JP2010524644A - 内腔器官用の組織工学装置及び方法 - Google Patents

Abstract

層状に配置された内腔器官の一部に一致する生分解性高分子マトリックスの使用、細切組織組成物を得るための、複数の細胞集団を含む自己、同種又は異種組織の加工、マトリックスへの組織組成物の播種、播種された高分子マトリックスの患者への移植を含む、内腔器官又は組織構造を再構築、修復、増大又は置換するための組織工学装置及び方法を提供する。

Description

開示の内容

〔技術分野〕
本発明は、組織の再構築、修復、増大及び置換のための方法及び材料に関する。より具体的には、本発明は、内腔器官又は組織構造の少なくとも一部にぴったり一致するよう成形された生体適合性、生分解性、合成又は天然高分子マトリックスを含み、及び細切組織が播種された、移植可能な装置を使用する、患者の治療を提供する。

〔背景技術〕
ヒトの膀胱は、骨盤腔の前部に位置する筋結織膜嚢を構成する内腔器官である。膀胱は、尿の貯蔵所として機能し、この器官は尿を尿管を通して受容し、尿道を通して排泄する。ヒトでは、膀胱は、骨盤骨（恥骨結合）及び尿道の背後の骨盤に見られ、尿道は体の外へ出る。膀胱、尿管及び尿道は、尿の通常の可溶性物質に対して非透過性である粘液でコーティングされた尿路上皮細胞を含む、膜で覆われた筋肉構造を含むという点で、全て同様に構成されている。膀胱の三角部（膀胱三角）は、膀胱基部の粘膜の平滑な三角形の部分である。膀胱組織は、弾性かつ伸展（compliant）性であり、すなわち、膀胱はそれが収容する尿の量に応じて形状及び大きさが変化する。膀胱は、空であるときにしぼんだ風船に似ているが、尿の量が増加したときは、若干洋梨のような形状になり、腹腔に上昇する。

膀胱壁は、粘膜、粘膜下層及び排尿筋という、組織の３つの主要層を有する。尿路上皮細胞を含む粘膜は、最内層であり、移行細胞上皮から構成される。粘膜下層は、粘膜及びその基底膜の直下に位置する。それは、粘膜に栄養素を供給する血管及びリンパ節から構成され、リンパ節は老廃物の除去に役立つ。排尿筋は、膨張して尿を貯蔵し、収縮して尿を放出する平滑筋細胞の層である。

膀胱は、患者を悪化させる多くの疾患及び傷害にさらされる。例えば、膀胱の悪化は、感染症、新生物及び発生異常に起因する場合がある。膀胱の悪化はまた、例えば、自動車事故及びスポーツ傷害による外傷の結果として生じる場合もある。

合成及び天然由来の高分子を含む、多くの生体材料が、組織の再構築又は増大に使用されているが、膀胱の再構築に用いるのに申し分ないことが判明している材料はない。機械的、構造的、機能的又は生体適合性の問題により、大部分の試みは失敗している。永続的合成材料は、機械的破損及び結石形成に関連している。

凍結乾燥硬膜、脱上皮化腸管分節、及び小腸粘膜下層のような天然由来の材料もまた、膀胱置換のために提案されている。しかしながら、硬膜、腹膜及び胎盤で増大した膀胱、並びに、経時的な筋膜収縮が報告されている。脱上皮化腸管分節は、膀胱の再構築に用いるために適切に尿路上皮を被覆することが実証されているが、粘膜再生、分節線維症又はその両方について問題が残る。腸の分節の脱上皮化は粘膜の再生を導く場合があるが、一方粘膜及び粘膜下層の除去は腸分節の退縮を導く場合があることが示されている。

膀胱の手術のために特定の胃腸の部位を用いることに関して、結石形成、過剰な粘液産生、異常増殖、感染、代謝障害、長期拘縮及び吸収を含む、他の問題も報告されている。これらの試みは、尿路上皮の透過性機能の置換が容易ではないことを示している。

膀胱の再構築のために胃腸の部位を用いることに関連する複数の合併症のために、代替の解決法が求められている。最近の外科的アプローチは、自家膀胱拡張術及び尿管膀胱形成術を含む、再構築のための天然の泌尿器組織に依存している。しかしながら、膀胱自家拡張術の長期的結果は失望的なものであり、尿管膀胱形成術は、拡張した尿管が既に存在する場合に限られる。尿管及び膀胱の進行性拡張のシステムが提案されているが、臨床的には試みられていない。漿膜筋層グラフト及び脱上皮化腸管分節は、単独で又は天然尿路上皮上でまた試みられている。しかしながら、グラフトの縮み及び初期脱上皮化腸管分節の再上皮化という問題が繰り返し起こる。

膀胱の再構築を取り巻くある重大な制限は、提供者の組織の利用可能性に直接関係する。膀胱組織の利用可能性が制限されると、正常膀胱組織を用いる常習的、日常的な膀胱の再構築が妨げられる。利用可能であり、使用可能であると考えられる膀胱組織は、それ自体が固有の欠陥及び疾患を含む場合がある。例えば、膀胱癌に罹患している患者では、残りの膀胱組織にも転移癌が混入している場合がある。患者は、したがって、膀胱機能が完全ではないことが運命づけられている。

〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、当該技術分野では、膀胱のような内腔器官又は組織構造の再構築、修復、増大及び置換のための、改良された方法及び材料に対する必要性が存在する。先行技術の欠点は、本発明により克服される。

〔課題を解決するための手段〕
本発明の実施形態は、層状に配置された内腔器官の一部に一致する生分解性高分子マトリックスを提供する工程と、複数の細胞集団を含む自己、同種又は異種組織を得る工程と、組織を加工して、細切（minced）組織組成物を得る工程と、マトリックスに組成物を播種する工程と、患者に、播種された高分子マトリックスを移植する工程と、を含む、器官を再構築する方法に関する。

本発明の実施形態は、層状に配置された内腔器官の一部に一致する生分解性高分子マトリックスを提供する工程と、複数の細胞集団を含む自己、同種又は異種組織を得る工程と、組織を加工して、第１の細切組織組成物及び第２の細切組織組成物を得る工程と、マトリックスの第１領域に第１の細切組織組成物を播種し、マトリックスの第２領域に第２の細切組織組成物を播種する工程と、患者に、播種された高分子マトリックスを移植する工程と、を含む、器官を再構築する方法に関する。

本発明の更に別の実施形態は、層状に配置された内腔器官の一部に一致する、移植可能な生分解性高分子マトリックスを含む、器官の再構築装置であって、前記マトリックスに、複数の細胞集団を含む細切自己、同種又は異種組織を含む、加工された組織組成物を播種することができる装置に関する。

本発明のいくつかの特徴及び利点は、特定の好ましい実施形態の図面を参照して説明され、これは本発明を例示するものであって、限定するものではない。
正常ヒト膀胱の解剖学的構造図。 本発明の細切組織組成物で用いることができる種々の細胞型の組織層の図。 膀胱の細切組織から吸収性スキャホールドへの尿路上皮及び平滑筋細胞の細胞移動、分布及び組織化を示す図。矢印（１）は、尿路上皮細胞塊及び層を指し、矢印（２）は、尿路上皮細胞の周りの平滑筋様細胞の組織化を指し、星は新たに組織化された尿路上皮及び平滑筋構造内の腔を指す。 膀胱の細切組織から吸収性スキャホールドへの尿路上皮及び平滑筋細胞の細胞移動、分布及び組織化を示す図。矢印（１）は、尿路上皮細胞塊及び層を指し、矢印（２）は、尿路上皮細胞の周りの平滑筋様細胞の組織化を指し、星は新たに組織化された尿路上皮及び平滑筋構造内の腔を指す。 膀胱の細切組織から吸収性スキャホールドへの尿路上皮及び平滑筋細胞の細胞移動、分布及び組織化を示す図。矢印（１）は、尿路上皮細胞塊及び層を指し、矢印（２）は、尿路上皮細胞の周りの平滑筋様細胞の組織化を指し、星は新たに組織化された尿路上皮及び平滑筋構造内の腔を指す。

本発明は、本明細書に記載する具体的な方法論、プロトコル等に限定されるものではなく、それ自体変化できることを理解すべきである。本明細書で用いられる専門用語は、具体的な実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は請求項によってのみ定義される。

本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に明示しない限り、複数のものを含む。したがって、例えば、細胞（a cell）に対する言及は、特に明示しない限り、当業者にとって既知である等価物を含む、１つ又はそれ以上のこのような細胞への言及であってよい。特に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語は、本発明が関連する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。操作例又は特に指示する場合を除き、本明細書で使用する成分の量又は反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」により修飾されると理解されるべきである。百分率に関連して用いられるとき、用語「約」は±１％を意味する場合がある。

確認された全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本発明に関連して用いる場合のあるこのような刊行物で記載された方法論を、説明及び開示する目的のために、参照することにより本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日前の開示のみ提供される。この点では、本発明者らが、先行技術によって又は任意の他の理由のために、このような開示に先行する資格のないことを、承認するものとして解釈するべきものはない。日付についての全ての記述又はこれらの文書の内容についての表現は、出願人らに利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さについていかなる承認も得ていない。

本発明は、異なる細胞型の層状分離を示し、一般的な内腔形状を保持する必要を有する成形中空器官又は組織構造の、再構築、修復、又は置換のための方法及び材料を提供する。器官又は構造に伸展性又は収縮特性を付与するために、平滑筋細胞層を含有している内腔器官又は組織構造は、本発明の方法及び装置に特によく適している。

本発明の適用に好適な内腔器官の１例は膀胱であり、これは尿路上皮組織を含む第１細胞型の内層、粘膜下層の中間層、及び平滑筋組織を含む第２細胞型の外層を有する。この組織化はまた、腎盂尿管及び尿道のような他の泌尿生殖器器官及び組織構造にも存在する。層状に配置された器官又は組織は、管状組織を含む、薄層で構成された又は薄層に配置された任意の器官又は組織を指す。本発明が標的とする他の好適な層状に組織化された内腔器官、組織構造又は管状組織としては、精管、卵管、涙管、気管、胃、腸、脈管構造、胆管、エジャクラトルイス管（ductus ejaclatoruis）、精巣上体管、耳下腺管、尿管、尿道及び外科的に作製された分路が挙げられる。

本発明は、膀胱外反症、膀胱の容積不足、膀胱の部分切除又は全膀胱切除後の膀胱の再構築、外傷により損傷を受けた膀胱の修復等のような状態の治療に好適である場合がある。

本明細書では、膀胱の再構築、修復、増大及び置換に関して言及するが、本発明の方法及び装置は、患者の種々の組織又は器官の再構築、修復、増大及び置換に有用であることが理解されよう。したがって、例えば、膀胱、尿管、尿道、腎盂等のような器官又は組織は、適切な細切組織を播種した高分子マトリックスで再構築、修復、増大又は置換することができる。本発明の装置及び方法は更に、導管組織（例えば、ズドラハーラ（Zdrahala）Ｒ．、ジャーナル・オブ・バイオマテリアルス・アプリケーションズ（J.Biomater.Appl.）１０巻４号：３０９頁〜２９頁（１９９６年）を参照のこと）、腸組織、胃（例えば、ローランサン（Laurencin）Ｃ．Ｔ．ら、ジャーナル・オブ・バイオマテリアルス・リサーチ（Biomed.Mater.Res.）３０巻２号：１３３頁〜３８頁（１９９６年）を参照のこと）等の再構築、修復、増大及び置換に適用することができる。治療を受けるべき患者は、器官又は組織構造の再構築、修復、増大及び置換を必要とする、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ又はヒトのような任意の種の哺乳類であってよい。

本発明の細切組織の源は、再構築、修復、増大及び置換されることを意図するのと同じ又は異なる組織起源であってよい。例えば、細切組織は、膀胱組織の再構築、修復、増大及び置換を容易にするために、尿道組織由来であってよい。例えば、膀胱及び尿道組織のような、内腔器官の形態学的類似は、当該技術分野で既知であり（ダス（Dass）ら、ザ・ジャーナル・オブ・ウロロギー（J.Urol.）、１６５巻、１２９４頁〜１２９９頁（２００１年）を参照のこと）、尿道の再構築における膀胱組織の使用はＡ．アタラ（Atala）、４（補足６）アメリカン・ジャーナル・オブ・トランスレーション（Am.J. of Transplantation）５８７３（２００４年）に報告されている。

先程述べたように、膀胱の再構築を取り巻くある重大な制限は、提供者の組織の利用可能性に直接関係する。膀胱組織の利用可能性が制限されると、正常膀胱組織を用いる常習的、日常的な膀胱の再構築が妨げられる。利用可能であり、使用可能であると考えられる膀胱組織は、それ自体が固有の欠陥及び疾患を含む場合がある。例えば、膀胱癌に罹患している患者では、残りの膀胱組織にも転移癌が混入している場合がある。患者は、したがって、膀胱機能が完全ではないことが運命づけられている。

結果として、他のものは、平滑筋細胞及び尿路上皮細胞が生検により単離され、インビトロで別々に培養され、次いで膀胱基質上に添加される、細胞培養アプローチ（アタラ（Atala）ら）を試みている。しかしながら、組織工学によって作製されたスキャホールドを次に移植する前に、患者は少なくとも８週間待たなければならず、このプロセスは長く、時間がかかる。他の組織もまた、例えば、頬側組織の膀胱増大のための細胞の源として評価されている。エル−シャービニー（El-Sherbiny）ら、「尿道欠損の治療：皮膚、頬側又は膀胱粘膜、管又はパッチ？ イヌにおける実験研究（Treatment of Urethral Defects: Skin, Buccal or Bladder Mucosa, Tube or Patch? An Experimental Study in Dogs）ザ・ジャーナル・オブ・ウロロギー（J.Urol.）、１６７巻、２２２５頁〜２２２８頁（２００２年）を参照のこと。

本発明の方法は、修復、再構築、増大又は置換される膀胱の一部又は全てとして使用するのに適合するよう成形された生体適合性の合成又は天然高分子マトリックスを提供する。生体適合性材料は、生物学的機能に対する毒性作用又は障害作用を有しない、任意の物質である。本明細書で使用するとき、用語「合成高分子」は、たとえ高分子が天然由来の生体材料から製造された場合でも、天然では見られない高分子を指す。用語「天然高分子」は、天然由来の高分子を指す。成形された合成又は天然高分子マトリックスは、好ましくは、多孔質であって、マトリックスの孔上又は孔内の両方への細胞付着及び移動を可能にする。凍結乾燥された発泡体、不織布のスキャホールド、又はメルトブローンスキャホールドのような、種々のスキャホールド材料から作製することができる。

凍結乾燥又はフリーズドライは、昇華を通して高分子−溶媒溶液から溶媒を除去し、多孔質体を残す。より具体的には、このプロセスは、固体から気体への相転移を通して、凍結した溶液から溶媒を分離する。昇華と呼ばれる、この転移は、絶対にそれが液体状態に入ることなく、溶媒を除去する。最終的な構造物は、発泡体と記載されることの多い、残りの溶質から作製された多孔質固体構造である。

昇華を通して除去することができる溶媒に溶解した、任意の天然又は合成生体適合性、生分解性高分子、又はこのようなポリマーの任意のブレンドを含む液体溶液を、開放型、蝶番式成形型に注ぎ、凍結の間機械的に回転させる。第１工程では、成形型を蝶番式に閉じ、部分的に溶液を満たす。注入中、成形型の体積の一部は空のままである。凍結乾燥後、成形型に注がれた溶液の体積は、スキャホールドの容積を構成し、一方空の体積が中空孔隙を構成する。注入後、成形型は多くの方法で回転してよい。成形型を垂直に保持し、速やかに回転させるとき、液体溶液に遠心力が作用し、それを成形型の中心から押しのけ、その側面上に押し上げる。回転している成形型を、次いで、ゆっくり冷却するか又は液体窒素中での潜水により急速冷凍する。成形型はまた、水平に保持し、ゆっくり回転させることで、重力により高分子を成形型の片側上に定着させることができる。成形型の温度は周囲空気の温度より低いと仮定され、凍結した液体の層は成形型の内部で徐々に増加し、内部凍結皮膚（skin）が得られる。両方の方法は、成形型の内部形状に一致する形状及び質感を有する凍結した構造物を製造する。一旦完全に凍結すると、構造物を昇華のために真空中に定置する。

種々の吸収性高分子を用いて発泡体を製造することができる。用いることができる好適な生体適合性、生体吸収性高分子の例としては、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、シュウ酸ポリアルキレン、ポリアミド、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含有するポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン（polyphosphzenes）、生体分子（すなわち、コラーゲン、エラスチン、生体吸収性デンプン等のような生体高分子）及びこれらのブレンドからなる群から選択される高分子が挙げられる。

好適な溶媒としては、ギ酸、ギ酸エチル、酢酸、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、環状エーテル（すなわち、ＴＨＦ、ＤＭＦ及びＰＤＯ）、アセトン、Ｃ₂〜Ｃ₅アルコールの酢酸塩（酢酸エチル及びｔ−ブチルアセテートのような）、グリム（すなわち、モノグリム、エチルグリム、ジグリム、エチルジグリム、トリグリム、ブチルジグリム及びテトラグリム）、メチルエチルケトン、ジプロピレングリコールメチルエーテル、ラクトン（γ−バレロラクトン、δ−バレロラクトン、β−ブチロラクトン、γ−ブチロラクトン）、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、１，３−ジオキソラン−２−オン（エチレンカーボネート）、ジメチルカーボネート、ベンゼン、トルエン、ベンジルアルコール、ｐ−キシレン、ナフタレン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、１，２−ジクロロメタン（duchloromethane）、モルホリン、ジメチルスルホキシド、ヘキサフルオロアセトンセスキ水和物（ＨＦＡＳ）、アニソール及びこれらの混合物からなる群から選択される溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒中の高分子の均質な溶液は、標準的な技術を用いて調製される。

当業者には明らかであるように、適用可能な高分子濃度又は利用してよい溶媒の量は、各システムによって変動する。いくつかのシステムでの好適な相図の曲線は既に作成されている。しかしながら、適切な曲線が利用可能でない場合、これは既知の技術により容易に作成することができる。高分子の量は、所与の溶媒中の高分子の可溶性及び所望の発泡体の最終特性に大幅に依存する。

発泡体構造を制御するために用いてよいパラメータは、高分子−溶媒溶液の凍結速度である。凍結工程中に閉じ込められる孔の形態の種類は、溶液熱力学、凍結速度、それを冷却する温度、溶液濃度、同種又は異種核形成等の関数である。このような相分離現象の詳細な説明は、本明細書に提供された参考文献中に見い出すことができる。Ａ．Ｔ．ヤング（Young）、「相分離を介した微孔性発泡体（Microcellular foams via phase separation）、ザ・ジャーナル・オブ・バキューム・サイエンス・アンド・テクノロジーＡ（J.Vac.Sci.Technol.A）４巻３号、５月／６月号、１９８６年；Ｓ．マツダ（Matsuda）、「溶液からの多孔質高分子膜の形成の熱力学（Thermodynamics of Formation of Porous Polymeric Membrane from Solutions）」、ポリマージャーナル（Polymer J.）２３巻５号、４３５〜４４４頁、１９９１年を参照のこと。

発泡体スキャホールドはまた、成形型の一部が中空部からなり、別の部分がコアからなる、２段階成形型により構築してもよい。この設計は、典型的な射出成形プロセスで用いられるものと類似している。溶液は、空洞とコアの間のすき間を介して注入することができる。すき間は、完成構築物の厚さにより決定することができる。一旦注入が完了すると、溶液を上記工程により凍結することができる。

本発明の他の実施形態は、不織布スキャホールドを含んでよい。好ましい不織布材としては、繊維、長繊維、又はフィルム様長繊維状構造の格子層（interlocking layer）又は網様構造により製造される可撓性多孔質構造が挙げられる。このような不織布材は、予め調製されたウェブから形成することができる／所望の構造の配置された網様構造に加工された繊維、長繊維、又はフィルムを形成することができる。

一般に、不織布材は、表面を形成する又は輸送するときに、構成要素（通常は繊維）を配置することにより形成される。これらの構成要素は、乾燥、湿潤、急冷又は溶融状態にあってよい。したがって、乾式、湿式、又は押出成形系不織布の形であることができ、又はこれらの種類の不織布のハイブリッドを形成することができる。不織布を製造できる繊維又は他の材料は、典型的には、合成又は天然由来の高分子である。

乾式スキャホールドとしては、ガーネッティング（garneting）、カーディング、及び／又は乾燥状態で空気力学的に操作する乾燥繊維によって形成される不織布を挙げることができる。更に、湿式不織布は、移動している運搬装置のような、表面上に沈着された繊維含有スラリーから形成してよい。不織布ウェブは、水性成分の除去及び繊維の乾燥後に形成することができる。押出成形系不織布としては、スパンボンド繊維、メルトブローン繊維及び多孔質フィルムシステムから形成されるものを挙げることができる。これらの不織布のハイブリッドは、種々の積層技術により異なる種類の不織布の１層又はそれ以上を組み合わせることにより形成することができる。不織布はまた、織布、メリヤス生地又はメッシュ生地で強化してもよい。

本発明の不織布は、好ましくは、増大している膀胱を修復するために理想的な機械的特性を得るよう設計された密度を有する。密度は、フェルト寸法（長さ及び幅）を決定する、例えば、各方向で２つの測定値を得て、各不織布フェルトの平均長さ及び幅を算出することにより測定してよい。トリムされたフェルトの重量を測定し、重量を記録してよい。各不織布フェルトの平均厚さは、シャーリー計測器（Shirley gauge）を用いて得てよい。密度は以下の式により算出してよい：
密度＝（フェルトの重量（Ｗ）（グラム））／（長さ×幅（ｃｍ²））＝（（Ｗ×１０００（ｍｇ／ｃｍ²））／（（厚さ（ｍｍ））／１０（ｍｍ／ｃｍ））

更に、スキャホールドは、メルトブローン技術を用いることにより製造してよく、それにより溶融高分子樹脂から製造された繊維質ウェブは、ポロゲン（porogen）の存在下で、回転している折り畳める物体上に紡糸口金（spinnarette）から押出成形される。折り畳める物体を、回転又は他の方法で移動させ、それにより層に押出成形された高分子のコーティング自体を折り畳める物体上で実質的に均等にすることができる。表面を連続回転させると、より多くの高分子が沈着するため、次第に厚い又は濃い層が作製される。折り畳める物体を使用することにより、継ぎ目のない、３次元形状の高分子ウェブを作製する。具体的には、完成品は、崩壊した形状のものが除去されている、単一の出口を備える中空形状であってよい。より複雑な形状は、メルトブローン長繊維の特定の形状への成形を導く成形型又はマンドレルのような、好適に成形された用具を用いることにより達成できる。この方法は、米国特許出願第１１／８５６，７４３号にキーリー（Keeley）らにより詳細に説明されている。

メルトブローン技術は、ＰＧＡ、ＰＬＡ又はそのそれぞれのコポリマーのような合成生体高分子、及び天然高分子を組み込むことができる。いずれかの材料で構築されるスキャホールドは、生体適合性かつ再吸収可能であるが、細胞の最適な増殖又は進行した組織の内部成長を容易にするのに十分なほど多孔質ではない場合がある。この障害を克服するために、不織布ウェブの製作中にポロゲンを添加してもよい。塩又はグルコース球体のようなポロゲンを、押出成形中溶融繊維上に散布する又は吹きつけることができる。ゼラチン小球体を用いることもできる。得られるスキャホールドの多孔性は、添加されるポロゲンの量により制御でき、一方孔径は球体の大きさに依存する。これらの粒子が悪気流に入るとき、それらはウェブにランダムに組み込まれる。メルトブローン構造中の長繊維は典型的には、時間と共に結晶化により縮むため、多孔質構造は所定の位置でポロゲン材料と共にアニーリング加工を受けてよい。一旦ポロゲン−繊維複合体がアニールされると、次いで、ポロゲンが溶解する又はウェブから浸出するように、構築物全体を水に浸漬してよい。得られるマトリックスは、高分子繊維を含有するが、それらの間の距離の増加は多孔率に影響を与える。１つの実施形態では、マトリックスは、より多くのポロゲンを有し、それ故より高い多孔率を有し、多孔率は９０％を超える。

生体適合性、生分解性スキャホールドを形成するために用いられる高分子又は高分子ブレンドはまた、薬剤組成物を含有してもよい。既に記載した高分子は、スキャホールドの形成前に１種又はそれ以上の薬剤と混合してよい。あるいは、このような薬剤組成物は、スキャホールドが形成された後に、スキャホールドをコーティングしてよい。本発明のスキャホールドと併用できる種々の薬剤としては、当該技術分野で既知である任意のものが挙げられる。広くは、本発明の組成物を介して投与してよい薬剤及び／又は生物製剤としては、抗生物質及び抗ウイルス剤のような抗感染薬；化学療法剤；拒絶反応抑制剤；鎮痛剤及び鎮痛剤の組み合わせ；抗炎症剤；ステロイドのようなホルモン；成長因子；及び天然由来若しくは遺伝子操作された（組み換え）タンパク質、多糖類、糖タンパク質、又はリポタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

これらの材料を含有するスキャホールドは、１種又はそれ以上の剤を、スキャホールドを作製するために用いられる高分子、又は溶媒、又は高分子−溶媒混合物と混合することにより、配合してよい。あるいは、好ましくは製薬上許容できる担体と共に、スキャホールド上に剤をコーティングすることができる。実質的にスキャホールドを分解しない任意の薬剤担体を用いてよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体又は任意の他の適切な物理的形として存在してよい。典型的には、しかし所望により、それらは、希釈剤、担体、賦形剤、安定剤等のような１種又はそれ以上の添加剤を含む。更に、抗体、細胞接着因子、成長因子等のような種々の生体化合物を用いて、最適な送達剤（例えば、薬剤又は他の生体因子）を本発明のスキャホールドに接触及び／又は結合させてよい。

合成高分子は、使用前にインビトロで改変することもでき、増殖及び分化を促進する、ペプチド及びステロイドホルモンのような成長因子及び他の生理学的剤を運ぶことができる。ポリグリコール酸高分子は、４ヶ月間にわたって生分解を受け、それ故細胞送達賦形剤として、移植された細胞の集団を拡大することにより、組織構造の全体の形（gross form）が、高分子のその後の置換と共に、移植前にインビトロで再構築されるのを可能にする。

高分子マトリックスは、任意の数の所望の形体に成形されて、任意の数の全体のシステム、形状又は空間の制限を満たすことができる。例えば、膀胱の再構築のための高分子マトリックスの使用では、マトリックスは、膀胱の全体又は一部の寸法及び形状に一致するように成形してよい。更に、高分子マトリックスは、異なる大きさの患者の膀胱に一致するよう、異なる大きさ及び形状に成形してよい。所望により、高分子マトリックスは、生分解後に、得られる再構築された膀胱が、天然の膀胱に類似した方式で、空になったとき、折り畳めるように、成形すべきである。高分子マトリックスはまた、他の様式で成形して、患者の特殊な要求に対応することもできる。例えば、既に傷害を受けている患者又は障害を持った患者は、異なる腹腔を有する場合があり、また再構築された膀胱を適応させてそれに適合させる必要がある場合もある。更に、高分子マトリックスが一致できる、層状に配置された内腔器官の一部は、比較的小さくてよい。例えば、７０〜８０％、又はそれ以上の内腔器官を、本発明の方法及び材料を用いて置換することができる。

最近の刊行物では、膀胱のような器官で組織を再生する目的のために、細胞に支持マトリックス（supporting matrix）を播種することが論じられている。Ａ．アタラ（Atala）、「膀胱置換のための組織工学（Tissue Engineering for Bladder Substitution）」、ワールド・ジャーナル・オブ・ウロロギー（World J.Urol.）１８：３６４頁〜３７０頁、３６５（２０００年）は、「インビトロで分離及び拡張され、マトリックスに再付着され、移植された細胞（cells that are dissociated and expanded in vitro, reattached to a matrix, and implanted」）」の使用に関与する全ての技術について言及している。具体的には、記事は、「システム．．．任意の酵素又は血清を用いず、大きな膨張能を有する（system...which does not use any enzymes or serum and has a large expansion potential）」について記載しており、Ｊ．ヨー（Yoo）ら、「細胞に播種された同種膀胱粘膜を用いる膀胱増大（Bladder Augmentation Using Allogeneic Bladder Submucosa Seeded with Cells）」ウロロギー（Urology）５１巻：２２１〜２２５頁（１９９８年）ではイヌから収集し及び拡大させた尿路上皮及び平滑筋細胞を用いて、同種の膀胱粘膜下層に播種する。米国特許第６，５７６，０１９号は、インビトロで単離及び培養されて、播種に利用可能な程度に細胞の数を増加させた「細胞集団」に関する方法及び装置を開示している。これらのアプローチは、インビトロで培養されていない細切組織を用いて、高分子マトリックスを直接播種することには基づいていない。欧州特許第１４１０８１１号は、罹患した又は損傷を受けた組織を修復及び又は再生する目的のために、生体適合性スキャホールドを播種するための細切組織の使用について論じている。しかしながら、この特許では、完全な器官の再生に適用される本発明についてはどこにも触れられていない。

本発明の高分子マトリックスは、細切組織の懸濁液と少なくとも一部が接触している生体適合性スキャホールドを含む。細切組織の懸濁液は、スキャホールドの外表面、スキャホールドの内表面、及びこれらの任意の組み合わせ上に配置することができる、又は、スキャホールド全体が細切組織の懸濁液と接触することができる。

組織は、例えば、生検又は外科的除去のような、種々の従来の技術のいずれかを用いて得ることができる。好ましくは、組織サンプルは、無菌条件下で得られる。一旦生体組織のサンプルが得られると、次いでサンプルを滅菌条件下で加工して、少なくとも１つの細切、又は超微粒子状組織粒子を有する懸濁液を作製できる。各組織断片の粒径及び形状は変動することができ、例えば、組織の大きさは約０．１〜３ｍｍ³の範囲、約０．５〜１ｍｍ³の範囲、約１〜２ｍｍ³の範囲、又は約２〜３ｍｍ³の範囲であることができるが、好ましくは組織粒子は１ｍｍ³未満である。組織断片の形状としては、例として薄片、ストリップ、フレーク又は立方体を挙げることができる。いくつかの方法としては、機械的断片化又は光学／レーザーダイセクションが挙げられる。

本発明で用いられる組織サンプルは、適切な収集用具を用いて提供者（自己、同種又は異種）から得られる。組織サンプルは、組織を採取するとき、又は体の外側で収集及び採取された後のいずれかに、細かく切り刻み、小粒子に分割することができる。組織を細切にすることは、種々の方法により達成できる。１つの実施形態では、細切は、平行方向を用いて２つの無菌外科用メスで達成することができ、別の実施形態では、組織を所望の大きさの粒子に自動的に分割する加工用具により組織を細切にすることができる。１つの実施形態では、細切組織は、例えば、篩い分け、沈降又は遠心分離のような、当業者に既知の種々の方法を用いて、生理液から分離し、濃縮することができる。細切組織を濾過及び濃縮する実施形態では、細切組織の懸濁液は、好ましくは、懸濁液中に少量の流体を保持して、組織が乾燥することを防ぐ。別の実施形態では、細切組織の懸濁液を濃縮せず、細切組織は、高濃度の組織懸濁液、又は例えばヒドロゲル、フィブリン接着剤又はコラーゲンのような他の担体を介して、組織修復部位に直接送達することができる。この実施形態では、細切組織の懸濁液を、上記生体適合性スキャホールドのいずれかにより被覆して、組織断片を所定の位置に保持することができる。

細切組織は、次いで、細胞延展器又は当該技術分野で既知である他の用具を用いてスキャホールド上に分配できる。細切組織は、いくつかの方法のうち１つでスキャホールド上に分散できる。第１の例では、膀胱の十分な厚さを含む組織サンプルの生検を得ることができる。組織を全体として細切し、スキャホールド上に分配することができる。第２の例では、組織サンプルの分層生検を得て、まとめて細切し、スキャホールド上に分配することができる。これらの２つの方法の違いは、尿路上皮細胞と例えば平滑筋細胞等の他の細胞との比率である。第３の例では、尿路上皮層及び漿膜筋層を分離し、続いてそれぞれをスキャホールドの表面上に分配する前に別々に細切にすることを含む。第４の例では、尿路上皮の細切組織を、単離された平滑筋細胞を播種したスキャホールド上に分配することができる。第５の例では、細切平滑筋組織を、単離した尿路上皮細胞を播種したスキャホールドと組み合わせることができる。第６の例では、尿路上皮及び又は平滑筋の細切組織は、スキャホールド上に播種された幹細胞と組み合わせることができる。

細切組織は、スキャホールド上の組織断片から移動することができる少なくとも１つの生細胞を有する。組織は、組織断片から移動し、スキャホールドで増殖し始めることができる有効量の細胞を含有する。１つの実施形態では、細切組織粒子は、組織粒子が生理学的緩衝溶液に関連する懸濁液として形成できる。好適な生理学的緩衝溶液としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、ハンク（Hank）の平衡塩、トリス緩衝食塩水、ヘペス緩衝食塩水及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。更に、組織は、血清の存在下又は非存在下のいずれかにおいて、当業者に既知の任意の標準的な細胞培養培地中で細切れにすることができる。スキャホールド上又は組織／器官の傷害部位に細切組織の懸濁液を配置する前に、細切組織の懸濁液を、ほんの少量の生理学的緩衝溶液が懸濁液中に残るように、濾過及び濃縮することができる。

細切組織断片をマトリックス消化酵素に接触させて、細胞外マトリックスからスキャホールド材料への細胞移動を促進してもよい。本発明で用いることができる好適なマトリックス消化酵素としては、コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ペプチダーゼ、サーモリシン及びプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

実施例１：ブタ由来の健常で無傷な膀胱組織を得た。膀胱組織を切開して開き、膀胱内の膀胱内液を吸引した。膀胱組織を次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回すすぎ、分層生検を、尿路上皮層、粘膜下層及び平滑筋層の一部からなる膀胱から得た。生検した組織を細かいペーストに細切した。この組織ペーストを、次いで、細切した組織のペーストが完全にスキャホールドを被覆するように、５ｍｍのパンチの生体再吸収性スキャホールド上に均一に分配した。細切組織の詰まったスキャホールドを、重篤な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに４週間皮下移植した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ／Ｅ）で染色した組織切片について、スキャホールド内及びその周りでの細胞移動、分布及び組織化、並びに形成されたマトリックスの性質を分析した。図３は、細切膀胱組織断片からの高分子のスキャホールドへの細胞移動の程度を示す。尿路上皮細胞の塊が、平滑筋細胞に取り囲まれているのが観察された。組織化した塊の大きさは、中心に尿路上皮塊を備える小さなもの（図３Ａ）から中心に空洞を備えるより大きなもの（図３Ｂ）まで変動する。これらの塊が成長するにつれて、それらはまた癒着し始めて、中心に空洞を備える平滑筋様細胞層に取り囲まれたよく組織化した尿路上皮細胞層を備えるより大きな構造（図３Ｃ）を形成する。これらの構造は、典型的な正常膀胱で見られる組織化に類似している。これらの図は、細胞が細切組織からスキャホールドへ移動することができ、また自身を分離し膀胱様構造に再組織化できることを示す。

〔実施態様〕
（１） 層状に配置された内腔器官の一部に一致する生分解性高分子マトリックスを提供する工程と、
複数の細胞集団を含む自己、同種又は異種組織を得る工程と、
細切組織組成物を得るために、前記組織を加工する工程と、
前記マトリックスに前記組成物を播種する工程と、
患者に前記播種された高分子マトリックスを移植する工程と、を含む、器官を再構築する方法。
（２） １種又はそれ以上のマトリックス消化酵素を、前記細切組織組成物に添加する工程を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記マトリックス消化酵素が、コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ペプチダーゼ、サーモリシン、プロテアーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様２に記載の方法。
（４） １種又はそれ以上の薬剤を、前記細切組織組成物に添加する工程を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記薬剤が、抗生物質、抗ウイルス剤、化学療法剤、拒絶反応抑制剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン、ステロイド、成長因子、天然由来のタンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様４に記載の方法。
（６） １種又はそれ以上の薬剤を前記高分子マトリックスに添加する工程を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（７） 前記薬剤が、抗生物質、抗ウイルス剤、化学療法剤、拒絶反応抑制剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン、ステロイド、成長因子、天然由来のタンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様６に記載の方法。
（８） １個又はそれ以上の幹細胞を、前記細切組織組成物に添加する工程を更に含む、実施態様１に記載の方法。
（９） 層状に配置された内腔器官の一部に一致する生分解性高分子マトリックスを提供する工程と、
複数の細胞集団を含む自己、同種又は異種組織を得る工程と、
第１の細切組織組成物及び第２の細切組織組成物を得るために、前記組織を加工する工程と、
前記マトリックスの第１の領域に前記第１の細切組織組成物を播種し、前記マトリックスの第２の領域に前記第２の細切組織組成物を播種する工程と、
患者に前記播種された高分子マトリックスを移植する工程と、を含む、器官を再構築する方法。
（１０） 前記第１の細切組織組成物が平滑筋組織からなり、前記第２の細切組織組成物が内皮組織からなる、実施態様９に記載の方法。
（１１） １種又はそれ以上のマトリックス消化酵素を、１種又はそれ以上の細切組織組成物に添加する工程を更に含む、実施態様９に記載の方法。
（１２） 前記マトリックス消化酵素が、コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ペプチダーゼ、サーモリシン、プロテアーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１１に記載の方法。
（１３） １個又はそれ以上の幹細胞を１種又はそれ以上の細切組織組成物に添加する工程を更に含む、実施態様９に記載の方法。
（１４） 層状に配置された内腔器官の一部に一致する移植可能な生分解性高分子マトリックスを含む、器官を再構築する装置であって、前記マトリックスに、複数の細胞集団を含む細切された自己、同種又は異種組織を含む、加工された組織組成物を播種することができる、装置。
（１５） 高分子メッシュ生地を更に含む、実施態様１４に記載の装置。
（１６） １種又はそれ以上の薬剤を更に含む、実施態様１４に記載の装置。
（１７） 前記薬剤が、抗生物質、抗ウイルス剤、化学療法剤、拒絶反応抑制剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン、ステロイド、成長因子、天然由来のタンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１６に記載の装置。
（１８） 第１の表面及び第２の表面を有し、前記第１の高分子メッシュ表面に接触する第１の生分解性高分子マトリックスを更に有し、かつ前記第２の高分子メッシュ表面に接触する第２の生分解性高分子マトリックスを更に有する、移植可能な生分解性高分子メッシュを含む強化された器官を再構築する装置であって、前記高分子マトリックス−メッシュ−マトリックス構築物が層状に配置された内腔器官の一部に一致し、更に前記第１及び第２の高分子マトリックスに、複数の細胞集団を含む細切された自己、同種又は異種組織を含む、加工された組織組成物を播種できる、装置。
（１９） 薬剤を更に含む、実施態様１８に記載の装置。
（２０） 前記薬剤が、抗生物質、抗ウイルス剤、化学療法剤、拒絶反応抑制剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン、ステロイド、成長因子、天然由来のタンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１９に記載の装置。

Claims (7)

1. 層状に配置された内腔器官の一部に一致する移植可能な生分解性高分子マトリックスを含む、器官を再構築する装置であって、前記マトリックスに、複数の細胞集団を含む細切された自己、同種又は異種組織を含む、加工された組織組成物を播種することができる、装置。
2. 高分子メッシュ生地を更に含む、請求項１に記載の装置。
3. １種又はそれ以上の薬剤を更に含む、請求項１に記載の装置。
4. 前記薬剤が、抗生物質、抗ウイルス剤、化学療法剤、拒絶反応抑制剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン、ステロイド、成長因子、天然由来のタンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の装置。
5. 第１の表面及び第２の表面を有し、前記第１の高分子メッシュ表面に接触する第１の生分解性高分子マトリックスを更に有し、かつ前記第２の高分子メッシュ表面に接触する第２の生分解性高分子マトリックスを更に有する、移植可能な生分解性高分子メッシュを含む強化された器官を再構築する装置であって、前記高分子マトリックス−メッシュ−マトリックス構築物が層状に配置された内腔器官の一部に一致し、更に前記第１及び第２の高分子マトリックスに、複数の細胞集団を含む細切された自己、同種又は異種組織を含む、加工された組織組成物を播種できる、装置。
6. 薬剤を更に含む、請求項５に記載の装置。
7. 前記薬剤が、抗生物質、抗ウイルス剤、化学療法剤、拒絶反応抑制剤、鎮痛剤、抗炎症剤、ホルモン、ステロイド、成長因子、天然由来のタンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の装置。

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