低く、生存細菌と非生存細菌の区別がなく、偽
陽性を招き追試の培養を必要とする。その方法は労働集
中が必要であり容易にかつ再現性を求めるには熟練した
オペレーターとミラースライドや相コントラスト対物レ
ンズのような特別の光学装置を必要とする。
を含む各種の細菌種によるＵＴＩの診断法として簡単、
鋭敏で、かつ時間とコストがセーブできる方法であると
平岡らは述べているが、この方法は次のごとくいくつか
の欠点がある。すなわち低濃度の細菌において培養法よ
り感度が低く、生存細菌と非生存細菌の区別がなく、偽
陽性を招き追試の培養を必要とする。その方法は労働集
中が必要であり容易にかつ再現性を求めるには熟練した
オペレーターとミラースライドや相コントラスト対物レ
ンズのような特別の光学装置を必要とする。
【００１１】尿のマイクロスコピー分析の自動化のため
に沈積尿のイメージ分析を行なう技術が提案されている
（Deindoerfer et al., Clin. Chem., 1982, 28, 9, 19
10-1016; Elin et al., Am. J. Clin. Pathol. 1986, 8
6, 731-737）。これらのシステムでは血球、キャストお
よび結晶のような大きな粒子を計数して分類するもので
あるが、細胞計数システムは小さな細菌を検出する観点
で粒子を区別する性能がない。したがってＵＴＩの予測
値は極めて低い。また沈降サンプルについての定量の問
題がある。
に沈積尿のイメージ分析を行なう技術が提案されている
（Deindoerfer et al., Clin. Chem., 1982, 28, 9, 19
10-1016; Elin et al., Am. J. Clin. Pathol. 1986, 8
6, 731-737）。これらのシステムでは血球、キャストお
よび結晶のような大きな粒子を計数して分類するもので
あるが、細胞計数システムは小さな細菌を検出する観点
で粒子を区別する性能がない。したがってＵＴＩの予測
値は極めて低い。また沈降サンプルについての定量の問
題がある。
【００１２】実際に１０5 ＣＦＵ／ml尿より少ない場合
のＵＴＩ（例えば急性の尿道症候群）は上記の迅速方法
で検出することは非常に困難で付随の膿尿が必要であ
る。したがって尿中の白血球を評価することが重要であ
る。しかし上記の方法のいずれも細菌、殊に生存細菌と
白血球を同時に定量検出するものではない。上記の技術
における欠点を次に要約する。
のＵＴＩ（例えば急性の尿道症候群）は上記の迅速方法
で検出することは非常に困難で付随の膿尿が必要であ
る。したがって尿中の白血球を評価することが重要であ
る。しかし上記の方法のいずれも細菌、殊に生存細菌と
白血球を同時に定量検出するものではない。上記の技術
における欠点を次に要約する。
【００１３】尿中細菌の直接検出 １．自動培養法：この方法は鋭敏で細菌を分類するが、
スローであり臨床上と実務上有用であることが分かって
いる膿尿（ＷＢＣ）についての情報を与えない（偽陽性
結果を除外するため）。 ２．沈渣の鏡検分析：自動化されているか、非自動化に
関係なく、このテストは生存細菌についての情報を与え
ない問題がある。また膿尿の測定は沈渣についてのもの
であるため正確ではなく結果としてＵＴＩと相関しな
い。
スローであり臨床上と実務上有用であることが分かって
いる膿尿（ＷＢＣ）についての情報を与えない（偽陽性
結果を除外するため）。 ２．沈渣の鏡検分析：自動化されているか、非自動化に
関係なく、このテストは生存細菌についての情報を与え
ない問題がある。また膿尿の測定は沈渣についてのもの
であるため正確ではなく結果としてＵＴＩと相関しな
い。
【００１４】３．細胞カウンター：このカウンターは細
菌が高濃度で存在するときのみ検出することができる
が、生存細菌を区別できない。 ４．フィルターと紙：この方法は迅速で体細胞（ＷＢ
Ｃ，ＲＢＣなど）ならびに細菌の両者を感知することに
よって感度を得る。しかしこれらを別々に定量すること
ができないので細菌とＷＢＣを別々に計数する臨床およ
び実務上の利点が失われる。
菌が高濃度で存在するときのみ検出することができる
が、生存細菌を区別できない。 ４．フィルターと紙：この方法は迅速で体細胞（ＷＢ
Ｃ，ＲＢＣなど）ならびに細菌の両者を感知することに
よって感度を得る。しかしこれらを別々に定量すること
ができないので細菌とＷＢＣを別々に計数する臨床およ
び実務上の利点が失われる。
【００１５】５．生物発光法：この方法は生存細菌およ
び非生存細菌の両方を検出する。しかし体細胞が通常レ
ベルでもかなりの干渉をするので最初に除去されなけれ
ばならない。その上、この技術は迅速ではあるがあまり
鋭敏ではない。 ６．計量棒：この技術は迅速ではあるが、あまり鋭敏で
はない。膿尿の評価による尿中細菌の間接検出 １．沈積の鏡検分析：膿尿の測定は沈積をするために正
確ではなく結果としてＵＴＩと相関しない。
び非生存細菌の両方を検出する。しかし体細胞が通常レ
ベルでもかなりの干渉をするので最初に除去されなけれ
ばならない。その上、この技術は迅速ではあるがあまり
鋭敏ではない。 ６．計量棒：この技術は迅速ではあるが、あまり鋭敏で
はない。膿尿の評価による尿中細菌の間接検出 １．沈積の鏡検分析：膿尿の測定は沈積をするために正
確ではなく結果としてＵＴＩと相関しない。
【００１６】２．未脱水尿の鏡検分析：この方法は互い
に異なる成分（ＷＢＣまたは細菌）を認識するのが難し
く、その上低頻度で存在する成分を検出することが非常
に難しい（例えば細菌について）。 ３．細胞カウンター：このカウンターはＷＢＣを計数で
きるが一般カテゴリーのみである。そのため白血球の異
なるカテゴリーを区別できない。なお、例えば多形核好
中球（ＰＭＮ）を特別に区別することは重要である。
に異なる成分（ＷＢＣまたは細菌）を認識するのが難し
く、その上低頻度で存在する成分を検出することが非常
に難しい（例えば細菌について）。 ３．細胞カウンター：このカウンターはＷＢＣを計数で
きるが一般カテゴリーのみである。そのため白血球の異
なるカテゴリーを区別できない。なお、例えば多形核好
中球（ＰＭＮ）を特別に区別することは重要である。
【００１７】４．フィルターと紙（上記参照）。 ５．自動イメージ分析（ＡＩＭ）：この方法はＷＢＣの
計数と分類を可能とするが正確ではない。 ６．計量棒：この技術は迅速ではあるがあまり鋭敏では
ない（上記参照）。
計数と分類を可能とするが正確ではない。 ６．計量棒：この技術は迅速ではあるがあまり鋭敏では
ない（上記参照）。
【００１８】
【課題を解決するための手段】したがってこの発明の目
的は上記の従来技術の方法より実務上の要求を満たし、
特に細菌培養を行わず、かつ尿検体を強制的に沈降させ
ることなく生存細菌と白血球とを同時に検出し、計数す
ることを可能にする、同じ尿検体中における細菌と白血
球の検出方法を提供することにある。
的は上記の従来技術の方法より実務上の要求を満たし、
特に細菌培養を行わず、かつ尿検体を強制的に沈降させ
ることなく生存細菌と白血球とを同時に検出し、計数す
ることを可能にする、同じ尿検体中における細菌と白血
球の検出方法を提供することにある。
【００１９】この発明は、生存細菌と白血球（ＷＢＣ）
の両方を迅速かつ同時に計数するため、（１）尿検体中
に存在する生存細菌と白血球（ＷＢＣ）を同一条件下
（すなわちマーカーの濃度、ｐＨと温度）で、細菌と白
血球を標識化および蓄積し、異なる蛍光成分にする細菌
の蛍光生存可能なマーカーで同時にラベル化し、（２）
蛍光マーカーの光電検出によってすべての蛍光成分を自
動的に計数し、かつ（３）一方で細菌の全数、他方で白
血球の全数を知るため、蛍光成分をそれらのサイズに基
づいて、蛍光生存細菌と蛍光白血数に同時に分類するこ
とからなることを特徴とする尿検体の分析方法に関す
る。
の両方を迅速かつ同時に計数するため、（１）尿検体中
に存在する生存細菌と白血球（ＷＢＣ）を同一条件下
（すなわちマーカーの濃度、ｐＨと温度）で、細菌と白
血球を標識化および蓄積し、異なる蛍光成分にする細菌
の蛍光生存可能なマーカーで同時にラベル化し、（２）
蛍光マーカーの光電検出によってすべての蛍光成分を自
動的に計数し、かつ（３）一方で細菌の全数、他方で白
血球の全数を知るため、蛍光成分をそれらのサイズに基
づいて、蛍光生存細菌と蛍光白血数に同時に分類するこ
とからなることを特徴とする尿検体の分析方法に関す
る。
【００２０】
【発明の実施の形態】この方法は蛍光シグナル振幅に基
づいてなされた区別で細菌と白血球の同時検出を意外に
も兼ねることができるものである。そのサイズは、例え
ば異なる蛍光成分の蛍光強度、散乱光強度または開口イ
ンピーダンスを測定することによって評価するのが有利
である。
づいてなされた区別で細菌と白血球の同時検出を意外に
も兼ねることができるものである。そのサイズは、例え
ば異なる蛍光成分の蛍光強度、散乱光強度または開口イ
ンピーダンスを測定することによって評価するのが有利
である。
【００２１】その方法を行なう一つの有利な方法によれ
ば、工程（１）における細菌の生存可能マーカーは細胞
内酵素、例えば非特異的エステラーゼまたはホスファタ
ーゼによって蛍光にされた生成物からなる群から選択さ
れる。その方法を行なう他の有利な方法によれば、工程
（１）は細菌の生存可能マーカーが細胞内非特異性エス
テラーゼで蛍光にされるとき、尿検体をカルボキシフル
オレッセンアセテートの溶液（０．１〜０．５％）と中
性ｐＨで培養することからなる。このような場合に培養
工程は３７℃での５〜１５分、好ましくは１０分の第１
培養と、続いて４℃での５〜１５分、好ましくは１０分
の第２培養からなる。
ば、工程（１）における細菌の生存可能マーカーは細胞
内酵素、例えば非特異的エステラーゼまたはホスファタ
ーゼによって蛍光にされた生成物からなる群から選択さ
れる。その方法を行なう他の有利な方法によれば、工程
（１）は細菌の生存可能マーカーが細胞内非特異性エス
テラーゼで蛍光にされるとき、尿検体をカルボキシフル
オレッセンアセテートの溶液（０．１〜０．５％）と中
性ｐＨで培養することからなる。このような場合に培養
工程は３７℃での５〜１５分、好ましくは１０分の第１
培養と、続いて４℃での５〜１５分、好ましくは１０分
の第２培養からなる。
【００２２】この方法を行なう他の有利な方法によれ
ば、尿の非沈降サンプルでラベル化を行なうとき、工程
（２）と（３）（計数と分類）はフローサイトメータで
行われる。または、本発明の方法は、（１）既知量のサ
ンプルを、細菌と白血球の両者を保持するのに十分小さ
なポワーサイズを有するフィルターで濾過して尿検体を
定量的に濃縮し、（２）フィルター上に保持された成分
を上記のごとくラベル化し、（３）一方で蛍光細菌の
数、他方で蛍光白血球の数を得られるように、適当な走
査血球計算器を用いて全フィルター上の蛍光成分をサイ
ズに基づき計数分類し、かつ（４）元検体中の濃度で表
すため、得られた計数を濾過した尿の容量で割って当初
の尿検体中に存在する細菌と白血球の濃度を計算するこ
とからなる。
ば、尿の非沈降サンプルでラベル化を行なうとき、工程
（２）と（３）（計数と分類）はフローサイトメータで
行われる。または、本発明の方法は、（１）既知量のサ
ンプルを、細菌と白血球の両者を保持するのに十分小さ
なポワーサイズを有するフィルターで濾過して尿検体を
定量的に濃縮し、（２）フィルター上に保持された成分
を上記のごとくラベル化し、（３）一方で蛍光細菌の
数、他方で蛍光白血球の数を得られるように、適当な走
査血球計算器を用いて全フィルター上の蛍光成分をサイ
ズに基づき計数分類し、かつ（４）元検体中の濃度で表
すため、得られた計数を濾過した尿の容量で割って当初
の尿検体中に存在する細菌と白血球の濃度を計算するこ
とからなる。
【００２３】この発明によれば、走査血球計算器（scan
ning cytometer）はヨーロッパ特許第０３３３５６１号
に記載されたようなものが用いられる。この発明におい
ては細菌と白血球の検出が同じ検体について迅速にかつ
同時に行われる。生存細菌の迅速な測定は、微生物の生
存度を測定し、定量する直接的なアプローチのため成長
相の省略を可能とする。
ning cytometer）はヨーロッパ特許第０３３３５６１号
に記載されたようなものが用いられる。この発明におい
ては細菌と白血球の検出が同じ検体について迅速にかつ
同時に行われる。生存細菌の迅速な測定は、微生物の生
存度を測定し、定量する直接的なアプローチのため成長
相の省略を可能とする。
【００２４】例えば、上記したごときこの発明の方法に
おいては、生存可能マーカーが細胞内非特異的エステラ
ーゼで蛍光性にされるとき、その生存微生物の細胞内酵
素が反応を触媒化し、蛍光含有分子の非蛍光性状態から
蛍光性状態への変換をもたらす。蛍光生成物が分単位で
細胞中に創製され蓄積され、生存細菌に対する蛍光標識
となる。
おいては、生存可能マーカーが細胞内非特異的エステラ
ーゼで蛍光性にされるとき、その生存微生物の細胞内酵
素が反応を触媒化し、蛍光含有分子の非蛍光性状態から
蛍光性状態への変換をもたらす。蛍光生成物が分単位で
細胞中に創製され蓄積され、生存細菌に対する蛍光標識
となる。
【００２５】細菌と白血球の同時測定は普通の白血球酵
素（非特異的エステラーゼまたはホスファターゼ）でも
ある生存テスト用酵素の使用を可能とするものである。
このように、大部分の白血球はそれらの細胞内酵素が蛍
光含有分子に関する同時変換を行なう際に蛍光にされる
であろう。かくして意外にも単一の化学製品が分析すべ
き尿サンプル中の白血球と生存細菌の両者を同時にラベ
ル化するのである。
素（非特異的エステラーゼまたはホスファターゼ）でも
ある生存テスト用酵素の使用を可能とするものである。
このように、大部分の白血球はそれらの細胞内酵素が蛍
光含有分子に関する同時変換を行なう際に蛍光にされる
であろう。かくして意外にも単一の化学製品が分析すべ
き尿サンプル中の白血球と生存細菌の両者を同時にラベ
ル化するのである。
【００２６】これらの蛍光成分は、そのサイズに基づい
て計数し分類することができる。これは白血球の容量
（１００フェムトリットルないし２００フェムトリット
ル）が代表的には１フェムトリットルより少ない細菌の
容量より、より大きいからである。意外にもこの発明の
方法は蛍光シグナル振幅に基づいてなされる区別によっ
て細菌と白血球の同時検出を兼ねることが可能となる。
て計数し分類することができる。これは白血球の容量
（１００フェムトリットルないし２００フェムトリット
ル）が代表的には１フェムトリットルより少ない細菌の
容量より、より大きいからである。意外にもこの発明の
方法は蛍光シグナル振幅に基づいてなされる区別によっ
て細菌と白血球の同時検出を兼ねることが可能となる。
【００２７】この発明において、白血球と細菌の両者に
対する方法の感度は、ラベル化の前に定量的濾過工程を
導入することによって有利に増加することができる。こ
の方法において上記のように既知量の尿が細菌と血球を
保持できる膜を通して濾過される。次いで膜を上記のよ
うに化学的に処理し、生存細菌と白血球を蛍光性にさせ
る。次いで全部の膜を迅速に走査し、異なる蛍光成分を
計数し分類する。
対する方法の感度は、ラベル化の前に定量的濾過工程を
導入することによって有利に増加することができる。こ
の方法において上記のように既知量の尿が細菌と血球を
保持できる膜を通して濾過される。次いで膜を上記のよ
うに化学的に処理し、生存細菌と白血球を蛍光性にさせ
る。次いで全部の膜を迅速に走査し、異なる蛍光成分を
計数し分類する。
【００２８】得られる細胞計数は、全体の膜を走査して
得られた数を濾過した尿の容量で割ることによって定量
濃度測定に校正される。この発明は意外にも単一尿サン
プル中の生存細菌と白血球を同時にラベル化し濾過膜を
用いて定量測定を可能とするものである。
得られた数を濾過した尿の容量で割ることによって定量
濃度測定に校正される。この発明は意外にも単一尿サン
プル中の生存細菌と白血球を同時にラベル化し濾過膜を
用いて定量測定を可能とするものである。
【００２９】
【実施例】この発明を次の実施例を用いてより詳細に説
明するが、これは単なる例示の目的のためだけのもので
あり、発明を限定するものではないと理解されるべきで
ある。 実施例１ フローサイトメータを用いての尿中の細菌と
白血球の検出 健康ドナーからの尿サンプル３ｍｌに細菌（Ｅ．コリ１
０7／ｍｌ貯蔵液）、ヒト白血球をスパイクし、３ｍｌ
のラベル化緩衝液（ヘペス１０ｍＭ ＮａＣｌ１４０ｍ
Ｍ，ｐＨ７．３）で希釈した。この希釈尿にカルボキシ
フルオレッセンジアセテートの貯蔵溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）の６０μｌを加えた。このサンプルを水浴中３７℃
で１０分間培養し、次いで氷浴中４℃で１０分間培養し
た。
明するが、これは単なる例示の目的のためだけのもので
あり、発明を限定するものではないと理解されるべきで
ある。 実施例１ フローサイトメータを用いての尿中の細菌と
白血球の検出 健康ドナーからの尿サンプル３ｍｌに細菌（Ｅ．コリ１
０7／ｍｌ貯蔵液）、ヒト白血球をスパイクし、３ｍｌ
のラベル化緩衝液（ヘペス１０ｍＭ ＮａＣｌ１４０ｍ
Ｍ，ｐＨ７．３）で希釈した。この希釈尿にカルボキシ
フルオレッセンジアセテートの貯蔵溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）の６０μｌを加えた。このサンプルを水浴中３７℃
で１０分間培養し、次いで氷浴中４℃で１０分間培養し
た。
【００３０】次いでラベル化緩衝液の１５mlを加え、ラ
ベル化懸濁液を１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
上澄液を破棄し、ペレットを冷ラベル化緩衝液の３mlに
懸濁し、その後サンプルをただちに１０μｌ／分の流速
でアルゴンレーザー光に露光されるフローサイトメータ
ーに注入した。１０4エベントで補足を行ない、得られ
る細胞の蛍光を、図１および２に示すごとく、その強度
によって定量し、分類した。同図においてＸ軸は蛍光強
度チャネルを示し、縦軸は各チャネルの蛍光細胞の数を
示す。
ベル化懸濁液を１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
上澄液を破棄し、ペレットを冷ラベル化緩衝液の３mlに
懸濁し、その後サンプルをただちに１０μｌ／分の流速
でアルゴンレーザー光に露光されるフローサイトメータ
ーに注入した。１０4エベントで補足を行ない、得られ
る細胞の蛍光を、図１および２に示すごとく、その強度
によって定量し、分類した。同図においてＸ軸は蛍光強
度チャネルを示し、縦軸は各チャネルの蛍光細胞の数を
示す。
【００３１】２つの異なる細菌／白血球比でスパイクし
た２つのサンプルについての図で示されるように細菌と
白血球は２つの異なるチャネル窓に表示され、これらは
適当なソフトウェアを用いて計数できる。図１において
計数の５１％が細菌として分類され、２６％が白血球と
して分類される。図２においては計数の３３％が細菌と
して分類され、４４％が白血球として分類される。
た２つのサンプルについての図で示されるように細菌と
白血球は２つの異なるチャネル窓に表示され、これらは
適当なソフトウェアを用いて計数できる。図１において
計数の５１％が細菌として分類され、２６％が白血球と
して分類される。図２においては計数の３３％が細菌と
して分類され、４４％が白血球として分類される。
【００３２】実施例２ レーザースキャン血球計算器を
用いての尿中の細菌と白血球の検出 尿サンプルを実施例１のようにスパイクし、ただしレー
ザースキャンの感度が良好なためにより低濃度（１０2
／ml）にした（フィルター当たり１細胞に低下）。１ml
のスパイクした尿を０．２２μｍパーサイズの濾過膜を
通して濾過した。次いで濾過膜に１mlのラベル化溶液を
添加し、２５℃で１５分間培養した。ラベル化溶液を濾
過で除去し、次いでラベル化緩衝液の４mlで洗浄した。
濾過膜をレーザースキャンに導入し、ヨーロッパ特許第
０３３３５６１号に記載のように分析した。結果を図３
ａ〜ｃに示す。図３は、ａは細菌で、ｂはヒト白血球お
よびｃは細菌と白血球の両方でスパイクしたサンプルの
分析を示す。図で分かるごとく細菌と細胞は容易にそれ
ぞれの蛍光パルス長さの分析によりそれらのサイズにし
たがって区別できる。
用いての尿中の細菌と白血球の検出 尿サンプルを実施例１のようにスパイクし、ただしレー
ザースキャンの感度が良好なためにより低濃度（１０2
／ml）にした（フィルター当たり１細胞に低下）。１ml
のスパイクした尿を０．２２μｍパーサイズの濾過膜を
通して濾過した。次いで濾過膜に１mlのラベル化溶液を
添加し、２５℃で１５分間培養した。ラベル化溶液を濾
過で除去し、次いでラベル化緩衝液の４mlで洗浄した。
濾過膜をレーザースキャンに導入し、ヨーロッパ特許第
０３３３５６１号に記載のように分析した。結果を図３
ａ〜ｃに示す。図３は、ａは細菌で、ｂはヒト白血球お
よびｃは細菌と白血球の両方でスパイクしたサンプルの
分析を示す。図で分かるごとく細菌と細胞は容易にそれ
ぞれの蛍光パルス長さの分析によりそれらのサイズにし
たがって区別できる。
【図１】実施例１で得られたサンプルをフローサイトメ
ータで測定した際の細胞数と蛍光強度との関係を示す図
である。
ータで測定した際の細胞数と蛍光強度との関係を示す図
である。
【図２】実施例１で得られたサンプルをフローサイトメ
ータで測定した際の細胞数と蛍光強度との関係を示す別
の図である。
ータで測定した際の細胞数と蛍光強度との関係を示す別
の図である。
【図３】実施例２で得られたサンプルをレーザースキャ
ン血球計算器で測定した際の細細菌及び／又は白血球の
数と蛍光パルス強度との関係を示す図である。
ン血球計算器で測定した際の細細菌及び／又は白血球の
数と蛍光パルス強度との関係を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ドロクール ジャン−ルイ フランス 91330 イエール リュ シャ ルル デュ ゴール，１ ビス (72)発明者 フォアサック ルイ フランス 92200 ヌィリー スルー セ ーヌ ブルバール ジャン メルモ 22
Claims (7)
- 【請求項１】 生存細菌と白血球（ＷＢＣ）の両方を迅
速かつ同時に計数するため、（１）尿検体中に存在する
生存細菌と白血球（ＷＢＣ）を、同一条件下で細菌と白
血球を標識化および蓄積し、異なる蛍光成分にする細菌
の蛍光生存可能なマーカーで同時にラベル化し、（２）
蛍光マーカーの光電検出によってすべての蛍光成分を自
動的に計数し、かつ（３）一方で細菌の全数、他方で白
血球の全数を知るため、蛍光成分をそれらのサイズに基
づいて、蛍光生存細菌と蛍光白血数に同時に分類するこ
とからなることを特徴とする尿検体の分析方法。 - 【請求項２】 工程（１）の細菌の生存可能マーカー
が、細胞内酵素、例えば非特異的エステラーゼまたはホ
スファターゼによって蛍光にされた生成物からなる群か
ら選択される請求項１による方法。 - 【請求項３】 工程（１）が、細菌の生存可能なマーカ
ーが細胞内非特異性エステラーゼで蛍光にされた際、尿
検体を中性ｐＨでカルボキシフルオレッセンジアセテー
トの溶液（０．１〜０．５％）で培養することからなる
請求項１による方法。 - 【請求項４】 培養工程が、３７℃での５〜１５分間、
好ましくは１０分間の第１培養と続いて４℃での５〜１
５分間、好ましくは１０分間の第２培養からなる請求項
３による方法。 - 【請求項５】 ラベル化が尿の非沈降サンプルで行われ
るとき、工程（２）と（３）がフローサイトメトリーで
行われる請求項１による方法。 - 【請求項６】 生存細菌と白血球（ＷＢＣ）の両方を迅
速かつ同時に計数するため、（１）既知量のサンプル
を、細菌と白血球の両者を保持するのに十分小さなポワ
ーサイズを有するフィルターで濾過して尿検体を定量的
に濃縮し、（２）フィルター上に保持された成分を同一
条件下で、細菌と白血球を標識化および蓄積し、異なる
蛍光成分にする細菌の蛍光生存可能なマーカーで同時に
ラベル化し、（３）一方で蛍光細菌の数、他方で蛍光白
血球の数を得られるように、適当な走査血球計算器を用
いて全フィルター上の蛍光成分をサイズに基づき計数分
類し、かつ（４）元検体中の濃度で表すため、得られた
計数を濾過した尿の容量で割って当初の尿検体中に存在
する細菌と白血球の濃度を計算することからなることを
特徴とする尿検体の分析方法。 - 【請求項７】 蛍光成分のサイズが、異なる蛍光成分の
蛍光強度または散乱光強度または開口インピーダンスの
いずれかを測定して評価される請求項１〜６のいずれか
による方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95401483A EP0750045A1 (en) | 1995-06-22 | 1995-06-22 | Method for rapid diagnostic of urinary tract infections |
| FR95401483:3 | 1995-06-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09119926A true JPH09119926A (ja) | 1997-05-06 |
Family
ID=8221502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8162211A Pending JPH09119926A (ja) | 1995-06-22 | 1996-06-21 | 尿検体の分析方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5858697A (ja) |
| EP (1) | EP0750045A1 (ja) |
| JP (1) | JPH09119926A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010054335A (ja) * | 2008-08-28 | 2010-03-11 | Metawater Co Ltd | 微生物計測方法 |
| JP2015057590A (ja) * | 2013-06-03 | 2015-03-26 | シスメックス株式会社 | 細菌分析方法および検体分析装置 |
| JP2018151392A (ja) * | 2007-10-10 | 2018-09-27 | ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドＰｏｃａｒｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． | 光学分析装置及び流体サンプル中の微生物のタイプと量とを同定する方法 |
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|---|---|---|---|---|
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