KR20150014446A - 세포 형질감염 방법 - Google Patents

세포 형질감염 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150014446A
KR20150014446A KR1020147031173A KR20147031173A KR20150014446A KR 20150014446 A KR20150014446 A KR 20150014446A KR 1020147031173 A KR1020147031173 A KR 1020147031173A KR 20147031173 A KR20147031173 A KR 20147031173A KR 20150014446 A KR20150014446 A KR 20150014446A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
embryo
polynucleotide
algae
genetically modified
bird
Prior art date
Application number
KR1020147031173A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102076784B1 (ko
Inventor
스콧 제프리 타이악
Original Assignee
커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션
매트 몰타 어드밴스드 테크놀로지스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션, 매트 몰타 어드밴스드 테크놀로지스 리미티드 filed Critical 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션
Publication of KR20150014446A publication Critical patent/KR20150014446A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102076784B1 publication Critical patent/KR102076784B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/054—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function
    • A01K2217/058—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing loss of function due to expression of inhibitory nucleic acid, e.g. siRNA, antisense
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/30—Bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 세포의 형질감염 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조류의 원시생식세포의 형질감염 방법, 및 변형된 특성을 갖는 조류의 번식 방법에 관한 것이다.

Description

세포 형질감염 방법{CELL TRANSFECTION METHOD}
본 발명은 세포의 형질감염 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조류의 원시생식세포의 형질감염 방법, 및 변형된 형질 (trait)을 갖는 조류의 번식 방법에 관한 것이다.
트랜스제닉 또는 유전자 변형된 조류를 발육시키기에 효율적인 기법의 개발은 농업 및 생물약제 산업 모두에 크게 중요할 뿐만 아니라 기능 유전체학 연구를 통한 조류 생물학의 이해를 증가시키는데 매우 중요하다. 가금류 생산은 인구 증가에 직면하여 지구의 식량안보를 보장하는데 중요한 역할을 할 것이며, 트랜스제닉 가금류의 개발과 같은 생물공학의 현대적인 진보는 상기 산업이 증가된 생산 요구를 충족시키는데 도움이 될 것이다.
보다 구체적으로, 질병 내성 및 성별 결정의 조절과 같은 통상적인 번식을 통해서는 가능하지 않은 가금류의 형질 개질에 트랜스제닉 기술을 적용하는 것이 이제 가능할 것이며, 가금류 산업에 큰 이점을 제공할 것이다. 생물약학적 단백질에 대한 수요는 빠르게 성장하고 있으며 최근까지는 질병의 치료를 위한 신규의 재조합 단백질을 생산하기 위해 시험관내 세포-기재 제작 시스템들이 사용되었다. 현재 재조합 단백질 생산을 위한 생물반응기로서 트랜스제닉 가축류의 사용이, 값비싸고 노동 집약적인 세포-기재 시스템에 대한 주요 대안으로서 개발중에 있다. 닭에 대한 트랜스제닉 기술의 개발은 계란을, 생물약학적 단백질의 높은 수준의 생산 및 정제를 위한 생물반응기로서 개발할 수 있게 하였다.
선택된 외래 유전자를 레트로바이러스 벡터(예를 들어 세망내피 바이러스 또는 조류 백혈병 바이러스) 내로 클로닝하고, 상기 재조합 바이러스를 수정란에 주입하고, 상기 바이러스가 발생 배아 (embryo) (예를 들어 원시생식세포)를 감염시키게 하여 키메릭 생식소 또는 난자를 생성시키고, 외래 유전자를 자손에 도입시키고자 상기 생성된 재조합체를 사용함으로써, 상기 선택된 외래 유전자를 도입시키려는 시도가 또한 있었다. 그러나, 가금류 산업은 바이러스(천연 상태로)가 병원체이고, 심지어 변종 복제 가능 바이러스 벡터는 때때로 종양을 유발할 수 있으며, 복제 불능 변종은 높은 투여량 또는 반복된 투여량을 요하므로, 상기 기술을 상업적으로 사용하는 것에 대해 회의적이었다. 또한, 심지어 복제 결함 바이러스 구조물은 내생적인 바이러스 외막과 재조합하여 복제 가능하게 될 일부 위험성을 나타낼 수 있다. 더욱이, 상기 벡터는 현재 비교적 작은 크기(예를 들어 2 킬로염기 또는 그 이하)의 DNA 삽입물로 제한된다.
외래 DNA를, 암탉으로부터 외과적으로 제거한 후 발생되지 않은 수정란에 주입하고자 하는 시도가 또한 있었다. 그러나, 상기 접근법은 발생 배아를 일련의 대용 용기에서 배양시킬 것이 필요하였다. 더욱이, 상기 필요한 외과적 및 기술적 기술들을 획득하기 위해 전문적인 산란 무리와 광범위한 실행이 필요하였다.
대안의 접근법은 유전자 변형된 배아 세포 또는 원시생식세포(PGC)를 산란 직후의 수용 배아에 주입함을 수반한다. 상기 접근법에서 발생 배아에 통합시 기능성 난자 또는 정자 생산 세포로 분화하는 능력을 유지하는 PCG 배양물이 생성되었다. 상기 유형의 PGC 배양물을 유전자 변형시키고 이어서 수용 배아에 주입할 수 있다. 상기 수용 배아를 전형적으로, 상기 주입된 세포에 생식융기로 귀소하는 선택 이점을 제공하기 위해서 감마선 조사에 의해 상기 내생적인 원시생식세포가 쇠약해지도록 변형시킬 수도 있었다. 이어서 상기 변형된 세포는 성숙하고 상기 트랜스유전자를 적어도 다음 세대로 전할 수 있는 정자 또는 난자를 생산할 것이다. 그러나, 상기 기법은 제공자 배아로부터 PGC의 제거, 및 그의 후속 배양 및 수용 배아로의 재도입을 필요로 하므로, 시간 소모적이다. 더욱 또한, 유전자 변형된 PGC를 포함하는 조류를 상기 기법을 사용하여 수득할 수 있는 효율은 낮다.
따라서, 조류 원시생식세포의 유전자 변형 방법이 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 발명자들은 DNA와 혼합된 형질감염 시약을 발생중인 조류 배아의 혈액에 직접 주입하면 DNA가 원시생식세포(PGC)에 도입되고 상기 DNA가 상기 조류의 게놈에 삽입됨을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 조류 배아의 혈관에 주입하고, 이에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입되는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 (ii) 상기 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 형질감염 혼합물을 바람직하게는 대략 단계 12 내지 17의 PGC 이동 시기에 상기 조류 배아에 주입한다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 형질감염 혼합물을 단계 13 내지 14의 상기 조류 배아에 주입한다.
임의의 적합한 형질감염 시약을 본 발명의 방법에 사용할 수 있지만, 바람직하게는 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 형질감염 시약은 DOTMA (N-[1-(2.3-다이올레오일옥시)-프로필]-N,N,N-트라이메틸 암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트라이메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시 에틸 암모늄 브로마이드) 및 DDAB (다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드) 중 하나 이상으로부터 선택된 1가 양이온성 지질을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 형질감염 시약은 DOSPA (2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트) 및 DOSPER (1,3-다이올레오일옥시-2-(6카복시 스페르밀)-프로필-아미드, TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스페르민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스페르민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스페르민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스페르민) 및 TMDOS (테트라메틸다이올레일 스페르민) 중 하나 이상으로부터 선택된 다가 양이온성 지질을 포함한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 형질감염 시약은 DOSPA (2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트)를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 형질감염 시약은 중성 지질을 추가로 포함한다. 상기 중성 지질은 예를 들어 (DOPE) 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민, DPhPE (다이피타노일포스파티딜에탄올아민) 또는 콜레스테롤을 포함할 수 있다.
하나의 특정한 실시태양에서, 상기 형질감염 시약은 상기 형질감염 시약과 상기 폴리뉴클레오타이드와의 혼합 전에 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 혼합물을 포함한다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오타이드를 생식세포의 게놈에 도입시키는 비-레트로바이러스 방법의 용도에 적합하다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 트랜스포존 또는 징크 핑거 (Zinc finger) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
하나의 특정한 실시태양에서, 상기 형질감염 혼합물은 트랜스포사제 (transposase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 트랜스포사제는 예를 들어 플라스미드에서 DNA에 의해 암호화되거나, 또는 한편으로 상기 트랜스포사제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다.
하나의 특정한 실시태양에서, 상기 트랜스포존은 Tol2, 미니-Tol2, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 및 피기백(PiggyBac) 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 서열을 포함한다.
조류에서 유전자 변형된 생식세포는 배아 생식세포일 수 있으며, 바람직하게 상기 세포는 원시생식세포이다.
하나의 실시태양에서, 상기 주입 혼합물을 상기 배아가 발생한 난각 안의 상기 배아에 주입한다.
상기 형질감염 혼합물 중의 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자 또는 DNA 분자, 또는 이중가닥 영역을 포함하는 RNA를 암호화하는 DNA 분자일 수 있다. 하나의 특정한 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 이중가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 암호화한다. 상기 RNA 분자는 예를 들어 siRNA, shRNA 또는 RNA 디코이(decoy)일 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 암호화한다.
하나의 실시태양에서, 상기 RNA 분자 또는 폴리펩타이드는 상기 RNA 분자 또는 폴리펩타이드가 없는 세포에 비해, 세포에서 바이러스의 복제를 감소시킨다.
본 발명의 방법을 사용하여 조류의 임의의 바이러스 병원체를 표적화할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.
본 발명은 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류를 또한 제공하며, 여기에서 상기 조류는 본 발명의 방법에 의해 생산된다.
본 발명은 본 발명의 조류의 유전자 변형된 생식세포를 또한 제공하며, 여기에서 상기 생식세포는 상기 게놈내에 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 유전자 변형된 세포를 포함하는 조류에 의해 생산된 정자를 또한 제공한다.
본 발명은 본 발명의 유전자 변형된 세포를 포함하는 조류에 의해 생산된 난을 또한 제공한다.
본 발명은 조류의 생식세포의 유전자 변형 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 난 중에 함유된 조류 배아의 혈관에 주입하는 단계, 및
(ii) 상기 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계
를 포함하며, 여기에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입된다.
추가의 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 특징들 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명은 유전자 변형된 조류의 생산 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은
(i) 본 발명의 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류를 수득하는 단계,
(ii) 상기 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류를 번식시켜 자손을 생산하는 단계, 및
(iii) 상기 게놈에 삽입된 폴리튜클레오타이드를 포함하는 자손을 선택하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 식품의 생산 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은
(i) 본 발명의 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류 또는 본 발명의 유전자 변형된 조류를 수득하는 단계, 및
(ii) 상기 조류로부터 식품을 생산하는 단계
를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 조류로부터 고기 및/또는 난 (egg)을 수확하는 단계
를 포함한다.
본 발명은 또한 유전자 변형된 조류의 번식 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 본 발명의 방법을 수행하여 새끼 새 또는 자손을 생산시키는 단계,
(ii) 상기 새끼 새 또는 자손이 성적으로 성숙한 조류로 발육되게 하는 단계, 및
(iii) 상기 성적으로 성숙한 조류를 번식시켜 유전자 변형된 조류를 생산하는 단계
를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생산된 유전자 변형된 조류를 제공한다.
본 발명은 또한 조류의 형질을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 조류 배아의 혈관에 주입하고, 이에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입되는 단계, 및
(ii) 상기 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계
를 포함하고, 여기에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 조류의 형질을 조절하는 이중가닥 영역을 포함하는 RNA 분자 또는 폴리펩타이드를 암호화한다.
하나의 실시태양에서, 상기 RNA 분자는 siRNA, shRNA 또는 RNA 디코이를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 형질은 근육질량, 성별, 영양 함량 및/또는 질병 내성 중에서 선택된다.
본 발명은 또한 조류의 바이러스에 대한 내성의 증가 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 방법을 수행하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 세포에서 상기 바이러스의 복제를 감소시키는 siRNA, shRNA 또는 RNA 디코이이거나, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드는 세포에서 상기 바이러스의 복제를 감소시키는 항바이러스 펩타이드를 암호화한다.
하나의 특정한 실시태양에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 생산된 조류를 제공한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 조류는 닭, 오리, 칠면조, 거위, 밴텀닭 및 메추라기 중에서 선택된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시태양에서, 상기 형질감염 혼합물은, 상기 생식세포의 게놈내로의 상기 폴리뉴클레오타이드의 통합을 촉진하기 위해서 표적화 뉴클레아제, 또는 표적화 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 표적화 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN 및 CRISPR 중에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 조류 배아의 혈관에 주입하고, 이에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입되는 단계, 및
(ii) 상기 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계
를 포함하고, 여기에서 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 트랜스포존을 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 상기 형질감염 혼합물을 단계 13 내지 14에서 상기 조류 배아의 혈관에 주입한다.
하나의 실시태양에서, 상기 형질감염 시약은 상기 형질감염 시약과 상기 폴리뉴클레오타이드와의 혼합 전에 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 혼합물 또는 리포펙타민 2000을 포함하고, 상기 트랜스포존은 Tol2 또는 미니-Tol2이고, 상기 형질감염 혼합물은 Tol2 트랜스포사제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은
(i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 조류 배아의 혈관에 주입하고, 이에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입되는 단계, 및
(ii) 상기 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계
를 포함하고, 여기에서 상기 형질감염 시약은 양이온성 지질 및 중성 지질을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 상기 형질감염 혼합물을 단계 13 내지 14에서 상기 조류 배아의 혈관에 주입한다.
하나의 실시태양에서, 상기 형질감염 시약은 상기 형질감염 시약과 상기 폴리뉴클레오타이드와의 혼합 전에 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 혼합물 또는 리포펙타민 2000을 포함한다.
자명한 바와 같이, 본 발명의 하나의 태양의 바람직한 특성들 및 특징들을 본 발명의 다수의 다른 태양들에 적용할 수 있다.
본 명세서 전체를 통해서 "포함하다"란 단어, 또는 "포함하는"과 같은 어미변화는 서술된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 함유를 의미하는 것으로 이해될 것이나, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제를 의미하는 것은 아니다.
본 발명을 이후 본 발명에서 하기 비제한적인 실시태양에 의해, 및 첨부된 도면들을 참조하여 개시한다.
도 1. 조류 배아에, 리포펙타민 2000과 복합화된(complexed) EGFP를 암호화하는 DNA의 직접 주입. 제 7 일 배아로부터 제거된 생식소의 형광(좌측) 및 상응하는 명시야(우측) 상.
도 2. 제 14 일 조류 배아에, 리포펙타민 2000과 복합화된 EGFP를 암호화하는 DNA의 직접 주입 상. 제 14 일 배아로부터 제거된 생식소의 형광(우측) 및 상응하는 명시야(좌측) 상. 마지막 형광 상은 배아 중 녹색 세포의 왼쪽 무리로부터의 클로즈업 사진이다. 상기 영역은 새끼 새 바사 동족체(cvh) 염색을 위해 상기 생식소의 나머지로부터 절제되었다. 상기 생식소의 나머지의 작은 단편을 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 3. 조류 배아에, 리포펙타민 2000과 복합화된 EGFP를 암호화하는 DNA의 직접 주입. PGC 마커 cvh에 대한 세포의 염색. 핵 물질 및 모든 세포의 염색을 나타내는 DAPI 염색. PGC 특이성 마커인 cvh는 세포의 하위집단(보다 밝은 회색 세포)을 염색하였다. 직접 주입을 통해 트랜스포존을 수용한 형질전환된 세포 및 염색된 녹색을 화살표로 나타낸다.
도 4. 조류 배아에 직접 주입에 의한 시험관내 최적화의 확인. 제 14 일 배아의 생식소에서 EGFP 발현.
도 5. 육계의 배아에, EGFP를 암호화하는 DNA 및 리포펙타민 2000과 복합화된 shRNA를 암호화하는 다중 서열을 포함하는 다중-탄두 구조물의 직접 주입. 제 12 일 생식소로부터의 형광 상들.
도 6. 산란계의 배아에, EGFP를 암호화하는 DNA, 다중-탄두 구조물 및 리포펙타민 2000과 복합화된 연장된 헤어핀 구조물의 직접 주입. 직접 주입 후 제 14 일 배아의 생식소의 형광 상들.
도 7. 각각 2 개의 다중 shRNA 발현 카세트(pMAT084 및 pMAT085)를 갖는 Tol2-EGFP 구조물의 직접 주입. EGFP 발현을 나타내는, 14 일째에 취한 10 개 생식소의 상들.
도 8. 직접 주입된 배아내로의 PB shRNA의 통합을 나타내는 PCR 산물을 선별하는 젤 전기영동. DNA를, ZFN 및 수복 플라스미드(상기 PB shRNA 함유)의 직접 주입후 5일째에 대조용 배아로부터뿐만 아니라 ZFN 처리된 배아로부터의 PGC 풍부 샘플로부터 추출하였다. 이어서 선별 PCR을 수행하여 상기 게놈내로의 상기 PB shRNA의 통합을 검출하였다. 레인 1은 PB 주입된 배아를, 레인 2는 대조용 배아를, 레인 3은 ZFN 처리된 세포(양성 대조군)를, 레인 4는 수 대조군을 나타낸다.
서열 목록에 대한 풀이
서열번호 1 - Tol2 EGFP 구조물 폴리뉴클레오타이드 서열
서열번호 2 - Tol2 트랜스포사제 아미노산 서열
서열번호 3 - 스크린 7 올리고뉴클레오타이드 프라이머
서열번호 4 - 스크린 6 올리고뉴클레오타이드 프라이머
서열번호 5 - 미니Tol2 순방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머
서열번호 6 - 미니Tol2 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머
서열번호 7 - 미니Tol2 검출 탐침
서열번호 8 - 게놈 조절 영역 순방향 프라이머
서열번호 9 - 게놈 조절 영역 역방향 프라이머
서열번호 10 - 게놈 조절 영역 탐침
일반적인 기법 및 정의
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술과학 용어들은 당해 분야(예를 들어 단백질 화학, 생화학, 세포 배양, 분자 유전학, 미생물학 및 면역학)의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주될 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용되는 재조합 DNA 및 단백질, 세포 배양, 및 면역학 기법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 과정들이다. 상기와 같은 기법은 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], 문헌[J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001)], 문헌[R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer (1994)], 문헌[T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], 문헌[D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)], 및 문헌[F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트물들 포함), 문헌[Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)], 및 문헌[J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons](현재까지의 모든 업데이트물들 포함)과 같은 출처들의 문헌 전체를 통해 개시되고 설명된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "조류 (avian)"란 용어는 분류학상 조류 강의 유기체의 임의의 종, 아종 또는 류, 예를 들어 비제한적으로 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 피리새, 매, 까마귀, 및 타조, 에뮤 및 화식조를 포함한 주금류와 같은 유기체들을 지칭한다. 상기 용어는 갈루스 갈루스(Gallus gallus)(닭)의 다양한 공지된 계통들, 예를 들어 백색 레그혼, 갈색 레그혼, 줄무늬-락, 서섹스, 뉴햄프셔, 로드 아일랜드, 오스트랄로프, 코니쉬, 미노르카, 암록스, 캘리포니아 그레이, 이탈리안 파티지-색상의 계통들뿐만 아니라 상업적인 양으로 통상적으로 사육되는 칠면조, 꿩, 메추라기, 오리, 타조 및 다른 가금류의 계통들을 포함한다.
"가금류"란 용어는 고기 또는 난을 목적으로 기르거나, 수확하거나 길들이는 모든 조류, 예를 들어 닭, 칠면조, 타조, 사냥닭, 비둘기 새끼, 호로새, 꿩, 메추라기, 오리, 거위 및 에뮤를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 변형된 조류" 또는 "트랜스제닉 조류"는 상기 조류의 세포들 중 하나 이상이 인간 중재에 의해 도입되는 이종 핵산을 함유하는 임의의 조류를 지칭한다.
직접 주입 기법
닭의 생식계열은 X 단계 배아의 외배엽으로부터 발생기 내배엽으로의 진입으로 세포로서 시작된다(문헌[Kagami et al., 1997]; 및 문헌[Petitte, 2002]). 상기 내배엽이 먼저 진행하기 때문에, 전-원시생식세포는 상기 세포가 큰 글리코겐이 실린 세포로서 동정될 수 있는 생식반월로 순방향으로 일소된다. 이러한 형태학상 기준에 의한 상기 생식계열 세포의 가장 빠른 확인은 배양 시작 후 대략 8 시간째이다(햄버거와 해밀튼(Hamburger and Hamilton, (1951))에 의해 확립된 발생단계 분리 시스템을 사용하여 단계 4). 상기 원시생식세포는 상기 세포가 단계 12 내지 17 동안 맥관구조를 통해 이동할 때까지 단계 4에서부터 상기 생식반월 중에 존재한다. 이때, 상기 원시생식세포는 약 200 개 세포의 작은 집단이다. 상기 맥관구조로부터, 상기 원시생식세포는 생식융기로 이동하고 생식소가 분화함에 따라 난소 또는 고환에 통합된다.
생식계열 키메릭 닭은 앞서, 다양한 발생 단계(20일 배아까지 배반엽)로부터의 제공자 PGC 및 생식선 생식세포의 수용 배아에의 이식에 의해 생산되었다. 조류 원시생식세포(PGC)의 장기간 배양물로부터 트랜스제닉 닭을 수득하는 방법이 또한, 예를 들어 미국 특허 출원 제 20060206952 호에 개시되었다. 공지된 과정에 의해 숙주 조류 배아와 결합 시, 상기 변형된 PGC는 상기 생식계열을 통해 전달되어 유전자 변형된 자손을 생산한다.
제공자 배아로부터 PGC의 수확에 의존하는 통상적으로 사용되는 종래 기술 방법과 대조적으로, 본 발명의 방법은 조류 배아에의 형질감염 혼합물의 직접 주입을 수반한다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 PGC 및 배아 생식세포를 포함한 조류 생식세포를 형질감염시킬 수 있다.
형질감염 혼합물
본 발명의 방법에서, 폴리뉴클레오타이드는 적합한 형질감염 시약과 복합화되거나 혼합된다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "형질감염 시약"는, 비제한적으로 조류세포, 예를 들어 원시생식세포를 포함한 진핵생물 세포에의 상기 폴리뉴클레오타이드의 흡수를 증대시키기 위해 상기 폴리뉴클레오타이드에 첨가되는 조성물을 지칭한다. 진핵생물 세포의 형질감염에 적합한 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 형질감염 시약을 사용할 수도 있지만, 본 발명의 발명자들은 양이온성 지질을 포함하는 형질감염 시약이 본 발명의 방법에 특히 유용함을 발견하였다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 1가 양이온성 지질은 DOTMA (N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)-프로필]-N,N,N-트라이메틸 암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트라이메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시 에틸 암모늄 브로마이드) 및 DDAB (다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드) 중 하나 이상으로부터 선택된다. 바람직한 다가 양이온성 지질은 리포스페르민, 구체적으로 DOSPA (2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트) 및 DOSPER (1,3-다이올레오일옥시-2-(6카복시 스페르밀)-프로필-아미드, 및 다이- 및 테트라-알킬-테트라-메틸 스페르민, 예를 들어 비제한적으로 TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스페르민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스페르민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스페르민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스페르민) 및 TMDOS (테트라메틸다이올레일 스페르민)이다. 양이온성 지질은 비-양이온성 지질, 특히 중성 지질, 예를 들어 DOPE (다이올레오일 포스파티딜에탄올아민), DPhPE (다이피타노일포스파티딜에탄올아민) 또는 콜레스테롤과 같은 지질과 임의로 결합된다. DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 혼합물 또는 DOTMA 및 DOPE의 1:1(w/w) 혼합물로 구성된 양이온성 지질 조성물이 본 발명의 방법에 일반적으로 유용하다. 양이온성 지질을 포함하는 적합한 상업적으로 입수할 수 있는 형질감염 시약의 비제한적인 예는 리포펙타민(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 및 리포펙타민 2000(라이프 테크놀로지스)을 포함한다.
일반적으로, 임의의 세포, 특히 진핵생물 세포에 핵산을 도입시키는데 사용될 수 있는 임의의 덴드리머가 본 발명의 방법에 유용하다. 5 세대 이상(G5 이상)의 덴드리머가 바람직하며, G5 내지 G10 세대의 것들이 특히 중요하다. 본 발명에 유용할 수 있는 덴드리머는 NH3 또는 에틸렌다이아민 코어, GX(NH3) 또는 GX(EDA)(여기에서 X는 세대 수임)를 갖는 것들을 포함한다. X가 5 내지 10인 덴드리머가 바람직하다. 본 발명에 유용할 수 있는 덴드리머는 내부층의 반복 단위가 아미도아민인 것들(폴리아미도아민, 즉 PAMAM을 형성함)을 포함한다. 유용한 덴드리머는 상기 덴드리머 외부 표면의 말단 작용기들이 양의 전하 밀도를 제공하는 것들, 예를 들어 말단 아민 작용기를 갖는 것들을 포함한다. 상기 외부 덴드리머 표면의 표면 전하 및 화학적 성질을, 예를 들어 상기 표면 아민기의 일부 또는 전부의 반응에 의해 상기 표면상의 작용기를 변화시킴으로써 변화시킬 수 있다. 양이온성 아미노산, 예를 들어 리신 또는 아르기닌과의 반응에 의해 작용화되는 덴드리머가 특히 중요하다. 예를 들어 PCT 공보 WO 9622321 및 WO 9631549에 개시되고 미국 특허 제 5,266,106 호에 나타낸 바와 같은 그래프트화된 덴드리머를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 활성화된 덴드리머(문헌[Haensler and Szoka, 1993]; 및 문헌[Tang et al., 1996])를 또한 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
상기 형질감염 시약은 양이온성 지질 및 덴드리머를 포함하는 형질감염제에 의해 매개되는 진핵생물 세포의 형질감염 효율을 증대시킬 수 있는 펩타이드, 단백질 또는 그의 단편 또는 부분을 포함한, 바이러스, 세균 또는 동물 단백질 및 다른 공급원들로부터의 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 펩타이드는 US 20030069173에 개시되어 있으며, 예를 들어 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스, HIV, 간염, 헤르페스 단순 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 또는 유인원 바이러스 40의 바이러스성 펩타이드 또는 단백질, 및 보다 구체적으로 RGD-펩타이드 서열, NLS 펩타이드 서열 및/또는 VSVG-펩타이드 서열 및 상기 각각의 변형된 펩타이드 또는 단백질을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 제조사의 설명서 또는 공지된 프로토콜에 따라 상기 형질감염 시약과 혼합(또는 "복합화")시킬 수 있다. 예로서, 플라스미드 DNA를 리포펙타민 2000 형질감염 시약(인비트로젠(Invitrogen), 라이프 테크놀로지스)으로 형질감염시킬 때, DNA를 50 ㎕ Opit-MEM 배지로 희석하고 서서히 혼합할 수 있다. 상기 리포펙타민 2000 시약을 서서히 혼합하고 적합한 양을 50 ㎕ Opti-MEM 배지로 희석한다. 5 분 배양 후에, 상기 희석된 DNA 및 형질감염 시약을 합하고 실온에서 20 분 동안 서서히 혼합한다.
이어서 적합한 부피의 상기 형질감염 혼합물을 본 발명의 방법에 따라 조류 배아에 직접 주입할 수 있다. 전형적으로, 조류 배아에 주입하기에 적합한 부피는 약 1 ㎕ 내지 약 3 ㎕이지만, 상기 배아의 단계 및 주입되는 조류의 종과 같은 인자에 의해 적합한 부피를 결정할 수도 있다. 당해 분야의 숙련가는 상기 형질감염 시약 및 DNA를 혼합하기 위한 프로토콜뿐만 아니라 상기 조류 배아에 주입되는 부피를 본 명세서의 교시에 비추어 최적화할 수 있음을 알 것이다.
배아에의 주입
주입에 앞서, 난을 배아 발생에 적합한 온도, 예를 들어 대략 37.5 내지 38 ℃에서, 뾰족한 끝(taglion)을 위로하여 대략 2.5 일(단계 12 내지 17) 동안 또는 상기 배아의 혈관들이 주입을 허용하기에 충분한 크기를 갖는 바와 같은 시간까지 배양한다. 상기 형질감염 혼합물의 주입에 최적인 시간은 전형적으로 대략 12 내지 17 단계, 보다 바람직하게는 13 내지 14 단계에서 발생하는 PGC 이동의 시간이다. 당해 분야의 숙련가가 이해하는 바와 같이, 육계는 전형적으로 보다 빨리 성장하는 배아를 가지며, 따라서 주입을 바람직하게는, 상기 형질감염 혼합물이 PGC 이동시에 혈류에 도입되도록 13 내지 14 단계에서 일찍 수행해야 한다.
상기 조류 배아의 혈관에 접근하기 위해서, 난각에 구멍을 만든다. 예를 들어, 대략 10 ㎜ 구멍을 적합한 도구, 예를 들어 핀셋을 사용하여 상기 난의 뾰족한 끝에 만들 수 있다. 상기 배아 및 그의 막에 대한 손상을 피하면서 껍질 및 결합된 막 부분을 조심스럽게 제거한다.
실리콘처리된 유리 모세관 튜빙으로 제조된 마이크로피펫을 사용하여 상기 형질감염 혼합물을 상기 조류 배아의 혈관에 주입할 수 있다. 전형적으로, 마이크로피펫을 마이크로피펫 풀러로 끌어당기거나 또는 "잡아당기고" 팁을 피펫 그라인더의 도움으로 대략 10 ㎛ 내지 약 50 ㎛ 직경, 보다 바람직하게는 대략 25 ㎛ 내지 대략 30 ㎛ 직경의 직경(내부 개구)으로 비스듬하게 만든다. 마이크로피펫을 전형적으로는 대략 25 ㎛ 내지 대략 30 ㎛의 직경으로 갈아 조류 배아에 PGC의 주입을 촉진한다. 숙련가는 상기 형질감염 혼합물이 세포를 포함하지 않기 때문에 본 발명의 방법에 보다 좁은 직경을 사용할 수도 있음을 알 것이다. 상기 방식으로 생성된 마이크로피펫을 또한 "잡아 당겨진 유리 모세관"이라 칭한다.
잡아 당겨진 유리 모세관에 대략 1 내지 3 ㎕의 형질감염 복합체를 로딩한다. 상기 모세관을 수용하기에 충분한 크기의 임의의 혈관, 예를 들어 전면맥 또는 등대동맥, 또는 상기 모세관을 취하기에 충분한 크기의 임의의 또 다른 혈관에 주입을 수행한다. 공기압을 사용하여 상기 형질감염 복합체를 상기 모세관으로부터 상기 혈관으로 분출시킬 수도 있다.
상기 조류 배아의 혈관내로 상기 형질감염 혼합물을 주입한 다음에, 상기 난을 충분량의 파라필름, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다른 적합한 밀봉 필름을 사용하여 밀봉시킨다. 예를 들어, 상기 껍질에 10 ㎜ 구멍이 만들어진 경우, 대략 20 ㎜ 정사각형 조각의 파라필름을 사용하여 상기 구멍을 덮을 수 있다. 이어서 따뜻한 외과용 메스날을 사용하여 상기 파라필름을 상기 외부 난 표면에 붙일 수 있다. 이어서 난을 뾰족한 끝을 아래 위치로 뒤집고, 예를 들어 나중의 분석 또는 부화시까지 상기 배아가 발생하기에 충분한 온도에서 배양한다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "상기 배아가 발생하기에 충분한 온도" 및 "상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도"는 조류 배아가 난 중에서 계속해서 발생하고 바람직하게는 부화준비가 된 새끼 새로 발육하기 위해 필요한 배양 온도를 지칭한다. 적합한 배양 온도는 당해 분야의 숙련가들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 계란을 전형적으로는 약 35.8 내지 약 38 ℃에서 배양한다. 배양 온도를 바람직한 수준으로, 예를 들어 산란 후 1 내지 6일째에 37.9 ℃, 9 및 10일째에 약 37.6 ℃, 11 및 12일째에 약 37.5 ℃, 13일째에 약 37.4 ℃, 14 및 15일째에 약 37.3 ℃, 16일째에 약 37.2 ℃, 17일째에 약 37.1 ℃, 및 22일까지 약 35.8 ℃로 떨어질 수도 있는 온도로 조절하는 배양기를 상업적으로 입수할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 게놈 통합
상기 조류 생식세포의 게놈내로 상기 폴리뉴클레오타이드의 통합을 촉진하기 위해서, 바람직하게는 트랜스포존, 징크 핑거 뉴클레아제, 또는 다른 비-바이러스성 구조물 또는 벡터를 본 발명의 방법에 사용한다.
적합한 트랜스포존의 예는 Tol2(문헌[Kawakami et al., 2002]), 미니-Tol2, 슬리핑 뷰티(문헌[Ivics et al., 1997]), 피기백(문헌[Ding et al., 2005]), 마리너(Mariner) 및 갈루홉(Galluhop)을 포함한다. 송사리 오리지아스 라티페스(Oryzias latipes)로부터 최초로 단리되었고 트랜스포존의 hAT 과에 속하는 Tol2 트랜스포존이 문헌[Kawakami et al. (2000)]에 개시되어 있다. 미니-Tol2는 Tol2의 변종이며 문헌[Balciunas et al., (2006)]에 개시되어 있다. 미니-Tol2 및 미니-Tol2 트랜스포존은 상기 Tol2 트랜스포사제와 함께 작용할 때 유기체의 게놈내로의 트랜스유전자의 통합을 촉진한다. 상기 Tol2 트랜스포사제를 별도의 비-복제성 플라스미드상에 전달함으로써, 오직 상기 Tol2 또는 미니-Tol2 트랜스포존 및 트랜스유전자만을 상기 게놈에 통합시키며 상기 Tol2 트랜스포사제를 함유하는 플라스미드는 제한된 수의 세포분열 내에서 상실된다. 따라서, 통합된 Tol2 또는 미니-Tol2 트랜스포존은 더 이상 후속의 전위 사건을 수행할 능력을 갖지 않을 것이다. 또한, Tol2는 천연 조류 트랜스포존이 아닌 것으로 공지되어 있기 때문에, 조류 세포, 예를 들어 닭 세포에서 추가의 전위 사건을 유발하는 내생적인 트랜스포사제 활성은 존재하지 않는다. 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 상기 Tol2 트랜스포사제를 암호화하는 RNA를, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 DNA 플라스미드에 대한 대안으로서 상기 형질감염 혼합물에 포함시킬 수 있다. 따라서, 상기 Tol2 트랜스포존 및 트랜스포사제가 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 적합하다.
임의의 다른 적합한 트랜스포존 시스템을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 트랜스포존 시스템은 슬리핑 뷰티, 프로그 프린스 또는 Mos1 트랜스포존 시스템이거나, 또는 트랜스포존의 tc1/마리너 또는 hAT 과에 속하는 임의의 트랜스포존을 사용할 수 있다.
숙련가는 조류 배아에 주입시킬 구조물 중에 추가적인 유전 요소를 포함시키는 것이 바람직할 수도 있음을 알 것이다. 상기 핵산 구조물 중에 포함시킬 수 있는 추가적인 유전 요소의 예는 리포터 유전자, 예를 들어 GFP 또는 RFP와 같은 형광 마커 단백질에 대한 하나 이상의 유전자; 쉽게 분석되는 효소, 예를 들어 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 베타-글루쿠로니다제, 클로람페니칼 아세틸 트랜스퍼라제 또는 분비된 배아의 알칼리성 포스파타제; 또는 면역분석이 쉽게 이용할 수 있는 단백질, 예를 들어 호르몬 또는 사이토킨을 포함한다. 본 발명의 실시태양에 사용될 수 있는 다른 유전 요소는 세포상에 선택적인 성장 이점을 부여하는 단백질, 예를 들어 아데노신 데아미나제, 아미노글리코딕 포스포트랜스퍼라제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 또는 약물 내성을 암호화하는 것들을 포함한다.
게놈 편집 기술을 또한 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예로서, 상기 게놈 편집 기술은 표적화 뉴클레아제일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "표적화 뉴클레아제"란 용어는 천연 단백질 또는 조작된 단백질에 대한 언급을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제는 긴 인식 서열을 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제이다, 즉 상기 인식 서열은 일반적으로 약 12 염기상 내지 약 40 염기쌍 범위이다. 상기 요건의 결과로서, 상기 인식 서열은 일반적으로 임의의 주어진 게놈에서 단지 한번만 존재한다. 메가뉴클레아제들 중에서, LAGLIDADG라 명명되는 귀소 엔도뉴클레아제의 과는 게놈 및 게놈 공학의 연구에 귀중한 도구가 되었다. 메가뉴클레아제를 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 기법을 사용하여 그의 인식 서열을 변형시킴으로써 특이적인 염색체 서열에 표적화할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 "표적화 뉴클레아제"는 징크 핑거 뉴클레아제이다. 아연-집게 뉴클레아제(ZFN)는 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 뉴클레아제이다. 징크 핑거 도메인을, 목적하는 DNA 서열을 표적화하도록 조작할 수 있으며 이는 아연-집게 뉴클레아제가 복합체 게놈 내의 독특한 서열을 표적화할 수 있게 한다. 내생적인 DNA 수복 기구를 이용함으로써, 상기 시약들을 사용하여 보다 고등 유기체의 게놈을 정확하게 변경시킬 수 있다. 징크 핑거 뉴클레아제는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 7,241,574 호에 개시되어 있고 문헌[Durai et al. (2005)] 및 문헌[Davis and Stokoe (2010)]에 논의되어 있다.
본 발명에 앞서, 징크 핑거 뉴클레아제 기술을 사용하여 PGC를 변형시키기 위해서, 징크 핑거 구조물을 배양된 PGC에 도입시킬 것이 예상되었다. 이어서 목적하는 삽입/변형을 포함하는 형질감염된 세포를 선택하고 클로닝할 것이다. 상기 분류되고 클로닝된 세포를 PGC 고갈된 수용 배아에 주입할 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 징크 핑거 뉴클레아제 구조물의 조류 배아에의 직접 주입으로 특이적인 게놈 변형이 생성되고, 이는 14일째에 상기 형질감염된 배아의 생식소에서 검출될 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견은 상기 형질감염의 효율과 징크 핑거 뉴클레아제 활성의 결합된 수준이 직접 주입된 배아에서 특이적인 변형을 검출하기에는 너무 낮을 것으로 예상되었기 때문에 놀라운 것이었다. 목적하는 DNA 서열의 표적화에 대한 특이성과, 배아에 직접 주입된 징크 핑거 뉴클레아제 및 형질감염 시약의 조합이 예상된 수준보다 더 높은 효율을 성취한다는 본 발명자들의 발견에 비추어, 징크 핑거 뉴클레아제가 본 발명의 방법에서 조류 생식세포의 게놈내로 폴리뉴클레오타이드를 도입시키기에 특히 유용하다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 표적화 엔도뉴클레아제는 전사 활성제-유사 효과기(TALE) 뉴클레아제일 수 있다(예를 들어, 문헌[Zhang et al., 2011] 참조). TALE은 새로운 DNA 표적과 결합하도록 쉽게 조작될 수 있는 식물 병원체 잔토모나스로부터의 전사 인자이다. TALE 또는 그의 절두된 버전을 Fok1과 같은 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인에 결합시켜 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN이라 칭하는 표적화 엔도뉴클레아제를 생성시킬 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, "표적화 뉴클레아제"는 떼를 지어 규칙적으로 산재된 짧은 회귀성 반복부(CRISPR) 뉴클레아제이다(문헌[Barrangou, 2012]). CRISPR은 침입 파지 및 플라스미드에 대한 방어에 관련된 미생물 뉴클레아제 시스템이다. 미생물 숙주 중 CRISPR 자리는 CRISPR-연관(Cas) 유전자뿐만 아니라 상기 CRISPR-매개된 핵산 절단의 특이성을 프로그램화할 수 있는 비-암호화 RNA 요소의 조합을 함유한다. 3 가지 유형(I-III)의 CRISPR 시스템이 광범위한 세균 숙주에 걸쳐 동정되었다. 각 CRISPR 자리의 한 가지 핵심적인 특징은 비-반복 서열의 짧은 신장부(간격서열)에 의해 이격된 반복서열들의 배열(직접 반복부)의 존재이다. 상기 비-암호화 CRISPR 배열은, Cas 뉴클레아제를 표적 부위(프로토간격서열)로 향하게 하는 개별적인 간격서열을 함유하는 짧은 crRNA로, 직접 반복부내에서 전사되고 절단된다.
II 유형 CRISPR은 가장 잘 특성화된 시스템들(예를 들어 문헌[Cong et al., 2013] 참조) 중 하나이며 4 개의 연속적인 단계로, 표적화된 DNA 이중가닥 중단을 수행한다. 먼저, 2 개의 비-암호화 RNA인 전-crRNA 배열 및 tracrRNA가 상기 CRISPR 자리로부터 전사된다. 둘째로, tracrRNA가 상기 전-crRNA의 반복 영역에 하이브리드화하고 전-crRNA의, 개별적인 간격서열을 함유하는 성숙한 crRNA로의 진행을 매개한다. 셋째로, 상기 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는 Cas9를, 상기 crRNA상의 간격서열과 상기 프로토간격서열 인접 동기(PAM) 옆의 표적 DNA 상의 프로토간격서열간의 왓슨-크리크 염기-쌍을 통해 표적 DNA로 향하게 한다(표적 인식에 추가적인 요건임). 최종적으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 상기 프로토간격서열 내 이중 가닥 중단을 생성시킨다. 상기 CRISPR 시스템을 또한 상기 게놈 내 단일 가닥 중단의 생성에 사용할 수 있다. 따라서, 상기 CRISPR 시스템을 RNA-유도된 부위 특이적 게놈 편집에 사용할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드
본 발명의 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를, 유전자 변형된 자손으로 전달될 수 있는 조류 원시생식세포의 게놈에 통합시킬 수 있다. 상기 게놈에 통합된 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 변형된 세포상에 바람직한 기능 또는 활성, 예를 들어 생산 형질을 변형시키거나 또는 질병 내성을 증가시킴을 제공할 수 있다. 따라서, 생식세포의 게놈에 통합시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 연장된 짧은 헤어핀 RNA(ehRNA), 촉매 RNA, 예를 들어 리보자임, RNA 디코이를 암호화하는 것들뿐만 아니라, 조류에서 생산 형질을 조절하거나 질병에 대한 내성을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 것들과 같은 내생 또는 외부 폴리펩타이드를 암호화하는 것들을 포함한다.
따라서, 일부 실시태양에서, 본 발명의 방법을 사용하여 조류 종의 임의의 형질을 변형시킬 수 있다. 변형시킬 수 있는 바람직한 형질은 생산 형질 및 질병 내성을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "생산 형질"는 근육 질량, 성별, 질병 내성 또는 영양 함량과 같이 상업적인 가치를 갖는 조류의 임의의 표현형을 지칭한다. 본 발명의 방법에 따라 변형시킬 수 있는 바람직한 형질은 성별, 근육 질량 및 질병 내성을 포함한다. 조류의 생산 형질로서 성별을 변형시키기 위해 표적화될 수 있는 유전자의 예는 DMRT1, WPKCI(ASW), R-스폰딘, FOX9, 아로마타제, AMH 및 β-카테닌을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "근육 질량"는 근육 조직의 중량을 지칭한다. 근육 질량의 증가는, 본 발명에 정의된 바와 같은 핵산이 투여되지 않은 동일한 종의 조류, 보다 바람직하게는 동일한 계통 또는 품종의 조류로부터의 새 및 훨씬 더 바람직하게는 동일한 새에 대해, 본 발명에 개시된 바와 같이 처리된 난으로부터 부화하는 새의 전체 근육 질량을 칭량함으로써 측정될 수 있다. 한편으로, 특정 근육, 예를 들어 가슴 및/또는 다리 근육을 사용하여 근육 질량의 증가를 확인할 수 있다. 근육 질량의 조절을 위해 표적화될 수 있는 유전자는 예를 들어 마이오스타틴 유전자를 포함한다.
RNA 간섭
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법은 조류에서 형질들의 조절을 위해 RNA 간섭에 대한 이중 가닥 영역을 암호화하는 핵산 분자를 사용한다. "RNA 간섭", "RNAi" 또는 "유전자 침묵"과 같은 용어는 일반적으로 이중가닥 RNA 분자가, 상기 이중가닥 RNA 분자와 상당한 또는 전체 상동성을 공유하는 핵산 서열의 발현을 감소시키는 과정을 지칭한다. 그러나, RNA 간섭은 비-RNA 이중가닥 분자를 사용하여 성취될 수 있는 것으로 나타났다(예를 들어 US 20070004667 참조).
상기 이중가닥 영역은 19 이상의 연속적인 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 19 내지 23 뉴클레오타이드이어야 하거나, 또는 더 길 수 있다, 예를 들어 30 또는 50 뉴클레오타이드, 또는 100 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 전체 유전자 전사물에 상응하는 전장(full-length) 서열을 사용할 수도 있다. 바람직하게, 상기 서열은 길이가 약 19 내지 약 23 뉴클레오타이드이다.
표적화된 전사물에 대한 핵산 분자의 이중가닥 영역의 일치 정도는 90% 이상 및 보다 바람직하게는 95 내지 100%이어야 한다. 상기 핵산 분자는 물론 상기 분자를 안정화시키는 작용을 할 수 있는 관련되지 않은 서열들을 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"라는 용어는, 예를 들어 서열-특이적인 방식으로 RNAi를 매개함으로써 유전자 발현을 억제하거나 하향 조절할 수 있는 리보뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 지칭하며, 여기에서 상기 이중가닥 부분은 길이가 50 뉴클레오타이드 미만, 바람직하게는 약 19 내지 약 23 뉴클레오타이드이다. 예를 들어 상기 siRNA는 자기-상보성 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 핵산 분자일 수 있으며, 여기에서 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부 중의 뉴클레오타이드 서열에 상보성인 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 센스 영역은 상기 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 상기 siRNA는 2 개의 별도의 올리고뉴클레오터이드로부터 조립될 수 있으며, 이때 하나의 가닥은 센스 가닥이고 다른 가닥은 안티센스 가닥이며, 여기에서 상기 안티센스 및 센스 가닥은 자기-상보성이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, siRNA란 용어는 서열 특이성 RNAi, 예를 들어 미세-RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오타이드, 짧은 간섭 핵산(siRNA), 짧은 간섭 변형된 올리고뉴클레오타이드, 화학적으로 변형된 siRNA, 전사후 유전자 침묵화 RNA(ptgsRNA) 등을 매개할 수 있는 핵산 분자를 개시하는데 사용되는 다른 용어들과 동등한 것으로 여겨진다. 또한, 본 발명에 사용된 바와 같이, RNAi란 용어는 서열 특이성 RNA 간섭, 예를 들어 전사후 유전자 침묵화, 번역 억제, 또는 후성유전학을 개시하기 위해 사용되는 다른 용어들과 동등한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 바와 같은 siRNA 분자는 유전자를 전사후 수준 또는 전사전 수준 모두에서 후성유전학적으로 침묵화시키기 위해 사용될 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 siRNA 분자에 의한 유전자 발현의 후성유전학적 조절은 유전자 발현을 변경시키기 위한 크로마틴 구조의 siRNA 매개된 변형으로부터 생성될 수 있다.
"shRNA" 또는 "짧은-헤어핀 RNA"는, 약 50 뉴클레오타이드 미만, 바람직하게는 약 19 내지 약 23 뉴클레오타이드가, 동일한 RNA 분자상에 위치한 상보성 서열과 염기쌍을 이루고, 상기 서열 및 상보성 서열이, 염기 상보성인 2 개의 영역에 의해 생성된 줄기 구조 위에서 단일가닥 고리를 형성하는 적어도 약 4 내지 약 15 뉴클레오타이드의 비결합 영역에 의해 분리되는 RNA 분자를 의미한다.
shRNA에는 이중 또는 겹-집게 및 다중-집게 헤어핀 dsRAN이 포함되며, 여기에서 상기 RNA 분자는 단일 가닥 간격서열 영역에 의해 분리되는 상기와 같은 줄기-고리 구조들 중 2 개 이상을 포함한다.
미세RNA 조절은 통상적인 RNAi/PTGS로부터 벗어난, 유전자 조절을 향해 진화된 RNA 침묵화 경로의 전문화된 부분이다. 미세RNA는 특징적인 역전된 반복부로 조직화된 유전자-형 요소들 중에 암호화되는 작은 RNA의 특정한 부류이다. 미세RNA 유전자는 전사될 때 줄기-고리화된 전구체 RNA를 생성시키며, 이로부터 후속으로 상기 미세RNA가 가공처리된다. 미세RNA는 전형적으로 길이가 약 21 뉴클레오타이드이다. 방출되는 miRNA는, 서열-특이성 유전자 억제를 발휘하는 아고너트 단백질의 특정한 부분집합을 함유하는 RISC-형 복합체에 통합된다.
질병 내성
본 발명의 방법을 사용하여 조류 배아에서 원시생식세포의 게놈내로, 세포상에 질병 내성을 부여하는 폴리뉴클레오타이드를 통합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드가 존재하는 세포에서 숙주 또는 병원체 유전자의 발현을 감소시켜 바이러스 복제의 감소를 생성시키는 핵산 분자, 예를 들어 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 암호화할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "바이러스 복제"는 숙주세포에서 바이러스 게놈의 증폭, 세포에서 상기 바이러스 게놈의 패키징, 및/또는 세포로부터 감염성 바이러스 입자의 방출을 지칭한다.
한편으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA 디코이를 암호화할 수 있다. RNA 디코이는 당해 분야에 공지되어 있으며 병원성 바이러스의 복제에 필수적인 바이러스 단백질과 결합하는 특정한 뉴클레오타이드 염기 서열을 함유한다. HIV 단백질을 표적화하는 RNA 디코이는 슐렌저(Sullenger) 등(1990)에 의해서 최초로 개시되었다. 그러나, 숙련가는 RNA 디코이를 조류 바이러스 병원체의 복제에 한 역할을 하는 단백질을 표적화하도록 설계할 수 있다, 예를 들어 RNA 디코이는 인플루엔자 바이러스의 폴리머라제 복합 단백질을 표적화한다.
바람직하게는, 조류 세포에서 바이러스 복제를 감소시킴으로써, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 변형된 조류는 바이러스 병원체에 대해 증가된 내성을 가질 것이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 병원체 또는 바이러스 병원체에 "내성"인 또는 "증가된 내성"을 갖는 조류는 상기 병원체에 노출될 때 감수성인 조류에 비해 질병 증상이 감소되거나 또는 상기 증상을 나타내지 않는다. 본 발명의 방법을 사용하여, 조류를 병원체, 예를 들어 비제한적으로 인플루엔자 바이러스, 마렉병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 전염성 F낭병 바이러스에 내성으로 만들 수 있다.
재조합 단백질의 난내(In ovo) 생산
페티트와 모드지악(Petitte and Modziak)(2007)은 사육용 암탉을 "매우 효율적인 단백질 생물반응기"로서 개시하고 있다. 조류의 난이 다량의 단백질을 함유하고 난백 중 단백질 또는 알부민의 절반이상이 단일 종으로 구성됨을 인지하므로, 난 중에서 재조합 또는 이종 단백질을 생산하는데 큰 가능성이 존재한다. 치료 단백질의 생성을 위해 트랜스제닉 가금류를 생산하는 종래 기술 방법에서 만나게 되는 어려움은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 난 중에 높은 수준의 상업적으로 적합한 단백질을 축척하는 트랜스제닉 새의 생산이, 바람직하지 못한 렌티바이러스 시스템을 사용하여 성취되기는 하지만, 성취되었다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 난 중에서 이종 또는 재조합 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 변형된 조류를 생산할 수 있다. 난 중에서 생성될 수 있는 상업적으로 중요한 단백질은 치료 단백질, 예를 들어 항체 및 백신 항원을 포함한다.
유전자 변형된 조류의 생산 및 번식
본 발명의 방법은 유전자 변형된 조류의 번식 방법 및 유전자 변형된 조류로부터 식품을 생산하는 방법을 포함한다. 숙련가는 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 본 발명의 조류가, 생식소로 이동한 생식세포의 단지 일부만이 유전자 변형된다는 점에서 생식계열 키메릭일 수 있음을 알 것이다. 따라서, 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류를, 모든 세포가 유전자 변형된 자손을 생산하도록 번식시킬 수 있다. 따라서 하나의 실시태양에서, 본 발명은 유전자 변형된 조류의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 본 발명에 따라 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류를 수득하는 단계, (ii) 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류로부터 자손을 생산하도록 번식시키는 단계, 및 (iii) 게놈내에 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 자손을 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명의 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류, 및 본 발명에 따른 유전자 변형된 조류를 식품의 생산에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 인간 및 동물 소비용 가금류 제품의 생산에 적용할 수 있다. 가금류로부터 식품을 생산하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 가금류, 예를 들어 비제한적으로 닭으로부터 고기 및/또는 난을 수확하는 단계를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 조류는 생산 형질을 조절하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 유전자 변형되었다.
실시예
실시예 1. 배아에 EGFP 발현 구조물의 직접 주입
Tol2 서열에 인접한 강화된 GFP(EGFP)를 암호화하는 5.1 ㎍의 핵산 구조물 및 1.0 ㎍의 Tol2 트랜스포사제를 암호화하는 플라스미드를 3 ㎕의 리포펙타민 2000과 복합화시켰다. 상기 핵산 및 형질감염 시약의 복합화를 제조사(라이프 테크놀로지스)에 의해 권장되는 배양 시간을 사용하여 총 부피 90 ㎕의 OptiMEM 또는 OptiPRO 배지 중에서 수행하였다.
최종 20 분 배양에 이어서, 1 내지 3 ㎕의 상기 복합체를 2.5일 닭의 배아(13 내지 17 단계; 문헌[Hamburger and Hamilton, 1951])의 혈관에 주입하였다. 혈액의 제거는 필요하지 않았다. 작은(10 ㎜) 껍질 조각을 제거하여 상기 배아에 접근하였다. 주입 후에 상기 구멍을 20 ㎜의 정사각형 파라필름으로 밀봉하였다.
EGFP 발현이 대부분의 생식소에서 7일 및 14일째에 다양한 수준으로 관찰되었다. 생식소로부터 분리된 세포 및 녹색 세포가 또한 PGC인 것으로 나타났다(도 1, 2 및 3).
실시예 2. DNA 대 형질감염 시약의 시험관내 최적화 비
DNA:리포펙타민 2000의 최적의 비 및 형질감염 복합체를 형성시키기 위한 배지의 부피를 시험하기 위한 실험을 수행하였다. Tol2 서열에 인접한 EGFP 및 단일 헤어핀(shRNA)을 암호화하는 DNA 구조물을 50, 40, 30 또는 20 ㎕의 OptiMEM 부피로 리포펙타민 2000과 복합화시켰다. 사용된 DNA(㎍) 대 리포펙타민 2000(㎕)의 비는 하기와 같았다: 1:2, 2:4 및 4:8.
상기 복합체를 닭 섬유아세포(DF-1)에 형질감염시키고 EGFP의 발현에 대해 분석하였다. 결과는 30 ㎕ 배지 중의 1:2의 DNA(㎍):리포펙타민 2000의 비가 50 ㎕ 중의 2:4의 비보다 약간 더 양호하게 작용함을 가리켰다(도시되지 않음).
상기 시험관내 데이터를 배아에서 후속으로 확인하였다. Tol2 트랜스포존을 포함하는 DNA 구조물 0.33 ㎍, 트랜스포사제 플라스미드 0.66 ㎍, 및 2 ㎕의 리포펙타민 2000을 OptiMEM 중에서 복합화시키고 닭의 배아에 직접 주입하였다. 모든 살아있는 배아는 14일째에 양호한 수준의 EGFP 발현을 가졌다(도 4).
실시예 3. 퓨젠(FuGene) 형질감염 시약의 시험
퓨젠(프로메가(Promega))을, 세포 배양물 형질감염에 대해 제조사에 의해 권장되는 바와 유사한 DNA:퓨젠 비를 사용하여 형질감염 시약으로서 시험하였다. 퓨젠과 복합화된 DNA 구조물은 인접한 Tol2 서열과 함께 EGFP 발현 카세트를 포함하였다. 상기 복합체(0.66 ㎍의 EGFP-Tol2 구조물, 1.33 ㎍의 트랜스포사제 플라스미드, 6 ㎕의 퓨젠)를 15 개의 배아에 직접 주입하였다. 상기 배아들 중 하나는 14일째에 생식소에서 매우 적은 양의 EGFP 발현을 나타내었다. 상기 실험을 반복하였으며, 12일째에, 주입된 10 개의 배아가 모두 여전히 살아있었다. 상기 배아들 중 2 개는 생식소에 한 쌍의 녹색 세포를 가졌다.
실시예 4. 육계의 직접 주입 형질전환
선행의 직접 주입 실험을 산란계에 대해서 수행하였으므로, 본 실험의 목적은 상기 직접 주입 방법을 사용하여 육계를 성공적으로 형질전환시킬 수 있는지의 여부를 시험하는 것이었다. 단일 헤어핀 및 인접한 Tol2 서열을 포함하는 EGFP 발현 구조물을 리포펙타민 2000(0.33 ㎍의 트랜스포존 구조물, 0.66 ㎍의 트랜스포사제, 2 ㎕의 리포펙타민 2000)과 복합화시키고 닭의 배아의 등대동맥에 직접 주입하였다. 주입된 13 개의 배아 중 12개가 10일째에 살아있었으며 양호한 양의 EGFP 발현이 대부분의 생식소에서 검출되었다.
상기 실험을 다수의 헤어핀(shRNA)을 포함하는 EGFP 발현 구조물(0.33 ㎍의 트랜스포존, 0.66 ㎍의 트랜스포사제, 2 ㎕의 리포펙타민 2000)을 사용하여 반복하였다. 양호한 양의 EGFP 발현이 12일째 배아에서 발견되었다(도 5).
실시예 5. 형질감염 시약 배지로서 OptiPRO와 OptiMEM의 비교
형질감염 시약 배지로서 OptiMEM(동물 제품 함유), OptiPRO(동물 제품 비함유), 및 PBSA간에 비교를 수행하였다. 인접한 Tol2 서열을 포함하는 EGFP 발현 구조물을 형질감염 시약(0.33 ㎍의 트랜스포존, 0.66 ㎍의 트랜스포사제, 2 ㎕의 리포펙타민 2000)과 복합화시키고 닭의 배아에 직접 주입하였다. 상기 배아들은 모두 12일째에 생식소에서 약간의 녹색을 나타내었으며 상기 사용된 배지는 사망률에 영향을 미치지 않았다. OptiMEM 및 OptiPRO는 동등한 결과를 제공한 반면, PBSA는 생식소에서 EGFP의 현저하게 감소된 발현을 생성시켰다.
실시예 6. 다중-탄두 구조물이 주입된 산란계
2 개의 DNA 구조물을 형질감염 시약과 복합화시키고 닭의 배아에 직접 주입하였다. 첫 번째 DNA 구조물은 EGFP 발현 카세트 및 Tol2 서열이 인접한 다수의 shRNA 헤어핀을 포함하였으며, 두 번째 구조물은 EGFP 발현 구조물 및 3 개의 이중가닥 영역을 암호화하는 단일의 연장된 헤어핀 카세트를 포함하였다. 상기 구조물들을 하기의 양의 형질감염 시약과 복합화시켰다: 0.33 ㎍의 트랜스포존, 0.66 ㎍의 트랜스포사제, 2 ㎕의 리포펙타민 2000. 14일째에, 상기 두 구조물 모두에 대해서 대부분의 배아의 생식소에서 EGFP 발현이 발견되었다.
실시예 7. Tol2-EGFP의 지속성에 대한 시험
EGFP 발현 카세트, 다수의 헤어핀 및 인접한 Tol2를 포함하는 DNA 구조물을 형질감염 시약(0.33 ㎍의 트랜스포존, 2 ㎕의 리포펙타민 2000)과 복합화시켰다. 트랜스포사제가 없는 형질감염 복합체를 닭의 배아에 직접 주입하였다.
트랜스포사제가 생략된 배아는 일부 배아에서 여전히 녹색 세포를 보였으나, 트랜스포사제가 포함된 경우에 보이는 것보다 더 적은 세포를 보였다. 이는, 플라스미드가 직접 주입 후 2 주 이상 동안 생식소 세포 중에 남아있을 수 있으며 관찰된 모든 녹색 세포가 게놈내로의 Tol2 통합에 기인하는 것은 아님을 암시한다.
실시예 8. 동물-부재 리포펙타민
Tol2 및 다수의 shRNA 발현 카세트를 갖는 EGFP 발현 카세트를 동물-제품 부재 형질감염 시약(리포펙타민 2000CD)(0.33 ㎍의 트랜스포존, 0.66 ㎍의 트랜스포사제, 2 ㎕의 리포펙타민 2000CD)과 복합화시켰다. 14일째에 검사된 10 개의 배아 모두 생식소에서 양호한 양의 EGFP 발현을 가졌다(도 7).
실시예 9. 3.5일째의 직접 주입
모든 선행 실험에서, 형질감염 복합체의 주입이 2.5일째에 수행되었다. 본 실험의 목적은 배아의 직접 주입에 대한 또 다른 시간(3.5일)을 시험하기 위한 것이었다. EGFP 발현 구조물 및 Tol2를 포함하는 DNA 구조물을 리포펙타민 2000CD(0.33 ㎍의 트랜스포존, 0.66 ㎍의 트랜스포사제, 2 ㎕의 리포펙타민 2000CD)와 복합화시켰다.
14일째에, 21 개의 배아 중 8 개가 생식소에서 소량의 EGFP 발현을 가졌다. 따라서, 2.5일째의 직접 주입 타이밍이 중요하며, 3.5일까지 상기 PGC의 효율적인 형질감염은 관찰되지 않는다.
실시예 10. 트랜스포존 대 트랜스포사제의 비율 변경
DNA:리포펙타민 2000CD:배지 비를 유지시키면서, 우리는 상기 트랜스포사제 플라스미드 비율을 약간 감소시키는 동시에 상기 DNA 혼합물 중 트랜스포존의 비율을 증가시켰다. 추후 실험들에서 보다 많은 난에 주입할 필요로 인해 약간 상이한 부피들을 사용하였다. 본 발명자들은 또한 상기 형질감염 혼합물의 증가된 부피의 주입이 허용되는지의 여부를 결정하기 위해서 상기 혼합물의 주입 전에 상기 배아로부터 혈액의 제거를 시험하였다.
EGFP 발현 카세트 및 Tol2를 포함하는 DNA 구조물을 형질감염 시약(0.66 ㎍의 트랜스포존, 1.0 ㎍의 트랜스포사제, 3 ㎕의 리포펙타민2000 CD)과 복합화시켰다. 14일째에, 사전-방혈 배아는 사전-방혈되지 않은 배아에 비해 생식소에서 유사한 수준의 EGFP 발현을 가졌다. 새로운 DNA 비는 양호한 수준의 EGFP 발현의 관찰과 함께 잘 작용하였다.
실시예 11. JetPEI 형질감염 시약
JetPEI에 대해서, EGFP 발현 카세트 및 Tol2를 포함하는 DNA 구조물을 50 ㎕ OptiPRO(5% 글루코스와 함께) 중의 형질감염 시약(4 ㎍의 트랜스포존, 6 ㎍의 트랜스포사제, 1.6 ㎕의 JetPEI(폴리플러스 형질감염))과 복합화시켰다. JetPEI는 주입시 혈액의 응고를 야기하였으나, 이는 배아 생존성에 영향을 미치지 않았다. 상기 배아 및 생식소에서 녹색 세포가 발견되었으나, 대부분, 리포펙타민2000이 사용된 경우에 나타난 형질전환된 PGC와 형태학적으로 상이하였다.
상기 JetPEI 형질감염 시약을 시험하기 위해서 두 번째 실험을 수행하였다. 2 개의 반응 혼합물, 즉 i) 100 ㎕ OptiPRO(5% 글루코스와 함께) 중의 0.66 ㎍의 트랜스포존, 1.0 ㎍의 트랜스포사제, 0.5 ㎕의 JetPEI; 및 ii) 100 ㎕ OptiPRO(5% 글루코스와 함께) 중의 1.32 ㎍의 트랜스포존, 2.0 ㎍의 트랜스포사제, 0.5 ㎕의 JetPEI를 사용하였다.
JetPEI는 주입시 혈액의 응고를 야기하였으며 반응 혼합물(ii)는 개선된 배아 생존성을 생성시켰다. 다시, 약간의 EGFP 발현이 생식소에서 발견되었으나 다시 상기 세포 유형은 PGC-유사한 것으로 보이지 않았다. 생식소를 취하고 세포를 분리시키고 PGC 마커를 염색하였다. 녹색 세포는 상기 PGC 마커 염색을 보이지 않았으며, 이는 PGC가 상기 JetPEI 복합체에 의해 형질감염되지 않았음을 입증한다.
실시예 12. 징크 핑거 뉴클레아제
본 실험의 목적은 아연-집게 뉴클레아제 플라스미드가 직접 주입 기법에 의해 PGC의 형질전환에 사용될 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 것이었다. 실험에 사용된 DNA는 2 개의 아연-집게 뉴클레아제 플라스미드 및 중복 단편(90 ㎕ OptiPRO 중의 형질감염 시약 0.5 ㎍의 각각의 플라스미드, 3 ㎕의 리포펙타민2000 CD와 복합화되었음)을 포함하였다.
상기 플라스미드 상에 EGFP가 존재하지 않았기 때문에, 본 발명자들은 오직 상기 중복 단편이 닭의 게놈에 통합된 경우에만 단편을 증폭시키는 PCR 시험에 의존하였다. 배양 14일 후에, 생식소를 제거하고, 항체 분류 방법을 사용하여 PGC를 농축시키고, 게놈 DNA를 제조하였다. PCR은 상기 중복 단편이 상기 닭의 게놈에 통합되었음을 밝혔다. 이러한 결과는 아연-집게 뉴클레아제가 본 발명의 직접 주입 방법을 사용하여 조류 PGC의 게놈 내로 DNA를 통합시키기에 적합함을 입증한다.
실시예 13. 결과
상기에 개략된 프로토콜에 따라, 본 발명자들은 수용 배아의 생식소에서 PGC의 현저한 형질전환을, 종래 기술의 PGC 형질감염 방법에 개시된 경우보다 훨씬 더 큰 정도로 보았다. PGC-특이성 마커에 의한 세포의 염색을 통해서, 본 발명자들은 상기 생식소에서 형질전환된 세포의 대부분이 PGC임을 보였다. 본 발명자들은 수용 배아를 성적으로 성숙하게 하였으며 다자란 수컷의 >90%의 정자에서 Tol2 트랜스포존 서열을 검출할 수 있었다.
다른 감염 시약들을 사용하였으나, 지질-기재 시약들이 PGC의 우수한 형질감염을 제공하였다. JetPEI는 상기 방법에 의해 세포를 형질감염시켰으나, 형질감염된 세포 중 임의의 것이 PGC임을 입증할 수 없었다. 퓨젠은 세포를 매우 낮은 비율로 형질감염시켰다.
실시예 14. 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하는 게놈의 직접 주입 변형
PANK1 유전자의 인트론 5의 영역을 표적화하는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 항-인플루엔자 shRNA PB1-2257 및 동종 수복에 필요한 영역을 함유하는 플라스미드와 함께 배아에 주입하였으며, 이를 후속으로 상기 shRNA의 통합에 대해 분석하였다.
총 1.5 ㎍의 DNA(500 ㎍의 각각의 ZFN 플라스미드 및 500 ㎍의 수복 플라스미드)를 45 ㎕의 OptiPRO에 가하고 이어서 45 ㎕의 OptiPRO 중의 3 ㎕의 리포펙타민2000 CD와 복합화한 후에 30일 2.5 난에 주입하였다. 7일까지 배양한 난을 생식소 제거하고, 분리시키고 PGC를 SSEA-1 항체(산타 크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech))와 함께 MACS 분류를 사용하기 위해 농축시켰다. DNA를 상기 ZFN 처리된 배아 및 대조용 배아로부터의 PGC 농축된 샘플로부터 퀴아겐(Qiagen) DNAeasy 키트를 사용하여 추출하였다.
상기 shRNA의 성공적인 통합을 선별하기 위한 PCR을, 동종 수복에 사용된 영역 밖의 게놈에 결합하는 프라이머(스크린 7 5' GTGACTCAGACTCCTGTTAG (서열번호 3)) 및 상기 shRNA에 결합하는 것(스크린 6 5'TCTGCTGCTTCACAGTCTTC (서열번호 4))을 사용하여 수행하였다. PCR을 94 ℃ 2 분에 이어서 36 주기의 94 ℃ 45 초, 55 ℃ 45 초 및 72 ℃ 1 분 10 초의 순환 조건을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 녹색 마스터 혼합물(프로메가)을 사용하여 수행하였다. 이어서 72 ℃에서 10 분간 최종 연장을 수행하였다.
PCR을 상기 ZFN 처리된 배아뿐만 아니라 대조용 배아로부터의 DNA PGC 농축된 샘플, 앞서 shRNA가 통합된 것으로 나타난 양성 대조용 세포로부터의 DNA, 및 수 대조군상에서 수행하였다. 도 8은 이들 PCR 반응들의 젤 전기영동을 도시한다. 상기 ZFN 직접 주입된 배아로부터의 PCR을 함유하는 첫 번째 레인은 주입된 배아 중의 게놈 통합을 가리키는 밴드를 명백히 나타낸다.
실시예 15. 닭의 직접 주입 게놈 변형의 결과
다수 라운드의 직접 주입 후에, 성적으로 성숙시킨 총 277 마리의 수탉 및 이들의 정자를 상기 Tol2 트랜스유전자의 존재에 대해서 시험하였다. 상기 시험된 277 개 샘플 중 98 개가 다양한 수준의 양성 정자 비율과 함께 Tol2 트랜스유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 다수의 이들 양성 G(0) 수탉을 교배시키고 총 7393 마리의 G(1) 새끼 새를 선별하였다. 상기 새끼 새 중 65마리가 트랜스제닉인 것으로 밝혀졌다. 상기 G(1) 새끼 새를 사용한 후속의 교배는 상기 트랜스유전자의 G(2) 세대로의 멘델 유전을 입증하였다.
부화된 새끼 새들을 성적으로 성숙시키고 정량적인 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 상기 정자 중 미니Tol-EGFP의 존재를 검출하였다. 정자 샘플을 모으고 DNA를 제조사의 설명서에 따라 퀴아겐 DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용하여 180 ㎕의 PBS 중에 희석된 20 ㎕의 정자로부터 추출하였다. 이어서 상기 정자 게놈 DNA를 상기 PCR 반응에 사용하기 위해서 ddH2O 중에서 1/100 희석하였다. qPCR을 제조사의 설명서에 따라 마스터사이클러(Mastercycler)(등록상표) ep 리얼플렉스(realplex)(에펜도르프 함부르크(Eppendorf Hamburg), 독일 소재)상에서 수행하였다. 간단히, 10 ㎕의 태크만(Taqman) 2 x 유니버셜 마스터 혼합물(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)), 1 ㎕의 20 x FAM 표지된 분석 혼합물(어플라이드 바이오시스템스) 및 9 ㎕의 희석된 DNA를 함유하는 20 ㎕의 반응물을 준비하였다. 각각의 샘플을 미니Tol2에 대한 특정 프라이머 및 탐침:
순방향 프라이머 5' CAGTCAAAAAGTACTTATTTTTTGGAGATCACT 3' (서열번호 5)
역방향 프라이머 5' GGGCATCAGCGCAATTCAATT 3' (서열번호 6);
검출 탐침 5' ATAGCAAGGGAAAATAG 3' (서열번호 7);
및 주형 대조군으로서 작용하는 닭의 게놈으로부터의 게놈 대조용 영역에 대한 특정 프라이머 및 탐침:
순방향 프라이머 5' GATGGGAAAACCCTGAACCTC 3' (서열번호 8);
역방향 프라이머 5' CAACCTGCTAGAGAAGATGAGAAGAG 3' (서열번호 9);
검출 탐침 5' CTGCACTGAATGGAC 3' (서열번호 10)
으로 중복해서 준비하였다.
상기 PCR 주기 매개변수들은 95 ℃ 10 분에 이어서 45 주기의 95 ℃ 15 초 및 60 ℃ 1 분의 초기 변성 단계였다. 각각의 수탉을 2 회 이상 시험하였으며, minTol2에 대해 36 미만의 CT 값이 획득된 경우 양성으로 분류하였다. 대조용 게놈 영역에 대해서 32 미만의 CT는 시험된 샘플 중에 충분한 DNA가 존재함을 가리키는데 사용되었다.
당해 분야의 숙련가는 본 명세서의 광범위한 일반적인 범위를 벗어나지 않고상술한 실시태양들에 대한 다수의 변화 및/또는 변형이 수행할 수 있는 것으로 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 실시태양들은 모든 점에 있어서 예시적인 것이지 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에서 논의되고/되거나 언급된 모든 공보들은 내용 전체가 본 발명에 도입된다.
본 출원은 2012년 4월 20일자로 출원된 US 61/636,331, 2013년 3월 14일자로 출원된 US 61/783,823 및 2013년 4월 12일자로 출원된 AU 2013204327로부터 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
본 명세서에 포함된 문서, 행위, 물질, 장치, 물품 등에 대한 임의의 논의는 오직 본 발명에 대한 배경을 제공하기 위한 것이다. 상기 논의를, 상기 내용 중 어느 하나 또는 전부가 종래 기술의 토대 부분을 형성하거나, 또는 본 출원의 각 항의 우선일 이전에 존재하기 때문에 본 발명과 관련된 분야의 통상의 일반적인 지식임을 인정하는 것으로서 간주해서는 안 된다.
참고문헌
Balciunas et al. (2006) PLoS Genet. 10:e169.
Barrangou (2012) Nature Biotechnology, 30:836-838.
Cong et al. (2013) Science, 339:819-823.
Davis and Stokoe (2010) BMC Med, 8:42.
Ding et al. (2005) Cell, 122:473-483.
Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res, 33:5978-5990.
Hamburger and Hamilton (1951) J Morphol, 88:49-92.
Haensler and Szoka, (1993) Bioconjugate Chem, 4:372-379.
Ivics et al. (1997) Cell, 91:501-510.
Kagami et al. (1997) Mol Reprod Dev, 48:501-510.
Kawakami et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97:11403-11408.
Petitte (2002) J Poultry Sci, 39:205-228.
Pettite and Modziak (2007) Proc Natl Acad Sci USA, 104:1739-1740.
Sullenger et al. (1990) Cell, 63:601-608.
Tang et al. (1996) Bioconjugate Chem, 7:703-714.
Zhang et al. (2011) Nature Biotechnology, 29:149-153.
SEQUENCE LISTING <110> Commonweath Scientific and Industrial Research Organisation MAT Malta Advanced Technologies Limited <120> Cell transfection method <130> IPA141082-AU <150> US 61/636,331 <151> 2012-04-20 <150> US 61/783,823 <151> 2013-03-14 <150> AU 2013204327 <151> 2013-04-12 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4090 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP expression construct flanked by Tol2 sequences <400> 1 cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60 ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120 tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180 ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240 cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300 tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360 ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420 gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480 gccacaggat caagagcacc cgtggccgta tcttcgcaga tcgacattga ttattgacta 540 gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 600 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 660 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 720 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 780 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 840 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 900 tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc 960 ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg 1020 ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg 1080 tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg 1140 gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg cgttgccttc 1200 gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt 1260 actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt 1320 ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg 1380 ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg 1440 ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg 1500 tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg 1560 gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg 1620 tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac 1680 ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc 1740 ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc 1800 tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca 1860 gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct 1920 ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg 1980 gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg 2040 tccccttctc cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg 2100 acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 2160 ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct 2220 gtctcatcat tttggcaaag aattgtacca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 2280 ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 2340 tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 2400 ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca cactagtgac caccttcgct tacggcgtgc 2460 agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 2520 ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 2580 gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 2640 acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaacttc aacagccaca 2700 acgtatacat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 2760 acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 2820 gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 2880 aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 2940 tcactcacgg catggacgag ctgtacaagt agggcggctc gaggatatca ggatcaattc 3000 actcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 3060 cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 3120 cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 3180 aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag 3240 aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc catgaacaaa 3300 ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc 3360 catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt 3420 tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 3480 tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga cctgcagccc 3540 aagctcgagg gcccatctgg cctgtgtttc agacaccagg gagtctctgc tcacgtttcc 3600 tgctatttgc agcctctcta tcaagactaa tacacctctt cccgcatcgg ctgcctgtga 3660 gaggcttttc agcactgcag gattgctttt cagccccaaa agagctaggc ttgacactaa 3720 caattttgag aatcagcttc tactgaagtt aaatctgagg ttttacaact ttgagtagcg 3780 tgtactggca ttagattgtc tgtcttatag tttgataatt aaatacaaac agttctaaag 3840 caggataaaa ccttgtatgc atttcattta atgttttttg agattaaaag cttaaacaag 3900 aatctctagt tttctttctt gcttttactt ttacttcctt aatactcaag tacaatttta 3960 atggagtact tttttacttt tactcaagta agattctagc cagatacttt tacttttaat 4020 tgagtaaaat tttccctaag tacttgtact ttcacttgag taaaattttt gagtactttt 4080 tacacctctg 4090 <210> 2 <211> 706 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding Tol2 transposase <400> 2 Met Phe Met Pro Ser Ser Phe Ser Tyr Ser Ser Trp Ala Thr Cys Trp 1 5 10 15 Leu Leu Cys Cys Leu Ile Ile Leu Ala Lys Asn Ser Ser Arg Ser Ser 20 25 30 His Ile Tyr Tyr His Asn Ala Gln His Leu Asp Leu Glu Ile Arg Glu 35 40 45 Ile Ile Thr Val Asn Gln Trp Lys Lys Met Glu Glu Val Cys Asp Ser 50 55 60 Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Val Gln Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu 65 70 75 80 His Pro Trp Pro Tyr Leu Arg Glu Phe Phe Ser Leu Ser Gly Val Asn 85 90 95 Lys Asp Ser Phe Lys Met Lys Cys Val Leu Cys Leu Pro Leu Asn Lys 100 105 110 Glu Ile Ser Ala Phe Lys Ser Ser Pro Ser Asn Leu Arg Lys His Ile 115 120 125 Glu Arg Met His Pro Asn Tyr Leu Lys Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala 130 135 140 Gln Lys Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr His Ala Ser Ser Ser Lys Gln 145 150 155 160 Leu Lys Val Asp Ser Val Phe Pro Val Lys His Val Ser Pro Val Thr 165 170 175 Val Asn Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile Ile Gln Gly Leu His Pro Phe 180 185 190 Ser Thr Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys Glu Leu Ile Ser Thr Leu Gln 195 200 205 Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro Thr Leu Arg Ser Lys Ile Ala 210 215 220 Glu Ala Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys Val Thr Ala Ala Met Ser Glu 225 230 235 240 Val Glu Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp Cys Trp Thr Ala Arg Arg Lys 245 250 255 Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu 260 265 270 Arg His Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys Arg Leu Met Gly Ser His Thr 275 280 285 Phe Glu Val Leu Ala Ser Ala Met Asn Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu 290 295 300 Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr Thr Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe 305 310 315 320 Met Lys Ala Phe Arg Val Phe Gly Val Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr 325 330 335 Glu Ala Arg Arg Cys Glu Ser Asp Asp Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly 340 345 350 Glu Gly Ser Asp Gly Val Glu Phe Gln Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp 355 360 365 Gln Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu Pro Lys His Gln Lys Cys Ala 370 375 380 Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu 385 390 395 400 Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys 405 410 415 Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala 420 425 430 Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu Leu Arg Pro Asn Gln Thr Arg 435 440 445 Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp Arg Ile Leu Gln Ile Cys Lys 450 455 460 Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn Ile Cys Thr Ser Leu Glu Val 465 470 475 480 Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu Phe Leu Thr Glu Trp Ala Asn 485 490 495 Thr Met Arg Pro Val Ala Lys Val Leu Asp Ile Leu Gln Ala Glu Thr 500 505 510 Asn Thr Gln Leu Gly Trp Leu Leu Pro Ser Val His Gln Leu Ser Leu 515 520 525 Lys Leu Gln Arg Leu His His Ser Leu Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val 530 535 540 Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr Arg Phe Lys His Met Phe Glu 545 550 555 560 Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Ile Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr 565 570 575 Ser Trp Thr Asn Asp Glu Thr Ile Ile Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile 580 585 590 Arg Val His Leu Glu Pro Leu Asp His Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser 595 600 605 Ser Ser Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala Ser Leu Lys Pro Thr Thr His 610 615 620 Glu Ala Ser Lys Glu Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr 625 630 635 640 Arg Glu Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys 645 650 655 Thr Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala Ala Cys Glu Arg Leu Phe Ser 660 665 670 Thr Ala Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys Arg Ala Arg Leu Asp Thr Asn 675 680 685 Asn Phe Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys Leu Asn Leu Arg Phe Tyr Asn 690 695 700 Phe Glu 705 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Screen 7 oligonucleotide primer <400> 3 gtgactcaga ctcctgttag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Screen 6 oligonucleotide primer <400> 4 tctgctgctt cacagtcttc 20 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miniTol2 forward oligonucleotide primer <400> 5 cagtcaaaaa gtacttattt tttggagatc act 33 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miniTol2 Reverse oligonucleotide primer <400> 6 gggcatcagc gcaattcaat t 21 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miniTol2 detection probe <400> 7 atagcaaggg aaaatag 17 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genomic control region forward primer <400> 8 gatgggaaaa ccctgaacct c 21 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genomic region control reverse primer <400> 9 caacctgcta gagaagatga gaagag 26 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genomic control region oligonucleotide probe <400> 10 ctgcactgaa tggac 15

Claims (41)

  1. 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류의 생산 방법으로,
    (i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 조류 배아 (embryo)의 혈관에 주입하고, 이에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입되는 단계
    를 포함하는 조류의 생산 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (ii) 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    형질감염 혼합물을 단계 13 내지 14의 조류 배아에 주입하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질감염 시약이 양이온성 지질을 포함하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    형질감염 시약이 DOTMA (N-[1-(2.3-다이올레오일옥시)-프로필]-N,N,N-트라이메틸 암모늄 클로라이드), DOTAP (1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트라이메틸암모늄)프로판), DMRIE (1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시 에틸 암모늄 브로마이드) 및 DDAB (다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드) 중 하나 이상으로부터 선택된 1가 양이온성 지질을 포함하는 방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    형질감염 시약이 DOSPA (2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트) 및 DOSPER (1,3-다이올레오일옥시-2-(6카복시 스페르밀)-프로필-아미드, TMTPS (테트라메틸테트라팔미토일 스페르민), TMTOS (테트라메틸테트라올레일 스페르민), TMTLS (테트라메틸테트라라우릴 스페르민), TMTMS (테트라메틸테트라미리스틸 스페르민) 및 TMDOS (테트라메틸다이올레일 스페르민) 중 하나 이상으로부터 선택된 다가 양이온성 지질을 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    형질감염 시약이 DOSPA (2,3-다이올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트)를 포함하는 방법.
  8. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질감염 시약이 중성 지질을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    중성 지질이 (DOPE) 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민, DPhPE (다이피타노일포스파티딜에탄올아민) 또는 콜레스테롤을 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    형질감염 시약이 형질감염 시약과 폴리뉴클레오타이드와의 혼합 전에 DOSPA 및 DOPE의 3:1(w/w) 혼합물을 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드가 트랜스포존 또는 징크 핑거 (Zinc finger) 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    형질감염 혼합물이 트랜스포사제 (transposase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    트랜스포사제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 방법.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    트랜스포존이 Tol2, 미니-Tol2, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 및 피기백(PiggyBac) 중에서 선택되는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드가 징크 핑거 뉴클레아제를 암호화하는 서열을 포함하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    생식세포가 원시생식세포인 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    주입 혼합물이 배아가 발생한 난각 안의 상기 배아에 주입되는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드가 이중가닥 영역을 포함하는 RNA 분자를 암호화하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    RNA 분자가 siRNA, shRNA 또는 RNA 디코이(decoy)인 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오타이드가 폴리펩타이드를 암호화하는 방법.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNA 분자 또는 폴리펩타이드가, 상기 RNA 분자 또는 폴리펩타이드가 없는 세포에 비해, 세포에서 바이러스의 복제를 감소시키는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    바이러스가 인플루엔자 바이러스인 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산되는, 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류.
  24. 게놈내에 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 제 23 항의 조류의 유전자 변형된 생식 세포.
  25. 제 23 항의 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류에 의해 생산된 정자.
  26. 제 23의 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류에 의해 생산된 난 (egg).
  27. 조류의 생식세포의 유전자 변형 방법으로,
    (i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 난 중에 함유된 조류 배아의 혈관에 주입하는 단계, 및
    (ii) 상기 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계
    를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입되는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    제 2 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 특징들 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법.
  29. 유전자 변형된 조류의 생산 방법으로,
    (i) 제 23 항의 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류를 수득하는 단계,
    (ii) 상기 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류를 번식시켜 자손을 생산하는 단계, 및
    (iii) 게놈에 삽입된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 자손을 선택하는 단계
    를 포함하는 방법.
  30. 제 29 항의 방법에 의해 생산된 유전자 변형된 조류.
  31. 식품의 생산 방법으로,
    (i) 제 23 항의 유전자 변형된 생식세포를 포함하는 조류 또는 제 30 항의 유전자 변형된 조류를 수득하는 단계, 및
    (ii) 상기 조류로부터 식품을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    조류로부터 고기 및/또는 난을 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 유전자 변형된 조류의 번식 방법으로,
    (i) 제 1 항 내지 제 22 항 또는 제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하여 새끼 새 또는 자손을 생산시키는 단계,
    (ii) 상기 새끼 새 또는 자손이 성적으로 성숙한 조류로 발육되게 하는 단계, 및
    (iii) 상기 성적으로 성숙한 조류를 번식시켜 유전자 변형된 조류를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  34. 제 33 항의 방법에 따라 생산된 유전자 변형된 조류.
  35. 조류의 형질 (trait)을 조절하는 방법으로,
    (i) 형질감염 시약과 혼합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질감염 혼합물을 조류 배아의 혈관에 주입하고, 이에 의해 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 하나 이상의 생식세포의 게놈에 삽입되는 단계, 및
    (ii) 상기 배아를, 상기 배아가 새끼 새로 발생하기에 충분한 온도에서 배양하는 단계
    를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 조류의 형질을 조절하는 이중가닥 영역을 포함하는 RNA 분자 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    RNA 분자가 siRNA, shRNA 또는 RNA 디코이를 포함하는 방법.
  37. 제 35 항 또는 제 36 항에 있어서,
    형질이 근육질량, 성별, 영양 함량 및/또는 질병 내성 중에서 선택되는 방법.
  38. 조류의 바이러스에 대한 내성의 증가 방법으로, 제 1 항 내지 제 22 항, 제 27 항 내지 제 29 항, 제 31 항 내지 제 33 항 및 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계를 포함하며, 폴리뉴클레오타이드가 세포에서 바이러스의 복제를 감소시키는 siRNA, shRNA 또는 RNA 디코이이거나, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드가 세포에서 상기 바이러스의 복제를 감소시키는 항바이러스 펩타이드를 암호화하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    바이러스가 인플루엔자 바이러스인 방법.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항의 방법에 따라 생산된 조류.
  41. 조류가 닭, 오리, 칠면조, 거위, 밴텀닭 및 메추라기 중에서 선택되는, 제 1 항 내지 제 22 항, 제 27 항 내지 제 29 항, 제 31 항 내지 제 33 항 및 제 35 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항의 방법, 제 23 항 또는 제 40 항의 조류, 또는 제 30 항 또는 제 34 항의 유전자 변형된 조류.
KR1020147031173A 2012-04-20 2013-04-19 세포 형질감염 방법 KR102076784B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261636331P 2012-04-20 2012-04-20
US61/636,331 2012-04-20
US201361783823P 2013-03-14 2013-03-14
US61/783,823 2013-03-14
AU2013204327 2013-04-12
AU2013204327A AU2013204327B2 (en) 2012-04-20 2013-04-12 Cell transfection method
PCT/AU2013/000414 WO2013155572A1 (en) 2012-04-20 2013-04-19 Cell transfection method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150014446A true KR20150014446A (ko) 2015-02-06
KR102076784B1 KR102076784B1 (ko) 2020-02-12

Family

ID=49515073

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147031173A KR102076784B1 (ko) 2012-04-20 2013-04-19 세포 형질감염 방법

Country Status (9)

Country Link
US (4) US10897881B2 (ko)
EP (2) EP2839016B1 (ko)
JP (1) JP6531239B2 (ko)
KR (1) KR102076784B1 (ko)
CN (2) CN112626128A (ko)
AU (2) AU2013204327B2 (ko)
BR (1) BR112014026186B8 (ko)
ES (2) ES2963732T3 (ko)
WO (1) WO2013155572A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210003070A (ko) * 2018-08-16 2021-01-11 (주)라트바이오 유전자 편집된 형질전환 동물 및 형질전환 배아

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
AU2013204327B2 (en) * 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
LT3241902T (lt) 2012-05-25 2018-06-25 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti rnr nukreiptos tikslinės dnr modifikacijai ir rnr nukreiptos transkripcijos moduliacijai
WO2014070111A1 (en) * 2012-10-29 2014-05-08 Agency For Science, Technology And Research A novel reagent for gene-drug therapeutics
KR102243092B1 (ko) 2012-12-06 2021-04-22 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
KR20150105956A (ko) 2012-12-12 2015-09-18 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작 및 치료적 적용을 위한 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 유전자 조작 및 최적화
NZ712727A (en) 2013-03-14 2017-05-26 Caribou Biosciences Inc Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
KR20160034901A (ko) 2013-06-17 2016-03-30 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작에 최적화된 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 이중 닉카아제 시스템, 방법 및 조성물
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
DK3011031T3 (da) 2013-06-17 2020-12-21 Broad Inst Inc Fremføring og anvendelse af crispr-cas-systemerne, vektorer og sammensætninger til levermålretning og -terapi
JP6702858B2 (ja) 2013-06-17 2020-06-03 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ウイルス成分を使用して障害および疾患をターゲティングするためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および組成物の送達、使用および治療上の適用
AU2014281026B2 (en) 2013-06-17 2020-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
EP3079726B1 (en) * 2013-12-12 2018-12-05 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
DK3079725T3 (da) 2013-12-12 2020-01-20 Broad Inst Inc Administration, brug og terapeutiske anvendelser af crispr-cas-systemerne og sammensætninger til genomredigering
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
CN106103705A (zh) 2013-12-12 2016-11-09 布罗德研究所有限公司 核苷酸重复障碍中crispr‑cas系统的组合物和使用方法
CN103782953A (zh) * 2014-01-23 2014-05-14 固镇县玉鹏蔬菜开发有限责任公司 一种小鹅瘟的预防方法
CN105265383A (zh) * 2014-10-18 2016-01-27 颍上县永祥旱粮研究所 一种林下鸡养殖方法
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
CN104789599A (zh) * 2015-04-13 2015-07-22 浙江省农业科学院 一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法
SG10201912329YA (en) 2015-06-18 2020-02-27 Broad Inst Inc Crispr Enzyme Mutations Reducing Off-Target Effects
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
AU2016305490B2 (en) * 2015-08-07 2022-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method for producing an animal comprising a germline genetic modification
CA3005989A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in cell culture
CA3005980A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in avian eggs
WO2017111144A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 国立研究開発法人産業技術総合研究所 遺伝子改変家禽卵
AU2018274769B2 (en) * 2017-05-25 2024-05-02 Eggxyt Ltd Methods for gender determination of avian embryos in unhatched eggs and means thereof
CN109275622A (zh) * 2017-07-20 2019-01-29 龚海华 一种蛋鸡的循环养殖方法
CN107723313A (zh) * 2017-10-30 2018-02-23 扬州大学 一种外源物质导入鸡胚的方法
CN111417407A (zh) * 2017-11-15 2020-07-14 奇异科学有限责任公司 用于非清髓性骨髓重建的方法和组合物
CA3125047A1 (en) * 2019-04-08 2020-10-15 Dna Twopointo Inc. Integration of nucleic acid constructs into eukaryotic cells with a transposase from oryzias

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5162215A (en) * 1988-09-22 1992-11-10 Amgen Inc. Method of gene transfer into chickens and other avian species
GB8906214D0 (en) 1989-03-17 1989-05-04 Nat Res Dev Introducing an exogenous gene into birds
US5631329A (en) 1990-08-27 1997-05-20 Dendritech, Inc. Process for producing hyper-comb-branched polymers
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5266106A (en) 1992-10-22 1993-11-30 Xerox Corporation Ink compositions with dendrimer grafts
WO1996031549A1 (de) 1995-04-07 1996-10-10 Mueller Egbert Dendrimere pfropfpolymerisate
US20030069173A1 (en) 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
JP4320054B2 (ja) 1996-08-13 2009-08-26 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド ポリヌクレオチド送達のための組成物および方法
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
CN1273599A (zh) 1997-08-04 2000-11-15 马萨诸塞州大学 通过对PGCs更长时间的培养而产生鸟胚生殖(EG)细胞系,其在克隆和嵌合化中的应用
JP2003532364A (ja) 1997-08-04 2003-11-05 ユニバシティ オブ マサチューセッツ、ア パブリック インスチチユーション オブ ハイアー エデュケイション オブ ザ コモンウエルス オブ マサチューセッツ、アズ リプリゼンテッド バイ イッツ アマースト キャンパス トリ始原生殖細胞（ｐｇｃ）細胞系とその長期間培養法
ATE489461T1 (de) * 1997-10-16 2010-12-15 Univ Georgia Transgene vögel und proteinproduktion
WO2000047717A1 (en) 1999-02-11 2000-08-17 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Avian pluripotent embryonic germ cell line
US6140118A (en) 1999-08-11 2000-10-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Avian blastodermal cell lines
JP4609869B2 (ja) 1999-12-03 2011-01-12 独立行政法人科学技術振興機構 トランスポゾン転移酵素および遺伝子改変方法
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
JP4300287B2 (ja) 2002-02-14 2009-07-22 国立大学法人東京海洋大学 分離始原生殖細胞の移植による生殖細胞系列への分化誘導法
JP4364474B2 (ja) 2002-02-15 2009-11-18 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 哺乳動物において機能的なトランスポゾン
US20040172667A1 (en) * 2002-06-26 2004-09-02 Cooper Richard K. Administration of transposon-based vectors to reproductive organs
US7527966B2 (en) * 2002-06-26 2009-05-05 Transgenrx, Inc. Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector
KR100502889B1 (ko) 2003-04-21 2005-07-20 한미약품(주) 조류 원시생식세포의 생식선 전이 효율의 개선방법
CA2595576A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Origen Therapeutics, Inc. Transgenic chickens
BRPI0609485A2 (pt) * 2005-03-31 2010-04-13 Ronen Kahana criação de aves domésticas e outros animais resistentes a doenças virais
US20070293449A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for delivery of double-stranded rna
EP2089427B1 (en) * 2006-11-13 2014-07-30 Sangamo BioSciences, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
AU2008250973B2 (en) 2007-05-16 2012-10-11 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Treatment and prevention of influenza
CA2706224A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 Origen Therapeutics, Inc. Transgenic chickens comprising an inactivated endogenous immunoglobulin light chain gene and methods to produce such chickens using genetically modified primordial germ cells
BRPI0817026A2 (pt) * 2007-09-20 2017-05-16 Australian Poultry Crc Pty Ltd molécula de ácido nucleico, polipeptídeo isolado, polipeptídeo de fusão, construção genética, métodos para produzir uma molécula de interferon-lambda recombinante aviário em uma célula, para identificar uma sequência genética de interferon-lambda aviário, para induzir ou regular de modo positivo uma resposta imune em aves e para o tratamento ou profilaxia de aves, molécula de interferon-lambda recombinante aviário, célula isolada, molécula de anticorpo, meio legível por computador, ensaio para mdir o nível de um polipeptídeo de interferon-lambda aviário em aves, uso do polipeptídeo de interferon-lambda aviário ou de uma molécula de ácido nucleico, gênero alimentício medicinal ou terapêutico, adjuvante, e, composição farmacêutica veterinária.
US20110041195A1 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Organisms homozygous for targeted modification
CN103930550B (zh) * 2011-02-25 2017-02-15 重组股份有限公司 经遗传修饰的动物及其生成方法
AU2013204327B2 (en) * 2012-04-20 2016-09-01 Aviagen Cell transfection method
WO2014138792A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Double-stranded rna
EP2981617B1 (en) * 2013-04-04 2023-07-05 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
NZ728159A (en) * 2014-07-14 2018-08-31 Univ Washington State Nanos2 knock-out that ablates germline cells
AU2016305490B2 (en) * 2015-08-07 2022-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method for producing an animal comprising a germline genetic modification
CN105524941A (zh) * 2016-01-19 2016-04-27 扬州大学 一种特异于禽类原始生殖细胞的基因转移系统及方法
TW202241259A (zh) * 2020-12-31 2022-11-01 以色列國家農業部、農村發展農業研究組織（沃爾卡尼研究所） 不育禽類胚胎、其產生及用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nauto Mitsuru et al., Journal of Poultry Science vol.44, no.4, October 2007, pp.4160425 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210003070A (ko) * 2018-08-16 2021-01-11 (주)라트바이오 유전자 편집된 형질전환 동물 및 형질전환 배아

Also Published As

Publication number Publication date
US20230189769A1 (en) 2023-06-22
EP2839016A4 (en) 2015-11-25
BR112014026186B1 (pt) 2022-02-01
KR102076784B1 (ko) 2020-02-12
BR112014026186B8 (pt) 2023-01-31
US20210112789A1 (en) 2021-04-22
CN104619848B (zh) 2020-12-15
ES2704155T3 (es) 2019-03-14
BR112014026186A2 (pt) 2017-07-18
EP3460065B1 (en) 2023-08-23
US20190261609A1 (en) 2019-08-29
US10897881B2 (en) 2021-01-26
US20150072064A1 (en) 2015-03-12
EP2839016A1 (en) 2015-02-25
WO2013155572A1 (en) 2013-10-24
AU2013204327B2 (en) 2016-09-01
AU2013204327A1 (en) 2013-11-07
AU2013248945A1 (en) 2014-10-30
JP2015514404A (ja) 2015-05-21
CN112626128A (zh) 2021-04-09
EP3460065A1 (en) 2019-03-27
US11369096B2 (en) 2022-06-28
JP6531239B2 (ja) 2019-06-19
EP2839016B1 (en) 2018-10-03
ES2963732T3 (es) 2024-04-01
CN104619848A (zh) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210112789A1 (en) Cell transfection method
CA3036926C (en) Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
AU2022252811A1 (en) Method for producing an animal comprising a germline genetic modification
CN111448318A (zh) 修饰在真核细胞中用于沉默基因表达的非编码rna分子的特异性的方法
US20040002077A1 (en) siRNA expression system and method for producing functional gene knock-down cell using the system
US20100105140A1 (en) Plaice dna transposon system
EP1462525A1 (en) siRNA EXPRESSION SYSTEM AND PROCESS FO RPRODUCING FUNCTIONAL GENE KNOCKDOWN CELL OR THE LIKE USING THE SAME
JP2010526542A (ja) インフルエンザの治療および予防
WO2018013759A1 (en) Poultry and offspring sex selection
JP2018534948A (ja) トリの卵におけるウイルスの生産
Jordan et al. Expression of green fluorescent protein in the chicken using in vivo transfection of the piggyBac transposon
CN107683336A (zh) 用于治疗乙型肝炎病毒(hbv)感染的试剂及其用途
WO2005054463A1 (ja) レトロトランスポゾンを用いた哺乳動物のゲノム改変技術の開発
Challagulla Precision engineering of the chicken genome for disease control
CN117042600A (zh) 具有经编辑的anp32基因的抗甲型流感动物
Jordan Utilizing the piggyBac transposon in transgenic chicken strategies
WO2021158883A1 (en) Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
WO2005070044A2 (en) Systems and methods for short rna expression
US20150010518A1 (en) Nr2e1 mini-promoters

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant