CN110564693A

CN110564693A - 一种分离的细胞或细胞系

Info

Publication number: CN110564693A
Application number: CN201910841822.5A
Authority: CN
Inventors: 肖磊; 吴昭; 毛丽; 彭君凯
Original assignee: SHANGHAI SIDANSAI STEM CELL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Shanghai Xuxu Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2019-12-13

Abstract

本发明公开了一种分离的细胞或细胞系，所述分离的细胞为嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞，其中所述T细胞的TRAC基因使用ZFN灭活，或所述T细胞是包含编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸或其组合的T细胞；能够提高CAR‑T细胞的安全性，降低后期GVHD的发病率。

Description

一种分离的细胞或细胞系

技术领域

本公开涉及修饰的细胞和用途，特别是用于使用修饰细胞制备修饰细胞和治疗癌症的组合物和方法。

背景技术

随着细胞免疫学的不断发展，免疫T细胞在缓解肿瘤发展以及清除肿瘤方面的作用日益受到科学家的重视。研究发现，使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时，肿瘤细胞的靶抗原需要经过其表面的主要组织相容性复合物(main histocompatibility complex，MHC)的加工递呈后才能被体内T细胞表面的受体所识别，使得肿瘤细胞被清除，即T细胞发挥功能具有“MHC限制性”的特性。然而，肿瘤免疫编辑的过程会使肿瘤细胞表面的MHC分子表达量显著降低，破坏了抗原的加工和递呈，降低肽段免疫原性，阻碍了T细胞的识别和激活，使肿瘤细胞成功地躲避T细胞的攻击，最终导致肿瘤的快速增殖，这就是肿瘤的免疫逃逸机制。为了提高T细胞杀伤肿瘤的能力，利用基因重组技术将靶向肿瘤抗原的特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)融合到T细胞(以下简称CAR-T细胞)基因组中，这种途径在体外和临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗提供了新的有效解决方案，展示了巨大的应用潜力和发展前景。

嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)治疗是一种新型的肿瘤免疫治疗方法。在多种血液肿瘤的临床实验中，CAR-T细胞疗法取得重大突破，在实体瘤的临床实验中也初见成效。然而，在获得显著疗效的同时，CAR-T这种自体T细胞免疫治疗仍具有局限性，特别是当一些患者可能不能产生足够量的用于连续CAR-T细胞治疗的T细胞。这使得这些患者的生命处于危险之中。并且，目前临床上CART细胞治疗面临的一个严重的副反应是移植物抗宿主病(GVHD)，所谓的GVHD是异基因造血干细胞移植(HCT)的主要并发症，是一种特异的免疫现象，是由于移植物组织中的免疫活性细胞与免疫受抑制的、组织不相容性抗原受者的组织之间的反应。由于供受体之间存在着免疫遗传学差异，移植骨髓中的免疫活性细胞(主要是T淋巴细胞)识别了受体的不同组织相容性抗原而增生分化，在受体内增生到一定程度后把受体的某些组织或器官作为靶目标进行免疫攻击而产生损害。急性GVHD通常移植后100天内发病，或者在移植后100天之后出现持续性、复发性或者迟发型症状。移植物抗宿主病是骨髓移植后出现的多系统损害(皮肤、食管、胃肠、肝脏等)的全身性疾病。慢性GVHD可能会在急性疾病后(进行性)出现，并在急性疾病(无症状或间断性)消退一段时间后开始出现，或者再次出现。临床表现多变，通常与自身免疫性疾病类似。重叠综合征的临床表现兼具了急性与慢性GVHD的特征。临床表现：类似于多系统的自身免疫性疾病，如：综合征、系统性红斑狼疮、硬皮病等。累及眼部时，临床上可表现为角膜、结膜干燥，无泪，无菌性结膜炎，持续性角膜上皮损害，角膜溃疡溶解。GVHD的发生可严重影响患者的生存率和生存质量，积极的预防具有重要意义。

因此，提高CAR-T细胞的安全性，降低后期GVHD的发病率是目前临床面临的首要问题。

发明内容

1.要解决的问题

针对目前CAR-T细胞治疗过程中出现的正常组织损伤的毒性，本发明提供了一种ZFN灭活TRAC基因或功能减少的方法，降低GVHD的发病率。本发明也提供一种安全性更高的CAR-T细胞。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明的实施方案涉及一种TRAC基因失活的分离的细胞，该细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列；

在一些实施方案中，分离的细胞或细胞系是包含编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸或其组合的T细胞。在一些实施方案中，T细胞包含编码hTERT的核酸序列和编码SV40LT的核酸。

在一些实施方案中，CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激信号传导区和CD3ζ信令结构域。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域与FZD10，TSHR，PRLR，Muc17，GUCY2C，CD207，CD19或CD20结合。

在一些实施方案中，与初级人T细胞的GVHD反应相比，上述T细胞在生物相容性人类受体中具有降低的移植物抗宿主病(GVHD)应答。

在一些实施方案中，CAR的共刺激信号传导区包含选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原的共刺激分子的细胞内结构域-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合。

在一些实施方案中，hTERT的表达受诱导型表达系统调节。

在一些实施方案中，SV40LT基因的表达受诱导型表达系统的调节。

在一些实施方案中，可诱导表达系统是rTTA-TRE，其可增加或激活SV40LT基因或hTERT基因的表达，或其组合。

在一些实施方案中，T细胞包含编码自杀基因的核酸序列。

在一些实施方案中，自杀基因是HSV-TK系统。

一些实施方案涉及分离的细胞中TRAC基因使用ZFN灭活；所述ZFN包括与TRAC基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，和切割结构域；

所述第一锌指蛋白包含三个或三个以上的锌指结构域；所述第二锌指蛋白包含三个或三个以上的锌指结构域；

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号SEQ ID NO为2、5-7、2和19的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、1-3和22的氨基酸序列；或

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、5-7、2和19的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为1-3和22的氨基酸序列；或

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、5、11、7、2和9的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、1-3和22的氨基酸序列；或

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、5、11、7、2和9的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为1-3和22的氨基酸序列；或

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、5、15、7、2,和9的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、1-3和22的氨基酸序列；或

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、5、15、7、2和9的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为1-3、22的氨基酸序列；或

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、5、23和7、2和9的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为1-3、22的氨基酸序列。

一些实施方案涉及治疗受试者中的癌症的方法。该方法可以包括向受试者施用经遗传修饰的细胞，并且癌症选自肺癌，胰腺癌，肝癌，骨癌，乳腺癌，结肠直肠癌，白血病，卵巢癌，淋巴瘤和脑癌。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的细胞或细胞系，利用ZFN对其基因组进行定向的修饰或改造，选用的ZFN包括与TRAC基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，其中所述第一锌指蛋白和第二锌指蛋白能够靶向识别切割特异目的DNA，切割效率高，有效地靶向替换或敲除基因组DNA，对TRAC基因进行灭活或功能减少。

(2)本发明的细胞或细胞系作为CAR-T细胞，细胞内包含自杀基因，相比传统型CAR-T，能够降低后期GVHD的发病率，安全性更高。

(3)本发明提供的细胞或细胞系，利用含有特定序列的锌指蛋白的ZFN对TRAC基因进行灭活或功能减少，具有极高的切割效率和打靶准确性，将DNA片段克隆到载体中，进行多克隆测序检测，在TRAC位点处发现有双测序信号存在，表明本发明的ZFN能够准确突变TRAC基因，其中左臂为ZFLm1，右臂为ZFRm1-4的ZFN组合切割效率最高，该组ZFN的基因打靶效率能够达到49％。

附图说明

参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。

图1为一种针对TRAC外显子1的锌指核酸酶；

图2-8表示针对TRAC基因片段的ZFN的测序结果，并通过PCR进行了扩增。可以观察到ZFN的双序列信号，将双序列信号的底部部分以黑框显示的形式循环，表明靶向基因是以突变的方式引入的。双序列信号密度越高，编辑效率越高；测序结果上方的标签表示相应的ZFN组合，ZFN识别的目标序列与黑框显示的形式一起循环。

图9为CAR-T细胞结构示意图。

图10为T细对肿瘤细胞(RK562-CD19)的特异性杀伤示意图，图中为分离的细胞是包含编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸序列或其组合的T细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

本公开部分涉及证明CAR-T细胞的内源性TRAC可以使用特定的ZFN进行修饰，而这些特定ZFN的设计决定了修饰的概率和/或效率。

除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与公开所涉技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本公开的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但对优选的方法和材料进行了描述。

为了便于描述，本文术语定义如下：

“约”是指与参考量、水平、值、数量、频率、百分比、量纲、大小、用量、重量或长度相比，量、水平、值、数量、频率、百分比、量纲、大小、用量、重量或长度的变化高达30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。

本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

如本文所使用的，术语“活化(激活)”指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。

术语“活化的T细胞”指的是正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性或功能即可。本公开中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999年，载于：《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社，纽约；Harlow等人，1989年，载于：《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，冷泉港，纽约；Houston等人，1988年，美国国家科学院院报85:5879-5883；Bird等人，1988年，《科学(Science)》242:423-426)。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常包含抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由一个重链和一个轻链可变区结构域通过紧密的、非共价结合的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠发出提供用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性的六个高变环(3个环各自来自H和L链)。但是，即使单个可变结构域(或者仅仅包括抗原特异的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力比完整结合位点低。

本文所使用的“抗体重链”指的是以它们天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两条多肽链中较大的一条。如本文所使用的，“抗体轻链”指的是以它们天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两条多肽链中较小的一条。抗体轻链有两种：κ链和λ链。

如本文所使用的术语“合成抗体”是指利用重组DNA技术产生的抗体，例如，如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指通过编码抗体的DNA分子的合成而产生的抗体，并且所述DNA分子表达抗体蛋白质，或表示抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列是利用本领域可用且公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得的。

如本文所使用的术语“抗原”被定义为引起免疫应答的分子，所述免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或这两者。抗原可以包括任何大分子，实际上包括所有蛋白质或肽，或者源自重组或基因组DNA的分子。例如，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，编码如本文所使用的术语“抗原”。此外，抗原不一定仅由基因的全长核苷酸序列编码。进一步地，抗原可以通过生物学样本产生、合成或衍生，所述生物学样本包括组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学液体。

如本文所使用的，术语“抗肿瘤作用”指的是与肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、转移数量的减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命的增加，或者与癌性病症相关的各种生理症状的改善相关的生物学效应。“抗肿瘤作用”也可由本公开的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤发生中的首要作用。

术语“自体抗原”指的是由免疫系统错误识别为外来的抗原。自体抗原包括细胞蛋白质、磷蛋白质、细胞表面蛋白质、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体”用于描述源自相同个体的物质，所述物质后来又被重新引入到个体中。

“同种异体”是指从同一物种的另一种动物中提取的移植物。

“异种异体”是指从不同物种的动物中提取的移植物。

如本文所使用的术语“癌症”被定义为以异常细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其它部位。各种癌症的包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含”、“含有”和“包含”将被理解为指包括所陈述的步骤或元素或多个步骤或多个元素以及多个步骤及元素，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的集合

“由……组成/构成”是指包括并且限于短语“由……组成/构成”之后所描述的内容。因此，短语“由……组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且其它元素均不存在。

“基本上由……组成”是指包括该短语后面列出的任何元素，并且限于对本公开中针对所列元素说明的活性或作用不干扰或无贡献的其它元素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元素是必要的或强制性的，但是其它元素是任选的，并且根据它们是否影响所列元素的活性或作用可以存在或不存在。

术语“互补的”和“互补”指的是通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”是互补的。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对原则进行匹配。或者，核酸之间可存在“完全”或“总体”的互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。

“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补的核酸序列或编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或者(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸的序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的同源共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体。

“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的同源结合配偶体，由此由T细胞介导共刺激应答，诸如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子、BTLA和Toll样受体。

“共刺激信号”指的是与初级信号(诸如TCR/CD3接合)结合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

如本文所使用的术语“疾病”和“病症”可以互换使用，也可以是不同的，因为特殊的疾病或病症可能不具有已知的致病因子(因此不能用病因学解决)，因此尚未被认为是一种疾病，而只是一种不受欢迎的状况或综合症，其中临床医师已经鉴定出或多或少的特异系列症状。

如本文所使用的“疾病”是受试者的健康状态，受试者不能维持体内平衡，如果疾病没有得到改善，那么受试者的健康继续恶化。与之相比，“紊乱”虽然也是受试者的一种健康状态，受试者能够维持体内平衡，但在这种状态下，受试者的健康状态明显比不上其没有处于紊乱时的健康状态。如果不加以治疗，这种紊乱并不一定会进一步使受试者的健康状态恶化。

如本文所使用的术语“有效的”是指足以实现所期望的、预期的或意图的结果。例如，“有效量”可以是足以产生治疗性或预防性益处的化合物的量。

“编码”指的是多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特异性序列在生物学过程中用作合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质，所述聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由其产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其它产物。

关于多核苷酸，术语“外源的”指的是在野生型细胞或生物体中并非天然存在但是通常通过分子生物学技术将其引入到细胞中的多核苷酸序列。外源多核苷酸包括载体、质粒、和/或编码所需蛋白质的人造核酸构建体。

对于多核苷酸，术语“内源的”或“天然的”指的是可在给定的野生型细胞或生物体中找到的天然存在的多核苷酸序列。同样，从第一生物体分离并且通过分子生物学技术转移到第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为相对于所述第二生物体是“外源”多核苷酸。在具体的实施例中，多核苷酸序列可以通过分子生物学技术被“引入”到已包含这样的多核苷酸序列的微生物中，例如以创建另外的天然存在的多核苷酸序列的一个或多个附加拷贝，并且由此促进所编码的多肽的过表达。

如本文所使用的，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

“同源性/同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为两个序列共有的匹配或同源位置数除以被比较的位置数再乘以l00所得的函数。例如,如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。通常，当两个序列进行比对给出最大同源性时才进行比较。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”指的是起到抗体作用的一类蛋白质。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物(诸如唾液、泪液、母乳)、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数受试者的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、补体结合和其它抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能但可用作抗原受体的免疫球蛋白。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。

“分离的”是指基本上或实质上不含通常在其天然状态下附带着的成分的物质。例如，如本文所使用的，“分离的多核苷酸”指的是在天然存在的状态下被来自其两侧的序列所纯化的多核苷酸，例如从正常毗邻于所述片段的序列所移除的DNA片段。可选地，如本文所使用的，“分离的肽”或“分离的多肽”等指的是肽或多肽分子从其天然细胞环境中的体外分离和/或纯化，以及与细胞的其它成分关联。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并版本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含(一个或多个)内含子。

如本文所使用的，“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中，慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以将显著量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，所以它们是基因传递载体的最有效的方法之一。慢病毒包括HIV、SIV和FIV。源自慢病毒的载体提供了实现显著水平的基因体内转移的工具。

如本文所使用的术语“调节”是指与缺少治疗或化合物的受试者中的应答水平相比，和/或与在另外相同但未治疗的受试者中的应答水平相比，介导受试者中的应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导受试者、优选人中的有益的治疗性应答。

当使一核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，所述核酸即是“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽的分泌的前蛋白，则其可操作地连接至所述多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位成便于翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相。然而，增强子不一定是连续的。连接是通过在方便的限制性位点进行接合而实现的。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或连接子。

术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意在表示相对于在来自组织或器官的正常细胞中的表达水平，肿瘤抗原在来自患者的特异性组织或器官内的疾病区域(如实体肿瘤)的细胞中的异常表达水平。患有特征在于肿瘤抗原的过表达的实体肿瘤或恶性血液疾病的患者可以通过本领域中已知的标准测定法来确定。

免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括，例如，皮下注射(s.c.)、静脉内注射(i.v.)、肌内注射(i.m.)、或胸骨内注射、或输液技术。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等等在本文中可互换使用，并且指的是不论是在体外或原位服从本文所描述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人。在一些实施例中，术语“受试者”意在包括可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

如本文所使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常指的是长度为至少10个碱基的聚合体形式的核苷酸，所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式。包括DNA和RNA的单链和双链形式。

术语“TRAC”为T细胞受体a链恒定区编码，α链恒定结构域具有以下的符号：TRAC，其中“TR”表示T细胞受体基因；“A”表示α链基因；C表示恒定区；

术语“多核苷酸变体”和“变体”等指的是显示出与参考多核苷酸序列具有基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的低严谨性条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过至少一个核苷酸的添加、缺失或取代而区别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸被添加或缺失，或用不同的核苷酸置换的多核苷酸。在这方面，本领域技术人员可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，由此所改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生物学功能或活性，或者相对于所述参考多核苷酸具有增加的活性(即，优化)。多核苷酸变体包括，例如，与本文中所描述的参考多核苷酸序列具有至少50％(即至少51％-99％，以及处于二者之间的所有整数百分比，例如，90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和编码这些酶的直系同源物。

“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用来指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物(诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化不同的化学反应(即，增加不同的化学反应的速率)的酶多肽，或“酶”。

叙述多肽“变体”指的是通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代而区别于参考多肽序列的多肽。在某些实施例中，多肽变体通过一个或多个取代基而区别于参考多肽，所述取代基可以是保守的或非保守的。在某些实施例中，所述多肽变体包含保守性取代基，并且在这方面，本领域中很好理解的是，一些氨基酸可以被改变为具有广泛相似性质的其它氨基酸，而不改变多肽的活性性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸被添加或缺失，或用不同的氨基酸残基置换的多肽。

如本文所使用的，术语“启动子”被定义为通过细胞的合成机制，或引入的合成机制识别的DNA序列，它是启动多核苷酸序列的特异性转录所必需的。表达“控制序列”指的是在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如适于原核生物的控制序列包括启动子，任选地包括操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、多腺苷酸化信号，以及增强子。

术语“结合”或“与……相互作用”是指一个分子识别并粘附到样本或生物体中的特定第二分子，但基本上不识别或粘附到样本中的其它结构上无关的分子。如本文关于抗体所使用的，术语“特异性结合”是指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其它分子的抗体。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体也可与来自一个或多个物种的抗原结合。但是，这种交叉物种反应性本身没有将抗体的类别改变为特异性的。在另一个实例中，与抗原特异性结合的抗体也可与不同等位基因形式的抗原结合。然而，这种交叉反应性本身没有将抗体的类别改变为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以在提及抗体、蛋白质或肽与第二化学物种的相互作用时使用，用于指所述相互作用依赖于化学物种上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白质结构而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在将降低与抗体结合的标记的A的量。

“结合蛋白”是能够非共价结合到另一个分子的蛋白质。结合蛋白可以结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)，RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况下，其可以结合自身(以形成同型二聚体，同三聚物等)和/或其可结合不同蛋白质或蛋白质的一种或多种分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合，RNA结合和蛋白结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白质或更大蛋白质内的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，所述锌指是在其结构通过配位锌离子稳定结构域。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。

锌指结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如通过天然存在的锌指蛋白的识别螺旋区的工程(改变一个或多个氨基酸)。此外，锌指结合结构域可以融合DNA切割结构域以形成靶向特定所需DNA序列的锌指核酸酶(ZFN)。例如，如图1所示，可以将一对ZFN(例如，ZFN-左臂和ZFN-右臂)设计成靶向并引起特定所需DNA序列(例如，TRAC基因)的修饰。

“裂解”是指DNA分子的共价骨架的断裂。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且由于两个不同的单链切割事件的结果可能发生双链切割。DNA切割可导致产生钝端或交错末端。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA切割。

“靶位点”或“靶序列”是限定结合分子将结合的核酸的一部分的核酸序列，只要有足够的结合条件存在即可。例如，序列5'GAATTC 3'是EcoRI限制性内切核酸酶的靶位点。各种靶向ZFP的示例性靶位点如表2所示。

“融合”分子是其中两个或多个亚单位分子连接，优选共价的分子。亚基分子可以是相同的化学类型的分子，也可以是不同化学类型的分子。第一类融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP DNA结合结构域和一个或多个激活结构域之间的融合物)和融合核酸(例如，编码上述融合蛋白)。第二类融合分子的实例包括但不限于三链体形成核酸和多肽之间的融合，以及小沟粘合剂和核酸之间的融合。

融合蛋白在细胞中的表达可以通过将融合蛋白递送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞而产生，其中多核苷酸被转录并转录转录物以产生融合蛋白。跨剪接，多肽切割和多肽连接也可以参与蛋白质在细胞中的表达。将多核苷酸和多肽递送到细胞的方法在本公开的其他地方有描述。

基因表达的“调节”是指基因活性的变化。表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因抑制。基因组编辑(例如，切割，改变，失活，随机突变)可用于调节表达。基因失活是指与不包含本文所述的ZFP的细胞相比，基因表达的任何降低。因此，基因失活可能是部分或完全的。

“感兴趣区域”是细胞染色质的任何区域，例如在基因内或邻近基因中的基因或非编码序列，其中期望结合外源性分子。结合可以用于靶向DNA切割和/或靶向重组。感兴趣的区域可以存在于例如染色体，附属物，细胞器基因组(例如线粒体，叶绿体)或感染性病毒基因组中。感兴趣的区域可以在转录的非编码区域(例如前导序列，尾部序列或内含子)内，或在编码区的上游或下游的非转录区域内的基因的编码区内。感兴趣的区域可以与单个核苷酸对一样小或长达2,000个核苷酸对，或核苷酸对的任何整数值。

“统计学上显著的”是指结果不太可能是偶然发生的。统计显著性可通过本领域已知的任何方法来确定。通常使用的显著性测量值包括P值，它是在无效假设是真的情况下所观察到的事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则无效假设被拒绝。在简单的情况下，显著性水平被限定在0.05或更小的p值。“下降的”或“减少的”或“更少的”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括是本文中描述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如，100、500、1000倍)(包括在之间和在1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的下降。

术语“刺激”是指通过将刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，由此介导信号转导事件，诸如经TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。

“刺激分子”指的是与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。

“刺激配体”指的是当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的同源结合配偶体(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合的配体，由此介导T细胞的初级应答，包括活化、免疫应答的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并且尤其包括负载有肽的MHC I类分子、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体，以及超激动剂抗-CD2抗体。

如本文所使用的，“基本上纯化的”细胞为基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与在其天然存在状态下与其正常相关联的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其它情况下，该术语仅仅指的是已经与在其天然状态下与其自然相关联的细胞分离的细胞。在一些实施例中，细胞在体外培养。在其它实施例中，细胞不在体外培养。

如本文所使用的，术语“治疗的”表示治疗和/或预防。治疗作用通过疾病状态的抑制、缓和或根除而获得。

术语“治疗有效量”指的是将引发由研究者、兽医、医生或其它临床医师所寻求的组织、系统或受试者的生物学或医学应答的受试者化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用化合物时足以预防被治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或在一定程度上减轻被治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、以及待治疗的受试者的年龄、重量等而变化。

如本文所使用的术语，“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或紊乱的至少一种迹象或症状的频率或严重性。

如本文所使用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是外源核酸被转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其子代。

如本文所使用的，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子在相对于多核苷酸的正确位置和朝向上，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。

“载体”为包括分离的核酸，并且可用于将分离的核酸传递至细胞内部的物质组合物。很多载体在本领域中是已知的，包括线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当被解释为包括便于将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的实例包括但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等等。比如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，其中，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，其还包含具有调节或结构功能的其它基因。慢病毒载体在本领域中是公知的。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体通过将大多的HIV的致病基因剔除而产生，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除使得载体具有生物安全性。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。

本发明的实施方案涉及分离的锌指核酸酶(ZFN)，包括与T细胞受体a链恒定区编码(TRAC)基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，和切割结构域；

所述第一锌指蛋白包含三个或三个以上的锌指结构域；所述第二锌指蛋白包含三个或三个以上的锌指结构域。

本公开的一些实施方案涉及包含锌指DNA结合蛋白的DNA结合结构域的锌指核酸酶(ZFN)和包含切割结构域和/或切割半结构域的DNA切割结构域。

锌指蛋白可以包括1、2、3、4、5、6或更多个锌指，每个锌指具有与所选序列(例如，基因)中的靶亚位点结合的识别螺旋。在某些实施方案中，锌指蛋白包含4或5或6个指(分别被命名为F1，F2，F3，F4，F5和F6，并且由N末端至C末端排列F1至F3，F4或F5或F6)，并且所述的指包含表1所示的识别区的氨基酸序列。

锌指蛋白包含切割结构域和/或切割半结构域(例如，野生型或工程化的FokI切割半结构域)。在一些实施方案中，核酸酶结构域可以包含野生型核酸酶结构域或核酸酶半结构域(例如，FokI切割半结构域)。在一些实施方案中，切割结构域和/或切割半结构域包含工程化(非天然存在的)核酸酶结构域或半结构域，例如，形成专性异二聚体的工程化的FokI切割半结构域。

在一些实施方案中，所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号SEQ ID NO为2、5-7、2和19的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、1-3和22的氨基酸序列；或

所述第一锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为2、5、23和7、2和9的氨基酸序列；所述第二锌指蛋白从N端到C端依次包括序列号为SEQ ID NO为1-3、22的氨基酸序列。在这些情况下，ZFN介导修饰的百分比不小于20。

一些实施方案涉及及分离的ZFN，其包括与TRAC基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，和切割结构域；

所述第一锌指蛋白包含三个或更多个的锌指结构域；所述第二锌指蛋白包含三个或更多个的锌指结构域。

在一些实施方案中，一些实施方案中，第一个锌指蛋白为ZFL-5，第二个锌指蛋白为ZFR-4，或第一个锌指蛋白为ZFL-4，第二个锌指蛋白为ZFR-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm1，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm1，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm1-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm1-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm1-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm1-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm2，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm2，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm2-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm2-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm2-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm2-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm3，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm3，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm3-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一个锌指蛋白为ZFLm3-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或第一个锌指蛋白为ZFLm4，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或第一锌指蛋白为ZFLm4-4，第二锌指蛋白为ZFRm1-4。具体可以参见表1。

一些实施方案涉及分离的ZFN，其包括与TRAC基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，和切割结构域；所述第一锌指蛋白包含三个或更多个的锌指结构域；所述第二锌指蛋白包含三个或更多个的锌指结构域；

在一些实施方案中，所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ IDNO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：21，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：21，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：21，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ IDNO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：21，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：10，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：21，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

在一些实施方案中，TRAC基因是人TRAC基因。

在一些实施方案中，切割结构域包含野生型或工程化的FokI切割结构域。

一些实施方案涉及编码上述分离的ZFN的多核苷酸。

一些实施方案涉及包含多核苷酸的载体。

在一些实施方案中，载体是腺病毒或慢病毒载体。

一些实施方案涉及包含上述分离的ZFN的分离的细胞或细胞。

在一些实施方案中，分离的细胞是干细胞，T细胞或天然杀伤(NK)细胞。例如，细胞是衍生自从人供体分离的原代人T细胞的T细胞。所述干细胞为不具有发育成人类个体的能力。

在一些实施方案中，T细胞具有降低的内源性TRAC基因的表达。

一些实施方案中，将上述分离的锌指核酸酶应用于动植物基因工程，进行动植物的基因组靶向修饰。

一些实施方案中，涉及用于切割、替换或修饰靶区域中的核苷酸序列的试剂盒，试剂盒中包含一对或多对上述的锌指核酸酶。

一些实施方案涉及具有降低的内源性TRAC基因表达的分离的T细胞。在一些实施方案中，分离的T细胞缺少功能性内源性TCR的表达和/或在其表面上产生实质上受损的内源性TCR，使得内源性TCR在宿主中不会实质上引起不良免疫反应，例如GVHD反应。在一些情况下，T细胞的后代也可能合理预期缺乏功能性内源性TCR的表达和/或在其表面上产生实质上受损的内源性TCR，使得内源性TCR的后代基本上不会引起不良免疫反应主机，例如GVHD反应。细胞是否表达功能性内源性TCR可以使用本领域已知的已知测定方法来确定。

一些实施方案涉及包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列的分离的细胞，并且使用上述ZFN在CART细胞中使内源TRAC基因失活以避免GVHD和排斥。例如，CART细胞具有降低的内源性TRAC基因的表达。在一些实施方案中，CAR T细胞缺少功能性内源性TCR的表达和/或在其表面上产生实质上受损的内源性TCR，使得内源性TCR在宿主中不会实质上引起不良免疫反应，例如GVHD反应。在一些情况下，CAR T细胞的后代也可能合理预期缺乏功能性内源性TCR的表达和/或在其表面上产生实质上受损的内源性TCR，使得内源性TCR在CAR T细胞的后代基本上不会引起不良的免疫反应在主机中，例如GVHD反应。

在一些实施方案中，TCR是或来源于与接受者匹配的具有HLA类型的健康人供体。通常，基于HLA基因的三个或更多个位点的变异性进行匹配，并且在这些位点处的完美匹配是优选的。在某些情况下，同种异体移植供体可能相关(通常是紧密HLA匹配的同胞)，同基因(患者的单卵巢“相同”双胞胎)或不相关(不相关的供体，发现具有非常接近程度的HLA匹配)。HLA基因分为两类(I型和II型)。一般来说，I型基因(即HLA-A，HLA-B或HLA-C)的错配增加了移植排斥的风险。HLA II型基因(即HLA-DR或HLA-DQB1)的不匹配增加了移植物抗宿主病的风险。在其它实施方案中，可以进一步灭活CAR T细胞的内源性HLA I基因以避免接受者拒绝供体的CAR T细胞。

在一些实施方案中，CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激信号传导区和CD3ζ信令结构域。在某些实施方案中，CAR的抗原结合结构域结合FZD10，TSHR，PRLR，Muc17，GUCY2C，CD207，CD19或CD20。在某些实施方案中，CAR的共刺激信号传导区包含选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原的共刺激分子的细胞内结构域-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合。CAR域的实例的序列可以在表4中找到。

在一些实施方案中，与初级人T细胞的GVHD反应相比，细胞在生物相容性人类受体中具有降低的移植物抗宿主病(GVHD)应答。

在一些实施方案中，分离的细胞或细胞系是包含编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸或其组合的T细胞。

在一些实施方案中，T细胞包含编码hTERT的核酸序列和编码SV40LT的核酸。

在一些实施方案中，hTERT的表达受诱导型表达系统调节。

在一些实施方案中，可诱导表达系统是rTTA-TRE，其增加或激活SV40LT基因或hTERT基因的表达，或其组合。

在一些实施方案中，T细胞包含编码自杀基因的核酸序列。

在一些实施方案中，自杀基因是HSV-TK系统。

通过参考以下实例进一步描述本公开。提供这些实例仅用于说明的目的，且并非旨在限制，除非另有说明。因此，本公开不应当以任何方式被解释为限于以下实例，而是应当被解释为包括由于本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

实施例1

TRAC特异性ZFN的设计

构建TRAC特异性ZFN以使得能够在TRAC基因上特异性引入突变位点(如图1所示)。ZFN由负责特异性识别序列的锌指DNA结合域和进行非特异性限制性内切酶切割的DNA切割域两部分组成。其中锌指结合域部分一般包含3-5个独立的锌指(Zinc finger,ZF)重复结构，每个锌指结构能够识别3个碱基。在ZFN中应用最广泛的DNA切割域来自限制性内切酶FokI。由于切割域与DNA链的结合能力较弱，因此DNA切割域必须以二聚体的形式发挥作用。构建锌指核酸酶时，应针对DNA各链上的邻近区域设计两条ZFN，即ZFN左臂和ZFN右臂，使其DNA切割域能够位于双链的同一位置，以达到最佳的切割效果。本发明的ZFN可以在TRAC外显子1处引入突变位点。

TRAC特异性ZFN及相应质粒载体的构建可参见文献(1：Urnov FD,Miller JC,LeeYL,et al.Highly efficient endogenous human gene correction using designedzinc-finger nucleases.Nature.2005,435(7042):646-651.；文献二：Lombardo,A.etal.2007.Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases andintegrase-defective lentiviral vector delivery.Nat Biotechnol.25(11):1298-306.；文献三：美国专利公开2008/0131962)所述。

含有不同的、特殊序列(ZNP)的锌指蛋白(锌指结合域不同)的ZFN，并构建了相应的质粒载体。本实施例中ZFN的锌指蛋白含有的锌指结合域(例如，ZFN-左和ZFN-右结合域)具体可参见表1及表2。

表1示例性ZFN对以及靶序列

表2序列和标识符

实施例2

ZFN体外活性测试

分别使用Fugene转染试剂将ZFN-左臂质粒载体和ZFN-右臂质粒载体转染到Hela细胞中。转染24小时后，用1μg/ml嘌呤霉素处理Hela细胞48小时，得到富含ZFN的细胞。然后收集Hela细胞，通过PCR扩增含有ZFN的裂解的DNA片段，使用TRAC基因特异性引物和Hela细胞基因组作为模板。使用正向引物对DNA片段进行测序。ZFN的切割结构域包含野生型的FokI切割结构域(如表2所示的FokI WC：SEQ ID NO.8)或工程化改造的FokI切割结构域(如表2所示的M FokI：SEQ ID NO.17或18)。

将DNA片段克隆到载体中。对约49个单克隆细胞的DNA片段进行测序以确定DNA片段是否包括突变。在TRAC位点处发现有双测序信号存在，表明本发明的ZFN能够准确突变TRAC基因。附图2-8为各个ZFN左右臂组合的多克隆测序结果，其中黑框标识的地方信号有重叠或双峰，表明存在双测序信号。具体的测序结果如表3所示，其中左臂为ZFLm1，右臂为ZFRm1-4的ZFN组合突变百分比高达49％，说明该组ZFN有极高的基因打靶效率和打靶准确性，切割效率最高。

表3针对TRAC基因片段并通过PCR扩增的ZFN的单克隆测序结果

CAR在HEK293T,K562以及在原代T细胞上的表达

图9中，由脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点序列生成编码分离的CD19 CAR的慢病毒载体(参见通过引用并入本文中的Chimeric Receptors Containing CD137 SignalTransduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and IncreasedAntileukemic Efficacy In Vivo Molecular Therapy，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月)。HEK293T和K562细胞用慢病毒载体转导。进行流式细胞获取并分析以确定CAR在这些细胞中的表达。

从美国典型培养物保藏中心(ATCC；弗吉尼亚州马纳萨斯)获得HEK293T和K562细胞。与细胞培养物、慢病毒载体的构建，以及流式细胞术有关的技术可以参见以下文献《T细胞的包含CD137信号转导结构域介导增强的存活率的嵌合受体和增加的抗白血病疗效的体内分子疗法》，第17卷，第8期，1453–1464，2009年8月。

由患者获得原代T细胞。所获得的原代T细胞用慢病毒载体转导。进行流式细胞获取并分析以确定CAR在原代T细胞中的表达。与细胞培养物、慢病毒载体的构建，以及流式细胞术有关的技术有关的技术可以参见以下文献《利用包含CD28和CD137结构域的经遗传重新靶向的人T细胞控制大的、所建立的肿瘤异种移植物(Control of large，establishedtumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28and CD137 domains)》，3360–3365PNAS，2009年3月3日，第106卷，第9期。

分离的细胞是包含编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸或其组合的T细胞。

图10中，图10a：K562-CD19 alone为肿瘤细胞(RK562-CD19)的阴性对照图；

图10b：Sv40lt alone+m19CAR(有)10：1指的是：感染了鼠源mCAR病毒的永生化的T细胞(这个永生化T细胞是只转入了sv40LT构建的永生化细胞)与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养的情况，与图10a相比较，可见有一定杀伤，所述比例10：1的意思是：10个Sv40lt alone+m19CAR T肿瘤细胞杀1个tumor cell(肿瘤细胞)；

图10c：Sv40lt alone+m19CAR(有)30：1指的是：感染了鼠源mCAR病毒的永生化的T细胞(这个永生化T细胞是只转入了sv40LT构建的永生化细胞)与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养的情况，与图10a相比较，可见有不错的杀伤效果，所述比例30：1的意思是：30个Sv40ltalone+m19CAR T肿瘤细胞杀1个tumor cell；

图10d：hTERT alone+m19CAR(有)10：1指的是：感染了鼠源mCAR病毒的永生化的T细胞(这个永生化T细胞是只转入了hTERT构建的永生化细胞)与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养的情况，与图10a相比较，可见有一定杀伤，所述比例10：1的意思是：10个hTERT alone+m19CAR T肿瘤细胞杀1个tumor cell；

图10e：hTERT alone+m19CAR(有)30：1指的是：感染了鼠源mCAR病毒的永生化的T细胞(这个永生化T细胞是只转入了hTERT构建的永生化细胞)与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养的情况，与图10a相比较，可见有不错的杀伤效果，所述比例30：1的意思是：30个hTERTalone+m19CAR T肿瘤细胞杀1个tumor cell；

图10f：Sv40lt+hTERT+m19CAR(有)10：1指的是：感染了鼠源mCAR病毒的永生化的T细胞(这个永生化T细胞是既转入了sv40LT同时也转入了hTERT构建的永生化细胞)与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养的情况，与图10a相比较，可见有一点杀伤效果，所述比例10：1的意思是：10个Sv40lt+hTERT+m19CAR T肿瘤细胞杀1个tumor cell；

图10g：Sv40lt+hTERT+m19CAR(有)30：1指的是：感染了鼠源mCAR病毒的永生化的T细胞(这个永生化T细胞是既转入了sv40LT同时也转入了hTERT构建的永生化细胞)与肿瘤细胞(RK562-CD19)共培养的情况，所述比例30：1的意思是：30个Sv40lt+hTERT+m19CAR T肿瘤细胞杀1个tumor cell；与图10a以及hTERT alone+m19CAR(有)30：1或Sv40lt alone+m19CAR(有)30：1相比可见具有更好的杀伤效果。

表4标识符及其序列

序列表

<110> 上海斯丹赛生物技术有限公司

<120> 一种分离的细胞或细胞系

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 1

Trp Arg Ser Ser Leu Ala Ser

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 2

Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 3

His Lys Trp Val Leu Arg Gln

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 4

Asp Arg Ser Asn Leu Thr Arg

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 5

Gln Trp Gly Thr Arg Tyr Arg

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 6

Glu Arg Gly Thr Leu Ala Arg

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 7

Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu

1 5

<210> 8

<211> 196

<212> PRT

<213> FokI WC(NATURE)

<400> 8

Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His

1 5 10 15

Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala

20 25 30

Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe

35 40 45

Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg

50 55 60

Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly

65 70 75 80

Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile

85 90 95

Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg

100 105 110

Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser

115 120 125

Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn

130 135 140

Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly

145 150 155 160

Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys

165 170 175

Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly

180 185 190

Glu Ile Asn Phe

195

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 9

Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg

1 5

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 10

Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly Thr

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 11

Asp Lys Ser Cys Leu Asn Arg

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 12

Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Ala

1 5

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 13

Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala

1 5 10 15

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 14

Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 15

Asp Cys Arg Asp Leu Ala Arg

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 16

Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly

1 5 10

<210> 17

<211> 196

<212> PRT

<213> M FokI（NATURE）

<400> 17

Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His

1 5 10 15

Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala

20 25 30

Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe

35 40 45

Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg

50 55 60

Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly

65 70 75 80

Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile

85 90 95

Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Lys Glu Asn Gln Thr Arg

100 105 110

Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser

115 120 125

Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn

130 135 140

Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Lys Thr Asn Cys Asn Gly

145 150 155 160

Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys

165 170 175

Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly

180 185 190

Glu Ile Asn Phe

195

<210> 18

<211> 196

<212> PRT

<213> M FokI（NATURE）

<400> 18

Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His

1 5 10 15

Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala

20 25 30

Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe

35 40 45

Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg

50 55 60

Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly

65 70 75 80

Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile

85 90 95

Gly Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg

100 105 110

Asn Lys His Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser

115 120 125

Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn

130 135 140

Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly

145 150 155 160

Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys

165 170 175

Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly

180 185 190

Glu Ile Asn Phe

195

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 19

Thr Ser Gly Ala Leu Thr Arg

1 5

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 20

Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala

1 5 10 15

Gly Cys Ala

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 21

Gly Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Ala Thr Gly Thr Gly Cys Ala

1 5 10 15

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 22

Cys Pro Ser Asn Leu Arg Arg

1 5

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 23

Asp Arg Ser Asp Leu Thr Arg

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> ZNP(人工序列)

<400> 24

Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg

1 5

<210> 25

<211> 21

<212> PRT

<213> SP（NATURE）

<400> 25

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 26

<211> 69

<212> PRT

<213> 铰链&跨膜结构域（人工序列）

<400> 26

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

50 55 60

Ser Leu Val Ile Thr

65

<210> 27

<211> 42

<212> PRT

<213> 共刺激域（NATURE）

<400> 27

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> CD3-zeta（NATURE）

<400> 28

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 29

<211> 242

<212> PRT

<213> CD19单链抗体(人工序列)

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 30

<211> 242

<212> PRT

<213> 人源CD19单链抗体(人工序列)

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 31

<211> 272

<212> PRT

<213> CD19 抗原(人工序列)

<400> 31

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys

260 265 270

<210> 32

<211> 7902

<212> DNA

<213> CAR CD19 核酸（人工序列）

<400> 32

gtcgacacta gtaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 60

aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 120

attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 180

tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 240

gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 300

ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 360

ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 420

ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 480

ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 540

cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 600

cctgccgcgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga 660

tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag 720

acaagatctg ctttttgctt gtactgagtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga 780

gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct 840

tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt 900

ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta ttcagtattt 960

ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg cagcttataa 1020

tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 1080

ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc tctagctatc 1140

ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 1200

catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta 1260

ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggga cgtacccaat tcgccctata 1320

gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1380

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 1440

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg 1500

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg 1560

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca 1620

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 1680

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 1740

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 1800

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 1860

aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 1920

acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt 1980

gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 2040

acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 2100

tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 2160

agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 2220

cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 2280

aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 2340

gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 2400

agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 2460

aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 2520

gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 2580

ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 2640

aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 2700

aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 2760

tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggctctcgcg gtatcattgc 2820

agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 2880

ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 2940

ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 3000

ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 3060

acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 3120

agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 3180

ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 3240

cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 3300

gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 3360

cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 3420

gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 3480

caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 3540

aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 3600

tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 3660

gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 3720

ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 3780

atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 3840

cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 3900

caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 3960

cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 4020

accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 4080

acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa ttaaccctca 4140

ctaaagggaa caaaagctgg agctgcaagc ttaatgtagt cttatgcaat actcttgtag 4200

tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt 4260

gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg 4320

ggtctgacat ggattggacg aaccactgaa ttgccgcatt gcagagatat tgtatttaag 4380

tgcctagctc gatacataaa cggctctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 4440

tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 4500

gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 4560

tcagtgtgga aaatctctag cagtggcgcc cgaacaggga cttgaaagcg aaagggaaac 4620

cagaggagct ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca agaggcgagg 4680

ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag gagagagatg 4740

ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga gaattagatc gcgatgggaa aaaattcggt 4800

taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca agcagggagc 4860

tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt agacaaatac 4920

tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca ttatataata 4980

cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc aaggaagctt 5040

tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaccac cgcacagcaa gcggccgctg 5100

atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat 5160

aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg 5220

cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca 5280

ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 5340

ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg 5400

caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac 5460

ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact 5520

gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg 5580

acctggatgg agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt 5640

gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg 5700

gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata 5760

atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat 5820

agagttaggc agggatattc accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga 5880

cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt 5940

cgattagtga acggatctcg acggtatcga tcacgagact agcctcgaca caaatggcag 6000

tattcatcca caattttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa 6060

tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa 6120

ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca gcagaaatcc actttggctc gagaagcttg 6180

atatcggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 6240

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 6300

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 6360

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggatc 6420

cgccaccatg gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc 6480

cgccaggccg gatatccaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggtga 6540

tcgcgtgacc attacctgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca 6600

gcagaaaccg ggtaaagcgc cgaaactgtt aatttatcat acatcaagat tacactcagg 6660

cgtgccgtcg cgttttagcg gctcgggttc gggcaccgat tttaccctga ccatctcgag 6720

cttgcagccg gaggacttcg ccacctacta ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac 6780

gttcggtcag ggcaccaaag tggagatcaa aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc 6840

gggtggcggc ggatctgagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg 6900

ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggagtgtcc ctgcctgatt atggcgtgtc 6960

ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggagtgggtt tcagtgatct ggggcagcga 7020

gacaacctac tacaacagcg ccctgaagtc ccgattcacc atctccagag acaatgccaa 7080

gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg 7140

tgcgaagcac tactactacg gcggcagcta cgctatggac tactggggcc aaggaaccct 7200

ggtcaccgtg tcctcaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat 7260

cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt 7320

gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac 7380

ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa 7440

actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga 7500

tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt 7560

cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct 7620

caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag aggcgtggcc gggaccctga 7680

gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa 7740

agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa 7800

ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct 7860

tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaatc tagaggcgcg cc 7902

<210> 33

<211> 270

<212> PRT

<213> CD19胞外结构域（人工序列）

<400> 33

Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val

1 5 10 15

Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr

20 25 30

Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly

35 40 45

Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe

50 55 60

Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro

65 70 75 80

Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val

85 90 95

Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro

115 120 125

Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg

130 135 140

Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser

145 150 155 160

Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr

165 170 175

Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro

180 185 190

Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu

210 215 220

Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr

245 250 255

Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly

260 265 270

<210> 34

<211> 3399

<212> DNA

<213> HTERT（NATURE）

<400> 34

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660

gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720

ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780

aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840

gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900

cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960

tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020

ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080

gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140

cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200

gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260

ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320

gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380

gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440

aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500

gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560

cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620

ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680

ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740

tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800

ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860

ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920

ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980

ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040

ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100

gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160

ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220

gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280

agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340

caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640

aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700

cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760

cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820

gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880

aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940

aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000

atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060

tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120

tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180

gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240

aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300

acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360

ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactga 3399

<210> 35

<211> 2127

<212> DNA

<213> SV40LT（NATURE）

<400> 35

atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 60

aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120

tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180

aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240

actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300

gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360

caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420

gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480

atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540

gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600

cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 660

ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720

ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 780

gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 840

aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900

atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 960

tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020

gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080

ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1140

tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200

atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260

tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1320

gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380

ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1440

gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1500

ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1560

tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1620

tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1680

gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1740

tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1800

gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860

atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920

gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 1980

acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040

catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100

acacctcccc ctgaacctga aacataa 2127

Claims

1.一种分离的细胞或细胞系，其特征在于：所述细胞包含编码CAR的分离的核酸序列，其中所述分离的细胞的TRAC基因被灭活或减少功能。

2.根据权利要求1所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：所述细胞是T细胞，所述的T细胞包含编码hTERT基因的核酸序列及编码SV40L基因的核酸序列中的任一种或两种。

3.根据权利要求1所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号结构域。

4.据权利要求3所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：所述CAR的抗原结合结构域与FZD10，TSHR，PRLR，Muc17，GUCY2C，CD207，CD19或CD20结合。

5.根据权利要求2所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：所述hTERT基因或SV40LT基因的表达均受诱导型表达系统的调节。

6.根据权利要求5的分离的细胞或细胞系，其特征在于：所述诱导型表达系统为rTTA-TRE，能够增加或激活hTERT基因和/或SV40LT基因的表达。

7.根据权利要求6所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：所述T细胞包含编码自杀基因的核酸序列，所述自杀基因是HSV-TK系统。

8.根据权利要求1-7任一所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：其中TRAC基因使用ZFN灭活；所述ZFN包括与TRAC基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，和切割结构域；

9.根据权利要求1-7任一所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：其中TRAC基因使用ZFN灭活；所述ZFN包括与TRAC基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，和切割结构域；

所述第一锌指蛋白包含三个或更多个的锌指结构域；所述第二锌指蛋白包含三个或更多个的锌指结构域；

其中：

第一个锌指蛋白为ZFL-5，第二个锌指蛋白为ZFR-4，或

第一个锌指蛋白为ZFL-4，第二个锌指蛋白为ZFR-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm1，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm1，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm1-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm1-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm1-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm1-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm2，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm2，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm2-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm2-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm2-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm2-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm3，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm3，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm3-5，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一个锌指蛋白为ZFLm3-4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm4，第二个锌指蛋白为ZFRm1，或

第一个锌指蛋白为ZFLm4，第二个锌指蛋白为ZFRm1-4，或

第一锌指蛋白为ZFLm4-4，第二锌指蛋白为ZFRm1-4。

10.根据权利要求1-7任一所述的分离的细胞或细胞系，其特征在于：其中TRAC基因使用ZFN灭活；所述ZFN包括与TRAC基因中的第一靶位点结合的第一锌指蛋白，与TRAC基因中的第二靶位点结合的第二锌指蛋白，和切割结构域；

其中：

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：10，或

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：12，或

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：10，或

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：10，或

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：20，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：12，或

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：13，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：21，或

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：21，或

所述第一靶位点包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，所述第二靶位点包含氨基酸序列SEQID NO：10。