DE69738177T2

DE69738177T2 - Verbesserte nukleinsäuren, welche für eine chimäre glycosyltransferase kodieren

Info

Publication number: DE69738177T2
Application number: DE69738177T
Authority: DE
Inventors: Ian Farquhar Brunswick McKENZIE; Mauro Sergio Brunswick SANDRIN
Original assignee: Austin Research Institute
Current assignee: Austin Research Institute
Priority date: 1996-08-02
Filing date: 1997-08-01
Publication date: 2008-07-03
Anticipated expiration: 2017-08-02
Also published as: CA2233705A1; ATE374816T1; US7001998B2; DE69738177D1; EP0874900A4; US20070271621A1; US20010055584A1; EP0874900B1; EP0874900A1; JPH11512933A; WO1998005768A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche eine Glycosyltransferase kodieren und bei der Herstellung von Zellen und Organen aus einer Spezies, welche zur Transplantation in einen Empfänger einer anderen Spezies verwendet werden kann, nützlich sind. Genauer betrifft die Erfindung die Herstellung von Nukleinsäuren, welche, wenn sie in Zellen eines transplantierten Organs vorliegen, verringerte Spiegel von Antikörpererkennung des transplantierten Organs zur Folge haben.
Hintergrund der Erfindung
Die Transplantation von Organen ist nun wegen großer Fortschritte bei chirurgischen und anderen Verfahren durchführbar. Jedoch ist die Verfügbarkeit von geeigneten menschlichen Organen zur Transplantation ein wesentliches Problem. Die Nachfrage übertrifft das Angebot. Dieses hat Forscher veranlasst, die Möglichkeit des Verwendens von nichtmenschlichen Organen zur Transplantation zu erforschen.
Xenotransplantation ist die Transplantation von Organen von einer Spezies an einen Empfänger einer anderen Spezies. Abstoßung des Transplantats ist in solchen Fällen ein besonderes Problem, besonders wenn die Donorspezies weiter entfernt verwandt mit menschlichen Empfängern ist, wie Donororgane von Schweinen und Schafen. Gefäßorgane stellen eine besondere Schwierigkeit wegen der hyperakuten Abstoßung (HAR).
HAR tritt auf, wenn die Komplementärkaskade beim Empfänger durch Binden von Antikörpern an Donorendothelzellen initiiert wird.
Vorhergehende Versuche, HAR zu verhindern, haben sich auf zwei Strategien konzentriert: Modifizieren des Immunsystems des Wirts durch Hemmung der systemischen Komplementärerzeugung (1, 2) und Antikörperdepletion (3, 4). Es wurde gezeigt, dass beide Strategien das Xenotransplantatüberleben vorübergehend verlängern. Jedoch sind diese Verfahren therapeutisch dadurch uninteressant, dass sie klinisch unpraktisch sind, und würden chronische Immunsuppressivumbehandlungen erfordern. Deshalb haben sich neue Bemühungen, HAR zu hemmen, auf das genetische Modifizieren des Donorxenotransplantats konzentriert. Eine derartige Strategie musste eine Expression von Spezies-beschränkten menschlichen komplementären inhibitorischen Proteinen in vaskularisierten Schweinorganen mittels transgener Technik (5–7) auf hohem Niveau erreichen. Diese Strategie hat sich dadurch als nützlich erwiesen, dass sie verlängertes Überleben von Schweinegeweben im Anschluss an einen Immunitätstest mit Antikörpern und Serum zur Folge hat (5, 6). Obwohl erhöhtes Überleben der transgenen Gewebe beobachtet wurde, wurde ein langfristiges Überleben des Transplantats nicht erreicht (6). Wie in diesen Experimenten und auch mit systemischer Komplementärdepletion beobachtet wurde, scheint Organversagen mit akuter Antikörper-abhängiger Vaskulitis (1, 5) verwandt zu sein.
Zusätzlich zu den Strategien, die auf das Blockieren der Komplementäraktivierung auf der Gefäßendothelzelloberfläche des Xenotransplantats zielen, hat sich neue Aufmerksamkeit auf die Identifizierung des vorherrschenden xenogenen Epitops konzentriert, das durch natürliche Antikörper des Menschen im Hochtiterbereich erkannt wird. Es wird nun angenommen, dass der endständige Galactosylrest, Gal-α(1,3)-Gal, das vorherrschende xenogene Epitop ist (8–15). Dieses Epitop fehlt bei Primaten der Alten Welt und Menschen, weil die α(1,3)-Galactosyltransferase (Gal-Transferase oder GT) bei diesen Spezies nicht funktionell ist. DNA-Sequenzvergleich des menschlichen Gens mit α(1,3)-Galactosyltransferase-Genen der Maus (16, 17), des Rindes (18) und des Schweins (12) ließ erkennen, dass das menschliche Gen zwei Mutationen enthielt, die zu einer Leserasterverschiebung führen, was ein nicht funktionelles Pseudogen zur Folge hat (20, 21). Folglich weisen Menschen und Primaten der Alten Welt vorher vorhandene Hochtiterantikörper auf, die auf diese Gal-α(1,3)-Gal-Einheit als das vorherrschende xenogene Epitop gerichtet sind.
Eine Strategie, die entwickelt wurde, war wirksam, die Expression des vorherrschenden Gal-α(1,3)-Gal-Epitops stabil zu verringern. Diese Strategie machte sich eine intrazelluläre Konkurrenz zwischen der Gal-Transferase und α(1,2)-Fucosyltransferase (H-Transferase) um ein gewöhnliches Akzeptorsubstrat zunutze. Die Gal-Transferase katalysiert die Übertragung einer endständigen Galaktose-Einheit auf ein N-Acetyllactosamin-Akzeptorsubstrat, was die Erzeugung des endständigen Gal-α(1,3)-Gal-Epitops zur Folge hat. Andererseits katalysiert die H-Transferase die Übertragung eines Fucosylrests auf das N-Acetyllactosamin-Akzeptorsubstrat und erzeugt ein fucosyliertes N-Acetyllactosamin (H-Antigen, d. h. das Blutgruppe 0-Antigen), eine Glykosid-Struktur, die allgemeinhin toleriert wird. Obwohl berichtet wurde, dass die Expression von Mensch-H-Transferasetransfizierten Zellen Expression auf hohem Niveau des nichtantigenen H-Epitops zur Folge hat, und die Expression des Gal-α(1,3)-Gal-Xenoepitops erheblich verringerte, gibt es dort noch wesentliche Spiegel eines Gal-α(1,3)-Gal-Epitops, das auf derartigen Zellen vorliegt.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Hinblick auf das Vorhergehende ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Spiegel von nicht gewünschten Epitopen in Zellen, Geweben und Organen weiter zu verringern, welche bei einer Transplantation verwendet werden können.
Bei der Arbeit, die zur Erfindung führen, entdeckten die Erfinder überraschenderweise, dass die Aktivität einer H-Transferase durch das Herstellen einer Nukleinsäure weiter erhöht werden kann, welche eine katalytische Domäne einer H-Transferase kodiert, aber in der Zelle an einer Position verankert ist, an der sie besser in der Lage ist, um Substrat mit der Gal-Transferase zu konkurrieren. Obwohl sich die Arbeit durch die Erfinder auf eine chimäre H-Transferase konzentrierte, können auch andere Glycosyltransferaseenzyme gemäß der Erfindung produziert werden.
Demgemäß stellt in einer ersten Ausführungsform die Erfindung eine Nukleinsäure bereit, die ein chimäres Enzym kodiert, wobei das chimäres Enzym eine katalytische Domäne einer ersten Glycosyltransferase und ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase umfasst, wodurch, wenn die Nukleinsäure in einer Zelle exprimiert wird, das chimäre Enzym in einem Bereich der Zelle lokalisiert ist, in dem es in der Lage ist, mit einer zweiten Glycosyltransferase um das Substrat zu konkurrieren, was verringerte Spiegel eines Produkts von der zweiten Glycosyltransferase zur Folge hat.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure in einer isolierten Form; das heißt, die Nukleinsäure wird mindestens teilweise von anderen Nukleinsäuren oder Proteinen gereinigt.
Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure die korrekten Sequenzen zur Expression, stärker bevorzugt zur Expression in einer eukaryotischen Zelle. Die Nukleinsäure kann auf jedem geeigneten eukaryotischen Expressionsvektor, wie pcDNA (Invitrogen) vorliegen. Die Nukleinsäure kann auch auf anderen Trägersubstanzen vorliegen, ob für Eukaryoten geeignet oder nicht, wie Plasmide, Phagen und dergleichen.
Vorzugsweise ist die katalytische Domäne des ersten Glycosyltransferase von der H-Transferase und Sekretorsialyltransferase ausgewählt.
Die Nukleinsäuresequenz, die die katalytische Domäne kodiert, kann sich von einer Glycosyltransferase von irgendeiner Spezies ableiten oder ihr ähnlich sein. Vorzugsweise ist die Spezies eine Säugetierspezies, wie ein Mensch oder andere Primatenspezies, die Affen der Alten Welt einschließen, oder andere Säugetiere, wie Huftiere (zum Beispiel Schweine, Schafe, Ziegen, Kühe, Pferde, Rotwild, Kamele) oder Hunde, Mäuse, Ratten und Kaninchen. Der Begriff „ähnlich zu" bedeutet, dass die Nukleinsäure mindestens teilweise homolog zu den vorstehend beschriebenen Glycocyltransferase-Genen ist. Der Begriff erstreckt sich auch auf Fragmente der und Mutaten, Varianten und Derivaten der katalytischen Domäne, ob natürlich vorkommend oder künstlich.
Vorzugsweise leitet sich das Lokalisierungssignal von einer Glycosyltransferase ab, welche Glycosylierungsmuster erzeugt, welche durch einen Transplantatempfänger als fremd erkannt werden. Stärker bevorzugt leitet sich das Lokalisierungssignal von einer α(1,3)-Galaktosyltransferase ab. Die Wirkung davon ist, den Spiegel der Gal-α(1,3)-Gal herunterzuregulieren, die in einer Zelle produziert wird, wenn die Nukleinsäure durch die Zelle exprimiert wird.
Die Nukleinsäuresequenz, die das Lokalisierungssignal kodiert, kann sich von einer Spezies, wie solche, die vorstehend beschrieben wurden, ableiten. Vorzugsweise leitet sie sich von derselben Spezies ab, wie die Zelle, welche die Nukleinsäure transformieren soll, d. h. wenn Schweinezellen transformieren werden sollen, leitet sich das Lokalisierungssignal vorzugsweise vom Schwein ab.
Stärker bevorzugt umfasst die Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz, die die katalytische Domäne einer H-Transferase kodiert, und eine Nukleinsäuresequenz, die ein Lokalisierungssignal von der Gal-Transferase kodiert. Noch stärker bevorzugt leiten sich beide Nukleinsäuresequenzen von Schweinen ab. Noch stärker bevorzugt kodiert die Nukleinsäure das hier beschriebene gtHT.
Der Begriff „Nukleinsäure" bezieht sich auf jede Nukleinsäure, die natürliche oder synthetische Purine und Pyrimidine umfasst. Die Nukleinsäure kann DNA oder RNA, einzel- oder doppelsträngig oder kovalent geschlossen zirkular sein.
Der Begriff „katalytische Domäne" des chimären Enzyms bezieht sich auf die Aminosäuresequenzen, die für das Enzym erforderlich sind, um katalytisch zu arbeiten. Dieses umfasst eine oder mehrere angrenzende oder nichtangrenzende Aminosäuresequenzen. Andere nichtkatalytisch aktive Teile können im chimären Enzym auch eingeschlossen sein.
Der Begriff „Glycosyltransferase" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Fähigkeit, Kohlenhydrate von einem Molekül zu einem anderen zu verschieben.
Der Begriff „sich ableiten von" bedeutet, dass die katalytische Domäne auf einem nativen Enzym beruht oder ihm ähnlich ist. Die Nukleinsäuresequenz, die die katalytische Domäne kodiert, leitet sich nicht notwendigerweise direkt von dem nativen Gen ab. Die Nukleinsäuresequenz kann durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt, de novo konstruiert oder kloniert werden.
Der Begriff „Lokalisierungssignal" bezieht sich auf die Aminosäuresequenz einer Glycosyltransferase, welche für das Verankern von dieser in einer Position innerhalb der Zelle verantwortlich ist. Allgemein umfassen Lokalisierungssignale endständige „Aminoendstücke" des Enzyms. Die Lokalisierungssignale leiten sich von einer zweiten Glycosyltransferase ab, von deren Aktivität gewünscht ist, dass sie minimiert wird. Die Lokalisierung einer katalytischen Domäne eines ersten Enzyms im gleichen Bereich wie die zweite Glycosyltransferase bedeutet, dass es wahrscheinlich ist, dass die katalytische Domäne des ersten Enzyms auf das Substrat, das diesen Bereich erreicht, wirkt, was ermöglicht, dass die Menge an Substrat, das durch das zweite Enzym katalysiert wird, verringert wird.
Der Begriff „Bereich der Zelle" bezieht sich auf eine Region, ein Kompartiment oder Organell der Zelle. Vorzugsweise ist der Bereich der Zelle ein Sekretionsorganell, wie der Golgi-Apparat.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäure, die ein chimäres Enzym kodiert, wobei das Enzym eine katalytische Domäne einer ersten Glycosyltransferase und ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase umfasst, wodurch, wenn die Nukleinsäure in einer Zelle exprimiert wird, das chimäre Enzym in einem Bereich der Zelle lokalisiert ist, in dem es in der Lage ist, mit einer zweiten Glycosyltransferase um das Substrat zu konkurrieren, wobei das Verfahren das funktionsfähige Verbinden einer Nukleinsäuresequenz, die eine katalytische Domäne von einer ersten Glycosyltransferase kodiert, mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase kodiert, umfasst.
Der Begriff „funktionsfähiges Verbinden" bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenzen so ligiert werden, dass ein funktionelles Protein in der Lage ist, transkribiert und translatiert zu werden.
Der Fachmann weiß von verschiedenen Verfahren zum Herstellen der Nukleinsäure. Standardverfahren wie solche, die in Sambrook et al. beschrieben sind, können verwendet werden.
Vorzugsweise sind die Nukleinsäuresequenzen die vorstehend beschriebenen bevorzugten Sequenzen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Verringern des Spiegels eines Kohlenhydrats bereit, das auf der Oberfläche einer Zelle gezeigt wird, wobei das Verfahren das Bewirken umfasst, dass eine Nukleinsäure in der Zelle exprimiert wird, wobei die Nukleinsäure ein chimäres Enzym kodiert, welches eine katalytische Domäne einer ersten Glycosyltransferase und ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase umfasst, wodurch das chimäre Enzym in einem Bereich der Zelle lokalisiert ist, in dem es in der Lage ist, mit einer zweiten Glycosyltransferase um das Substrat zu konkurrieren, und wobei die zweite Glycosyltransferase in der Lage ist, ein Kohlenhydrat zu erzeugen.
Der Begriff „Verringern des Spiegels eines Kohlenhydrats" bezieht sich auf das Senken, Minimieren oder in einigen Fällen das Abschmelzen der Menge eines Kohlenhydrats, das auf der Oberfläche der Zelle angezeigt wird. Vorzugsweise ist das Kohlenhydrat in der Lage, die Erkennung der Zelle als „nichteigen" durch das Immunsystem zu stimulieren. Die Verringerung eines derartigen Kohlenhydrats macht deshalb die Zelle oder ein Organ, das aus den Zellen besteht, für das Immunsystem eines Empfängertieres in einer Transplantationssituation oder Gentherapiesituation annehmbarer.
Der Begriff „bewirken, dass eine Nukleinsäure exprimiert wird" bedeutet, dass die Nukleinsäure in die Zelle eingebracht wird (d. h. durch Transformation/Transfektion oder andere geeignete Mittel) und geeignete Signale enthält, um Expression in den Zellen zu erlauben.
Die Zelle kann jede geeignete Zelle sein, vorzugsweise von einem Säugetier, wie die eines Affen der Neuen Welt, Huftieres (Schwein, Schaf, Ziege, Kuh, Pferd, Rotwild, Kamel, usw.) oder anderer Spezies, wie Hunde.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Zelle von einer Spezies (der Donor) bereit, welche für eine andere Spezies (den Empfänger) durch Verringern der Spiegel eines Kohlenhydrats auf der Zelle immunologisch annehmbar ist, welches bewirkt, dass es durch die andere Spezies als nichteigen erkannt wird, wobei das Verfahren das Bewirken umfasst, dass eine Nukleinsäure in der Zelle exprimiert wird, wobei die Nukleinsäure ein chimäres Enzym kodiert, welches eine katalytische Domäne einer ersten Glycosyltransferase und ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase umfasst, wodurch das chimäre Enzym in einem Bereich der Zelle lokalisiert ist, in dem es in der Lage ist, mit einer zweiten Glycosyltransferase um das Substrat zu konkurrieren, und wobei die zweite Glycosyltransferase in der Lage ist, ein Kohlenhydrat zu erzeugen.
Der Begriff „immunologisch annehmbar" bezieht sich auf das Herstellen einer Zelle oder eines Organs, das aus mehreren Zellen besteht, welche nicht dasselbe Ausmaß der immunologischen Reaktion in der Empfängerspezies wie eine native Zelle von der Donorspezies verursacht. Folglich kann die Zelle eine verminderte immunologische Reaktion verursachen, die nur niedrige Spiegel einer Immunsuppressivumtherapie, um ein derartiges transplantiertes Organ aufrechtzuerhalten, oder keine Immunsuppressionstherapie erfordert.
Die Zelle kann von einer der vorstehend erwähnten Spezies sein. Vorzugsweise ist die Zelle von einem Affen der Neuen Welt oder von einem Schwein. Stärker bevorzugt ist die Zelle von einem Schwein.
Die Erfindung erstreckt sich auf Zellen, die durch das vorstehende Verfahren hergestellt werden, und auch auf die Organe, die die Zellen umfassen.
Die Erfindung erstreckt sich ferner auf nichtmenschliche transgene Tiere, die die Nukleinsäure der Erfindung beherbergen. Vorzugsweise ist die Spezies ein Mensch, Menschenaffe oder Affe der Alten Welt.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Proteine, die durch die Nukleinsäure hergestellt werden. Vorzugsweise liegen die Proteine in isolierter Form vor.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Expressionseinheit bereit, welche die Nukleinsäure der Erfindung exprimiert, was eine Zelle zur Folge hat, welche für ein Tier mit verringerten Spiegeln eines Kohlenhydrats auf seiner Oberfläche immunologisch annehmbar ist, deren Kohlenhydrat durch die Spezies als nichteigen erkannt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Expressionseinheit eine retrovirale Verpackungszelle, Kassette, ein retrovirales Konstrukt oder retrovirale Herstellerzelle.
Vorzugsweise ist die Spezies ein Mensch, Menschenaffe oder Affe der Alten Welt.
Die retroviralen Verpackungszellen oder retroviralen Herstellerzellen können Zellen jeden tierischen Ursprungs sein, wo es gewünscht ist, den Spiegel der Kohlenhydrate auf ihrer Oberfläche zu verringern, um sie für einen Wirt immunologisch annehmbarer zu machen. Derartige Zellen können sich von Säugetieren, wie Hund-, Nagetier- oder Wiederkäuerspezies und dergleichen ableiten.
Die retroviralen Verpackungs- und/oder Herstellerzellen können in Anwendungen, wie der Gentherapie, verwendet werden. Allgemeine Verfahren, die die Verwendung von derartigen Zellen einschließen, sind in PCT/US95/07554 und den darin besprochenen Bezugnahmen beschrieben.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen einer retroviralen Verpackungszelle oder einer retroviralen Herstellerzelle mit verringerten Spiegeln eines Kohlenhydrats auf ihrer Oberfläche, wobei das Kohlenhydrat durch eine Spezies als nichteigen erkannt wird, umfassend das Transformieren/Transfizieren einer retroviralen Verpackungszelle oder einer retroviralen Herstellerzelle mit der Nukleinsäure der Erfindung unter derartigen Bedingungen, dass das chimäre Enzym produziert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Schematisches Diagramm von normalen und chimären Glycosyltransferasen
Das Diagramm zeigt normale Glycosyltransferasen α(1,3)Galactosyltransferase vom Schwein (GT) und α(1,2)Fucosyltransferase vom Menschen (HT) und die chimären Transferasen ht-GT, bei welcher die zytoplasmatische Domäne von GT vollständig durch die zytoplasmatische Domäne von HT ersetzt worden ist, und gt-HT, bei welcher die zytoplasmatische Domäne von HT vollständig durch die zytoplasmatische Domäne von GT ersetzt worden ist. Die bildlich dargestellten Proteindomänen sind die zytoplasmatische Domäne CYTO, Transmembrandomäne TM, Stammregion STEM, katalytische Domäne CATALYTIC. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz der entsprechenden normalen Transferase.
2: Zelloberflächenfärbung von COS-Zellen, transfiziert mit normalen und chimären Transferasen
Zellen wurden mit normalem GT oder HT oder mit den chimären Transferasen gt-HT oder ht-GT transfiziert, und wurden 48 h später mit FITC-markiertem Lektin IB4 oder UEAI gefärbt. Positiv-gefärbte Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und gezählt. Die Ergebnisse sind von mindestens drei Wiederholungen, und die Werte sind +/– SEM.
3: RNA-Analyse von transfizierten COS-Zellen
Nothernblots wurden an Gesamt-RNA durchgeführt, die aus transfizierten COS-Zellen hergestellt wurde: Mock, mock-transfiziert; GT, transfiziert mit Wildtyp GT; GT1-6/HT, transfiziert mit der chimären Transferase gt-HT; GT1-6/HT + HT1-8/GT, co-transfiziert mit den beiden chimären Transferasen gt-HT und ht-GT; HT1-8/GT, transfiziert mit der chimären Transferase ht-GT; HT, transfiziert mit normaler HT; GT + HT, co-transfiziert mit den beiden normalen Transferasen GT und HT. Die Blots wurden mit einer cDNA, die GT (oberes Feld), HT (mittleres Feld) oder g-Actin (unteres Feld) kodiert, geprüft.
4: Enzymkinetik von normalen und chimären Glycosyltransferasen
Lineweaver-Burk-Diagramme für α(1,3)Galactosyltransferase(?) und α(1,2)Fucosyltransferase(?) zum Bestimmen der apparenten Km-Werte für N-Acetyllactosamin. Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, die gezeigten Diagramme sind von Mittelwerten der Enzymaktivität von Wildtyp-Transferasen, GT und HT, und den chimären Proteinen ht-GT und gt-HT in transfizierten COS-Zellextrakten unter Verwendung von Phenyl-B-D-Gal und N-Acetyllactosamin als Akzeptorsubstrate.
5: Färbung von Zellen, co-transfiziert mit chimären Transferasen
Zellen wurden mit cDNAs, die die normalen Transferasen GT + HT (Felder A, B) kodieren, mit den chimären Transferasen gt-HT + ht-GT (Felder C, D), mit HT + ht-GT (Felder E, F) oder mit GT + gt-HT (Felder G, H) co-transfiziert, und wurden 48 h später mit FITC-markiertem Lektin IB4 (Felder A, C, E, G) oder UEAI (Felder B, D, F, H) gefärbt.
6 ist eine Darstellung der Nukleinsäuresequenz und der entsprechenden Aminosäuresequenz von Schweinesekretor.
7 ist eine Darstellung der Nukleinsäuresequenz und der entsprechenden Aminosäuresequenz von Schwein-H.
8: Zelloberflächenfärbung einer Schweineendothelzelllinie (PIEC), transfiziert mit chimärer α(1,2)-Fucosyltransferase. Zellen wurden transfiziert, und Klone, die eine stabile Integration zeigten, wurden mit UEAI-Lektin gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.
9: Absuchen von chimärer α(1,2)-Fucosyltransferase in Mäusen. Mäusen wurde chimäre α(1,2)-Fucosyltransferase injiziert, und die Gegenwart der Transferase wurde durch Dotblots analysiert.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die Nukleinsäuresequenzen, die die katalytische Domäne einer Glycosyltransferase kodieren, können jede Nukleinsäuresequenz sein, wie solche, die in PCT/US95/07554 beschrieben sind, welche hier durch Inbezugnahme eingeführt wird, vorausgesetzt dass sie eine funktionelle katalytische Domäne mit der gewünschten Glycosyltransferase-Aktivität kodiert.
Bevorzugte katalytische Domänen der Glycosyltransferase schließen H-Transferase und Sekretor ein. Vorzugsweise beruhen diese auf Sequenzen des Menschen oder Schweins.
Die Nukleinsäuresequenzen, die das Lokalisierungssignal einer zweiten Transglycosylase kodieren, können jede Nukleinsäuresequenz sein, die eine Signalsequenz kodiert, wie Signalsequenzen, die in P A Gleeson, R D Teasdale & J Rourke, Targeting of Proteins to the Golgi apparatus. Glycoconjugate J. (1994) 11: 381–394, offenbart sind. Vorzugsweise ist das Lokalisierungssignal spezifisch für den Golgi-Apparat, stärker bevorzugt für den des trans-Golgi. Noch stärker bevorzugt beruht das Lokalisierungssignal auf dem der Gal-Transferase. Noch stärker bevorzugt beruht das Lokalisierungssignal auf Schweine-, Maus-oder Rindersequenzen. Noch stärker bevorzugt kodiert die Nukleinsäure eine Signalsequenz mit folgender Aminosäuresequenz (im Einbuchstabencode):
MNVKGR (Schwein), MNVKGK (Maus) oder MVVKGK (Rind).
Vektoren zur Expression des chimären Enzyms können jeder geeignete Vektor sein, wobei solche, die in PCT/US95/07554 offenbart sind, eingeschlossen sind.
Die Nukleinsäure der Erfindung kann verwendet werden, um Zellen und Organe mit dem gewünschten Glycosylierungsmuster durch Standardverfahren, wie solche, die in PCT/US95/07554 offenbart sind, herzustellen. Zum Beispiel können Embryos durch Standardverfahren, wie Mikroinjektion der Nukleinsäure in einer linearen Form in den Embryo (22), transfiziert werden. Die Embryos werden dann verwendet, um lebende Tiere herzustellen, deren Organe anschließend als Donororgane zur Implantation verwendet werden können.
Zellen, Gewebe und Organe, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, sind allgemein Säugetierzellen. Beispiele geeigneter Zellen und Gewebe, wie Endothelzellen, Leberzellen, Pankreaszellen und dergleichen, sind in PCT/US95/07554 bereitgestellt.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele beschrieben.
ABKÜRZUNGEN
Die verwendeten Abkürzungen sind bp, Basenpaar(e); FITC, Fluoreszinisothiozyanat; GT, Galaktosyltransferase; H-Stoff, α(1,2)Fucosyllactosamin; HT, α(1,2)Fucosyltransferase; PCR, Polymerase-Kettenreaktion;
Beispiel 1: Zytoplasmatische Domänen von Glycosyltransferasen spielen eine zentrale Rolle bei der temporären Aktivität von Enzymen
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Plasmide – die verwendeten Plasmide wurden unter Verwendung von Standardverfahren (7) hergestellt; pGT kodiert die cDNA für die α(1,3)Galactosyltransferase von Schwein (23), pHT kodiert die cDNA für die α(1,2)Fucosyltransferase (Mensch) (25). cDNAs von chimären Glycosyltransferasen wurden durch Polymerase-Kettenreaktion erzeugt, wie folgt: ein 1105 bp-Produkt ht-GT wurde unter Verwendung von Primern, die dem 5'-Ende von ht-GT entsprechen (5'-GCGGATCCATGTGGCTCCGGAGCC ATCGTCAGGTGGTTCTGTCAATGCTGCTTG-3'), die die Nukleotide 1–24 von HT (25) kodieren, unmittelbar gefolgt von den Nukleotiden 68–89 von GT (8), und die eine BamHI-Stelle enthalten (unterstrichen), und eines Primers erzeugt, der dem 3'-Ende von ht-GT entspricht (5'-GCTCTAGAGCGTCAGATGTTATTTCTAACCAAATTATAC-3'), der Komplementarität zu den Nukleotiden 1102–1127 von GT mit einer Xba1-Stelle stromabwärts der translationalen Stoppstelle (unterstrichen) enthält; ein 1110 bp-Produkt gt-HT wurde unter Verwendung von Primern, die dem 5'-Ende von gt-HT entsprechen (5'-GCGGATCCATGAATGTCAAAGGAAGACTCTGCCTGGCCTTCCTGC-3'), die die Nukleotide 49–67 von GT kodieren, unmittelbar gefolgt von den Nukleotiden 25–43 von HT, und die eine BamHI-Stelle enthalten (unterstrichen), und eines Primers erzeugt, der dem 3'-Ende von gt-HT entspricht (5'-GCTCTAGAGCCTCAAGGCTTAGCCAATGTCCAGAG-3'), der Komplementarität zu den Nukleotiden 1075–1099 von HT mit einer Xba1-Stelle stromabwärts der translationalen Stoppstelle (unterstrichen) enthält. Die PCR-Produkte wurden mit Restriktionsenzymen BamHI/XbaI geschnitten, im Gel gereinigt und in einen BamHI/XbaI gespalteten pcDNA1-Expressionsvektor (Invitrogen) ligiert und hatten zwei Plasmide pht-GT (die chimäre Glycosyltransferase ht-GT kodierend) und pgt-HT (die chimäre Glycosyltransferase gt-HT kodierend) zur Folge, welche durch Erstellen einer Restriktionskarte, Durchführen eines Southernblots und DNA-Sequenzierung gekennzeichnet wurden.
Transfektion und Serologie – COS-Zellen wurden in Dulbecco's modified Eagles Medium (DMEM) (Trace Biosciences Pty. Ltd., Castle Hill, NSW, Australien) gehalten und unter Verwendung von DEAE-Dextran (26) transfiziert (1–10 μg DNA/5 × 10⁵ Zellen); 48 h später wurden Zellen auf Zelloberflächenexpression von H-Stoff oder Gal-α(1,3)-Gal unter Verwendung von FITC-konjugierten Lektinen untersucht: IB4-Lektin, isoliert aus Griffonia simplicifolia (Sigma, St. Louis, MO), detektiert Gal-α(1,3)-Gal (27); UEAI-Lektin, isoliert aus Ulex europaeus (Sigma, St. Louis, MO), detektiert H-Stoff (28). H-Stoff wurde auch durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (mAb) detektiert, der für den H-Stoff (ASH-1952) spezifisch ist, der am Austin Research Institute entwickelt wurde, unter Verwendung eines FITC-konjugierten Ziege-Antimaus-IgG (Zymed Laborstories, San Francisco, CA), um die mAb-Bindung zu detektieren. Die Fluoreszenz wurde durch Mikroskopie detektiert.
RNA-Analysen – Zytoplasmatische RNA wurde aus transfizierten COS-Zellen unter Verwendung von RNAzol (Biotecx Laborstories, Houston, TX) hergestellt, und Gesamt-RNA wurde in einem 1% Agarosegel, das Formaldehyd enthält, elektrophoretisch getrennt, das Gel auf eine Nylonmembran geblottet und mit zufällig mit Primer gestarteter GT- oder HT-cDNA geprüft.
Glycosyltransferase-Analysen – Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen zweimal mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 1% Triton X-100/100 mM Cacodylat pH 6,5/25 mM MnCl₂, bei 4°C 30 Minuten lang lysiert; die Lysate wurden zentrifugiert und der Überstand gesammelt und bei –70°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradfordverfahren unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard (29) bestimmt. Analysen für die HT-Aktivität (30) wurden in 25 μl, die 3 mM [GDP¹⁴C]Fucose (spezifische Aktivität 287 mCi/mmol, Amersham International), 5 mM ATP, 50 mM MOPS pH 6,5, 20 mM MnCl₂ enthalten, unter Verwendung von 2–10 μl Zellextrakt (ungefähr 15–20 μg Protein) und einem Konzentrationsbereich (7,5–75 mM) des Akzeptors Phenyl-B-D-Galactosid (Sigma) durchgeführt. Die Proben wurden 2 h lang bei 37°C inkubiert und die Reaktionen durch Zugabe von Ethanol und Wasser beendet. Die Menge an eingebauter ¹⁴C-Fucose wurde nach Trennung von nichteingebauter Markierung unter Verwendung von Sep-Pak C18-Patronen (Waters-Millipore, Millford, MA) gezählt. GT-Analysen (31) wurden in einem Volumen von 25 μl unter Verwendung von 3 mM UDP[³H]-Gal (spezifische Aktivität 189 mCi/mmol, Amersham International), 5 mM ATP, 100 mM Cacodylat pH 6,5, 20 mM MnCl₂ und verschiedenen Konzentrationen (1–10 mM) des Akzeptors N-Acetyllactosamin (Sigma) durchgeführt. Die Proben wurden 2 h lang bei 37°C inkubiert und die Reaktionen durch Zugabe von Ethanol und Wasser beendet. Der ³H-Gal-Einbau wurde nach Trennung von nichteingebautem UDP[³H]-Gal unter Verwendung von Dowex I-Anionenaustauschersäulen (BDH Ltd., Poole, UK) oder Sep-Pak Accell plus QMA-Anionenaustauscher-Patronen (Waters-Millipore, Millford, MA) gezählt. Alle Analysen wurden in doppelter Ausführung durchgeführt, und zusätzliche Reaktionen wurden in Ermangelung von zugefügten Akzeptorenmolekülen durchgeführt, um die Berechnung von spezifischem Einbau von Radioaktivität zuzulassen.
ERGEBNISSE
Expression von cDNAs von chimärer α(1,3)Galactosylransferase und α(1,2) Fucosylransferase
Wir hatten vorher gezeigt, dass, wenn cDNAs, die α(1,3)Galactosylransferase (GT) und α(1,2)Fucosylransferase (HT) kodieren, getrennt transfiziert wurden, sie beide wirksam funktionieren konnten, was zur Expression der passenden Kohlenhydrate führt: Gal-α(1,3)-Gal für GT und H-Stoff für HT (32). Wenn jedoch die cDNAs für GT und HT zusammen transfiziert wurden, schien die HT dadurch „dominant" gegenüber der GT, dass die H-Stoffexpression normal war, aber Gal-α(1,3)-Gal verringert wurde. Wir schlossen triviale Gründe für diese Wirkung aus und waren der Meinung, dass die Lokalisierung der Enzyme der Grund sein kann. Folglich würde, wenn das HT-Lokalisierungssignal das Enzym in ein früheres zeitliches Kompartiment als GT brächte, es „erste Verwendung" des N-Acetyllactosamin-Substrats haben. Jedoch war eine derartige „erste Verwendung", wenn sie auftrat, nicht ausreichend, um GT ausreichend zu verringern. Zwei chimäre Glycosyltransferasen wurden unter Verwendung der PCR konstruiert, wobei die zytoplasmatischen Endstücke von GT und HT getauscht wurden. Die beiden konstruierten Chimäre sind in 1 gezeigt: ht-GT, welche aus dem endständigen zytoplasmatischen NH₂-Endstück von HT, der an der Transmembran angebracht ist, Stamm und katalytischen Domänen von GT bestand; und gt-HT, welche aus dem endständigen zytoplasmatischen NH₂-Endstück von GT, der an der Transmembran angebracht ist, Stamm und katalytischen Domänen von HT bestand. Die chimären cDNAs wurden in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNAI subkloniert und in Transfektionsexperimenten verwendet.
Die chimären cDNAs, die ht-GT und gt-HT kodieren, wurden anfänglich auf ihre Fähigkeit bewertet, Glycosyltransferase-Expression in COS-Zellen zu induzieren, wenn durch die Oberflächenexpression des geeigneten Zuckers unter Verwendung von Lektinen gemessen wird. 48 Stunden nach der Transfektion wurden COS-Zellen durch Immunfluoreszenz auf ihre Expression von Gal-α(1,3)-Gal und H-Stoff getestet (Tabelle 1 & 2). Die Färbung mit IB4 (lektinspezifisch für Gal-α(1,3)-Gal) in Zellen, die die Chimäre ht-GT exprimieren (30% der Zellen, die positiv gefärbt wurden), war von der der normalen GT-Färbung (30%) nicht zu unterscheiden (Tabelle 1 & 2). In ähnlicher Weise war die intensive Zelloberflächenfluoreszenz, die mit UEAI-Färbung (lektinspezifisch für H-Stoff) gesehen wird, in Zellen, die gt-HT exprimieren (50%), ähnlich zu der, die in Zellen, die Wildtyp-pHT exprimieren (50%), gesehen wird (Tabelle 1 & 2). Außerdem wurden ähnliche Spiegel von mRNA-Expression der Glycosyltransferasen GT und HT und chimären Glycosyltransferasen ht-GT und gt-HT in Nothern-Blots von Gesamt-RNA, die aus transfizierten Zellen isoliert wurden, gesehen (3). Folglich werden beide chimäre Glycosyltransferasen in COS-Zellen wirksam exprimiert und sind funktionell, tatsächlich gibt es keinen detektierbaren Unterschied zwischen den chimären und normalen Glycosyltransferasen.
Glycosyltransferase-Aktivität in Zellen, die mit chimären cDNAs transfiziert wurden, die ht-GT und gt-HT kodieren
Um zu bestimmen, ob das Tauschen der zytoplasmatischen Endstücke von GT und HT die Kinetik der Enzymfunktion änderte, verglichen wir die enzymatische Aktivität der chimären Glycosyltransferasen mit denen der normalen Enzyme in COS-Zellen nach Transfektion der relevanten cDNAs. Durch das Herstellen von Extrakten aus transfizierten COS-Zellen und das Durchführen von GT- oder HT-Enzymanalysen stellten wir fest, dass N-Acetyllactosamin sowohl durch GT als auch das chimäre Enzym ht-GT (4, Tafel A) über einen Bereich von Substratkonzentrationen von 1–5 mM galactosyliert wurde. Lineweaver-Burk-Diagramme zeigten, dass sowohl GT als auch ht-GT eine ähnliche apparente Michealis-Menten-Konstante von Km 2,6 mM für N-Acetyllactosamin aufweisen (4, Tafel B). Ferner waren sowohl HT als auch das chimäre Enzym gt-HT in der Lage, Phenyl-B-D-Galactosid über einen Bereich von Konzentrationen (7,5–25 mM) (4, Tafel C) mit einer ähnlichen Km von 2,3 mM (4, Tafel D), gemäß der berichteten Km von 2,4 mM für HT zu fucosylieren (25). Deshalb sind die chimären Glycosyltransferasen ht-GT und gt-HT in der Lage, N-Acetyllactosamin (ht-GT) und Phenyl-B-D-Galactosid (gt-HT) auf dieselbe Art und Weise wie die normalen Glycosyltransferasen zu verwenden, wobei folglich das Tauschen der zytoplasmatischen Domänen von GT und HT die Funktion dieser Glycosyltransferasen nicht ändert, und wenn das zytoplasmatische Endstück tatsächlich das Lokalisierungssignal ist, dann arbeiten beide Enzyme genauso mit dem GT-Signal wie mit dem HT-Signal.
Tauschen der zytoplasmatischen Domänen von GT und HT hat eine Umkehr der „Dominanz" der Glycosyltransferasen zur Folge
Die cDNAs, die die chimären Transferasen oder die normalen Transferasen kodieren, wurden gleichzeitig in COS-Zellen co-transfiziert, und nach 48 h wurden die Zellen entweder mit Lektin IB4 oder UEA1 gefärbt, um Gal-α(1,3)-Gal beziehungsweise H-Stoff auf der Zelloberfläche zu detektieren (Tabelle 1 & 5). COS-Zellen, die mit DNAs für ht-GT + gt-HT co-transfiziert wurden (5, Tafel C) zeigten 30% Zellen, die mit IB4 positiv angefärbt wurden (Tabelle 1), aber keine Färbung an Zellen, die mit cDNAs für GT + HT co-transfiziert wurden (3%) (5, Tafel A). Außerdem ergab Färbung für H-Stoff an der Oberfläche von ht-GT- + gt-HT-Co-Transfektanten sehr wenige Zellen, die positiv gefärbt wurden (5%) (5, Tafel D), verglichen mit der Färbung, die in Zellen gesehen wurde, die mit DNAs für die normalen Transferase GT + HT (50%) transfiziert wurden (5, Tafel B), d. h. die Expression von Gal-α(1,3) Gal dominiert nun gegenüber der von H. Klarerweise führte das Tauschen der zytoplasmatischen Endstücke von GT und HT zu einer vollständigen Umkehr in dem Glycosylierungsmuster, das mit den normalen Transferasen gesehen wird, d. h. die zytoplasmatischen Endstücksequenzen geben das Muster der beobachteten Kohlenhydratexpression vor.
Dass das Austauschen der zytoplasmatischen Endstücke von GT und HT die Dominanz der Kohlenhydrat-Epitope umkehrt, weist auf die Glycosyltransferasen hin, die innerhalb des Golgi relokalisiert werden. Um diese Frage anzusprechen, wurden Experimente mit cDNAs durchgeführt, die Glycosyltransferasen mit demselben zytoplasmatischen Endstück kodieren: COS-Zellen, die mit cDNAs transfiziert wurden, die HT + ht-GT kodieren, färbten sowohl mit UEAI (50%) als auch mit IB4 (30%) stark (Tabelle 1 & 5, Tafeln E, F), wobei der Unterschied beim Färben die Unterschiede bei der Transfektionswirksamkeit der cDNAs reflektiert. In ähnlicher Weise färbten Zellen, die mit cDNAs transfiziert wurden, die GT + gt-HT kodieren, auch positiv mit UEAI (50%) und mit IB4 (30%) (Tabelle 1 & 5, Tafeln G, H). Folglich führen Glycosyltransferasen mit demselben zytoplasmatischen Endstück zu einer gleichen Zelloberflächenexpression der Kohlenhydrat-Epitope, wobei keine „Dominanz" von einer Glycosyltransferase gegenüber der anderen beobachtet wird, und voraussichtlich scheinen die Glycosyltransferasen, die an derselben Stelle lokalisiert sind, in gleicher Weise um das Substrat zu konkurrieren.
In COS-Zellen waren die Spiegel der Transkription der cDNAs von chimären und normalen Glycosyltransferasen im Wesentlichen dieselben (3), und die Immunfluoreszenzmuster der COS-Zellen, die die chimären Glycosyltransferasen ht-GT und gt-HT exprimieren, zeigten das typische Färbemuster der Zelloberfläche Gal-α(1,3)-Gal beziehungsweise des H-Stoffs (Tabelle 1 & 2), wobei das Muster von dem der COS-Zellen, die normale GT und HT exprimieren, nicht unterscheidbar ist. Unsere Untersuchungen zeigten, dass die Km von ht-GT für N-Acetyllactosamin zu der Km von GT für dieses Substrat identisch war, in ähnlicher Weise war die Km von gt-HT für Phenyl-B-D-Galactosid ungefähr dieselbe wie die Km von HT für Phenyl-B-D-Galactosid (3). Diese Entdeckungen zeigen an, dass die chimären Enzyme in einer zytoplasmatischen Endstück-unabhängigen Art und Weise arbeiten, so dass die katalytischen Domänen völlig funktionell sind und in Übereinstimmung mit solchen von Henion et al. (23) sind, der zeigte, dass eine NH₂-endständige trunkierte Marmoset-GT (einschließlich Trunkierung der zytoplasmatischen und Transmembrandomänen) die katalytische Aktivität beibehielt, und bestätigte, dass die GT-Aktivität tatsächlich von der Sequenz der zytoplasmatischen Domäne unabhängig ist.
Wenn das Golgi-Lokalisierungssignal für GT und HT völlig innerhalb der zytoplasmatischen Domänen der Enzyme enthalten ist, dann sollte das Tauschen der zytoplasmatischen Endstücke zwischen den beiden Transferasen eine Umkehr der Reihenfolge der Glycosylierung erlauben. Die Co-Transfektion von COS-Zellen mit cDNA, die die chimären Glycosyltransferasen ht-GT und gt-HT kodiert, verursachte eine Umkehr der Färbung, die mit den Wildtyp-Glycosyltransferasen beobachtet wurden (5), was darlegt, dass die Reihenfolge der Glycosylierung durch Austauschen der zytoplasmatischen Endstücke geändert worden ist. Außerdem ließ die Co-Transfektion mit cDNA, die Glycosyltransferasen mit denselben zytoplasmatischen Endstücken (d. h. HT + ht-GT und GT + gt-HT) kodiert, gleiche Expression sowohl von Gal-α(1,3)-Gal als auch von H-Stoff entstehen (5). Die Ergebnisse bedeuten, dass die zytoplasmatischen Endstücke von GT und HT für die Lokalisierung und die Retention dieser beiden Enzyme innerhalb des Golgi ausreichend sind.
Bis heute sind nur etwa zwanzig von mindestens einhundert vorhergesagten Glycosyltransferasen kloniert worden und einige von diesen sind hinsichtlich ihrer Golgi-Lokalisierungs- und -Retentionssignale untersucht worden (34). Untersuchungen unter Verwendung der Elongationstransferase N-Acetylglucosaminyltransferase I (33–37), der Terminaltransferasen α(2,6)Sialyltransferase (24–26) und β(1,4)Galactosyltransferase (38-40) weisen auf Reste hin, die innerhalb des zytoplasmatischen Endstücks, der Transmembran- und flankierenden Stammregionen enthalten sind, die für die Golgi-Lokalisierung und -Retention kritisch sind. Es gibt mehrere Beispiele von Lokalisierungssignalen, die innerhalb der zytoplasmatischen Endstückdomänen der Proteine bestehen, die die KDEL und KKXX-Motive in Proteinen einschließen, die sich innerhalb des endoplasmatischen Reticulums (41, 42) befinden, wobei das letztere Motiv auch im cis Golgi befindlichen Protein ERGIC-53 (43) und in einem Dileucin-enthaltenden Peptidmotiv in dem Mannose-6-Phosphatrezeptor identifiziert worden ist, welches den Rezeptor von dem trans-Golgi-Netzwerk zu Endosomen (44) leitet. Diese Motive liegen nicht innerhalb der zytoplasmatischen Endstücksequenzen von HT oder GT oder in irgendeiner anderen berichteten Glycosyltransferase vor. Bis heute ist ein Lokalisierungssignal in Golgi befindlichen Glycosyltransferasen nicht identifiziert worden, und während es Übereinstimmung gibt, dass Transmembrandomänen in der Golgi-Lokalisierung wichtig sind, ist es ersichtlich, dass diese Domäne für die Lokalisierung aller Glycosyltransferasen nicht wesentlich ist, wie durch die Untersuchung von Munro (45) gezeigt, wo das Austauschen der Transmembrandomäne von α(2,6)Sialyltransferase in einem hybriden Protein mit einem Polyleucinstrang normale Golgi-Retention zur Folge hatte. Dandal und Colley (46) zeigten auch, dass Sequenzen in der Transmembrandomäne für die Golgi-Retention nicht wesentlich waren. Diese Untersuchung ist die erste zum Identifizieren von Sequenzanforderungen für die Lokalisierung von α(1,2)Fucosyltransferase und α(1,3)Galaktosyltransferase innerhalb des Golgi. Es wird vorweggenommen, dass andere Glycosyltransferasen ähnliche Lokalisierungsmechanismen aufweisen.
Beispiel 2: Verwendung von Sekretor bei der Konstruktion eines chimären Enzyms
Ein Konstrukt wird unter Verwendung der PCR und Subklonieren, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzeugt, so dass die Aminosäuren #1 bis #6 der α(1,3)-Galactosyltransferase vom Schwein (MNVKGR) die Aminosäuren #1 bis 5 des Schweinesekretors ersetzen (6). Die Konstrukte werden getestet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3: Verwendung von H-Transferase vom Schwein bei der Konstruktion eines chimären Enzyms
Ein Konstrukt wird unter Verwendung der PCR und Subklonieren, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzeugt, so dass die Aminosäuren #1 bis #6 der α(1,3)-Galactosyltransferase vom Schwein (MNVKGR) die Aminosäuren #1 bis 8 der H-Transferase vom Schwein ersetzen (7). Die Konstrukte werden getestet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 4: Erzeugung von Schweineendothelzellen, die eine chimäre α(1,2)Fucosyltransferase exprimieren
Die Schweineendothelzelllinie PIEC, die die chimäre α(1,2)Fucosyltransferase exprimiert, wurde durch Lipofektamintransfektion von pgtHT-Plasmid-DNA (20 μg) und pSV2NEO (2 μg) und Auswählen der stabilen Integration durch Wachsenlassen der transfizierten PIEC in Medien, die G418 (500 μg/ml; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) enthalten, erzeugt. Vierzehn unabhängige Klone wurden auf Zelloberflächenexpression von H-Stoff durch Färben mit UEA-1-Lektin untersucht. Es wurde festgestellt, dass > 95% der Zellen von jedem dieser Klone positiv ist. 8 zeigt ein typisches FACS-Profil, das für diese Klone erhalten wurde.
Beispiel 5: Erzeugung von transgenen Mäusen, die eine chimäre α(1,2)Fucosyltransferase exprimieren
Ein Nrul/Notl-DNA-Fragment, das die vollständige Länge der chimären α(1,2)Fucosyltransferase kodiert, wurde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion und des phHT-Plasmids unter Verwendung der Primer erzeugt:
5'-Primer, homolog zu 5'-UTR:
5'-TTCGCGAATGAATGTCAAAGGAAGACTCTG, bei welcher die unterstrichene Sequenz eine einzigartige Nrul-Stelle enthält;
3'-Primer, homolog zu 3'-UTR:
5'-GGCGGCCGCTCAGATGTTATTTCTAACCAAAT
die unterstrichene Sequenz enthält eine Notl-Stelle
Die DNA wurde auf Gelen gereinigt, elektroeluiert und in einen genomischen H-2Kb-Nrul/Notl-Schnitt enthaltenden Vektor subkloniert, der den Plasmidklon (pH-2Kb-gtHT) zur Folge hat, der das Gen der chimären α(1,2)Fucosyltransferase kodiert, das in Exon 1 des H-2Kb-Gens der Maus gerichtet kloniert wurde, was ein Transkript zur Folge hat, das an der H-2Kb-Transkriptionsstartstelle beginnt, was durch die gtHT-cDNA-Insertion weitergeht. Das Konstrukt wurde so konstruiert, dass die Translation beim Anfangscodon (ATG) der hHT-cDNA beginnen und am In-Phase-Stoppcodon (TGA) enden würde.
DNA wurde zur Mikroinjektion durch Spalten von pH-2Kb-hHT mit Xhol und Reinigung der H-2Kb-hHT-DNA vom Vektor durch elektrophoretische Trennung in Agarosegelen, gefolgt von der Extraktion mit Chloroform, und Ausfällung in Ethanol, um die DNA zu dekontaminieren, erzeugt. Injektionen in die Vorkernmembran von (57BL/6xSJL)F1-Zygoten wurden bei Konzentrationen zwischen 2–5 ng/ml durchgeführt und die Zygoten auf pseudoschwangere (C57BL/6xSJL)F1-Weibchen übertragen.
Die Gegenwart des Transgens in lebenden Nachkommen wurde durch Durchführen von Dotblots detektiert. 5 mg genomischer DNA wurde auf Nylonfilter übertragen und mit der Insertion von gtHT unter Verwendung von abschließendem Waschen bei 68°C in 0,1 × SSC/1% SDS hybridisiert. 9 zeigt die Ergebnisse des Testens von 12 lebenden Nachkommen, wobei zwei Mäuse das transgene Konstrukt in das Genom integriert haben. Die Expression eines transgenen Proteins wird durch Schätzen der Menge von UEAI-Lektin (spezifisch für H-Stoff) oder anti-H-mAb, die erforderlich ist, um rote Blutzellen von transgenen Mäusen zu hämagglutinieren, untersucht. Hämagglutination in dieser Analyse legt transgene Expression dar.

Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass, während die Erfindung zu Zwecken der Klarheit und der Verständlichkeit ziemlich ausführlich beschrieben worden ist, verschiedene Abwandlungen und Änderungen der Ausführungsformen und Verfahren, die hier beschrieben werden, durchgeführt werden können, ohne vom Schutzbereich des Erfindungsgedankens abzuweichen, der in dieser Beschreibung offenbart ist. EXPRESSION VON GAL-α(1,3)GAL UND H-STOFF DURCH COS-ZELLEN, DIE MIT cDNAs TRANSFIZIERT WURDEN, DIE NORMALE UND CHIMÄRE GLYCOSYLTRANSFERASEN KODIEREN TABELLE 1

COS-Zellen, die mit cDNA transfiziert wurden, die kodiert	IB4-positive Zellen in%	UEAI-positive Zellen in%
GT	30	0
HT	0	50
ht-GT	30	0
gt-HT	3	50
GT + HT	3	50
ht-GT + gt-HT	33	5
GT + gt-HT	30	30
GT + ht-GT	30	0
HT + ht-GT	30	30
HT + gt-HT	0	50
Mock	0	0

Transfizierte COS-Zellen wurden mit FITC-markiertem I84 (lektinspezifisch für Galα(1,3)Gal oder UEAI (lektinspezifisch für H-Stoff) gefärbt, und positiv gefärbte Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und gezählt. Die Ergebnisse sind von mindestens drei Wiederholungen.

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Sequenzliste

Claims

Nukleinsäure, die ein chimäres Enzym kodiert, wobei das chimäre Enzym eine katalytische Domäne einer ersten Glycosyltransferase und ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase umfasst, wodurch, wenn die Nukleinsäure in einer Zelle exprimiert wird, das chimäre Enzym in einem Bereich der Zelle lokalisiert ist, in dem es in der Lage ist, mit einer zweiten Glycosyltransferase um das Substrat zu konkurrieren, was verringerte Spiegel eines Produkts von der zweiten Glycosyltransferase zur Folge hat.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Lokalisierungssignal die katalytische Domäne lokalisiert, um dadurch der katalytischen Domäne zu ermöglichen, mit der zweiten Glycosyltransferase um ein Substrat zu konkurrieren.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei sich das Lokalisierungssignal von einer Glycosyltransferase ableitet, welche Glycosylierungsmuster erzeugt, welche von einem Transplantatempfänger als fremd erkannt werden.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Lokalisierungssignal den Aminoterminus der zweiten Glycosyltransferase umfasst.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei sich das Lokalisierungssignal von α(1,3)-Galactosyltransferase ableitet.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die erste Glycosyltransferase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer H-Transferase und Sekretorsialyltransferase.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die katalytische Domäne und das Lokalisierungssignal jeweils von einem Säugetier stammt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mensch, Primaten, Huftieren, Hunden, Mäusen, Ratten und Kaninchen.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei sich das Lokalisierungssignal von derselben Spezies ableitet, wie die Zelle, welche die Nukleinsäure transformieren soll.
Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend eine Sequenz, die die katalytische Domäne der H-Transferase kodiert und eine Nukleinsäuresequenz, die ein Lokalisierungssignal der Gal-Transferase kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 9, wobei sich die katalytische Domäne und das Lokalisierungssignal von Schweinen ableiten.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welche eine chimäre Transferase kodiert, umfassend eine α(1,2)-Fucosyltransferase, wobei die zytoplasmatische Domäne davon vollständig durch die zytoplasmatische Domäne der α(1,3)-Galactosyltransferase ersetzt ist.
Trägersubstanz, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Trägersubstanz nach Anspruch 12, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Expressionsvektor, Plasmid und Phagen.
Trägersubstanz nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, welche der Nukleinsäure ermöglicht, in Prokaryoten oder in Eukaryoten exprimiert zu werden.
Verfahren zum Herstellen einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend den Schritt des funktionsfähigen Verbindens einer Nukleinsäuresequenz, die eine katalytische Domäne von einer ersten Glycosyltransferase kodiert, mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase kodiert.
In vitro-Verfahren des Verringerns des Spiegels eines Kohlenhydrats, das auf der Oberfläche einer Zelle gezeigt wird, wobei das Verfahren bewirkt, dass eine Nukleinsäure in der Zelle exprimiert wird, wobei die Nukleinsäure ein chimäres Enzym kodiert, welches eine katalytische Domäne einer ersten Glycosyltransferase und ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase umfasst, wodurch das chimäre Enzym in einem Bereich der Zelle lokalisiert ist, in dem es in der Lage ist, mit einer zweiten Glycosyltransferase um das Substrat zu konkurrieren, und wobei die zweite Glycosyltransferase in der Lage ist, ein Kohlenhydrat zu erzeugen.
Verfahren zum Herstellen einer Zelle aus einer nichtmenschlichen Donorspezies, welche für eine Empfängerspezies durch Verringern der Spiegel eines Kohlenhydrats auf der Zelle immunologisch verträglich ist, welches bewirkt, dass es vom Empfänger als nichteigen erkannt wird, wobei das Verfahren umfasst, dass bewirkt wird, dass eine Nukleinsäure in der Zelle exprimiert wird, wobei die Nukleinsäure ein chimäres Enzym kodiert, welches eine katalytische Domäne einer ersten Glycosyltransferase und ein Lokalisierungssignal einer zweiten Glycosyltransferase umfasst, wodurch das chimäre Enzym in einem Bereich der Zelle lokalisiert ist, in dem es in der Lage ist, mit einer zweiten Glycosyltransferase um das Substrat zu konkurrieren, und wobei die zweite Glycosyltransferase in der Lage ist, ein Kohlenhydrat zu erzeugen.
Zelle, die mit einem Verfahren nach Anspruch 17 hergestellt wurde.
Nichtmenschliches Donororgan, das eine Zelle nach Anspruch 18 umfasst.
Nichtmenschliches transgenes Tier, Organ oder Zelle, umfassend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Expressionseinheit, welche eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11 exprimiert, wobei es eine Zelle, welche für einen Empfänger immunologisch verträglich ist, mit verringerten Spiegeln eines Kohlenhydrats auf ihrer Oberfläche, deren Kohlenhydrat vom Empfänger als nichteigen erkannt wird, zur Folge hat.
Expressionseinheit nach Anspruch 21, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer retroviralen Verpackungskassette, einem retroviralen Konstrukt oder einer retroviralen Herstellerzelle.
Verfahren zum Herstellen einer Expressionseinheit nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, wobei die Einheit verringerte Spiegel eines Kohlenhydrats auf ihrer Oberfläche aufweist, wobei das Kohlenhydrat von einer Spezies als nichteigen erkannt wird, umfassend das Transformieren/Transfizieren einer retroviralen Verpackungszelle oder einer retroviralen Herstellerzelle mit der Nukleinsäure der Erfindung unter derartigen Bedingungen, dass das chimäres Enzym produziert wird.