CN103243159A - 具毒性质粒沙门氏菌荧光pcr检测探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法，该荧光PCR检测探针具有序列为：5’-FAM-AGGGCTGGCGATGTTACTC-TAMRA-3’，705-723，19bp，Tm=57.4，GC=57.9，H0，D0，F0，Taqman荧光探针与特异性引物spvR-P35-P36配套使用进行荧光PCR检测，从而将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速准确检测出来。

Description

具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于沙门氏菌属检测技术领域，尤其涉及具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

现有市场上销售的沙门氏菌属荧光定量PCR检测试剂盒和沙门氏菌属荧光PCR试剂盒，这些试剂盒是运用荧光PCR技术检测出沙门氏菌属的全部种类。但现有技术的PCR检测沙门氏菌属均为普通PCR方法，其检测灵敏度较低，检测速度较慢，PCR扩增时间太长，电泳成本较高且时间长。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：提供一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针，从而实现将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速准确检测出来。

本发明要解决的又一技术问题在于：提供一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，以利于方便快捷地将致病性沙门氏菌检出。

本发明要解决的再一技术问题在于：提供一种具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，从而将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速准确检测出来。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针，为Taqman荧光探针，具有序列为：

5’-FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’       705-723

19bp    Tm= 57.4   GC=57.9       H0     D0    F0

所述Taqman荧光探针与特异性引物spvR-P35-P36配套使用进行荧光PCR检测。

进一步地，所述特异性引物spvR-P35-P36为：

上游引物：

P35：5’-GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’            249-266

18bp    Tm=57.4    GC=61.1%    H0    D0    F0

下游引物：

P36：5’-AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’            755-738

18bp    Tm=57.7    GC=61.1%    H0    D0    F0。 

本发明还提供毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其包括所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针。

进一步地，所述试剂盒还包括沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、沙门氏菌阳性对照及沙门氏菌阴性对照；所述沙门氏菌PCR反应液包括所述具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针以及所述引物P35和引物P36。

进一步地，所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。

进一步地，所述试剂盒中的相对规格为：沙门氏菌PCR反应液为500 μL，Taq酶为5U/μL 20 μL，沙门氏菌阳性对照为0.5 mL，沙门氏菌阴性对照为0.5 mL；所述检测试剂盒还包括一细菌基因组DNA提取试剂盒。

进一步地，所述沙门氏菌PCR反应液组成及配比为：不含MgCl₂的10 × PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl₂ 3μL，10 mmol/L dNTPs 0.5μL，10 μmol/L的引物P35和引物P36各0.5μL，10μmol/L 的TaqMan探针0.5μL；或者，单次反应25μL PCR反应液组成及配比为：Mg²⁺ Plus的10×PCR缓冲液3.0μL，25mM each 的dNTP Mixture 0.5μL，5 U/μL 的Taq DNA聚合酶0.25μL，25 μmol/L的TaqMan探针0.5μL，50μmol/L的引物P35为0.5μL，50μmol/L的引物P36为0.5μL，50μg/mL模板DNA为2μL，超纯水17.75μL。

本发明还提供具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

步骤1：模板DNA提取；

步骤2：配制荧光PCR反应体系，并设定空白、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照，所述荧光PCR反应体系包括上述具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针；

步骤3：设定PCR反应条件进行荧光PCR检测；

步骤4：结果判断：根据扩增结果，对照空白管、阳性对照管、阴性对照管扩增曲线，确定样品的扩增结果。

进一步地，步骤2中所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。

进一步地，所述步骤2的荧光PCR反应体系25μL单次反应时组成及配比如下：

10×PCR缓冲液Mg²⁺ Plus 3.0μL： 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100

dNTP Mixture 25mM each：0.5μL

5 U/μL Taq DNA聚合酶：0.25μL

25 μmol/L TaqMan探针：0.5μL

50μmol/L引物35：  0.5μL

50μmol/L引物36：  0.5μL

50μg/mL模板DNA： 2μL

超纯水：           17.75μL

所述PCR反应条件为95℃, 5 min；95℃, 5s, 60 ℃, 40 s, 40个循环, 4℃保存。

本发明的有益效果：本发明利用特异性引物和探针，运用荧光PCR技术将具有毒性质粒的沙门氏菌能从众多的沙门氏菌属的种类中迅速检测出来，而具有毒性质粒沙门氏菌种类，均为高致病性沙门氏菌，可以引起人类和动物致病，也是食源性疾病的重要病原菌之一。故本发明《具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒》不仅用于食品检测，也可应用于医学诊断。 

本发明的具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法，能快速检测出具有毒性质粒的有致病作用的沙门氏菌，比普通PCR的检测速度更快，不仅大大节省PCR的扩增时间，也节省了电泳的成本和时间，有助于对人和动物常见沙门氏菌病的早期临床诊断和食物、水源、环境中沙门氏菌的跟踪监测，并对于公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要的实际意义。

附图说明

图1（纵座标表示的是荧光强度，横座标表示是循环数）是本发明实施例的具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒检测图谱，其中从下往上9条曲线分别表示：                                                大肠埃希氏菌（阴性对照）、

空白对照、

鼠伤寒沙门氏菌、

猪霍乱沙门氏菌、

样品分离株沙门氏菌、

鸡白痢沙门氏菌、

鸡伤寒沙门氏菌、

羊流产沙门氏菌、

肠炎沙门氏菌。

具体实施方式

以下具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。

具有毒性质粒的沙门氏菌菌株对小鼠的毒力要比其相应的无质粒菌株强至数百甚至数万倍，截至目前已先后在鼠伤寒、猪霍乱、肠炎、羊流产、鸡伤寒、鸡白痢等沙门氏菌中鉴定出不同分子量的毒力质粒，由于不同血清型沙门氏菌的毒力质粒（spv）中存在一个含毒力基因的高度保守的10kb左右的区域，因此通过对此保守区的检测，可以鉴定出常见的具有毒性质粒的沙门氏菌。

本发明基于最常见的具有毒性质粒的沙门氏菌种类，在普通PCR的基础上，设计出一条具有序列特异性的Taqman荧光探针；最终连同常规的DNA提取液，沙门氏菌PCR反应液、Taq酶等组装成一套具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒。

从NCBI的GenBank 数据库中搜索S.typhimurium, S.choleraesuis, S.enteritidis, S.galli-narum各代表菌株公布的spvR基因序列如序列表中SEQ ID NO. 1，递交NCBI进行Blast检索，并递交EBI利用ClustalW(1.82)软件进行多重序列比对。通过Blast检索和多重序列比对，发现spvR基因序列具有很强的保守性，结合多重PCR考虑，利用Primer Premier 5软件设计一对特异性引物spvR-P35-P36，与此同时，设计出一条Taqman荧光探针，具体结果如下：

上游引物：

P35：5’-GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’            249-266

18bp    Tm=57.4    GC=61.1%    H0    D0    F0

下游引物：

P36：5’-AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’            755-738

18bp    Tm=57.7    GC=61.1%    H0    D0    F0 

Taqman荧光探针：

5’-FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’       705-723

19bp    Tm= 57.4   GC=57.9       H0     D0    F0

运用这条Taqman荧光探针，同时与特异性引物spvR-P35-P36配套使用，在Roche lightcycler系列荧光定量PCR仪上进行荧光PCR实验验证，结果同时检测出6种具有毒性质粒的沙门氏菌，特异性和灵敏性好。其最大的优点及积极效果是：能快速检测出具有毒性质粒及有致病作用的沙门氏菌。本发明比普通PCR的检测速度更快，不仅大大节省PCR的扩增时间，也节省了电泳的成本和时间。

本发明进一步建立具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒，用于对人和动物常见沙门氏菌病的早期临床诊断和食物、水源、环境中沙门氏菌的跟踪监测，并对于公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要的实际意义。

该毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒具体组成及其功用作为一实施例如下表1，但需说明的是，表中所述规格及数量可适当调整和选择，也可选择其它规格及数量： 

表1 毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒

其中，所述毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒的沙门氏菌PCR反应液组成及配比为：做单个样品时，沙门氏菌PCR反应液（购买的10 × PCR缓冲液中不含MgCl₂时）的组成为：10 × PCR缓冲液2.5μL；25 mmol/L MgCl₂ 3μL；10 mmol/L dNTPs 0.5μL，引物P35和引物P36 (均为10 μmol/L)各0.5μL；TaqMan探针(10μmol/L) 0.5μL。 

所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液，其提取方式与模板DNA提取方法相同，模板DNA提取方法将于后文进一步详细说明。

所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液，其提取方式与模板DNA提取方法相同。

进一步地，使用该检测试剂盒检测毒性质粒沙门氏菌时，该试剂盒内再配合一《细菌基因组DNA提取试剂盒》同时使用，用于提取待测样品的模板DNA，也可用作提取沙门氏菌阳性对照和阴性对照的DNA。该《细菌基因组DNA提取试剂盒》可以为现有技术或市场购买获得，例如由北京索莱宝科技有限公司出售的细菌基因组DNA提取试剂盒。其中洗脱液是试剂盒的组成之一。

作为一实施例，所述《细菌基因组DNA提取试剂盒》如表2：                                           

表2细菌基因组DNA提取试剂盒组成

用该细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因DNA的方法包括以下步骤：

1. 取细菌培养液1mL，12000rpm离心1min，尽量吸尽上清；

2. 向菌体沉淀中加入200μL溶液A，振荡至菌体充分悬浮，加入20μL 10mg/mL的RNase A，37℃放置15-30min；

3. 向管中加入20μL 10mg/mL的蛋白酶K，充分混匀，55℃消化30-60min，直至样品消化完全为止，液体清亮及粘稠；

4. 向管中加入200μL溶液B，充分混匀；

5. 向管中加入200μL无水乙醇，充分混匀；

6.  12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

7. 向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中；

8. 向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱入收集管中；

9.  12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，去除吸附柱中残余的漂洗液；

10. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μL经75℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min；

11. 离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的细菌基因组DNA。

上述步骤中，使用前可先在漂洗液中加入无水乙醇，所有离心步骤均可使用台式离心机在室温下离心。利用该《细菌基因组DNA提取试剂盒》及DNA的提取方法，可从待测样品中提取细菌模板DNA，有效获取模板DNA并保证其质量。

本发明毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒的主要用途：可快速检测出鼠伤寒、猪霍乱、肠炎、鸡白痢、鸡伤寒、羊流产等常见具有毒性质粒的沙门氏菌标准菌株，也可检测样品中的类似菌株。适用于食品、卫生防疫、化妆品等具毒性质粒沙门氏菌的特异检测。不仅可用于食品安全检测部门，也可用于医院的病原诊断。

本发明毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒进行检测包括以下步骤：

1．模板DNA提取：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因DNA的方法提取待测样品的模板DNA；

2．准备荧光PCR检测体系，设定空白管、阳性对照管、阴性对照管：

（1）检测所用仪器：Roche lightcycler系列荧光定量PCR仪；

（2）配制荧光PCR反应体系25μL（单次反应），组成及配方如下：

10×PCR缓冲液（Mg²⁺ Plus）3.0μL   （从北京索莱宝生物科技有限公司直接购买的，其组成为：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100）

dNTP Mixture(25mM each) 0.5μL

Taq DNA聚合酶（5 U/μL ） 0.25μL

TaqMan探针（25 μmol/L）：0.5μL

引物35（50μmol/L）  0.5μL

引物36（50μmol/L）  0.5μL

模板DNA（50μg/mL）  2μL

超纯水：           17.75μL

（3）设定PCR反应条件：95℃, 5 min；95℃, 5s, 60 ℃, 40 s, 40个循环, 4℃保存；在荧光PCR仪运行前按下表设定程序：

（4）结果判断：根据扩增结果，对照空白管、阳性对照管、阴性对照管扩增曲线，确定样品的扩增结果；空白对照和阴性对照无Ct值显示或Ct值为30以上，阳性对照的Ct值≤30，否则为实验失败。

本发明《具毒素质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒》可用于医院中常见食源性中毒疾病的快速诊断；人和动物常见沙门氏菌病的早期临床诊断；食物、水源、环境中沙门氏菌（具毒素质粒沙门氏菌）的跟踪监测；并对于公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫中的具毒素质粒的致病性沙门氏菌的检出具有重要的实际意义。

在一具体检测实验中，利用该检测试剂盒及检测方法，分别检测大肠埃希氏菌（阴性对照）、鼠伤寒沙门氏菌（阳性对照）、猪霍乱沙门氏菌、样品分离株沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、羊流产沙门氏菌、肠炎沙门氏菌，荧光PCR检测图谱见图1，从下往上9条曲线分别表示：

大肠埃希氏菌（阴性对照）、

空白对照、

鼠伤寒沙门氏菌、

猪霍乱沙门氏菌、

样品分离株沙门氏菌、

鸡白痢沙门氏菌、

鸡伤寒沙门氏菌、

羊流产沙门氏菌、

肠炎沙门氏菌。

实验证明，运用本发明的条Taqman荧光探针，同时与特异性引物spvR-P35-P36配套使用，在Roche lightcycler系列荧光定量PCR仪上进行荧光PCR实验验证，结果同时检测出6种具有毒性质粒的沙门氏菌，特异性和灵敏性好。检测速度快，大大节省PCR的扩增时间，也节省了电泳的成本和时间。因此，本发明《具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR快速检测试剂盒》的发明有助于对人和动物常见沙门氏菌病的早期临床诊断和食物、水源、环境中沙门氏菌的跟踪监测，并对于公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要的实际意义。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同范围限定。

序列表

 

<110>  深圳职业技术学院

<120>  具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针、试剂盒及检测方法

<130>  12F10401CH02

<160>  1   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  894

<212>  DNA

<213>  spvR

<220>

<221>  genomic DNA

<222>  (1)..(894)

<400>  1

atggatttct tgattaataa aaaattaaaa attttcataa cactgatgga aacaggttcc          60

ttcagtatcg caacatcagt actgtatatc acccgaaccc cgctgagcag ggttatttca        120

ggcctagaaa gagagctgaa acaaagactc tttatacgga agaatggcac tcttatccca       180

accgaatttg cacaaactat ttatcgaaaa gtaaaatccc attatatttt cttacatgca          240

ctggagcagg aaatcggacc tacgggtaaa acgaaacaac tagaaataat atttgacgaa      300

atttatccgg aaagtttaaa aaatctgatc atttcagcac tgaccatttc cggccaaaaa         360

acaaatataa tggggagagc cgttaacagc caaataatag aagaactgtg tcagacaaac      420

aactgcattg ttatttctgc cagaaattat tttcatcggg aatcgcttgt ctgccggaca         480

tcagtggagg gtggggtcat gttatttatt cctaaaaaat tctttctctg cggcaaacct         540

gatatcaaca ggctggccgg aacacctgta ctttttcatg agggggctaa aaattttaat        600

ctggacacca tataccattt ttttgaacag acactaggta ttaccaaccc tgcattcagt         660

tttgataacg tcgatttgtt cagttcactg taccggttac aacaagggct ggcgatgtta        720

ctcatccccg tcagagtctg tcgggctctg ggattatcaa cagatcacgc actgcacatc       780

aaaggcgtag cgctctgtac ctccttgtat tacccgacca agaaacggga gacaccagat       840

tatcgtaaag ctataaaact gatacagcag gaactgaaac agtccacctt ctga             894

Claims (10)

1.具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针，为Taqman荧光探针，具有序列为：

5’-FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’       705-723

19bp    Tm= 57.4   GC=57.9       H0     D0    F0

所述Taqman荧光探针与特异性引物spvR-P35-P36配套使用进行荧光PCR检测。

2.如权利要求1所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针，其特征在于：所述特异性引物spvR-P35-P36为：

上游引物：

P35：5’-GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’            249-266

18bp    Tm=57.4    GC=61.1%    H0    D0    F0

下游引物：

P36：5’-AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’            755-738

18bp    Tm=57.7    GC=61.1%    H0    D0    F0。

3.具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1~2中任一项所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针。

4.如权利要求3所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括沙门氏菌PCR反应液、Taq酶、沙门氏菌阳性对照及沙门氏菌阴性对照；所述沙门氏菌PCR反应液包括所述具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针以及所述引物P35和引物P36。

5.如权利要求4所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。

6.如权利要求4所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒相对规格为：沙门氏菌PCR反应液为500 μL，Taq酶为5U/μL 20 μL，沙门氏菌阳性对照为0.5 mL，沙门氏菌阴性对照为0.5 mL；所述检测试剂盒还包括一细菌基因组DNA提取试剂盒。

7.如权利要求6所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述沙门氏菌PCR反应液组成及配比为：不含MgCl₂的10 × PCR缓冲液2.5μL，25 mmol/L MgCl₂ 3μL，10 mmol/L dNTPs 0.5μL，10 μmol/L的引物P35和引物P36各0.5μL，10μmol/L 的TaqMan探针0.5μL；或者，单次反应25μL PCR反应液组成及配比为：Mg²⁺ Plus的10×PCR缓冲液3.0μL，25mM each 的dNTP Mixture 0.5μL，5 U/μL 的Taq DNA聚合酶0.25μL，25 μmol/L的TaqMan探针0.5μL，50μmol/L的引物P35为0.5μL，50μmol/L的引物P36为0.5μL，50μg/mL模板DNA为2μL，超纯水17.75μL。

8.具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

步骤1：模板DNA提取；

步骤2：配制荧光PCR反应体系，并设定空白、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照，所述荧光PCR反应体系包括如权利要求1~2中任一项所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测探针；

步骤3：设定PCR反应条件进行荧光PCR检测；

步骤4：结果判断：根据扩增结果，对照空白管、阳性对照管、阴性对照管扩增曲线，确定样品的扩增结果。

9.如权利要求8所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤2中所述沙门氏菌阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌DNA提取液；所述沙门氏菌阴性对照为大肠埃希氏菌DNA提取液。

10.如权利要求8所述的具毒性质粒沙门氏菌荧光PCR检测方法，其特征在于：所述步骤2的荧光PCR反应体系25μL单次反应时组成及配比如下：

10×PCR缓冲液Mg²⁺ Plus 3.0μL： 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100

dNTP Mixture 25mM each：0.5μL

5 U/μL Taq DNA聚合酶：0.25μL

25 μmol/L TaqMan探针：0.5μL

50μmol/L引物35：  0.5μL

50μmol/L引物36：  0.5μL

50μg/mL模板DNA： 2μL

超纯水：           17.75μL

所述PCR反应条件为95℃, 5 min；95℃, 5s, 60 ℃, 40 s, 40个循环, 4℃保存。

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