CN1533438A - 在植物生产蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在植物中用以生产蛋白质的组合物及方法，尤其是于自然状态下的蛋白质为了成为具有生物活性的蛋白质，需要多数个结构基因来协同表达。典型地最终产物具有治疗、诊断或产业上用途。

Description

在植物生产蛋白质的方法

相关申请案

本申请案基于35美国法典第119(e)条对美国专利临时申请案第60/297,103号(于2001年6月8日提出申请)主张优先权，其全部内容以参考资料合并于本文。

技术领域

本发明涉及在植物中生产抗体以及其它复合蛋白质。

背景技术

为了某些有利益的目的，重组DNA技术是以特定DNA片段修改生物体的基因构造所必须的技术。这项技术导致以微生物、细胞培养、植物及动物的工程学来生产可广泛应用的有用产物。进行此项工程的重要之处在于以最经济(与先前通过标准方法达到相同目的相比)的方式生产所需产物的能力。本质上，基因工程已扩大产物的价值，现今可通过最适合及最经济的生产系统来生产产物。

虽然此项技术最初是在细菌系统中进行的，而现今于培养中可依照固定程序来改变多种生物体(包含各种微生物的真核细胞(酵母菌及其它真菌)、植物以及动物细胞)以及生产所有转基因的植物及动物。于通过任何转基因的方式来生产产物方面，仍需面对许多挑战。尽管微生物系统往往在克隆及生产转化细胞速度方面提供先进技术的优点，但在自实验室规模提升至大型发酵槽上经常遭遇到困难。此外，虽然细菌可有效地合成及分泌重组蛋白质及酶，但大体而言，细菌无机制去执行所有所需的翻译后修饰。某些真菌可生产经分泌的糖蛋白质类；然而，聚糖的型式及制造并不同于动物系统。

哺乳动物及昆虫细胞培养已广泛使用于生产各种蛋白质，最显著进步可能是翻译作用后程序。其它方面，培养基、设备及特殊培养环境使生产成本提高而此明显地成为这些系统的缺点。与微生物培养的情形相似，由于由实验室规模提升至大量制造时，往往无法直接进行翻译作用，所以使大量制造成为显著的问题。这些系统的另一缺点为考虑到培养病毒或病原性蛋白颗粒(prion)时，对人类健康具有潜在性的危险。

已说明利用转基因动物可于牛乳中、分泌至尿中或通过鸟类的蛋来生产人类蛋白质。一般，仍有动物病毒及造成生物体疾病等潜在问题。此外，大量生产及维持生产族群(细菌或细胞群)的成本高且耗费时间。与动物细胞培养类似，转基因动物应提供带有需要的翻译后修饰的蛋白质。

已讨论过利用植物作为重组蛋白质表达系统或″生物反应器″的引人注目的方式来替代以细菌、酵母菌、昆虫、动物及细胞为主的生产系统。于植物中生产蛋白质有许多好处且使用植物来生产转基因的蛋白质正获得广泛的支持。

植物生产系统可容易予以纯化而免于动物病原的污染。已存在多种植物种类的转化方法。在许多种子植物及农作物的例子中，已存在收集及控制大量物质的方法及基础设备。大量生产相当简单且纯粹地基于种子的生产及种植区域。因此，与通过哺乳动物细胞培养或转基因动物生产类似物质的方法相比，以植物生产类似物质的方法具有实质上减少商品成本的优点、降低哺乳动物的病毒或病原性蛋白颗粒污染的风险，以及相对低的原料及生产设备的资本需求。

一般，以植物生产所需的蛋白质的方法仅有一个显著的缺点，即在于蛋白质于翻译后糖化作用方面。然而，于许多例子中已证实，植物中替代的糖修饰作用对糖蛋白质不会造成有毒的作用或不需要的免疫基因特性。

已发展出许多在植物中表达蛋白质的生产系统。这些系统包含于油体(oil bodies)上(Rooijen等人的Plant Physiology 109：1353-1361(1995)；Liu等人的Molecular Breeding 3：463-470(1997))、通过根分泌(rhizosecretion)(Borisjuk等人的Nature Biotechnology 17：466-469(1999))、于种子中(Hood等人的Molecular Breeding 3：291-306(1997)；Hood等人的In Chemicals via Higher Plant Bioengineering[由Shahidi等人编辑]Plenum Publishing Corp.pp 127-148(1999)；Kusnadi等人的Biotechnology and Bioengineering 56：473-484(1997)；Kusnadi等人的Biotechnology and Bioengineering 60：44-52(1998)；Kusnadi等人的Biotechnology Progress 14：149-155(1998)；Witcher等人的MolecularBreeding 4：301-312(1998))、以病毒表面的抗原决定部位(epitopes)(Verch等人的Journal of Virology 73：930-938(1999)；Brennan等人的Microbiology 145：211-220(1999))以及于马铃薯块茎中稳定的表达蛋白质(Arakawa等人的Transgenic Research 6：403-413(1997)；Arakawa等人的Nature Biotechnology 16：292-297(1998)；Tacket等人的Nature Medicine 4：607-609(1998))。重组蛋白质亦可标记至种子、叶绿体或细胞外间隔上，以辨别可提供蛋白质累积最高程度的位置。

通常，所采用的可编码出产物的DNA基础功能片段包含启动子、接着为蛋白质编码区域以及终结基因。于任何生物体中，这些基础的、单一的顺反子(cistronic)(亦称为″单顺反子″)为表达基因的标准型式。根据核糖体扫描模型(典型为大多数真核生物的mRNA)，40S核糖体亚单位会结合至mRNA的5′-端且沿着非翻译的5′序列移动直到40S核糖体亚单位到达AUG密码子(Kozak，Adv.Virus Res.31：229-292(1986)；Kozak，J.Mol.Biol.108：229-241(1989))。虽然对大多数真核生物的mRNA而言，只有第一个开放阅读框(，ORF)具有翻译活性，但仍有其它不同的机制(mRNA具有多顺反子功能(Kozak，Adv.Virus Res.31：229-292(1986)))，不需以分离的启动子控制各个编码区域而可表达多数个编码区域。

专利公开第WO98/54342号教示于植物中利用植物病毒驱动核糖体内进入位点(IRES)以同时表达期望的基因的方法。该公开案亦揭示烟草花叶病毒属的IRES要件对3′近侧基因表达(于植物、动物、人类以及酵母菌中，自双顺反子假想的mRNA转录)提供一种内翻译途径，且可将外来基因插入至IRES下游而表达。专利公开第WO 00/789085号描述利用基因构建中所设计的IRES片段以允许作物中多重作物保护特性(即除草剂抗药性以及杀虫毒素(Bt)的表达)的累积或表达可改变植物的代谢物的基因使植物生产聚羟基爱康酯(polyhydroxyalconates，PHA′s)，其可作为塑料的某种型式的前驱物。

发明概要

本发明提供一种在植物中用以生产蛋白质的组成及方法，尤其是于自然状态下的蛋白质为了成为具有生物活性的蛋白质，需要多数个结构基因来协同表达。典型地最终产物具有治疗、诊断或产业上用途。

此外，本发明的一方面是针对重组核酸分子或表达单元，由5′至3′包含转录起始物及多个结构基因，并通过核糖体内结合序列(internalribosome binding sequence，IRES)分开各个重组核酸分子或表达单元。于一优选具体实施例中，该转录起始物为植物细胞中具有功能的启动子(其不必为植物中自然发现的启动子)。该转录起始物可另外包括加强序列或其它调节要件以调整表达及/或特异性表达(例如提供转录作用的暂时性及/或空间性调节)的程度。

结构基因以可编码出多-亚单位蛋白质的亚单位为佳。本文中所使用的″多-亚单位蛋白质″系一种蛋白质，其含有多个分离的多肽或蛋白质链，彼此结合后可形成单一球状蛋白质，其中至少两个分离的多肽系由不同的基因所编码。在另一优选的观点中，多-亚单位蛋白质至少包括一个抗体的免疫活性部分，因此可与抗原专一地结合。例如，该多-单元蛋白质可包括抗体分子的重链(heavy chains)及轻链(light chains)或部分重链及轻链。多重抗原结合部分可通过不同的结构基因而编码出以产生多价抗体。

然而，任何多-亚单位蛋白质系包含于本发明的范畴中。多亚单位蛋白质的实例包含，但非限于异二聚或异多聚蛋白质，例如T细胞受体、MHC分子、免疫球蛋白家族的蛋白质、核酸结合蛋白质(例如复制因子、转录因子等)、酶、催化性抗体(abzymes)、受体(尤其是可溶性受体)、生长因子、细胞膜蛋白质、分化因子、似血红素蛋白质、多聚激酶等。

于另一方面，该结构基因可编码带有同等功能的蛋白质复合物的成分，例如酶复合物、分化因子复合物、复制复合物等。

于一方面，本发明提供第一表达单元，包括于植物细胞中具有功能的转录起始物、可编码出第一多-亚单位蛋白质(例如包括抗体分子的重链或轻链)中一个亚单位的结构基因以及可编码出于植物中具有活性的选择性标记的第一报导基因。亦可提供第二表达单元，其含有于植物细胞中具有功能的转录起始物、一或多个结构基因(其可编码出第二多-亚单位蛋白质(例如抗体分子的重链或轻链)的其它亚单位)以及可编码出不同于第一表达单元的选择性标记且其于植物细胞中亦具有活性的第二报导基因。一或多个表达单元可包括复制源、原核生物源及真核生物源。例如可提供多重不同型式的真核生物源，使表达单元的复制作用可于一或多个植物细胞、哺乳动物细胞、酵母菌、昆虫细胞等中进行。

于另一优选具体实施例中，表达单元中的结构基因可编码出一或多个蛋白质，其为将不成熟的蛋白质加工成具有成熟生物活性型式的蛋白质所需。例如，该结构基因可编码出蛋白酶(其系通过切割蛋白质来加工不成熟蛋白质(例如前胰岛素原)成为成熟型式蛋白质(胰岛素)所需)。可以部分相同表达单元或部分不相同的表达单元提供可编码出不成熟蛋白质的基因。

于又一优选具体实施例中，该重组核酸分子或表达单元包含至少一个5′结构基因，其序列为可编码出靶肽(例如转移肽)的序列，该肽系指引基因的表达产物转移至植物细胞内或细胞外某些位置。于一方面，各个结构基因(包括5′靶序列)系用以指引结构基因至所选择的位置。该5′靶序列可相同或不同，例如基因产物的某些结合作用可靶至相同或不同位置。该重组核酸分子进一步包括可选择性标记基因及/或多腺苷序列。优选为该多腺苷序列系位于表达单元的3′端部分。

本发明的另一方面系针对于植物中生产蛋白质的方法，包括制备包括重组核酸分子的载体；将载体引入植物细胞中，以产生转化植物细胞；以及选择衍生自转化植物细胞(可表达多数个编码序列)的植物。于一优选具体实施例中，表达的产物系标记至特定位置，例如细胞膜、细胞外间隔或细胞器，例如细质体(叶绿体)。于另一优选具体实施例中，该植物细胞为阿拉伯芥(arabidopsis)细胞。亦提供经转化的植物细胞、含有重组核酸分子的转基因植物、包含由经转化的植物细胞再生的植物、植物的一部分以及衍生自转基因植物的种子。

本发明提供用于植物及植物细胞中可暂时或稳定表达的基因构建，以及造成活性生物分子(非植物之内生性生产)的表达。

附图描述

参考以下详细描述和附图可以更好地理解本发明的目的与特征。

图1是本发明核酸构建图示；

图2是本发明核酸构建的图示；

图3是来自烟草核酮糖-1，5二磷酸羧化酶小亚单位(GenBankACCESSION X023 53)的叶绿素靶肽；

图4表示植物钙调蛋白的氨基末端部分与各种抗体基因的氨基末端区域比较的序列比较；

图5是pICP1176的质粒图谱；

图6是pICP1221的质粒图谱；

图7是pICP1177的质粒图谱；

图8是pICGHpolyAb1的质粒图谱；

图9是pICGHpolyAb4的质粒图谱；

图10是Pxb1500的质粒图谱。

图11A和11B是本发明核酸构建在产生胰岛素中的示意图。

发明详述

依照本发明的各种基因构建系图示地说明于第1及2图中。第1图说明DNA构成，其中启动子会驱动一系列基因中的第一基因，各基因系由IRES要件将其分开。IRES序列会于经选择的植物细胞中起始帽-独立(cap-independent)翻译作用。于一优选具体实施例中，多腺苷信号系紧接的插入需要表达的最后一个基因序列的3′端以使转录出的mRNA可有效地加工。该DNA构成的转录作用可形成聚顺反子mRNA。核糖体系独立地结合至RNA的5′端以及各IRES要件上，使聚顺反子mRNA中所有蛋白质可独立但同等重要的表达。

第2图说明本发明的另一具体实施例，其中，IRES要件系位于DNA构成的5′端，而不位于启动子。如此使得DNA构成上的基因可利用一种通过宿主位点(该宿主位点是在转化期间插入DNA构成的位点)的转录活性加以调节的方法而表达。于一相关的具体实施例中，该DNA构成包含一段可允许特定位置整合至先前所定义的染色体的位点的序列(该染色体的位点具有所需要的转录表达的能力)。因此，由第2图所示的具体实施例中，基于基因位点(基因构建插入处)的转录作用的控制，利用5′IRES要件使基因表达。

植物的启动子

该启动子可为结构性、组织特异性、发育调节或其它诱发性或抑制性调节基因，且所提供的启动子于植物细胞中具有功能。大多数植物的启动子(如前述)可引导基因表达(不论是结构性或其它形式调节)。调节作用可基于暂时性、空间性或发育信号、环境的讯息或通过化学性诱导物或抑制物的手段来控制，以及这些制剂的来源可为自然或合成而来，即该启动子可由自然的来源或由基因重组工程而得到。转录作用的起始区域包括启动子以及一或多个添加的调节要件，例如增强子。启动子亦可为嵌合的基因序列，即来自利用二或多个不同的自然或合成的启动子的序列要件。

植物的启动子可经选择，以于不同的植物组织中通过熟习此技艺的人士所知悉的方法(Gasser & Fraley，Science 244：1293-99(1989)来控制转殖基因的表达。花椰菜镶嵌病毒35S启动子(CaMv)、经加强的CaMv启动子的衍生物(Odell等人的Nature，3(13)：810(1985))、肌动蛋白启动子(McElroy等人的Plant Cell 2：163-71(1990))、AdhI启动子(Fromm等人的Bio/Technology 8：833-39(1990)，Kyozuka等人的Mol.Gen.Genet.228：40-48(1991))、泛素(ubiquitin)启动子、玄参(Figwort)镶嵌病毒启动子、甘露碱(mannopine)合成酶启动子、诺巴林(nopaline)合成酶启动子以及章鱼碱(octopine)合成酶启动子及其衍生物等为熟知的基本的启动子。经调节的启动子系描述为光诱发(例如核酮糖双磷酸羧基酶启动子的小亚单位)、热冲击启动子、硝酸盐及其它化学性诱发启动子(参见，例如美国专利第5,364,780以及5,777,200号)。

当需要于植物中的特定部位表达蛋白质时，可使用组织特异性启动子。叶子的特异性启动子可包含因前接35S增强子的C4PPDK启动子(Sheen，15 MBO，12：3497-505(1993))或其它于叶子中具特异性表达的启动子。至于欲在种子中表达蛋白质时，则可使用下列启动子：柰平(napin)基因的启动子(美国专利第5,420,034以及5,608,152号)、乙酰基-CoA羧基酶启动子(美国专利第5,420,034以及5,608,152号)、2S白蛋白启动子、种子贮存蛋白质启动子、腰豆蛋白(phaseolin)启动子(Slightom等人的Proc.Natl.Acad Sci.USA 80：1897-1901(1983))、油膜蛋白启动子(Plant等人的Plant Mol.Bio.25：193-205(1994)；Rowley等人的1997，Biochim.Biophys.Acta.1345：1-4(1997)；美国专利第5,650,554号；PCT WO 93/20216)、玉米胶蛋白质(zein)启动子、碱溶性蛋白质(glutelin)启动子、淀粉合成酶启动子以及分枝淀粉酶启动子。

植物中的IRES要件

该IRES要件可为先前所叙述中一者或于植物细胞中具有活性的人造IRES(即合成的或由基因工程制造的IRES)。至于含有多-IRES的DNA构成，其可使用具有不同DNA序列的IRES要件。近年来已由Oleracia officinalis L.植物中分离出一种新的烟草花叶病毒，crTMV，且该crTMV的基因体已完成定序(6312个核酸)(Dorokhov等人的Dokladyof Russian Academy of Sciences 332：518-522(1993)；Dorokhov等人的FEBS Lett.350：5-8(1994))。

crTMV的RNA与典型的烟草花叶病毒的RNA不同处为crTMV的RNA的3′近侧的CP基因的翻译作用系通过核糖体内进入(由特定序列要件(IRES cp)所调节，Ivanov等人的Virology 232，32-43(1997))机制而发生于试管以及植物界中。该结果指出，crTMV的RNA中的CP基因上游于148-核酸区域含有IRES cp，该IRES cp可促进于试管及生物体(原生质粒及转基因植物)中翻译作用之内起始。

近年来，已证实烟草花叶病毒的基因体RNA含有一序列(该序列位于MP基因之上游)，其可促进3′近侧基因的表达(于试管中，以帽-独立的方式翻译连接至该序列上嵌合的mRNA)。crTMV的RNA中的MP基因上游的228-核酸序列(IRES_MP228CR)可调节3′近侧GUS基因(其系由双顺反子转录)的翻译。另外，crTMV的RNA中的MP基因上游的75-核酸序列与228-核酸序列具有一样的效力。因此，75-核酸序列含有一IRES_MP要件(IRES_MP75 ^CR)。已发现类似于crTMV RNA，与烟草花叶病毒为同一群(TMV UI)的病毒其基因体RNA上游的75-核酸序列亦含有IRES_MP75 ^UI要件，该IRES_MP75 ^UI要件可调节3′近侧基因的帽-独立翻译作用。

该烟草花叶病毒提供了一种新的内起始翻译作用的实例，其与小RNA病毒及其它病毒以及真核细胞的mRNA显示的IRES显然不同。可调节帽-独立翻译作用的IRES_MP要件不仅存在于crTMV的RNA中，也存在于与烟草花叶病毒为同一群病毒(TMV UI)及其它草嵌纹病毒(胡瓜绿斑嵌纹病毒)的基因体中。也就是说，草嵌纹病毒群中不同的病毒成员亦含有IRES_MP。

由实施例可知，使用两种特异性的IRES要件来验证本发明。下列为由十字花科烟草花叶病毒(crTMV)的基因体而来的两种IRES的核酸序列：

IRESmp75^cr：

5′TTCGTTTGCTTTTTGTAGTATAATTAAATATTTGTCAGATAAGAGA

TTGTTTAGAGATTTGTTCTTTGTTTGATA3′(SEQ ID NO.1)

IREScp148^cr：

5′GAATTCGTCGATTCGGTTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTT

TAAAAGAAGGAAAAAGAAGGTTGAAGAAAAGGGTGTAGTAAGT

AAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCCGGTCCTGATTCGTTT

AATTTGAAAGAAGAAA3′(SEQ ID NO.2)

由结构基因编码的蛋白质

于一方面中，通过本发明的表达方法以及表达单元所编码出的蛋白质为原始形式的蛋白质，为了使该蛋白质具有生物活性，其基因需要与数个结构基因协同表达。于一例子中，该蛋白质需要与数个亚单位组合才能具有活性。于另一例子中，该蛋白质生产出来后，为未成熟的形式，其需要经过加工(例如由一或多个其它蛋白质进行蛋白水解切割)或经过蛋白质修饰(例如，磷酸化、蛋白质糖化、异戊烯化(prenylation)、核糖基化(ribosylation)等)而变成具有活性的蛋白质。

用以验证本发明的非限制实例为抗体(例如单株抗体)以及胰岛素。于此两种蛋白质中，本发明不仅证明出可通过协同表达的方法来生产该功能性分子的能力且亦可通过细胞蛋白质的分泌器以正确地辨识于植物细胞中较不寻常、本文揭示的基因体构建及其后的多顺反子mRNA。尤其，可通过该基因构建以及本发明的方法生产单株抗体而不需要产生融合瘤细胞。

单株抗体的基因可由鼠科动物、人类或其它动物来源获得。此外，亦可合成该基因，例如可编码出组成抗体分子的重链或轻链的基因，其为嵌合或经修饰的基因型式。编码区域的顺序(例如重链然后轻链，或轻链然后重链)并不重要。重链以及轻链多肽(例如可变重链及可变轻链多肽)的基因编码可来自细胞产生的IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。制备基因体DNA片段(由此免疫球蛋白变异区域的基因可经克隆)的方法为此技艺中所熟知的技术。参见例如，Herrmann等人的Methods inEnzymol.，152：180-183(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol.，152：183-190(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol.，152：199-212(1987)。

用于分离可编码出免疫球蛋白产物的基因的探针包含编码VH的恒定部分的序列、编码VH及VL的骨架区域的序列以及完全重组的免疫球蛋白基因的恒定区域的探针，这些序列系由可利用的来源获得。参见，例如，Early and Hood，Genetic Engineering，Setlow and Hollaendereds.，Vol.3：157-188，Plenum Publishing Corporation，New York(1981)；以及Kabat等人的Sequences of Immunological Interests，National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1987)。

蛋白质的实例为胰岛素，于其自然的环境中，编码及翻译出的胰岛素为前驱物形式，然后通过一或多个蛋白水解切割步骤以形成成熟且具有功能性的蛋白质。翻译作用之后，前胰岛素原蛋白质的加工(以获得成熟形式的胰岛素)包含蛋白水解切割步骤(包含移除胺基端的分泌作用信号序列(此为真核生物的分泌作用途径的一般步骤))，以及通过枯草菌素(subtilisin)家族的蛋白酶(例如PC2以及PC1/PC3蛋白酶)于内位置进行加工及通过羧肽酶E进行修饰。切割作用会使内肽(C-肽以及A及B肽)释出。该A及B肽在形成肽链内及肽链间的双硫键后，才会形成熟成的胰岛素蛋白质。

真核生物的分泌作用途径的细胞内区间提供了优选的环境使适当的蛋白质进行成熟作用、折叠作用以及双硫键的形成，于植物中以此方式表达人类或动物的蛋白质将同样地显示有利于生产适当成熟形式的蛋白质。其它合成成熟胰岛素的方法包含分别地表达各个A及B肽，然后于试管中提供一个适合进行还原作用的环境以利双硫键的形成(美国专利第4,421,685以及4,559,300号)。

依照本发明，可制备许多型式的多顺反子基因构建以生产胰岛素。于一具体实施例中，一多顺反子基因构建包含胰岛素编码区域与其本身的分泌作用信号或植物的分泌作用信号，以及可编码出蛋白水解加工酶的结构基因。可使用各种为熟知此技艺的人士所知悉的方法克隆出人类的胰岛素基因(GenBank Accession J00265)。该克隆的优选型式为来自成熟mRNA的cDNA，以此方式可排除内含子以及减少期望克隆的基因的整体大小。同样地，可利用已知DNA序列的信息(例如于一或多个如上述的表达单元中包括下列一或多个序列)克隆出编码蛋白水解酶(PC2、PC1/PC3以及羧肽酶E)的基因。

结构基因             于GenBank中的说明

人类胰岛素           定义：人类胰岛素基因，完整的cds。

                     编号：J00265(GenBank)

PC2前蛋白转换酶      定义：现代人(homo sapiens)的蛋酶

                     白原转变，枯草菌素/第2

                     型科星(kexin)(PCSK2)，mRNA。

                     编号：XM_012963(GenBank)

PC3(PC1)前蛋白转换酶 定义：现代人的前蛋白转换酶，枯

                     草菌素/第1型科星(PCSK1)，mRNA。

                     编号：XM_003674

CPE羧肽酶E酶         定义：现代人的羧肽酶E(CPE)，mRNA。

                     编号：XM_003479(GenBank)

于这些例子中，优选型式的基因为来自成熟mRNA或与其DNA序列同等的cDNA。该基因可产生多个多顺反子载体以使这些所有构成成熟蛋白质的组份以所需的比例来达成于植物中成熟胰岛素的高阶表达。因此，本发明提供一种在植物中通过将所有所需的基因结合于多顺反子载体中以完整的合成具有治疗作用的经加工的成熟的蛋白质。

于一优选的具体实施例中，该核酸构建或表达单元由5′至3′的顺序包括驱动人类胰岛素基因表达的启动子、接着为IRES(优选为cp148或mp75)、CP2的编码区域、第二个IRES、CP3的编码区域、第三个IRES以及CPE的编码区域。整个的片段结束于带有适当的植物转录作用终止处以及多腺苷酸作用信号的3′端以确保转录出的mRNA可进行最有效的加工作用。参见第3A图。虽然所述的基因为单一顺序，但该编码区域(编码区域中所给予的任何序列系为了生产出治疗性蛋白质)最理想的顺序可依照标准技术而决定以及具有不同基因顺序的表达单元皆包括于本发明范畴中。

于其它具体实施例中，本发明的基因构建及方法可以下述方式修改：例如，于引入含有编码加工蛋白质的结构基因的基因构建后，分别将编码未成熟形式胰岛素的结构基因引入植物细胞中。因此，制备出一种″宿主″加工植物且使其增殖到引入包括胰岛素基因的表达单元。于此例中的胰岛素，该多顺反子基因构建未包含胰岛素编码区域且该启动子会驱动第一个加工酶(PC2)的表达，接着由IRES驱动PC3及PCE基因的表达。然后以稳定的基因片段或通过暂时性表达(transientexpression)将胰岛素基因引入植物中。此基因构建的图标说明显示于第3B图。这些基因的各个产物系定位于适当的次细胞间隔中，此与人类细胞中发生的加工作用最为相似。

靶序列

当蛋白质于细胞中合成时，其可通过靶序列的功效靶至特定的亚细胞或细胞外位置。于一些例子中，氨基酸的序列系以多肽的胺基端部分合成，以及于移位或定位过程之后或期间通过蛋白酶加以切割。例如，于真核细胞中，蛋白质分泌途径的模型为随着核糖体结合至mRNA以及翻译作用起始后，开始出现刚合成的多肽链。如果该蛋白质系预定用于分泌，该蛋白质暴露出的胺基端会为信号辨识粒子(signalrecognition particle，SRP)所辨识，使得当mRNA、核糖体以及SRP复合体停靠于内质网时短暂地中止翻译作用。停靠后，翻译作用重新开始，虽然此时的多肽链为一边进行翻译作用一边移位至ER内部。蛋白质亦可于翻译作用后再移位；但于生物体中此种过程较不具效率且通常不将其视为进入ER的正常途径。

美国专利第5,474,925号描述利用信号肽的基因表达构成，该肽可经翻译融合成重组蛋白质，使该蛋白质靶至细胞壁的纤维素基质。如此使可回复的纤维素基质与蛋白质分离出特别有助于在棉属植物中表达蛋白质。因此，本发明的一具体实施例中，该表达单元可包括一结构基因，其系融合至编码这些信号肽的序列的主干中。

于另一方面，该蛋白质可靶至植物的间液(interstitial fluids)而允许蛋白质(例如抗体，优选为单株抗体)可自间液中直接分离。自间液分离蛋白质的一示范方法系描述于美国专利第6,284,875号。因此，于一具体实施例中，该表达单元包括一结构基因，其系融合至靶序列(由蛋白质分泌至间隙液体)的主干中。此种蛋白质系描述于例如，美国专利第6,284,875号。

本发明中，特佳的具体实施例为，例如，该结构基因可编码抗体分子的重链及轻链者，该结构基因包含用以指引表达产物至分泌途径的靶肽。如同抗体系一种正常分泌的蛋白质-该分泌过程于成熟抗体分子的生产中扮演一重要角色。为了于植物中达成上述目的，该基因系经合成(例如克隆)，且该基因具有其本身哺乳动物的信号肽编码区域或以融合型式取代植物的分泌作用信号肽。该信号肽及该蛋白质间的融合应使植物进行加工时，所得的蛋白质的胺基端与于人类宿主中所产生的胺基端相同。

将蛋白质靶至植物内膜系统为本发明的优选具体实施例，其对蛋白质的胺基端提供适当的成熟作用。如果期望的蛋白质不论是具有附加的靶信息或是利用基因工程的方式使该蛋白质包含附加的靶信息，则可实现将其进一步定位至内膜系统的特定区域。

靶至胞器(例如细质体(如叶绿体)以及线粒体)亦有利于达成期望的胺基端成熟，靶至这两个位置系由胺基端的信号序列指定，接着则进行蛋白质切割。于一优选具体实施例，该作为信号的肽可指引表达产物至细质体(如叶绿体)或其它亚细胞器。一实例为紫花苜蓿核酮糖-双磷酸羧基酶的小亚单位的转移肽(transit peptide)(Khoudi等人的Gene197：343-5(1997))。过氧化物酶体的(peroxisomal)靶序列系有关肽序列(不论系N-端序列，内部序列或C-端序列)，其可使蛋白质靶至过氧化物酶体上，例如植物的C-端靶三肽SKL(Banjoko等人的Plant Physiol.107：1201-08(1995))。

另一方面，细胞核定位信号并不一定是限制在5′端位置(胺基端)且无法通过任何已知的细胞机制将其蛋白水解移除。第3图显示叶绿体靶肽的序列，它是来自烟草细胞核基因编码的核酮糖-双磷酸羧基酶的小亚单位(GenBank ACCESSION X02353)。于进入胞器期间，该信号或转移肽会通过胞器的蛋白酶的作用而移除。于基因融合体的5′端包括此序列，该基因融合至这段序列(起始于期望的成熟形式蛋白质(即抗体的重链或轻链)的第一个氨基酸)有助于生产成熟形式的蛋白质。

为了于液泡中定位或分泌蛋白质，用以将蛋白质靶至内膜系统的信号序列在植物及动物中是相似的。第4图显示植物钙调蛋白蛋白质的胺基端部分与一些抗体基因的胺基端部分的比较。该比较的序列包含抗体蛋白质的部分，该抗体蛋白质系制造成前蛋白质原的部分，但不存在于最终成熟蛋白质(经过分泌途径的加工)。一般，此种信号序列在长度上可有些许改变，如实施例中，植物的信号肽比哺乳动物的序列长10至11个氨基酸，但它们都具有共同的特征，该特征已知为与真核细胞的分泌信号肽有关。为了使信号肽适用于本发明，可依据标准技术加以改变(例如制备带有适合用于与其它任何基因克隆的端基)。

融合蛋白质

结构基因亦可编码融合蛋白质。例如，结构基因(其可编码出需经加工的多聚体蛋白质或蛋白质的多肽亚单位)包括可编码出效应物多肽的序列。本文中所使用的″效应物分子″系指氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽，以及可包含，但非限于调节因子、酶、抗体、毒素等。由效应物分子产生所需的效应的非限制实例包含，引起细胞增生或细胞死亡、起始免疫反应或作为诊断目的的侦测分子(例如该融合体可编码出萤光多肽，例如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。

选择性标记以及报导基因(Reporter genes)

由报导基因编码出的选择性标记(例如抗抗生素基因(例如卡那霉素(kanamycin)以及抗潮霉素(hygromycin))、抗除草剂(固杀草(glufosinate)、伊米达璘诺(imidazlinone)或嘉磷塞(glyphosate))基因或生理上标记(可见或生物化学上))系用于筛选经本发明的核酸构建转化的细胞。另一方面，非转基因的细胞(即非转化株)系经扑杀或优先地在选择性的条件下无法生长。报导基因可包含于基因构建中或载体中，最后将该基因构建运送至植物细胞。本文中所使用的″报导基因″系指可提供细胞一种经表达后为可见的或可测量的表型的任何基因。

优选地，报导基因的表达会产生一种可侦测的结果，例如，提供视觉上的比色、萤光、冷光或生物化学上可分析的产物；以及/或选择性标记，其可基于生理反应(例如生长差异、增殖速率的改变、分化状态等)选择转化体。细胞中报导基因的表达会造成该细胞展现出视觉生理上或生物化学的特征。一般使用的报导基因包含lacZ(β-半乳糖)、GUS(β-尿酸化)、GFP(绿色萤光蛋白质)、萤光酶或CAT(绿霉素乙酰基转移)，这些特征可容易地观察到或测量。此种基因可组合使用或取代选择性标记而可轻易地挑出所想要的克隆。选择性标记亦可包含有助于分离出表达该标记的细胞的分子。例如，选择性标记可编码出抗原(该抗原可由抗体所辨识)而通过以亲合性为主的纯化技术或流式细胞技术(flow cytometry)分离出经转型的细胞。报导基因亦包括可通过对植物细胞为外来者的优点而侦测到的序列(例如，由PCR侦测)。于此具体实施例中，该报导基因不需表达蛋白质或造成表型可见的改变。

植物转化作用将DNA分子转移以及整合至植物宿主基因体中的方法为已知。例如以阿拉伯芥的真空-渗透或浸渍为优选的方法，因为许多植物可于小空间中进行转化作用，而产生大量的种子以筛选转化体。典型地，定氮菌属(agrobacterium)可以经界定端(T-DNA边缘)转移线形DNA片段(T-DNA)亦使其成为优选的方法。可利用显微注射法、化学处理或粒子枪法(microprojectile bombardment，biolistics)进行直接DNA转化作用。除了任何重组DNA构成的尺寸上的限制外，多顺反子基因(依据本发明的编码序列)可利用病毒载体传送至植物内。该经转型的植物细胞可能存在于原生质粒、细胞培养、愈合组织、悬浮培养、叶、花粉或分生组织的型式中。

于适宜的情形下，经转化的细胞会再生至整个植物中，其新的细胞核材料系稳定的合并至基因体内。以此方式可获得经转化的单子叶及双子叶植物。尚有多种植物类型可以本发明的核酸构建加以转化。其它经基因修饰且可生产的植物的实例包含农艺作物、谷类、水果以及蔬菜(例如油菜、烟草、甜菜、棉花、大豆、玉蜀黍、小麦、大麦、稻谷、高梁、西红柿、芒果、桃子、苹果、洋梨、草莓、香蕉、甜瓜、马铃薯、胡萝卜、莴苣、甘蓝菜、洋葱)。优选的植物为阿拉伯芥、芸薹类、玉蜀黍、紫花苜蓿、大豆、烟草、十字花科(crucifera)、棉子、向日葵以及豆科植物。

蛋白质的分离

耕种后，采收转基因植物以回收经生产的多-亚单位蛋白质或经加工的蛋白质(及/或其它依照本发明，通过结构基因生产的蛋白质)。采收的步骤包括采收整株植物，或只采收植物的叶子、根或细胞。这个步骤会砍杀植物或只采收转基因植物中的部分，只采收转基因植物中的部分可使该植物其余部分继续生长。

采收后，可利用此技艺中习知的方法进行蛋白质分离。例如，将至少一部分的植物均质化，以及萃取蛋白质然后将其进一步纯化。萃取包括于适当溶剂中浸泡或浸渍该均质物。如上述，蛋白质亦可由植物之间隙液体中分离，例如，通过真空浸透法(描述于美国专利第6,284,875号)。

纯化方法包含，但非限于免疫亲合性纯化法以及根据蛋白质/蛋白质复合体的特定尺寸、电泳移动性、生物活性以及/或欲分离的多聚体蛋白质的净电荷等的纯化方法。

[实施例]

以下将通过数个可行的实施例说明本发明。这些实施例的目的系用以说明本发明而不欲于任何方面限制本发明。

实施例1

质粒ICP1176(第6图)包含IgG1亚种单株抗体(pspHCIgG1)的重链编码区域，该抗体可辨识哺乳动物组织因子蛋白质。质粒ICP1221(第7图)含有κ轻链编码区域(pspLCIgG1/4)，其可与上述的重链形成带有所需特性的完整链的单株抗体。在两克隆中使用标准的方法产生限制端以有助于进行克隆。两克隆区域系释放为NcoI至XbaI限制片段。于该实施例(第8图)中显示该轻链区域系克隆至植物的表达载体中，与(OCS)3MAS启动子相邻并接着将IRES(cp148)及重链插入至其3′处，且接着为Nos转录作用终止信号。该相同的载体于2x35S启动子的转录控制下带有植物选择性标记(BAR)(pICGHpolyAb1，第8图)。

于第1图中，DNA构成与所述的分子相似，其中轻链基因系Gene1以及重链基因系Gene 2。另外构成一个类似的质粒，其重链及轻链的顺序与上述相反。接着将此载体转移至定氮菌属而用以进行暂时性表达及阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(N.benthamiana)、芥菜(Brassica juncea)以及小油菜(B.campestris)的转化作用。虽然已确定有多种方法可进行定氮菌属引导的植物转化作用，而本发明中阿拉伯芥的定氮菌属转化作用系利用真空渗透法进行。暂时性表达试验系利用叶子移植片段以及整株幼苗的真空渗透物而进行。

于第9图中显示的实施例，该结构基因可编码出抗体的轻链。该基因系克隆至植物的表达载体，与(OCS)3MAS启动子相邻，如图所示，该IRES(cp148)及植物的可选择性标记(NPTII)系插入该结构基因的3′端。于此基因构建的3′端提供CaMV35S转录作用终止信号。于相同的载体中也带有可编码出抗体的重链的基因，该基因克隆至与(OCS)3MAS启动子相邻的位置。IRES(cp148)及植物的可选择性标记(NPTII)系插入重链基因的3′端，且接着为CaMV 35S转录作用终止信号(pXB1500，第9图)。于此形式中，该DNA构成与第1图所述的分子相似，其中抗体链基因系Gene 1以及可选择性标记基因系Gene 2。

另外构成一个类似的质粒，其重链及轻链的顺序与上述相反。接着将此载体转移至定氮菌属而用以进行暂时性表达及如上述的阿拉伯芥、烟草、芥菜以及小油菜的转化作用。虽然已确定有多种方法可进行定氮菌属引导的植物转化作用，而本发明中阿拉伯芥的定氮菌属转化作用系利用真空渗透法进行。众所周知的暂时性表达试验系利用叶子移植片段以及整株幼苗的真空渗透物而进行。

于定氮菌属的转化作用的例，T1种子是在含有选择性试剂的培养基上发芽，然后将存活的植物通过PCR分析筛选出存在有重链及轻链编码区域者。于此试验中呈阳性的材料使其进一步繁殖以及通过西方点墨(western blot)分析法及ELISA加以测试。

实施例2

此实施例系描述单株抗体的生产。

质粒ICP1177(第9图)包含IgG4亚种单株抗体(pspHCIgG4)的重链编码区域。质粒ICP1221(第7图)含有κ轻链编码区域(pspLCIgG1/4)，其与上述的重链一起形成一个带有所需特性的完整链的单株抗体。

克隆的程序(产生pICGHpolyAb4，第10图)、植物的转化作用、筛选以及产物的分析实质上与实施例1所述相同。

实施例3

实施例3。于此实施例中有3个编码区域系由单一个启动子驱动。此例子中，植物选择性标记已直接包含在DNA构建中，其系与启动子相邻的基因中最5′端的基因，而重链的5′端系插入至cp148 IRES的下游。轻链基因的5′端系插入至mp75 IRES的下游，最后为终止信号/多A位置。另一种构形可使多顺反子重链及轻链基因通过实施例1及2的启动子而驱动，且于相同DNA构建上，该选择性标记带有自己的启动子。此型式中该抗体基因系置于一种型式的启动子的控制下，而选择性基因系置于另一种型式的启动子的控制下。与实施例1及2所述的共-转化作用法相比，实施例3提供标记及该抗体基因较紧密的连接，但仍可分离及区别基因表达的调节。

于本说明书中所举例的所有专利及非专利的公开案是指本领域技术人员普通水平程度。所有这些公开案及专利申请均合并于本文作为参考，即个别的公开案或专利申请案系明确地及分别地以参考方式合并于本文。

那些熟知此技艺的人士者可仅利用常规的实验法确定或察明与本文所述等同的多种特定物质及程序。此种等同物质及方法系视为本发明的范围且包含于下列权利要求中。

Claims (57)

1.一种核酸构建物，它含有在植物细胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作连接：转录调节要件、可编码出包括可专一性地与抗原结合的抗体中具有免疫活性的第一部分的第一多肽的第一编码区域、IRES要件、可编码出包括可专一性地与抗原结合的抗体中具有免疫活性的第二部分的第二多肽的第二编码区域，其中当该第一及第二部分经表达后，它们会互相结合以形成可专一性地与抗原结合的多-亚单位多肽。

2.一种核酸构建物，它含有在植物细胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作连接：转录作用调节要件、编码多-亚单位蛋白质的第一多肽亚单位的第一编码区域、IRES要件、编码多-亚单位蛋白质的第二多肽亚单位的第二编码区域，其中所述的第一及第二编码区域不会编码出相同的亚单位。

3.一种核酸构建物，它含有在植物细胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作连接：转录作用调节要件、至少一个第一编码区域，其可编码出用以加工不成熟蛋白质使其成为成熟蛋白质的加工蛋白质、于植物细胞中具有功能的IRES要件、第二编码区域，其可编码出不成熟蛋白质，其中于相同植物细胞中，该第一及第二编码区域的表达会造成将不成熟蛋白质加工成为成熟形式的蛋白质，IRES要件位于编码区域之间，转录调节要件转录编码第一和第二编码区域的多顺反子片段。

4.一种在宿主植物细胞中用于表达外源性多-亚单位多肽的核酸构建物，它包括编码外源性多-亚单位蛋白的多顺反子mRNA的编码序列，其中所述的外源性多肽是在宿主植物细胞中非天然表达的多肽。

5.一种在宿主植物细胞中表达多肽的核酸构建，它包括编码单链T细胞受体、单链MHC分子、单链免疫球蛋白超家族或其融合物的多顺反子mRNA的编码序列。

6.根据权利要求1所述的核酸构建物，其中所述的第一编码区域及第二编码区域可编码抗体的重链或轻链，且其中所述的第一及第二编码区域不会编码出相同的链。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，它还包括终止信号。

8.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，其中所述的第一及第二编码区域还包括靶序列。

9.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，其中所述的转录作用调节要件为启动子。

10.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，其中所述的转录作用调节要件是用植物细胞中具有功能的IRES要件替代以及该整合的基因体位点对经基因工程的基因构建提供转录控制。

11.根据权利要求1所述的核酸构建物，其中所述的抗体系单克隆抗体。

12.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，其中所述的IRES要件系IRESmp75。

13.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，其中所述的IRES要件系IREScp148。

14.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，其中所述的靶序列将第一及第二编码区域的多肽产物靶向至植物细胞的内质网。

15.根据权利要求8所述的核酸构建物，其中所述的靶序列系转移肽，其将第一及第二编码区域的多肽产物靶向至植物细胞的质体。

16.根据权利要求15所述的核酸构建物，其中所述的质体系叶绿体。

17.根据权利要求8任意一项所述的核酸构建物，其中所述的靶序列系转移肽，其将第一及第二编码区域的多肽产物靶向至植物细胞的线粒体。

18.根据权利要求1所述的核酸构建物，其中所述的第一编码区域可编码出该抗体分子的重链以及该第二编码区域可编码出该抗体分子的轻链。

19.根据权利要求1所述的核酸构建物，其中所述的第一编码区域可编码出该抗体分子的轻链以及该第二编码区域可编码出该抗体分子的重链。

20.根据权利要求1所述的核酸构建物，其中所述的抗体系人类的抗体或人类属性的抗体。

21.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，还包括编码可选择标记的基因。

22.根据权利要求21所述的核酸构建物，其中所述的编码可选择标记的基因可操作连接至启动子，而该启动子可驱动标记的表达。

23.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，还包括至少一个真核细胞的复制作用起始点。

24.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，还包括原核细胞的复制作用起始点。

25.根据权利要求23所述的核酸构建物，还包括原核细胞的复制作用起始点。

26.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，还包括一种或多种在一或多种附加结构基因的5′处包括IRES要件的附加的结构基因。

27.根据权利要求3所述的核酸构建物，其中所述的不成熟蛋白质系前胰岛素原。

28.根据权利要求8所述的核酸构建物，其中所述的靶序列可靶至非质粒、液泡、叶绿体、质体、线粒体、过氧化物酶体或细胞核，或者靶至细胞壁。

29.一种包括第一表达单元以及第二表达单元的组合物，其中所述的第一表达单元包括根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物，以及该第二表达单元包括第三编码区域，该第三编码区域可操作连接至启动子或IRES要件。

30.一种包括根据权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物的植物或其部分。

31.根据权利要求30所述的植物或其部分，其中所述的植物系选自阿拉伯芥、芸薹类、玉蜀黍、紫花苜蓿、大豆、烟草、十字花科、棉子、向日葵以及豆科植物。

32.一种生产可表达外源性蛋白质的宿主植物细胞的方法，包括引入如权利要求1-5任意一项所述的核酸构建物至宿主植物细胞中。

33.根据权利要求32所述的方法，还包括由该植物细胞繁殖出植物。

34.根据权利要求33所述的方法，还包括栽培该植物的后代。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述的植物细胞系由选自原生质粒、细胞、愈合组织、悬浮培养、叶子、根、茎、胚轴、花粉、种子以及分生组织等组织而来。

36.根据权利要求32所述的方法，还包括表达蛋白质的步骤。

37.根据权利要求32所述的方法，其中所述的蛋白质系选自抗体、T细胞受体、MHC蛋白质、免疫球蛋白超家族的蛋白质、干扰素、白介素、激素、抗原、受体以及治疗性蛋白质。

38.根据权利要求32所述的方法，其中所述的蛋白质系融合蛋白质。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述的融合蛋白质包括效应物分子。

40.一种宿主植物或其部分，包括至少一个细胞，该细胞包括可编码出多顺反子mRNA的核酸，该多顺反子mRNA可编码出外源性多-亚单位蛋白质，而该外源性蛋白质为宿主植物中非自然表达者。

41.根据权利要求40所述的植物或其部分，其中所述的植物系F₀植物。

42.根据权利要求40所述的植物或其部分，其中所述的植物系阿拉伯芥。

43.根据权利要求40-42任一所述的植物或其部分，其中所述的多-亚单位蛋白质包括选自由T细胞受体、MHC分子、免疫球蛋白超家族的蛋白质或共-受体、核酸结合蛋白质、催化性抗体(abzymes)、受体、生长因子、细胞膜蛋白质、分化因子、类血红素蛋白质以及多聚激酶异二聚体或异多聚体蛋白质。

44.一种植物或其部分，包括至少一个细胞，该细胞包括可编码出多顺反子mRNA的核酸，而该多顺反子mRNA可编码出无活性的多肽，该无活性的多肽可经修饰而成为活性形式以及包括可加工该无活性的蛋白质成为活性形式的加工蛋白质。

45.根据权利要求44所述的植物或其部分，其中所述的加工蛋白质系蛋白酶。

46.根据权利要求44-45中任一所述的植物或其部分，其中所述的无活性的蛋白质系前胰岛素原。

47.根据权利要求44所述的植物或其部分，其中所述的加工蛋白质系修饰蛋白质用的酶。

48.根据权利要求47所述的植物或其部分，其中所述的酶系激酶。

49.一种生产可表达于宿主植物细胞中非自然表达的外源性多-亚单位蛋白质的宿主植物细胞的方法，包括于植物细胞中表达可编码出多顺反子mRNA的核酸，而该多顺反子mRNA可编码出多-亚单位蛋白质。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述的植物细胞系得自F₀植物。

51.根据权利要求49所述的方法，其中所述的植物细胞系阿拉伯芥细胞。

52.根据权利要求49-51中任一所述的方法，其中所述的多-亚单位蛋白质包括选自由T细胞受体、MHC分子、免疫球蛋白超家族的蛋白质或共-受体、核酸结合蛋白质、催化性抗体、受体、生长因子、细胞膜蛋白质、分化因子、类血红素蛋白质以及多聚激酶的异二聚体或异多聚体蛋白质。

53.一种于植物中生产活性形式的外源性蛋白质的方法，包括表达可编码出多顺反子mRNA的核酸，该多顺反子mRNA可编码出无活性的多肽，该无活性的多肽可经修饰而成为活性形式以及包括可加工该无活性的蛋白质成为活性形式的加工蛋白质。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述的加工蛋白质系蛋白酶。

55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述的无活性的蛋白质系前胰岛素原。

56.根据权利要求52所述的方法，其中所述的加工蛋白质系修饰蛋白质用的酶。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述的酶系激酶。

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