CN104677866A - 测定CP装载siRNA体系中siRNA释放的方法 - Google Patents

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张德蒙
刘袖洞
于炜婷
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Abstract

本发明提供一种可测定阳离子聚合物载siRNA体系中siRNA释放曲线的方法。该监测siRNA释放方法需要分别对阳离子聚合物载体及所装载siRNA进行荧光标记，且标记使用的两种荧光物质构成荧光共振能量转移（FRET）荧光供体/受体对。FRET效率变化反映壳聚糖与siRNA复合状况的变化，即FRET效率降低曲线即为siRNA释放曲线。本发明优势在于只需对常规体系进行荧光标记，操作简便，检测灵敏度高，且可实现siRNA释放的原位、实时检测，即可用于细胞外环境模拟也可用于细胞、动物水平的实验操作。

Description

测定CP装载siRNA体系中siRNA释放的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种实时测定阳离子聚合物（CationicPolymeric，CP）装载siRNA体系中siRNA释放的方法。
背景技术
小干扰RNA(siRNA)由21～23个碱基对构成，可在细胞质中特异性与其碱基对互补的信使RNA(mRNA)结合并使其经核酸酶降解，从而阻断其编码蛋白质的表达，即通过RNA干扰(RNAi)实现基因沉默。因此，siRNA作为药物在癌症和流感、炎等病毒感染疾病治疗领域有重要科学意义和应用价值。然而，荷负点的亲水性siRNA难以跨越表面负电的疏水性细胞膜，易被核酸酶降解及快速从血液循环中清除。因此需要安全高效的载体释放系统保护并高效运送进入细胞发挥功能。
理想的siRNA载体应具有高效、稳定，并且无毒、靶向性好等特点。siRNA载体主要分为病毒型和非病毒型两种。病毒型siRNA载体虽然转染效率高，但同时具有免疫原性、潜在的致瘤性，且装载容量有限、成本高等缺陷而限制其应用。因此，非病毒型载体的应用受到重视。
阳离子聚合物作为非病毒siRNA载体的一类，其转导效率虽低于病毒载体，但因其具有无免疫原性、低毒、装载容量大、制备容易等优势而引起广泛关注。阳离子聚合物所携带正电荷，可与带负电荷siRNA通过静电相互作用，自聚集形成纳米结构复合体系，无需使用有机溶剂及超声处理，减少对核酸损伤。
阳离子聚合物装载siRNA进入细胞，即要在siRNA进入细胞前保持复合状态的稳定而避免siRNA提前释放而遭核酸酶降解；同时还要求载体到达细胞质后及时释放siRNA而发挥基因沉默功能。无论siRNA递送过程中释放过早或过晚，都会降低最终基因沉默效果。因此，明确siRNA释放过程对提高阳离子聚合物载siRNA体系的基因沉默效果有重要意义。实际操作中siRNA浓度极低，一般低于50nM，同时游离siRNA与处于复合态的siRNA亦极难分离，最终导致常规方法无法检测siRNA释放过程。
移荧光共振能量转移（FRET）是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。产生FRET的条件（附图1）主要有三个：（1）供体与受体间在合适的距离（1～10nm）；（2）供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）供体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。
FRET的效率用E表示，E值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（E=1-IDA/ID，IDA表示A存在时D的荧光强度）；用量子产率表征（E=1-φDA/φD）；用荧光寿命表征（E=1-τDA/τD）。这表示研究FRET可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。随着成像技术的发展，用显微成像的方法可更直观地观测FRET地发生。
由于FRET现象的效率对荧光探针间距离变化十分敏感，即两种荧光物质间距变化即导致FRET效率变化。阳离子聚合物载siRNA FRET体系中，siRNA释放过程伴随FRET探针的分离及FRET效率的降低。因此体系FRET效率降低曲线即为siRNA释放曲线。
Christopher A.Alabi等人将分别标记了AlexaFluor594（荧光供体）与AlexaFluor647（荧光受体）的siRNA共同装载入PEI纳米复合物中（ChristopherA.Alabi，Kevin T.Love，Gaurav Sahay，et al.FRET-Labeled siRNA ProbesforTracking Assembly and Disassembly of siRNANanocomplexes[J].ACS Nano,6(2012):6133-6141）。当siRNA处于复合态时，两种荧光分子间发生FRET现象，而随着siRNA释放，这种FRET效率逐渐减弱。文中比较了三种载体装载siRNA在细胞内的释放过程：b-PEI组几乎不见siRNA释放，C14-113组siRNA于2小时内快速释放；而ND98组可在6小时内几乎保持相同的释放速率。
Shan Jiang and Yong Zhang将BOBO-3标记的siRNA装载于上转换量子点上构成FRET体系（Shan Jiang and Yong Zhang，Upconversion Nanoparticle-BasedFRET System for Study of siRNAin Live Cells[J].Langmuir,26(9),2010:6689-6694），通过FRET效率变化曲线得出载体在SK-BR-3细胞中20小时内释放完全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系中siRNA释放的方法，该方法无需将释放的siRNA分离，直接检测样品荧光的变化而得出体系FRET效率进而得出siRNA释放曲线。
本发明阳离子聚合物装载siRNA体系中siRNA释放是利用FRET效率随探针间距离发生改变的特性，FRET效率定义为：
E = R 0 6 R 0 6 + R 6 - - - ( iii )
R0=const·κ2·n-4·φD·JDA   (iv)；
其中其中R0为Foster距离，表示某一给定供体与受体间能量转移效率为50％时的距离；R为供体与受体的实际距离。R0可由式（iv）计算：其中κ2是方向因素，n是溶剂的反射系数，φD是供体探针结合到阳离子聚合物的量子效率,JDA是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。由式（2）可看出R0对于给定的给－受体是一个特征值，因此，式（iii）中E值与R的关系紧密，这也成为了FRET用于测定siRNA释放过程的重要理论依据。体系FRET效率的降低意味着载体与siRNA的分离，即siRNA的释放。
由此，本发明人提出如下实时测定聚阳离子装载siRNA体系中siRNA释放状况的方法。
本发明提出的具体技术方案：
选用经FRET荧光供体/受体对分子Donor/Acceptor（D/A）分别标记CP与siRNA，即D-CP、A-siRNA或A-CP、D-siRNA；
当标记形式为D-CP、A-siRNA时，实施方案步骤如下：
(1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中，使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离子基团浓度为1-600μM；
(2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢加入步骤（1）所得溶液中，避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物；
(3)采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为D-CP，得到D-CP/siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，将siRNA更换为A-siRNA，得到CP/A-siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为D-CP同时将siRNA更换为A-siRNA，得到D-CP/A-siRNA复合物；
(4)取等体积CP/siRNA、D-CP/siRNA、CP/A-siRNA、D-CP/A-siRNA复合物分别加入到相同条件、体积为0.1-10mL溶液R，使得R中siRNA终浓度为1-1000nM；
(5)分别取含有CP/siRNA、D-CP/siRNA及D-CP/A-siRNA复合物体系R0.1-2mL，测定D激发波长下，D最大发射波长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A，并根据公式（i）计算FRET效率E；或分别取含有CP/siRNA、CP/A-siRNA及D-CP/A-siRNA复合物R0.1-2mL，分别测定D激发波长下，A最大发射波长处的荧光发射强度I0、IA、ID/A，并根据公式（ii）计算FRET效率E
E = ( I D - I 0 ) - ( I D / A - I 0 ) I D - I 0 × 100 % - - - ( i )
E = ( I D / A - I 0 ) - ( I A - I 0 ) I A - I 0 × 100 % - - - ( ii ) ;
(6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤（5），持续检测24-72小时，绘制时间-FRET效率曲线，该曲线即为siRNA释放过程曲线。
或者，当标记形式为A-CP、D-siRNA时，具体步骤如下：
(1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中，使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离子基团浓度为1-600μM；
(2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢加入步骤（1）所得溶液中，避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物；
(3)采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为A-CP，得到A-CP/siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将siRNA更换为D-siRNA，得到CP/D-siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为A-CP同时将siRNA更换为D-siRNA，得到A-CP/D-siRNA复合物；
(4)取等体积CP/siRNA、A-CP/siRNA、CP/D-siRNA、A-CP/D-siRNA复合物分别加入到体积为0.1-10mL溶液R中，使得R中siRNA终浓度为1-1000nM；
(5)分别取含有CP/siRNA、A-CP/siRNA及A-CP/D-siRNA复合物体系R0.1-2mL，测定D激发波长下，A最大发射波长处的荧光发射强度I0、IA、ID/A，并根据公式（ii）计算FRET效率E；或分别取含有CP/siRNA、CP/D-siRNA及A-CP/D-siRNA复合物R0.1-2mL，分别测定D激发波长下，D最大发射波长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A，并根据公式（i）计算FRET效率E；
(6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤（5），持续检测24-72小时，绘制时间-FRET效率曲线，该曲线即为siRNA释放过程曲线。
作为具体解决方案的优选方案，阳离子聚合物为下列物质或其衍生物的一种：壳聚糖（CS）、聚乙烯亚胺（PEI）、L-聚赖氨酸（PLL）、聚酰胺-胺（PAMAM）、聚丙烯亚胺（PPI）、碳硅烷（CB）、三嗪、聚甘油等带有氨基基团的树状聚合物。
作为具体解决方案的优选方案，阳离子聚合物上结合的荧光探针分子与聚合物阳离子基团摩尔比为1：500至1:10。
作为具体解决方案的优选方案，FRET荧光供体/受体对为以下荧光供体/受体对或其衍生物的一种：FITC/TMR；CFP/YFP；CFP/dsRED；BFP/GFP；GFP/dsRED；YFP/dsRED；Cy3/Cy5；Alexa488/Alexa555；Alexa488/Cy3；FITC/TRITC；YFP/TRITC；YFP/Cy3；FITC/Cy3。
作为具体解决方案的优选方案，siRNA上结合的荧光探针分子标记于siRNA5’端，荧光探针分子与siRNA的摩尔比为1：1至1：5。
作为具体解决方案的优选方案，所述溶剂S为水，0.01-5M pH4.5-pH6.5醋酸-醋酸钠缓冲液，0.01-5M pH5.0-pH8.0磷酸缓冲液及0.9%氯化钠溶液中的一种；所述释放体系R为水，0.01-5M pH4.5-pH6.5醋酸-醋酸钠缓冲液，0.01-5MpH5.0-pH8.0磷酸缓冲液，0.9%氯化钠溶液，RPMI-1640、DMEM、MEM、F12等细胞培养液中的一种。
作为具体解决方案的优选方案，当考察siRNA在细胞内释放过程时，权利要求2步骤（4）应将复合物分别加入接种密度102-105细胞/cm2，培养时间5-48小时细胞培养皿中，培养液中siRNA终浓度为1-1000nM，步骤（5）取出103-106细胞悬于0.1-2mL权利要求7中所述培养液中中用于检测；当考察siRNA在小鼠或大鼠体内释放过程时，权利要求2步骤（4）应将复合物分别经尾静脉注射入相同饲养条件体重15-25g的小鼠或150-250g大鼠体内，步骤（5）取出0.1-2mL小鼠或大鼠血液用于检测。
本发明效果如下：
(1)本发明可实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系siRNA释放过程，该方法灵敏度高，重复性好。
(2)本发明实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系siRNA释放过程，可用于细胞外环境模拟及细胞、动物水平实验操作。
(3)本发明实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系siRNA释放过程，原位进行，无需对纳米粒分离，且检测过程不对样品产生损伤。
附图说明
图1.荧光共振能量转移原理图；
图2.体系FRET效率与siRNA实际复合率关系；
图3.FRET效率随时间变化曲线。
具体实施方式
实施例1：测定壳聚糖/siRNA纳米复合物siRNA装载稳定性
(1)选用罗丹明B（RB）标记的壳聚糖（CS）RB-CS作为阳离子载体，装载羧基荧光素（FAM）标记的siRNA（FAM-siRNA）。壳聚糖分子量Mw为230KDa、脱乙酰度DD为80%，RB与壳聚糖上氨基摩尔比为1:300，FAM与siRNA摩尔比为1:1。以无荧光标记的CS、siRNA作为对照；
(2)称取0.002g RB-CS，溶于5mL0.2M醋酸中，并以10M NaOH调节pH至5.5，并取出0.95mL于1mL反应瓶中。随后，将体积为50μL、浓度为10μM FAM-siRNA缓慢加入到盛有RB-CS的反应瓶，避光搅拌反应20分钟，即得RB-CS/FAM-siRNA，其中siRNA浓度为500nM，N/P=120；
(3)同（2）反应条件，将FAM-siRNA替换为siRNA，反应得RB-CS/siRNA复合物；将FAM-siRNA替换为siRNA，同时将RB-CS替换为CS，得CS/siRNA复合物；
(4)将（3）所得样品分别以0.2M pH5.5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释10倍；
(5)490nm激发下，分别测定CS/siRNA、RB-CS/siRNA及RB-CS/FAM-siRNA所在缓冲液580nm荧光发射强度I0、IA、ID/A，并根据公式（ii）计算该时刻FRET效率为63%；
(6)30分钟内，每隔3分钟测定一次荧光强度并计算FRET效率，30min后，每隔2h测定一次荧光强度并计算FRET效率，48小时后终止实验，并将各时刻FRET效率绘制成时间-FRET效率曲线，如图3所示。结果显示CS装载siRNA体系FRET效率24小时内几乎保持恒定，48小时内略有降低，说明CS装载siRNA有良好的稳定性。
实施例2：测定壳聚糖/siRNA纳米复合物在溶菌酶作用下siRNA释放特性
(1)选用荧光素异硫氰酸酯（FTIC）标记的壳聚糖（CS）FITC-CS作为阳离子载体，装载四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）标记的siRNA（TRITC-siRNA）。壳聚糖分子量Mw为230KDa、脱乙酰度DD为80%，RB与壳聚糖上氨基摩尔比为1:300，FAM与siRNA摩尔比为1:2。无荧光标记的CS、siRNA作为对照；
(2)称取0.005g FITC-CS，溶于5mL0.5M醋酸中，并以10M NaOH调节pH至5.0，并取出0.98mL于1mL反应瓶中。随后，将体积为20μL、浓度为50μM TRITC-siRNA缓慢加入到盛有FITC-CS的反应瓶，避光搅拌反应10分钟，即得FITC-CS/TRITC-siRNA，其中siRNA浓度为1000nM，N/P=150；
(3)同（2）反应条件，将TRITC-siRNA替换为siRNA，反应得FITC-CS/siRNA复合物；将FITC-CS替换为CS，同时将TRITC-siRNA替换为siRNA，得CS/siRNA复合物；
(4)将（3）所得样品分别加入等体积含浓度为2mg/mL溶菌酶的0.5MPh5.0缓冲液中；
(5)490nm激发下，分别测定CS/siRNA、FITC-CS/siRNA及FITC-CS/TRITC-siRNA所在缓冲液520nm荧光发射强度I0、ID、ID/A，并根据公式（i）计算该时刻FRET效率为56%；
(6)30分钟内，每隔10分钟测定一次荧光强度并计算FRET效率，30min后，每隔4h测定一次荧光强度并计算FRET效率，48小时后终止实验，并将各时刻FRET效率绘制成时间-FRET效率曲线，如图3所示。结果显示CS装载siRNA体系加入溶菌酶后FRET效率30分钟内急剧下降至初始水平的75%，随后下降速度减慢，48小时约降至初始值的50%。
实施例3：测定PEI/siRNA纳米复合物在细胞内siRNA释放特性
(1)选用Cy3标记的聚乙烯亚胺Cy3-PEI作为载体，装载Cy5标记的siRNA（siRNA），PEI分子量Mw为25KDa，Cy3与PEI上氨基摩尔比为1:500，Cy5与siRNA摩尔比为1:1，无荧光标记的CS、siRNA作为对照；
(2)称取0.005g Cy3-PEI，溶于5mL pH7.40.2M磷酸盐缓冲液中，并取出8μL于1mL反应瓶中，并加入972μL pH7.40.2M磷酸盐缓冲液搅拌均匀。随后，将体积为20μL、浓度为20μM Cy5-siRNA缓慢加入到盛有Cy3-PEI的反应瓶中，避光搅拌反应10分钟，即得Cy3-PEI/Cy5-siRNA，其中siRNA浓度为400nM，N/P=10；
(3)同（2）反应条件，将Cy5-siRNA替换为siRNA，反应得Cy3-PEI/siRNA复合物；将Cy3-PEI替换为PEI，同时将Cy5-siRNA替换为siRNA，得PEI/siRNA复合物；
(4)小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10）提前24小时接种入24孔板中，每孔接种细胞数为2×104，培养液为含10%新生牛血清RPMI-1640培养液500μL。三块孔板分成三组，（2）、（3）所得三种复合物分别加入一组孔板中，每孔复合物体积为60μL。转染5小时后更换新鲜培养继续培养；
(5)各组孔板分别取三孔，细胞消化后以PBS清洗并重悬于0.1mL PBS中。测定550nm激发下，三组样品对应PEI/siRNA、Cy3-PEI/siRNA及Cy3-PEI/Cy5-siRNA复合物570nm处荧光发射强度I0、ID、ID/A，并根据公式（i）计算该时刻FRET效率；
(6)步骤（5）所得结果即为0小时，并分别在2h、4h、8h、12h、24h、48h重复（5）操作，并绘制每隔5h测定一次荧光强度并计算FRET效率，48小时后终止实验，并将各时刻FRET效率绘制成时间-FRET效率曲线，结果显示PEI装载siRNA在细胞中48小时内siRNA释放速率均十分缓慢。

Claims (10)

1.测定CP装载siRNA体系中siRNA释放的方法，其特征在于：体系中阳离子聚合物（Cationic Polymeric，CP）及其所装载siRNA皆选用带有荧光基团的原料，且载体阳离子聚合物与siRNA所标记两种荧光物质可构成荧光共振能量转移（FRET）效应的荧光供体/受体对，即可根据体系中FRET效率的变化获得siRNA释放信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：选用经FRET荧光供体/受体对分子Donor/Acceptor（D/A）分别标记CP与siRNA，即D-CP、A-siRNA或A-CP、D-siRNA；
当标记形式为D-CP、A-siRNA时，具体步骤如下：
(1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中，使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离子基团浓度为1-600μM；
(2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢加入步骤（1）所得溶液中，避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物；
(3)采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为D-CP，得到D-CP/siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，将siRNA更换为A-siRNA，得到CP/A-siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为D-CP同时将siRNA更换为A-siRNA，得到D-CP/A-siRNA复合物；
(4)取等体积CP/siRNA、D-CP/siRNA、CP/A-siRNA、D-CP/A-siRNA复合物分别加入到相同条件（相同组成的缓冲体系、pH、浓度条件）、体积为0.1-10mL溶液R，使得R中siRNA终浓度为1-1000nM；
(5)分别取含有CP/siRNA、D-CP/siRNA及D-CP/A-siRNA复合物体系R0.1-2mL，测定D（D即为FRET体系供体/受体对的供体荧光探针）激发波长下，D最大发射波长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A，并根据公式（i）计算FRET效率E；或分别取含有CP/siRNA、CP/A-siRNA及D-CP/A-siRNA复合物R0.1-2mL，分别测定D激发波长下，A最大发射波长处的荧光发射强度I0、IA、ID/A，并根据公式（ii）计算FRET效率E
E = ( I D - I 0 ) - ( I D / A - I 0 ) I D - I 0 × 100 % - - - ( i )
E = ( I D / A - I 0 ) - ( I A - I 0 ) I A - I 0 × 100 % - - - ( ii ) ;
(6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤（5），持续检测24-72小时，绘制时间-FRET效率曲线，该曲线即为siRNA释放过程曲线；
或者，当标记形式为A-CP、D-siRNA时，具体步骤如下：
(1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中，使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离子基团浓度为1-600μM；
(2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢加入步骤（1）所得溶液中，避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物；
(3)采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为A-CP，得到A-CP/siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将siRNA更换为D-siRNA，得到CP/D-siRNA复合物；采用与步骤（1）、步骤（2）所述相同的条件和过程，不同之处是将CP更换为A-CP同时将siRNA更换为D-siRNA，得到A-CP/D-siRNA复合物；
(4)取等体积CP/siRNA、A-CP/siRNA、CP/D-siRNA、A-CP/D-siRNA复合物分别加入到相同条件（相同组成的缓冲体系、pH、浓度条件）、体积为0.1-10mL溶液R中，使得R中siRNA终浓度为1-1000nM；
(5)分别取含有CP/siRNA、A-CP/siRNA及A-CP/D-siRNA复合物体系R0.1-2mL，测定D激发波长下，A最大发射波长处的荧光发射强度I0、IA、ID/A，并根据公式（ii）计算FRET效率E；或分别取含有CP/siRNA、CP/D-siRNA及A-CP/D-siRNA复合物R0.1-2mL，分别测定D激发波长下，D最大发射波长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A，并根据公式（i）计算FRET效率E；
(6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤（5），持续检测24-72小时，绘制时间-FRET效率曲线，该曲线即为siRNA释放过程曲线。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述阳离子聚合物为下列物质或其衍生物的一种：壳聚糖（CS），聚乙烯亚胺（PEI），L-聚赖氨酸（PLL）以及聚酰胺-胺（PAMAM）、聚丙烯亚胺（PPI）、碳硅烷（CB）、三嗪、聚甘油等带有氨基基团的树状聚合物。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：阳离子聚合物上结合的荧光探针分子与聚合物阳离子基团摩尔比为1：500至1:10。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述FRET荧光供体/受体对为以下荧光供体/受体对或其衍生物的一种：FITC/TMR；CFP/YFP；CFP/dsRED；BFP/GFP；GFP/dsRED；YFP/dsRED；Cy3/Cy5；Alexa488/Alexa555；Alexa488/Cy3；FITC/TRITC；YFP/TRITC；YFP/Cy3；FITC/Cy3。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述siRNA上结合的荧光探针分子标记于siRNA5’端，荧光探针分子与siRNA的摩尔比为1：1至1：5。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：溶剂S为水，0.01-5MpH4.5-pH6.5醋酸-醋酸钠缓冲液，0.01-5M pH5.0-pH8.0磷酸缓冲液及0.9%氯化钠溶液中的一种；所述释放体系R为水，0.01-5M pH4.5-pH6.5醋酸-醋酸钠缓冲液，0.01-5M pH5.0-pH8.0磷酸缓冲液，0.9%氯化钠溶液，RPMI-1640、DMEM、MEM、F12等细胞培养液中的一种。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
当考察siRNA在细胞内释放过程时，权利要求2步骤（4）应将复合物分别加入接种密度102-105细胞/cm2，培养时间5-48小时细胞培养皿中，培养液中siRNA终浓度为1-1000nM，步骤（5）取出103-106细胞悬于0.1-2mL权利要求7中所述培养液中中用于检测；
当考察siRNA在小鼠或大鼠体内释放过程时，权利要求2步骤（4）应将复合物分别经尾静脉注射入相同饲养条件体重15-25g的小鼠或150-250g大鼠体内，步骤（5）取出0.1-2mL小鼠或大鼠血液用于检测。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法用于细胞外环境模拟siRNA释放过程及细胞siRNA释放过程、或动物水平siRNA释放过程的监测。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CP装载siRNA体系是阳离子聚合物（CS、PEI、阳离子型树状聚合物等）与siRNA形成的纳米复合物；然后分别在阳离子聚合物与siRNA标记上荧光探针，构成FRET体系，根据FRET效率变化即可获得siRNA在细胞外、细胞内、或动物体内的释放情况。
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