CN101225375B - 一个与耐盐性相关的水稻蛋白质激酶基因的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明克隆了一个与耐盐性相关的水稻蛋白质激酶基因，并公开了其应用。所述蛋白质激酶基因编码的是一种促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K)，是下述蛋白质(i)或(ii)：(i)具有序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有调控植物耐盐性功能的由(i)衍生的蛋白质。实验证明，将所述基因转化水稻可显著提高水稻对盐胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物逆境耐受性机制的研究，以及提高植物的耐盐性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义。

Description

一个与耐盐性相关的水稻蛋白质激酶基因的克隆及应用

技术领域

本发明涉及植物耐盐相关基因，特别涉及一个来源于水稻的与耐盐性相关的蛋白质激酶相关基因及其在培育耐盐性植物中的应用。

背景技术

蛋白激酶催化生物体内蛋白质的磷酸化，蛋白质的磷酸化是生物体能量代谢和信号传递中的重要生化反应。促分裂原活化蛋白质激酶(MAPKs，mitogen-activatedprotein kinases)是蛋白质激酶中的一个大家族，属于丝/苏氨酸蛋白质激酶家族，有11个保守的亚结构域，广泛存在于各种真核生物中(Nakagami H，Pitzschke A，Hirt H.，2005.Emerging MAP kinasepathways in plant stress signalling.Trends Plant Sci.10：339～346)，在细胞中对各种信号进行应答，迅速在其丝氨酸、苏氨酸残基部位磷酸化而被激活。真核生物中的MAPKs在将外源刺激信号转入胞内应答受体/感应器的下游的过程中起着枢纽的作用(Bogre L，Meskiene I，Heberle-Bors E，Hirt H.，2000.Stressing the role of MAP kinases in mitogenic stimulation.PlantMol Biol.43：705-718.)。在植物中，MAPK级联途径与不同的生物及非生物胁迫反应、激素反应、细胞分化和发育过程有关。

MAPK被上游分子促分裂原活化蛋白质激酶激酶(即MAP2K，MAP kinase kinase、MAPKK)磷酸化后激活，而MAP2K又被其上游的促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K，MAPKK kinase、MAPKKK)激活，这3个激酶构成一个功能模块，组成MAPK级联(MAPK cascades)(Nakagami H，Pitzschke A，Hirt H.，2005.Emerging MAP kinasepathways in plant stress signalling.Trends Plant Sci.10：339～346)。MAPK能将众多底物蛋白，如转录因子、蛋白激酶、细胞骨架蛋白等磷酸化。某些低分子量的的GTP结合蛋白(如Ras、Rac、cdc42)和一些特殊的激酶能够作为MAP4K(MAPKKKK)来调节MAP3K的活性。

植物MAPKs与动物和酵母的蛋白激酶一样，有一个由300多个氨基酸组成的催化区域，包含11个保守的亚结构域，在VII和VIII亚结构域之间，有一个非常保守的T-X-Y区，由苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)和一个X氨基酸(X可以是谷氨酸、脯氨酸或甘氨酸)构成，也称为三肽模块，在其中起关键作用(Boulton T G，Yancopoulos G D，Gregory J S，SlaughterC，Moomaw C，Hsu J，Cobb M H.，1990.An insulin-stimulated protein kinase similar to yeastkinases involved in cell cycle control.Science，249：64～67)。在植物中已发现的MAPK可分为两个亚类，其中一类含有TEY区，具体又分为A、B、C 3组，另一类则含有TDY区，则单独为D组(MAPK Group(Ichimura K et al.)，2002.Mitogen-activated protein kinasecascade in plants：anew nomenclature.Trends Plant Sci，7：301～308)。虽然MAPK级联途径由这3种激酶组成，但就具体的MAPK级联途径的组成成份、生理功能、调节因子等情况还知之甚少，目前仅在哺乳动物中研究得相对清楚，在植物中目前只在拟南芥中发现了一条相对完整的植物体MAPK级联途径：MEKK1(MAP3K)→MKK4/MKK5(MAP2K)→MPK3/MPK6(MAPK)。这条途径的激活使植物体表现出对细菌性和病毒性病原体的抗性(Nakagami H，Pitzschke A，Hirt H.，2005.Emerging MAP kinase pathways in plant stresssignalling.Trends Plant Sci.10：339～346)。

MAPK级联途径在病原反应、机械损伤、各种生物和非生物胁迫、激素以及细胞周期等多种信号途径中均具有关键性作用，当生物体感受到环境胁迫(如冷、干旱、高盐、紫外辐射或受到损伤)及其他细胞因子和生长发育信号(如生长素、乙烯、脱落酸等激素)刺激时，MAPK被不同的上游信号分子激活，通过对下游分子如转录因子、蛋白激酶、细胞骨架蛋白等的磷酸化作用，最终将外界信号传递给细胞核，调节特异基因的表达，使细胞、组织、器官、整个生物体作出相应的生理反应(Bogre L，Meskiene I，Heberle-Bors E，HirtH.，2000.Stressing the role of MAP kinases in mitogenic stimulation.Plant Mol Biol.43：705-718.)。

已经分离克隆的许多植物的MAPK基因，主要参与病原反应、环境胁迫和激素反应等。用真菌刺激因子(elicitor)处理紫花苜蓿能激活4个MAPK，它们分别是SIMK、MMK2、MMK3和SAMK(Cardinale F，Jonak C，Ligterink W，Niehaus K，Boller T，Hirt H，2000.Differential activation of four specific MAPK pathway by distinct elicltors.J Biol Chem，275：36734～36740)。对芹菜细胞的研究发现真菌刺激因子能引起AtMPK同源物ERMK的活化，且该MAPK被转运进核内，这说明它有可能将某些参与防御反应的转录因子进行磷酸化(Ligterink W，Kroj T，zur Nieden U，Hirt H，Scheel D，2000.Receptor-mediated activationof a MAP kinase in pathogen defense of plants.Science，276：2054-2057)。烟草的SIPK和WIPK可被TMV病毒激活，同时SIPK在高渗环境和低渗环境下都被诱导激活，而WIPK仅在低渗环境下被激活(Zhang S，Klessig DF，1998.Resistance gene N-mediated de novosynthesis and activation of a tobacco mitogenactivated protein kinase by tobacco mosaic virusinfection.Proc NatlAcad Sci USA，95：7433～7438)。H₂O₂是生物防御反应中一个重要的信号物质，也是MAPK的强激活剂。在大豆中发现有两个MAPK家族成员在氧爆发诱导因子的刺激下被快速激活(Taylor A T S，Kim J，Low P S，2001.Involvement of mitogen-activatedprotein kinase activation in the signaltransduction pathways of the soya bean oxidative burst.Biochem，355：795～803)。H₂O₂在拟南芥叶片细胞中激活一个特异的MAPKK-ANP1，后者又能激活AtMPK3和AtMPK6，组成磷酸化级联。能表达ANP1类似物NPK1的转基因烟草表现出对多种逆境的忍受力，被激活的MAPK级联在调节基因表达中起着双重作用：它既能激活逆境反应基因，保护植物不受伤害；又能抑制生长素诱导的启动子的作用(Kovtun Y，Chiu W L，Tena G，Sheen J，(2000)Functional analysis of oxidative stress-activatedmitogen-activated protein kinase cascade in plants.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，2940-2945)。

各种环境胁迫，如极端温度、干旱、渗透胁迫及紫外辐射等都能通过MAPK信号途径在生物体内引发相应的反应。紫花苜蓿中的p44MMK4蛋白在干旱和冷胁迫时被激活，它又能引起自身mRNA水平的上升(Jonak，C.，Kiegeri，S.，Ligterink，W.，Barker，P.J.，Huskisson，N.S.，Hirt，H.1996.Stress signaling in plants：a mitogen-activated protein kinase pathway isactivated by cold and drought.Proc.Natl Acad.Sci.USA，93，11274 11279.)。渗透胁迫对烟草悬浮培养细胞的作用已得到初步了解，SIPK在高渗环境和低渗环境下都被诱导激活，而WIPK仅在低渗环境下被激活。番茄处于热胁迫状态下时，有一个50kDa的MAPK被激活(Link V，Sinha A K，Vashista P，Hofmann M G，Proels R K，Ehness R，Roitsch T，2002.Aheat-activated MAP kinase in tomato：a possible regulator of the heat stress response.FEBS Lett，531：179～183)。另外，UV-B辐射处理番茄也能激活MAPK(Yalamanchili R D，Stratmann J W，2002.Ultraviolet-B activates components of the systemin signaling pathway in Lycopersiconperuvianum suspension-cultured cells.J Biol Chem，277：28424～28430)。玉米中的ZmMPK5在冷胁迫的恢复过程中被激活(Coronado M J，Gonzalez-Melendi P，Segui J M，Ramirez C，Rarany I，Testillano P S，Risueno M C，2002.MAPK entry into the nucleus at specificinterchromatin domains in plant differentiation and proliferation processes.J Struct Biol，140：200～213)。在紫花苜蓿中发现了两个对温度变化敏感的MAPK，它们在25℃时均没有活性，而当细胞所处的温度从37℃变成25℃时，SAMK(Stress-Activated Protein Kinase)被激活，当温度从4℃变成25℃时，HAMK(Heart shock-Activated Protein Kinase)被激活(Sangwan V，Dhindsa R S，2002.In vivo and in vitro activation of temperature-responsive plant map kinases.FEBS Lett，531：561～564.)。风是植物体在自然界中最易遭受的机械胁迫，机械操作处理拟南芥的叶片后能引起特殊的MAPK和MAPKK基因的转录(Mizoguchi，T.，Irie，K.，Hirayama，T.，Hayashida，N.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，Matsumota，K.，Shinozaki，K.1996.A geneencoding a mitogen-activated protein kinase kinase kinase is induced simultaneously with genesfor a mitogen-activated protein kinase and an S6 ribosomal protein kinase by touch，cold，andwater stress in Arabidopsis thaliana.Proc.Natl Acad.Sci.USA，93，765769.)。触碰紫花苜蓿植株2s之后就能引起MAPK的活化。紫花苜蓿的悬浮培养细胞受到持续的振荡后也能持续表达MAPK的活性，停止振荡1h后，MAPK活性消失，再振荡几秒钟后，其活性又恢复(

L，Ligterink W，Heberle-Bors E，Hirt H，1996.Mechanosensors in plants.Nature，383：489～490)。这些都为MAPK参与机械刺激信号的传导提供了直接的证据。在受到创伤的烟草叶子中WIPK基因被快速转录(Seo S，Okamoto M，Seto H，Ishizuka K，Sano H，Ohashi Y.，1995.Tobacco MAP kinase：a possible mediator in wound signal transductionpathways.Science.22：270(5244)：1988-92)。转基因烟草中WIPK基因的过量表达导致内源MAPK的失活，结束创伤反应。紫花苜蓿的叶子受到创伤后，MMK4被激活(L，Ligterink W，Meskiene I，Barker P J，Heberle-Bors E，Huskisson N S，1997.Wounding inducesthe rapid and transient activation of a specific MAP kinase pathway.Plant Cell，9：75～83)。

植物MAPK对生物和非生物的胁迫反应并不是孤立的，往往同时对多个胁迫因子起反应。OsBWMK1是水稻中第一个被分离的MAPK基因，病原菌M.grisea感染4个小时后被诱导，对机械损伤响应时间为半小时，同时又受SA、JA、ABA、ET等各种激素以及H₂O₂、高盐、蔗糖、干旱和高温等各种压力信号的诱导(He，C.，Fong，S.H.T.，Yang，D.et al.，1999，BWMK1，a novel MAP kinase induced by fungal infection and mechanical wounding in rice，Mol.Plant-Microbe Interact.12：1064-1073.)。水稻OsMAPK5基因及其蛋白质和蛋白质激酶的活性受ABA，病原体感染及机械性伤害、干旱、盐害及低温等非生物逆境所诱导。有趣的是，在抑制OsMAPK5表现的RNAi转基因植株中，减弱的激酶活性导致抗病基因，例如，PR1和PR10的持续性表达，进而增加对真菌(Magnaporthe grisea)和细菌(Burkholderia glumae)的抵抗力，而RNAi转基因植株在干旱、盐害及低温的耐性上却大大降低。相对的，OsMAPK5过表达的转基因植株，表现为激酶活性提高和对干旱、盐害及低温的耐性。从这些结果推测，OsMAPK5正向地调控对干旱、盐害及低温的耐性，而负向地调控PR基因的表现，进而影响对广泛病原物种的抗性(Xiong L，YangY，2003.isease resistance and abiotic stress.tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic Acid-Inducible Mitogen-ActivatedProtein Kinase.The Plant Cell，Vol.15，745-759.)。

在MAPK级联中的3种成分里，MAP2K数量最少，研究发现MAP2K能与不止一个MAPK作用。因此MAP2K在植物体信号传导途径中起着一个信号发散点的作用(Jin，H.，Liu，Y.，Yang，K.，Kim，C.，Baker，B.J.，Zhang，S.，2003.Function of a mitogen-activated proteinkinase pathway in N-gene mediated resistance in tobacco.Plant J.33，719-731)。

MAP3K有许多MAP2K和MAPK所没有的调节区域，如GTP结合蛋白的结合域、亮氨酸拉链二聚化序列、酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸激酶的磷酸化位点等，MAP3K结构上的变化比MAP2K和MAPK都大。这样，MAP3K就能被各种特异的上游因子调节，并能选择性的调节不同的MAP2K的活性，使MAPK级联能灵活的对各种细胞刺激做出反应。植物体中的MAP3K主要分为含有与MEKK1/STE11/BCK1等典型MAP3K相似的激酶结构域的MEKKs和类Raf(Raf-like)亚组(MAPK Group(Ichimura K et al.)，2002.Mitogen-activatedprotein kinase cascade in plants：a new nomenclature.Trends Plant Sci，7：301～308)。Jouannic等在1999年时获得14个的植物MAP3K基因，其中包括AtMAP3Kα(AJ010090)，AtMAP3Kβ3(AJ010092)，AtMAP3Kγ(Y14316)，AtMAP3Kδ1(Y14199)等(Jouannic S，HamalA，Leprince AS，Tregear JW，Kreis M，Henry Y.1999 Characterisation of hovel plant genesencoding MEKK/STE11 and RAF-related protein kinases.Gene.229(1-2)：171-181.)。随后MEKK亚组又被细分为：α，β，γ，andζ组等；类Raf(Raf-like)亚组则包括δ、θ组等(Jouannic S，Hamal A，Leprinee AS，Tregear JW，Kreis M，Henry Y.1999 Plant MAP kinasekinase kinases structure，classification and evolution.Gene.233(1-2)：1-11.)。在拟南芥中，MEKKs亚组的AtMEKK1(一种MAP3K)能激活冷、高盐、植物病原菌激发子、触碰等4个不同途径的MAP2K。(Ichimura，K.，Mizoguchi，T.，Morris，P.，Giraudat，J.，Matsumoto，K.and Shinozaki，K.，1998.Isolation of ATMEKK1(a MAP kinase kinase kinase)-interactingProteins and Analysis of a MAP Kinase Caseade inArabidopsis.；Mizoguchi T，Ichimura K，IrieK，Morris P，Giraudat J，Matsumoto K，Shinosaki K，1998.Identification of a possible MAPkinase caseade in Arabidopsis thaliana based on pairwise yeast two-hybrid analysis andfunetional complementation tests of yeast mutants.FEBS Lett.437，56-60.)。MEKKs亚组的其它MAP3K如苜蓿的MsOMTK1和烟草的NtNPK1分别参与氧化应激和环境胁迫及激素信号途径。类Raf亚组的MAP3Ks的序列与MEKKI亚组的MAP3Ks不同，且差异比较大，可分为2类：一类有延伸的N端，存在一些特定的结构域；另一类则没有延伸的N端，但有些成员在N端序列中含有特定的结构域。类Raf亚组的AtCTR1(Kieber JJ，RothenbergM，Roman G，Feldmann KA，Ecker JR.1993.CTR1，a negative regulator of the ethyleneresponse pathway in Arabidopsis，eneodes a member of the raf family of protein kinases.Cell.；72(3)：427-41.)和LeCTR1(Leclercq J，Adams-Phillips LC，Zegzouti H，Jones B，LatehéA，Giovannoni JJ，Pech JC，Bouzayen M.，2002.LeCTR1，a tomato CTR1-like gene，demonstratesethylene signaling ability in Arabidopsis and novel expression patterns in tomato.Plant Physiol.130(3)：1132-42.)参与拟南芥和番茄的乙烯信号途径。类Raf亚组的AtEDR1则参与拟南芥的真菌病原反应(Tang D，Innes RW(2002)Overexpression of a kinase-deficient form of theEDR1 gene enhances powdery mildew resistance and ethylene-induced senescence inArabidopsis.Plant J 32：975-983)。水稻的OsEDR1的表达受JA、SA、H₂O₂、干旱、盐害、重金属等多种因子的诱导，表明其在防卫/逆境信号途径和生长发育过程中均起作用(KimJA，Agrawal GK，Rakwal R，Han KS，Kim KN，Yun CH，Heu S，Park SY，Lee YH，Jwa NS.，2003.Molecular cloning and mRNA expression analysis of a novel rice(Oryzasativa L.)MAPKkinase kinase，OsEDR1，an ortholog of Arabidopsis AtEDR1，reveal its role in defense/stresssignalling pathways and development.Biochem Biophys Res Commun.300(4)：868-76.)。

总之，在植物体MAPK主要参与了抗逆信号传导，对多种植物激素的反应以及对植物生长发育过程的调节，有关植物MAPK的研究还处于比较初级的阶段，MAPK参与这些生物学过程的作用机制，还需要进一步的深入研究。

水稻中已有的研究主要集中在MAPK上，参与水稻对病原菌侵染和非生物逆境(干旱、盐和寒冷等)反应以及水稻自身的生长发育等，如OsBIMK1(Song F，Goodman R M，2002.OsBIMK1，a rice MAP kinase gene involved in disease resistance responses.Planta，215：997～1005)、OsMAPK5(Xiong L，Yang Y，2003.isease resistance and abiotic stress.tolerance in rice are inversely modulaed by an abscisic Acid-Inducible Mitogen-ActivatedProtein Kinase.The Plant Cell，Vol.15，745-759.)、OsBWMK1(He，C.，Fong，S.H.T.，Yang，D.et al.，1999，BWMK1，a novel MAP kinase induced by fungal infection and mechanicalwounding in rice，Mol.Plant-Microbe Interact.12：1064-1073.a)、OsWJUMK1(AgrawalGK，Agrawal SK，Shibato J，Iwahashi H，Rakwal R.，2003.Novel rice MAP kinases OsMSRMK3and OsWJUMK1 involved in encountering diverse environmental stresses and developmentalregulaion.Biochem Biophys Res Comm，300：775～783)。水稻MAP2K目前只克隆鉴定了受低温诱导表达的OsMEK1基因，由OsMEK1和OsMAP1介导的MAPK级链可能参与水稻对低温的抗逆反应(Wen JQ，Oono K，Imai R，2002.Two novel mitogen-activated proteinsignaling components，OsMEK1 and OsMAP1，are involved in a moderate low-temperaturesignaling pathway in rice.Plant Physiol.129(4)：1880-91.)。水稻MAP3K克隆鉴定的第1个基因是拟南芥EDR1的同源基因OsEDR1，其表达受JA、SA、H₂O₂、干旱、盐害、重金属等多种因子的诱导，而且在营养和生殖器官组织中也存在差异表达，表明OsEDR1基因在水稻防卫/逆境信号途径和生长发育过程中起作用(Kim JA，Agrawal GK，Rakwal R，Han KS，Kim KN，Yun CH，Heu S，Park SY，Lee YH，Jwa NS.，2003.Molecular cloning and mRNAexpression analysis of a novel rice(Oryza sativa L.)MAPK kinase kinase，OsEDR1，an orthologof Arabidopsis AtEDR1，reveal its role in defense/stress signalling pathways and development.Biochem Biophys Res Commun.300(4)：868-76.)。但OsEDR1介导的MAPK级联尚不清楚。已报道的MAPK和MAPK级联途径中参与抗盐反应的基因有水稻的OsBWMK1、OsMAPK5(MAPK基因)、OsEDR1(MAP3K基因，类Raf亚组)和拟南芥的AtMEKK1(MAP3K基因，MEKK亚组)。

已有的研究结果表明MAPK和MAPK级联途径在水稻的抗病反应和抗逆反应中具有重要作用。

水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物。然而，干旱、高盐和低温等逆境胁迫，每年都会在全世界范围内造成水稻大面积的减产，全球约有40％的水稻种植区受到不同程度的环境胁迫。随着全球人口的不断增加和可耕种面积的逐年减少，提高水稻产量成为全球所共同面临的一个紧迫的挑战，而减少逆境胁迫所造成的产量损失，就能够在很大程度上缓解粮食危机。

发明内容

本发明的目的是提供一个与耐盐相关的促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K)及其编码基因。

本发明所提供的与耐盐性相关的促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K)OsMAP3Kβ3，来源于稻属水稻(Oryza sativa L.)，是下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)具有序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

(ii)在(i)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有调控植物耐盐性功能的由(i)衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸序列由536个氨基酸残基组成，其中，自氨基端第275-505位氨基酸残基为促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K)保守区，将具有该氨基酸残基序列的蛋白命名为OsMAP3Kβ3；所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白。通过在植物中表达所述蛋白，并测试这些植物的耐盐性，可以判断发生这些变化后的蛋白是否还具有调控植物耐盐性的功能。

编码本发明来源于水稻的与耐盐性相关的OsMAP3Kβ3基因，可以具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有调控植物耐盐性功能的蛋白质的核苷酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSC(或0.1×SSPE)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。其中，0.1×SSC为20×SSC的稀释液，20×SSC的配方为：3mol/LNaCl(175g/L)，0.3mol/L柠檬酸三钠·2H₂O(88g/L)，用1mol/L HCl调至pH 7.0；0.1×SSPE为20×SSPE的稀释液，20×SSPE的配方为：3mol/LNaCl(175g/L)，0.2mol/LNaH₂PO·H₂O(27.6g/L)和0.2mol/L EDTA(7.4g/L)，用1mol/LNaOH调至pH 7.4。

序列表中的SEQ ID NO：2由1835个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1608位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，其中，自5’端第823-1515位碱基编码促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K)保守区，将具有该核苷酸序列的基因命名为OsMAP3Kβ3。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增OsMAP3Kβ3中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐盐性的方法。

本发明所提供的提高植物耐盐性的方法，是将编码所述与耐盐性功能相关的基因(例如：OsMAP3Kβ3或与该基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列)导入植物组织、细胞或器官，使植物耐盐性获得提高。

在上述提高植物耐盐性的方法中，本发明水稻与耐盐性相关基因OsMAP3Kβ3既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明水稻与耐盐性相关基因OsMAP3Kβ3或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如Gateway^TW系列载体(如pH2GW7等)、pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 1301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明水稻与耐盐性相关基因OsMAP3Kβ3或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：NM_118848.2，GI：30687489)和NapinA(GenBank号：M64633.1，GI：349405)启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

其中，以pH2GW7(购自inVitrogen公司)为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐盐性相关的促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K)OsMAP3Kβ3基因的植物表达载体为pH2GW7 Vector-OsMAP3Kβ3。

携带有编码本发明水稻与耐盐性相关的基因OsMAP3Kβ3或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明水稻与耐盐性相关基因OsMAP3Kβ3或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的抗逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

本发明提供了一个与水稻耐盐性相关的蛋白质激酶基因促分裂原活化蛋白质激酶激酶激酶(即MAP3K)OsMAP3Kβ3。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对盐胁迫的耐受性，且对水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物逆境耐受性机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的抗逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明分离的序列OsMAP3Kβ3与推测序列EAY87678基因结构的比对图。

图2为AtMAP3Kβ3、AtMEKK1和OsMAP3Kβ3保守区的同源性比对结果。

图3为OsMAP3Kβ3 T1代转基因水稻不同株系耐盐苗比例的柱形图。

图4为经盐胁迫处理后的OsMAP3Kβ3 T1代转基因耐盐植株与野生型植株照片。

图5为OsMAP3Kβ3 T2代转基因水稻不同株系耐盐苗比例的柱形图。

图6为经盐胁迫处理后的OsMAP3Kβ3 T2代转基因耐盐植株与野生型植株照片。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例1、耐盐基因OsMAP3Kβ3的获得

1、基因序列的获得

以拟南芥MAP3K beta 3即AtMAP3Kβ3基因的核苷酸序列(GenBank号：AJ010092)在GENBANK中进行同源基因检索，获得水稻的同源序列(GenBank号：EAY87678)，该同源序列位于水稻第二条染色体上，其CDS为1572bp，编码523个氨基酸，与AtMAP3Kβ3的激酶结构域具有58％的同源性，具有蛋白激酶的11个亚结构域，推测是水稻中的一个MAP3K基因，并命名为OsMAP3Kβ3。

2、OsMAP3Kβ3的PCR扩增及序列分析

根据GENBANK中OsMAP3Kβ3序列的编码区设计引物，以水稻广陆矮cDNA为模板，采用PCR方法扩增OsMAP3Kβ3。引物序列如下：

正向引物：5’＞CACCATGGCGGCGCGCCAGCGG＞3；

反向引物：5’＞CCGCTGTATCATGGCAAGGGATTTGGG＞3’。

按Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(cat.#K 1622，购自Fermentas公司)说明书的步骤对水稻广陆矮的幼苗总RNA进行反转录得到cDNA，然后用RT-PCR方法扩增，50μL PCR反应体系为：上、下游引物(10μM)各1μl，cDNA模板1μl，Pfu酶(5U/l)1μl，4×dNTPs(各10mM)1μl，10×Pfu buffer(Mg²⁺)5μl，H₂O 40μl。PCR反应条件为：预热95℃预变性2min，然后95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸150s，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小为1835bp的DNA片段。

回收并纯化上述片段，将其连接入载体pENTER-TOPO(Invitrogen公司)中，再将连接产物用CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pENTER-TOPO Vector-OsMAP3Kβ3。对上述质粒进行测序，测序结果表明获得了与推测序列基本一致的OsMAP3Kβ3基因，但其中的3’端序列有所不同。经过与基因组序列比对，发现数据库中推测的核苷酸序列(GenBank号：EAY87678)与序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列是属于不同的剪切方式。推测的核苷酸序列(GenBank号：EAY87678)有9个外显子。本发明所分离的序列由1835个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-1608位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。与推测序列相比，本发明所分离的序列由8个外显子组成，第1至7个外显子(1-1430bp)与推测的核苷酸序列(GenBank号：EAY87678)相同，如图1所示，第8个外显子(1431-1608bp)包括推测序列的第8个外显子部分(1431-1517bp)及其内含子的序列(1518-1608)，推测序列中的第9个外显子(1518-1572bp)在本发明分离的序列中不属于编码区。由于GENBANK中的只是推测的基因剪切模型，而本发明所获得的序列是具体的实验数据，更为真实可信。所以将本发明所分离的序列表中SEQ ID NO：1序列也命名为OsMAP3Kβ3。OsMAP3Kβ3与同属于MAP3K基因MEKK亚组的AtMAP3Kβ3、AtMEKK1氨基酸残基序列进行序列比对分析，结果如图2所示，比对结果表明OsMAP3Kβ3与AtMAP3Kβ3的激酶结构域具有64％的同源性，与AtMEKK1的激酶结构域具有66％的同源性。

实施例2、水稻中耐盐相关OsMAP3Kβ3基因的转基因水稻的获得

用农杆菌介导法将实施例1获得的与耐盐性相关的基因OsMAP3Kβ3转化水稻，具体方法如下：

1)转化农杆菌

通过LR反应将实施例1中构建的重组质粒pENTER-TOPO Vector-OsMAP3Kβ3中的OsMAP3Kβ3基因重组到表达载体pH2GW7(Invitrogen公司的Gateway^TW vector载体)上，LR反应体系为2μl缓冲液、2μl(150-300ng)线性化的pH2GW7质粒DNA、2μl(100-300ng)pENTER-TOPO Vector-OsMAP3Kβ3质粒DNA、2μl H₂O，再加入2μl LRClonase，LR反应条件为25℃水浴保温1h，加入1μl 2U/μl蛋白酶K，37℃水浴10min。然后，通过热激法将上述重组载体转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，挑选阳性单菌落加入到5mL含50mg/L的壮观霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提取质粒，用限制性内切酶EcoRV进行酶切鉴定，经酶切获得了大小分别为1919bp的酶切产物，与预期结果相符。再在实施例1中引物的引导下进行PCR鉴定，鉴定结果表明获得了含有OsMAP3Kβ3的重组植物表达载体，命名为OsMAP3Kβ3-pH2GW7，随后将上述重组载体转化农杆菌AGL0菌株(中国科学院遗传所赠送)。

2)侵染水稻愈伤组织

挑取步骤1)获得的阳性重组农杆菌的单菌落接种于含壮观霉素50mg/L和利福平50mg/L的20mL YEB液体培养基中，在28℃、150rpm下振荡培养2-3天，再于4℃、5000rpm离心3分钟，去上清，将菌体沉淀重悬于含O.1mmol/L乙酰丁香酮的AA培养基(含Co(NO₃)₂·6H₂O 0.15mg/L，CaCl₂110mg/L，MgSO₄ 122mg/L，KI 3.75mg/L，NaH₂PO₄·H₂O150mg/L，Na₂-EDTA 0.01mM，FeSO₄·7H₂O 139mg/L，KCl 2.95g/L，MnSO₄·4H₂O 84.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 6.25mg/L，H₃BO₃ 5mg/L，Gly 37.5mg/L，CuSO₄ 0.005mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O1.25mg/L，盐酸硫胺素VB₁ 5mg/L，烟酸5mg/L，盐酸吡哆醇VB₆ 5mg/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Gln 87.6mg/L，L-Asp 26.6mg/L，蔗糖20g/L)中，在28℃下避光振荡培养1-2小时至OD₆₀₀＝0.6-0.9。挑选按常规植物组织培养方法获得的水稻中花11的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入上述转化有OsMAP3Kβ3-pH2GW7的重组农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于N₆共培养基(N₆培养基+10g/L葡萄糖+1mg/L乙酰丁香酮+2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))上培养，其中N₆基本培养基的配方为(NH₄)₂SO₄0.46g/L，KNO₃ 2.83g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄ 0.092g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，Na₂-EDTA 0.15g/L，FeSO₄·7H₂O 0.11g/L，MnSO₄·4H₂O0.44g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.17g/L，H₃BO₃ 0.14g/L，CoCl₂·6H₂O 0.0005g/L，CuSO₄·5H₂O0.0005g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.005g/L，盐酸硫胺素VB₁ 0.01g/L，烟酸0.001g/L，盐酸吡哆醇VB₆ 0.001g/L，肌酸0.1g/L，酪蛋白水解物0.3g/L，L-Pro 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，pH5.8。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再用无菌水冲洗1遍，置于无菌滤纸上晾干，最后转入筛选培养基(N₆基本培养基+2，4-D 2mg/L+头孢霉素250mg/L)筛选。

3)阳性转基因水稻的获得

将侵染后的水稻愈伤组织于N₆共培养基中共培养3-5天后，转至含30mg/L潮霉素和400mg/L头饱霉素的N₆固体培养基(N₆大量元素+B₅微量元素+B₅有机成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH 5.8)上筛选3周，再转入含50mg/L潮霉素和200mg/L头饱霉素的N₆固体培养基上筛选4周，随后将抗性愈伤组织转入预分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3周，再转入分化培养基(N₆培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤)上进行分化，将生长出的再生植株在壮苗培养基(1/2MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上进行生根培养后移至温室中，在28℃、15小时/天的光照下培养1个月后取植株叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’和反向引物5’-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’的引导下，PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得1009bp DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果表明用上述方法获得了转化有OsMAP3Kβ3-pH2GW7的转基因水稻。

实施例3、转基因T1代水稻植株的遗传分析和分子鉴定

取实施例2收获的OsMAP3Kβ3T1代转基因水稻的种子，用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3：1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的OsMAP3Kβ3转基因株系。

实施例4、转基因T1代植株耐盐性鉴定

收获OsMAP3Kβ3T1代转基因水稻种子。用水浸种培养3天使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以未转基因水稻中花11作对照，筛选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离比，获得具有单位点插入的OsMAP3Kβ3转基因株系。继续培养10天后，将苗转移到大试管中，加入含有1％NaCl的盐溶液，进行盐胁迫处理7天(温度：28℃；光强：2500Lux；光照时间：光15h/暗9h)，期间每天更换盐溶液，以保持盐浓度和pH值的稳定，筛选7天后除去盐溶液，改为正常培养，一周后统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图3所示(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)，同时以未转基因的中花11水稻苗为对照。实验结果显示，T1代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，OsMAP3Kβ3转基因水稻T1代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(见图4)。将筛选得到的OsMAP3Kβ3转基因T1代耐盐阳性植株移栽大田，继续生长。

实施例5、转基因T2代植株耐盐性鉴定

收获T2代OsMAP3Kβ3转基因水稻种子，对T1代进行耐盐筛选后的3个不同的具有单位点插入的转基因株系进行T2代植株耐盐鉴定，每个株系选取2个不同的T2代植株进行筛选，每个植株选取100粒饱满的种子进行浸种，发芽出苗后，用50mg/L的潮霉素进行筛选5天，选取纯合体植株进行耐盐筛选。继续培养10天后，将苗转移到大试管中，加入含有1％NaCl的盐溶液，进行盐胁迫处理7天(温度：28℃；光强：2500Lux；光照时间：光15h/暗9h)，期间每天更换盐溶液，以保持盐浓度和pH值的稳定，筛选7天后除去盐溶液，改为正常培养，一周后统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图5所示(横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)，同时以未转基因的中花11水稻苗为对照。实验结果显示，T2代转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，OsMAP3Kβ3转基因水稻T2代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，未转基因的中花11对照(WT)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(见图6)。

尽管为说明目的公开了本发明的具体实施例和附图，其目的在于帮助理解本发明的内容并据以实施，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于最佳实施例和附图所公开的内容。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>北京未名凯拓农业生物技术有限公司

<120>一个与耐盐性相关的水稻蛋白质激酶基因的克隆及应用

<130>JSP070356

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>536

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>1

Met Ala Ala Arg Gln Arg Pro Arg Ala Gln Leu Ala Arg Ile Asn Ala

1               5                   10                  15

Met Arg His Ser Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Asp Gly Ser Gly Asp Asp

            20                  25                  30

Val Cys Gly Glu Leu Asp Asp Gly Gly Gly Glu Tyr Ala Ser Gln Thr

        35                  40                  45

Ser Phe Arg Ile Arg Gly Gly Arg Gly Ala Ala Glu Val Thr Ala Ile

    50                  55                  60

Phe Arg Lys Leu Gly Leu Ser Gly Pro Glu Asp Phe Thr Ile Pro Pro

65                  70                  75                  80

Ala Val Tyr Ala Ala Ala Met Ser His Leu Ser Ser Ser Ala Arg Arg

                85                  90                  95

Arg Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Pro Ser Glu Leu Leu Glu Ala Ser

            100                 105                 110

Pro Ala Glu Ala Ala Val Pro Met Asn Arg Glu Ala Val Glu Lys Gly

        115                 120                 125

Glu Glu Ala Gly Pro Ala Pro Lys Leu Val Gln Ser Glu Val Thr Glu

    130                 135                 140

Val Ser Thr Arg Ala Tyr Ala Asn Ala Thr Pro Ala Pro Glu Ser Ser

145                 150                 155                 160

Ile Arg Val Val Ala Pro Ser Ala Thr Lys Phe Val Gln Ala Glu Ala

                165                 170                 175

Ile Glu Val Ser Thr Arg Ser Tyr Ala Arg Pro Ala Ala Ser Val Arg

            180                 185                 190

Ser Val Ala Ser Lys Arg Ala Leu Leu Lys Gln Asp Ser Ala Asp Glu

        195                 200                 205

Asp Lys Glu Lys Gly Lys Leu Val Arg Leu Asp Lys Ser Arg Glu Glu

    210                 215                 220

Ile Arg Gly Glu Val Val Val Glu Ala Thr Arg Glu Thr Thr Gly Ala

225                 230                 235                 240

Ser Ala Leu Val Val Glu Ala Thr Arg Glu Ser Thr Ser Arg Asp Ile

                245                 250                 255

Glu His Leu Ile Ser Pro Ser Pro His Arg Arg Phe Arg Arg Thr Ile

            260                 265                 270

Thr Ser Trp Leu Lys Gly Glu His Leu Gly Ser Gly Ser Phe Gly Ser

        275                 280                 285

Val Tyr Glu Ala Ile Ser Asp Asp Gly Phe Phe Phe Ala Val Lys Glu

    290                 295                 300

Val Ser Leu Ile Asp Gln Gly Ile Asn Ala Lys Gln Arg Ile Val Gln

305                 310                 315                 320

Leu Glu His Glu Ile Ser Leu Leu Ser Arg Leu Glu His Glu Asr Ile

                325                 330                 335

Val Gln Tyr Phe Gly Thr Asp Lys Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Ile Phe

            340                 345                 350

Leu Glu Leu Val Thr Gln Gly Ser Leu Ala Ala Leu Tyr Gln Lys Tyr

        355                 360                 365

Arg Leu Gln Asp Ser Gln Val Ser Ala Tyr Thr Arg Gln Ile Leu Ile

    370                 375                 380

Gly Leu Asn Tyr Leu His Gln Arg Asn Val Leu His Arg Asp Ile Lys

385                 390                 395                 400

Cys Ala Asn Ile Leu Val Asp Ser Asn Gly Leu Val Lys Leu Ala Asp

                405                 410                 415

Phe Gly Leu Ala Lys Glu Met Ser Ile Leu Ser Gln Ala Arg Ser Ser

            420                 425                 430

Lys Gly Thr Val Tyr Trp Met Ala Pro Glu Val Ala Lys Ala Lys Pro

        435                 440                 445

His Gly Pro Pro Ala Asp Ile Trp Ser Leu Gly Cys Thr Val Leu Glu

    450                 455                 460

Met Leu Thr Gly Lys Val Pro Tyr Thr Asp Met Glu Trp Thr His Ala

465                 470                 475                 480

Leu Leu Lys Ile Gly Arg Gly Ile Pro Pro Glu Ile Pro Ala Thr Leu

                485                 490                 495

Ser Glu Asp Ala Arg Asp Phe Ile Met Lys Cys Val Lys Val Asn Pro

            500                 505                 510

Asn Asp Arg Pro Ser Ala Ala Gln Leu Leu Asp His  Pro Phe Val Gln

        515                 520                 525

Arg Ser Leu Gln His Lys Gly Ala

    530                 535

<210>2

<211>1835

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

atggcggcgc gccagcggcc gcgggcgcag ctcgcgcgga tcaacgccat gaggcactcc    60

tacaccgccg cgggggacga tggctccggg gacgacgtgt gtggggagct cgacgacggc    120

gggggcgagt acgcgtcgca gaccagcttc cgcatccgcg gggggcgcgg ggccgcggag    180

gtcaccgcca tcttccgcaa gctggggctc tccgggcccg aggacttcac catcccgccc    240

gcggtctacg ccgccgccat gtcccacctc tccagctccg cccgccgccg cgcgtcgctc    300

gaggtggctt ccccgtcgga gctcctagaa gcttctccag ccgaagccgc ggttccgatg    360

aatcgggaag cagtcgagaa gggggaggaa gctggtccgg cccccaaatt ggttcaatca    420

gaggttacag aagtttccac acgagcttat gcaaatgcaa cgcctgcacc agaatcgagc    480

atcagagtag tagctccatc ggccaccaaa tttgttcaag cagaagctat agaagtttcc    540

acacgatcat atgcaaggcc tgcagcgagc gtcagatcag tagcttctaa acgagctctg    600

ctgaagcagg atagtgcaga cgaggacaag gagaaaggta aattggtcag attggataaa    660

tcacgagagg aaattagagg agaggtggtt gtggaggcta caagggagac caccggtgcc    720

tcggctctgg tcgtggaggc gacaagggag tccacttcac gtgacatcga gcatttgatt    780

tcaccctctc ctcacaggcg gtttaggaga accatcacgt cctggcttaa gggagagcat    840

ctcgggagtg gatcgttcgg gtcagtgtat gaggctatca gtgatgatgg ttttttcttc    900

gctgtcaagg aggtgtcatt gattgatcaa gggatcaatg caaaacaacg cattgtccaa    960

cttgagcatg agatctctct gttgagtcgt ttggagcatg aaaacattgt tcagtatttt    1020

ggaacagaca aggaagatgg aaaactgtat attttccttg aactagtaac tcaaggctct    1080

ttggcagctc tatatcaaaa ataccgttta caggactcac aagtctcagc gtacacaagg    1140

cagattttga taggtttgaa ctatctacac cagcggaacg tgttacacag agatattaaa    1200

tgtgcaaata tcctagtgga ttctaatgga ttagttaaac tggcagattt tgggcttgca    1260

aaagagatgt caattttgag tcaggcaaga tctagcaagg gaactgttta ctggatggcc    1320

cctgaggttg ctaaggctaa gcctcatgga cctccagcag atatatggag tcttggctgc    1380

acagttttag aaatgctgac tggcaaagtt ccatacactg atatggaatg gacgcatgct    1440

ttgcttaaaa ttggtagagg aataccacca gaaattccag ctacactgtc agaagatgct    1500

cgtgatttca taatgaagtg tgtaaaagta aatccaaatg atcggccatc tgctgctcag    1560

ctgttggacc atccatttgt ccagagatca ctgcaacata aaggcgccta atcactcttg    1620

tgttgctaac aaacttgctt gtacataagc tggtcagtat tccattcttt ctcatacaaa    1680

aatttcaaga aatagggcgc tatgactatg atcctgtatt gcaaacatta atggatttct    1740

ctctgttgca tttcatagat tttaatttta cctgtggaaa caggaaagct gttgatgctg    1800

aggatgatcc caaatccctt gccatgatac agcgg                               1835

Claims (10)

1.一种与植物耐盐性相关的蛋白质，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：1。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID NO：2。

4.权利要求1所述蛋白质及其编码基因在提高植物耐盐性上的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将所述蛋白质的编码基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐盐性提高的转基因植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述蛋白质编码基因的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID NO：2。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述蛋白质编码基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：用所述蛋白质编码基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：用所述蛋白质编码基因构建植物表达载体时添加翻译增强子和/或转录增强子。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：在所述植物表达载体中加入选择性标记基因，所述选择性标记基因包括但不限于：可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶的基因、发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物和抗化学试剂标记基因。

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