ES2652025T3

ES2652025T3 - Composición de injerto óseo

Info

Publication number: ES2652025T3
Application number: ES07760765.3T
Authority: ES
Inventors: Jerome Connor; Qing-Qing Qiu
Original assignee: LifeCell Corp
Current assignee: LifeCell Corp
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-17
Publication date: 2018-01-31
Anticipated expiration: 2027-04-17
Also published as: AU2007240510B2; JP2009534125A; EP2007196A4; AU2007240510A1; EP2007196B1; WO2007124302A3; CA2646487A1; WO2007124302A2; EP2007196A2; ZA200809010B; US20070248575A1; JP5951172B2

Abstract

Un método para hacer una composición de injerto óseo (CIO); caracterizado porque dicho método comprende: combinar fragmentos de una matriz de tejido acelular (MTA) con fragmentos de matriz ósea desmineralizada (MOD) para crear una mezcla, en la que los fragmentos de MTA y los fragmentos de MOD en la mezcla están sustancialmente hidratados; secar e irradiar la mezcla para proporcionar una forma que se ha secado e irradiado; en el que dicha forma puede almacenarse durante seis meses y posteriormente puede rehidratarse para proporcionar una CIO osteoinductiva.

Description

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DESCRIPCION

Composicion de injerto oseo Campo tecnico

Esta invencion se refiere a la ingeniena de tejidos, y mas en particular a la remodelacion de tejido oseo. Antecedentes

El hueso es unico entre los tejidos de los vertebrados por su capacidad de cicatrizacion a traves de la formacion de hueso nuevo. Otros tejidos, por ejemplo, el musculo, el corazon y el cerebro se curan mediante el reemplazo con tejido conectivo, lo que resulta en la formacion de cicatrices. La regeneracion del tejido esqueletico es el resultado de una interaccion compleja y dinamica entre tres componentes: celulas, factores de crecimiento y un andamiaje permisivo. Un andamiaje osteoinductivo tiene la capacidad de inducir la formacion de hueso nuevo al influir en el reclutamiento, la diferenciacion y la maduracion de las celulas pluripotenciales de un paciente en celulas formadoras de hueso.

El documento US2006/073592 proporciona metodos de almacenamiento de matrices de tejido acelular en las que una porcion sustancial de agua en las matrices se reemplaza con un agente de reemplazo de agua, por ejemplo, glicerol. Tambien incluidas en la invencion del documento US 2006/073592 hay composiciones hechas por estos metodos, asf como tambien metodos de tratamiento que usan dichas composiciones.

Sumario

La presente invencion se refiere a un metodo para preparar una composicion de injerto oseo (CIO); caracterizado porque dicho metodo comprende: combinar fragmentos de una matriz de tejido acelular (MTA) con fragmentos de matriz osea desmineralizada (MOD) para crear una mezcla, en la que los fragmentos de MTA y los fragmentos de MOD en la mezcla estan sustancialmente hidratados; secar e irradiar la mezcla para proporcionar una forma que se ha secado e irradiado; en la que dicha forma puede almacenarse durante seis meses y posteriormente rehidratarse para proporcionar una CIO osteoinductiva.

La presente invencion tambien se refiere a una CIO preparada mediante el metodo anterior, asf como a un artfculo de fabricacion que comprende dicha CIO.

Los inventores han descubierto que una mezcla hidratada de fragmentos de matriz de tejido acelular (MTA) y fragmentos de matriz osea desmineralizada (MOD) se puede secar para formar una composicion de injerto oseo (CIO) que, cuando se hidrata, es osteoinductiva. Ademas, los inventores observaron que la CIO retema la osteoinductividad despues del almacenamiento (por ejemplo, almacenamiento a largo plazo). La invencion proporciona asf metodos para elaborar una CIO, metodos de tratamiento que usan la CIO y artfculos de fabricacion que incluyen la CIO.

Mas espedficamente, la invencion proporciona un metodo para preparar una composicion de injerto oseo (CIO). El metodo implica: (a) combinar fragmentos (por ejemplo, una pluralidad de fragmentos) de una matriz de tejido acelular (MTA) con fragmentos (por ejemplo, una pluralidad de fragmentos) de matriz osea desmineralizada (MOD) para crear una mezcla, los fragmentos de MTA y los fragmentos de MOD en la mezcla que estan sustancialmente hidratados; y (b) secar la mezcla para formar una CIO, de modo que, cuando se hidrata, la CIO es osteoinductiva. Los fragmentos de MTA pueden ser partfculas (por ejemplo, partfculas de un tamano uniforme) y los fragmentos de MOD pueden ser partfculas (por ejemplo, partfculas de un tamano uniforme).

La mezcla puede ser una masilla semisolida y, antes del secado, la masilla semisolida se puede moldear. La MTA puede ser, o puede incluir, dermis (o fascia, tejido pericardico, duramadre, tejido del cordon umbilical, tejido placentario, tejido valvular cardfaco, tejido ligamentario, tejido del tendon, tejido arterial, tejido venoso, tejido conectivo neural, tejido de la vejiga urinaria, tejido de ureter, o tejido intestinal) del que se han eliminado todas, o sustancialmente todas, las celulas viables. La MTA puede estar hecha de tejido humano o tejido de mairnfero no humano (por ejemplo, cerdo) y el mamffero no humano puede modificarse por ingeniena genetica para que carezca de expresion de restos de a-1,3-galactosilo. El mamffero geneticamente modificado puede carecer de un gen funcional de la a-1,3-galactosiltransferasa. Ademas, la MOD se puede preparar a partir de cualquiera de los mamfferos mencionados anteriormente. La etapa de secado puede incluir, por ejemplo, liofilizacion y el metodo implica ademas irradiar la CIO con, por ejemplo, radiacion y, radiacion X, radiacion con haz de electrones o radiacion ultravioleta. La CIO puede irradiarse de manera que absorba de 6 kGy a 30 kGy de la radiacion. En lugar de, o ademas de irradiar la CIO, la mezcla se puede irradiar (utilizando cualquiera de los tipos y dosis de radiacion anteriores) antes del secado. La invencion tambien presenta una CIO realizada mediante el metodo descrito anteriormente. Tambien se desvela un metodo de tratamiento. El metodo incluye: (a) identificar un sujeto mam^era que tiene un organo receptor, o tejido, que necesita una mejora o reparacion; y (b) colocar la CIO de la invencion (vease mas arriba) en o sobre el organo o tejido. La CIO puede mantenerse en su lugar mediante un dispositivo

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estructural de apoyo. La mezcla a partir de la cual se fabrico la CIO puede haber sido una masilla semisolida y, antes del secado, la masilla semisolida puede tener forma. El tejido u organo receptor puede ser hueso cortical o hueso esponjoso.

La invencion tambien proporciona un artfculo de fabricacion que incluye: (a) la CIO de la invencion (vease mas arriba); y (b) material de embalaje, o un prospecto, que incluye instrucciones para un metodo de tratamiento. El metodo de tratamiento puede implicar (i) identificar un sujeto mairnfero que tiene un organo receptor, o tejido, que necesita una mejora o reparacion; y (ii) colocar la CIO en o sobre el organo o tejido. Una realizacion descrita es un kit que incluye: (a) un fragmento (por ejemplo, una pluralidad de fragmentos) de MOD; (b) fragmentos (por ejemplo, una pluralidad de fragmentos) de MTA; y (c) material de embalaje, o un prospecto, que incluye instrucciones para un metodo de fabricacion de una CIO. El metodo implica: (i) combinar los fragmentos de MTA con los fragmentos de MOD para crear una mezcla, los fragmentos de MTA y los fragmentos de MOD en la mezcla estan sustancialmente hidratados por completo; y (ii) secar la mezcla para formar la CIO, de modo que, cuando se hidrata, la CIO es osteoinductiva.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Los metodos y materiales preferidos se describen a continuacion, aunque se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la puesta en practica o a prueba de la presente invencion. Los materiales, metodos y ejemplos descritos en este documento son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion, por ejemplo, metodos de reparacion de defectos oseos, seran evidentes a partir de la siguiente descripcion, de los dibujos y de las reivindicaciones.

Descripcion detallada

Los materiales y metodos proporcionados en la presente memoria se pueden usar para hacer una composicion de injerto oseo (CIO) que se puede implantar en tejido oseo danado o defectuoso para facilitar la reparacion del tejido oseo danado o defectuoso. Como se usa en este documento, el termino "composicion de injerto oseo" es un material que a) esta compuesto de matrices de tejido acelular (producidas a partir de tejidos que contienen colageno) y matrices oseas desmineralizadas; b) esta deshidratado para su almacenamiento a largo plazo; y c) retiene la mayona, y de manera optima, todas las funciones biologicas del tejido oseo nativo y que contiene colageno nativo del que se formo, incluso durante el almacenamiento a largo plazo.

"Injerto oseo" como se describe en este documento es un procedimiento que coloca material oseo o formador de hueso en, sobre o alrededor, o adyacente a defectos oseos, por ejemplo, huecos, agujeros o espacios en el hueso o roturas en el hueso, para ayudar a la curacion. El hueso es un material denso y multifasico o "material compuesto" formado por celulas integradas en una matriz compuesta de elementos organicos, que incluyen fibras de colageno, lfpidos, peptidos, glicoprotemas, polisacaridos y citratos, y elementos inorganicos, incluidos fosfatos de calcio, carbonatos, y sales de sodio, magnesio y fluoruro. Al proporcionar un andamiaje tridimensional, los materiales de injerto oseo pueden actuar para reemplazar temporalmente el hueso perdido y proporcionar un marco dentro o fuera del cual el hueso anfitrion y la red vascular pueden regenerarse y sanar. Ademas, los materiales de injerto oseo pueden facilitar la reparacion osea de varias maneras, dependiendo de su capacidad para interactuar con las celulas formadoras de hueso.

Los materiales osteoconductivos proporcionan un andamiaje que facilita la neovascularizacion y la infiltracion del injerto por medio de una "sustitucion progresiva" en los bordes del injerto. Los materiales osteoconductivos dependen del sitio de implantacion (es decir, inician la formacion de hueso nuevo solamente cuando se implanta en o sobre el hueso) y actuan simplemente como soporte para el nuevo hueso para formar un puente sobre el sitio de un defecto en el hueso. Por el contrario, los materiales osteoinductivos se distinguen por su capacidad para estimular las propias celulas pluripotenciales pluripotentes del receptor para que se diferencien en celulas osteogenicas funcionales tales como osteoblastos y osteoclastos. Por lo tanto, los materiales osteoinductivos son capaces de iniciar un nuevo crecimiento oseo esencialmente independiente del sitio del implante, es decir, pueden inducir la formacion de hueso en cualquier tejido, incluido el hueso, en o sobre el que se ponen. La CIO proporcionada en este documento es una composicion que conserva la osteoinductividad tras el almacenamiento a largo plazo y, como tal, es util para tratar una variedad de trastornos oseos.

I. Componentes de la CIO

En este documento se proporciona una composicion de injerto oseo (CIO). La composicion de injerto oseo (CIO) incluye un componente de matriz de tejido acelular (MTA) y un componente de matriz osea desmineralizada (MOD).

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Matrices de tejido acelular

Como se usa en este documento, una "matriz de tejido acelular" ("MTA") es una estructura derivada de tejido que esta compuesta de cualquiera de una amplia gama de tejidos que contienen colageno eliminando todas, o sustancialmente todas, las celulas viables y, preferentemente, todos los componentes subcelulares detectables y/o desechos generados por celulas asesinas. Como se usa en este documento, una MTA que carece de "sustancialmente todas las celulas viables" es una MTA en la que la concentracion de celulas viables es inferior al 1 % (por ejemplo, inferior al: 0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, 0,0001 %; 0,00001 %; 0,000001 %, o incluso inferior al 0,000001 %) en el tejido u organo del que se fabrico la MTA. La MTA preferentemente tambien carece sustancialmente de celulas muertas y/o componentes celulares.

La MTA de la invencion puede tener, o no tener, una membrana basal epitelial. La membrana basal epitelial es una lamina delgada de material extracelular contigua al aspecto basilar de las celulas epiteliales. Las laminas de celulas epiteliales anadidas forman un epitelio. Asf, por ejemplo, el epitelio de la piel se llama epidermis, y la membrana basal epitelial de la piel se encuentra entre la epidermis y la dermis. La membrana basal epitelial es una matriz extracelular especializada que proporciona una funcion de barrera y una superficie de union para celulas epiteliales; sin embargo, no contribuye a ningun papel estructural o biomecanico significativo al tejido subyacente (por ejemplo, la dermis). Los componentes unicos de las membranas basales epiteliales incluyen, por ejemplo, laminina, colageno tipo VII y nidogeno. La organizacion temporal y espacial unica de la membrana basal epitelial la distingue, por ejemplo, de la matriz extracelular dermica. La presencia de la membrana basal epitelial en una MTA podna ser desventajosa ya que la membrana basal epitelial probablemente contenga una variedad de componentes espedficos de especie que podnan provocar la produccion de anticuerpos y/o unirse a anticuerpos preformados en receptores de injerto xenogenico de la matriz acelular. Ademas, la membrana basal epitelial puede actuar como barrera para la difusion de celulas y/o factores solubles (por ejemplo, quimioatrayentes) y a la infiltracion celular. Por lo tanto, su presencia en una MTA puede retrasar significativamente la formacion de nuevo tejido de la MTA en un animal receptor. Como se usa en este documento, una MTA que "carece sustancialmente" de una membrana basal epitelial es una matriz de tejido acelular que contiene menos del 5 % (por ejemplo, menos del: 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,25%, 0,1 %; 0,01 %, 0,001 %, o incluso menos del 0,001 %) de la membrana basal epitelial posefda por el correspondiente tejido no procesado del que se deriva la MTA.

Las MTA retienen los atributos biologicos y estructurales de los tejidos a partir de los cuales estan hechas, incluyendo el reconocimiento celular y la union celular, asf como la capacidad de soportar la propagacion celular, la proliferacion celular y la diferenciacion celular. Dichas funciones son proporcionadas por protemas colagenas no desnaturalizadas (por ejemplo, colageno tipo I) y una variedad de moleculas no colagenas (por ejemplo, protemas que sirven como ligandos para moleculas tales como receptores de integrinas, moleculas con alta densidad de carga tales como los glicosaminoglicanos (por ejemplo, hialuronano o proteoglicanos, u otras adhesinas). Las funciones estructurales retenidas por matrices acelulares utiles incluyen el mantenimiento de la arquitectura histologica, el mantenimiento del conjunto tridimensional de los componentes del tejido y las caractensticas ffsicas tales como resistencia, elasticidad y durabilidad, porosidad definida y retencion de macromoleculas. La eficacia de las funciones biologicas de una MTA puede medirse, por ejemplo, mediante la capacidad de la MTA para soportar la proliferacion celular (por ejemplo, celulas epiteliales) y es al menos del 50 % (por ejemplo, al menos: 50 %; 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 100 % o mas del 100 %) del tejido u organo nativo del que se fabrica la MTA.

No es necesario que la MTA este formada de tejido que sea identico al tejido huesped circundante, sino que simplemente debe ser remodelable invadiendo o infiltrando celulas tales como celulas diferenciadas del tejido huesped relevante, celulas pluripotenciales tales como celulas pluripotenciales mesenquimales, o celulas progenitoras. Se entiende que la mTa se puede producir a partir de cualquier tejido blando y esqueleto muscular que contenga colageno (por ejemplo, dermis, fascia, pericardio, duramadre, cordones umbilicales, placentas, valvulas cardfacas, ligamentos, tendones, tejido vascular (arterias y venas tales como como venas safenas), tejido conectivo neural, tejido de vejiga urinaria, tejido de ureter o tejido intestinal), siempre que las propiedades descritas anteriormente sean retenidas por la matriz.

Una MTA util para la invencion opcionalmente puede fabricarse a partir de un tejido propio del receptor a base de colageno. Ademas, aunque una MTA generalmente se habra fabricado a partir de uno o mas individuos de la misma especie que la del receptor de la CIO, este no es necesariamente el caso. Por lo tanto, por ejemplo, una MTA se puede haber fabricado a partir de un tejido porcino y se puede usar para fabricar una CIO que se pueda implantar en un paciente humano. Las especies que pueden servir como receptoras de una CIO y donantes de tejidos u organos para la produccion del componente de MTA de la CIO pueden incluir, sin limitacion, seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, mandriles o chimpances), cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, perros, gatos, conejos, conejillos de indias, jerbos, hamsteres, ratas o ratones.

De particular interes como donantes son los animales (por ejemplo, cerdos) que han sido disenados geneticamente para carecer de la fraccion galactosa-a-1,3-galactosa terminal. Para descripciones de los animales apropiados, vease la Solicitud publicada pendiente de aprobacion de Estados Unidos n.° 2005/0028228 A1 y la Patente de Estados Unidos n.° 6.166.288. Un problema importante de los xenotrasplantes en animales receptores (por ejemplo, seres humanos) que no expresan la enzima UDP-galactosa:p-D-galactosil-1,4-N-acetil-D-glucosaminida a-1,3

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galactosil-transferasa (a-1,3 galactosiltransferasa; "a-GT") que cataliza la formacion de la estructura de disacarido terminal, la galactosa a-1,3 galactosa ("a-gal"), es el rechazo hiperagudo de xenoinjertos en dichos receptores. Este rechazo es en gran parte debido, si no exclusivamente, a la accion de anticuerpos espedficos para el epttopo de a- gal en la superficie de las celulas en el xenoinjerto. Se han obtenido animales transgenicos (por ejemplo, cerdos) que carecen, o carecen sustancialmente, de a-GT funcional y, por lo tanto, tambien carecen, o carecen sustancialmente, de epftopos a-gal. Los metodos divulgados para producir animales transgenicos, y en particular animales transgenicos alterados geneticamente, son bien conocidos en la tecnica. Los metodos para producir animales alterados geneticamente implican la incorporacion de una forma alterada de un gen de interes en la lmea germinal de un individuo de una especie. El gen puede alterarse de modo que no se produce ningun producto proteico (por ejemplo, a-GT) o se produce un producto proteico que carece de la actividad, o sustancialmente carece de la actividad, de la protema nativa. Como se usa en el presente documento, una protema a-GT "que sustancialmente carece de actividad a-GT" es una protema a-GT que tiene menos del 5 % (por ejemplo, menos del: 4 %; 2 %; 1 %; 0,1 %; 0,01 %; 0,001 %; o incluso menos del 0,001 %) de la capacidad de la a-GT de tipo silvestre para generar epftopos de a-gal. Los metodos divulgados para alterar genes, y en particular, el gen de a-GT, son conocidos en la tecnica y generalmente implican el proceso conocido como recombinacion homologa. En este proceso, una o ambas copias de un gen de interes de tipo silvestre pueden alterarse insertando una secuencia en el gen o genes de tipo silvestre de manera que no se produce transcripcion a partir del gen o genes; o se produce una transcripcion de la cual no se traduce ninguna protema; o se produce una transcripcion que dirige la smtesis de una protema que carece, o carece sustancialmente, de la actividad funcional de la protema de interes. Dichas construcciones normalmente incluyen toda o parte de la secuencia genomica del gen de interes y contienen, dentro de esa secuencia genomica, una secuencia que interrumpira la expresion del gen de interes de una de las formas descritas anteriormente. La secuencia utilizada para interrumpir la expresion del gen puede ser una secuencia que codifica una protema que confiere resistencia a los antibioticos (por ejemplo, resistencia a la neomicina) en celulas diana que han incorporado la construccion en sus genomas. Dicha secuencia codificante facilita la seleccion in vitro de celulas que han incorporado la construccion genetica en sus genomas. Pueden usarse metodologfas de seleccion de farmacos adicionales conocidas en la tecnica para seleccionar celulas en las que ha tenido lugar la recombinacion entre la construccion y al menos una copia del gen diana.

En algunos metodos descritos para generar animales con genes alterados, se pueden usar celulas totipotentes (es decir, celulas capaces de dar lugar a todos los tipos de celulas de un embrion) como celulas diana. Dichas celulas incluyen, por ejemplo, celulas pluripotenciales embrionarias (ES) (en forma de lmeas celulares ES) o ovulos fertilizados (oocitos). Una poblacion de celulas ES en la que se interrumpe al menos una copia del gen de interes se puede inyectar en blastocitos apropiados y los blastocistos inyectados se pueden implantar en madres de crianza. Como alternativa, los ovulos fertilizados inyectados con la construccion de interes disruptora de genes pueden implantarse en las madres de crianza. Ademas, los oocitos implantados en madres de crianza pueden ser aquellos que han sido enucleados e inyectados o fusionados con nucleos de celulas ES alteradas geneticamente con exito [Campbell et al., (1996) Nature 380: 64-66]. Los descendientes que contienen mutaciones resultantes que surgen en dichas madres de crianza pueden identificarse y, a partir de estos animales fundadores, pueden producirse lmeas animales distintas usando metodos de seleccion y cna conocidos por los expertos en la tecnica. Realizacion divulgada: los animales transgenicos convencionales y alterados geneticamente tambien se pueden producir usando celulas somaticas (por ejemplo, fibroblastos fetales) como celulas diana para la alteracion genica. Dichas celulas crecen mucho mas rapido y se manipulan mas facilmente in vitro que, por ejemplo, las celulas ES, facilitando asf la alteracion del gen y los procedimientos posteriores de seleccion celular con genes alterados. Una vez que se ha seleccionado una lmea de celulas somaticas alteradas geneticamente in vitro, los nucleos de las celulas somaticas alteradas geneticamente se pueden incorporar a las celulas totipotentes (por ejemplo, celulas ES u oocitos), que luego se manipulan como se ha descrito anteriormente. Los metodos para el trasplante nuclear son conocidos por los expertos en la tecnica y pueden incluir tecnicas tales como, por ejemplo, fusion celular o trasplante nuclear. Realizacion divulgada: lo mas comunmente posible, los procedimientos de alteracion del gen dan como resultado la alteracion de solo un alelo de un gen de interes. En estos casos, los animales transgenicos seran heterocigotos para el gen alterado. Se puede usar la cna de dichos heterocigotos y los procedimientos de seleccion apropiados familiares para los expertos en la tecnica para obtener animales que son homocigoticos para el gen alterado. Naturalmente, dichos procedimientos de reproduccion no son necesarios cuando el procedimiento de alteracion de genes descrito anteriormente da como resultado la alteracion de ambos alelos del gen de interes.

Para la produccion de la CIO, generalmente se usan MTA en forma de fragmentos (es decir, partmulas, hilos o fibras) (vease a continuacion). La MTA se puede producir por cualquiera de una variedad de metodos. Todo lo que se requiere es que los pasos usados en su produccion den como resultado matrices con las propiedades biologicas y estructurales descritas anteriormente. Los metodos de produccion particularmente utiles incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos n.° 4.865.871; 5.366.616; 6.933.326 y la Solicitud copendiente publicada de Estados Unidos n.° 2003/0035843 A1 y 2005/0028228 A1. En resumen, los pasos implicados en la produccion de una MTA generalmente incluyen recoger el tejido de un donante (por ejemplo, un cadaver humano o cualquiera de los mairftferos mencionados anteriormente), el tratamiento qrnmico para estabilizar el tejido y evitar la degradacion bioqmmica y estructural junto con, o seguida de, eliminacion de celulas en condiciones que de manera similar preservan la funcion biologica y estructural. La MTA puede tratarse opcionalmente con un agente de crioconservacion y crioconservarse y, opcionalmente, liofilizarse, de nuevo bajo las condiciones necesarias para mantener las propiedades biologicas y estructurales descritas de la matriz. Despues de congelar o liofilizar, el tejido

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se puede fragmentar, por ejemplo, pulverizar o micronizar, para producir una MTA particuladas en condiciones similares de preservacion de la funcion. Todos los pasos generalmente se llevan a cabo en condiciones asepticas, preferentemente esteriles.

Un metodo ejemplar de produccion de MTA, que se describe con mayor detalle en la Patente de Estados Unidos n.° 5.366.616, se resume a continuacion.

Despues de la extraccion del donante, el tejido se pone en una solucion estabilizadora inicial. La solucion estabilizadora inicial detiene y previene la degradacion osmotica, hipoxica, autolftica y proteolftica, protege contra la contaminacion microbiana y reduce el dano mecanico que puede ocurrir con los tejidos que contienen, por ejemplo, componentes del musculo liso (por ejemplo, vasos sangumeos). La solucion estabilizante generalmente contiene un tampon apropiado, uno o mas antioxidantes, uno o mas agentes oncoticos, uno o mas antibioticos, uno o mas inhibidores de la proteasa y, en algunos casos, un relajante del musculo liso.

El tejido se pone en una solucion de procesamiento para eliminar celulas viables (por ejemplo, celulas epiteliales, celulas endoteliales, celulas de musculo liso y fibroblastos) de la matriz estructural sin danar el complejo de la membrana basal o la integridad biologica y estructural de la matriz de colageno. La solucion de procesamiento generalmente contiene un tampon apropiado, sal, un antibiotico, uno o mas detergentes, uno o mas agentes para evitar la reticulacion, uno o mas inhibidores de la proteasa y/o una o mas enzimas. El tratamiento del tejido debe ser (a) con una solucion de procesamiento que contenga agentes activos a una concentracion y (b) durante un penodo de tiempo tal que se mantenga la integridad estructural de la matriz.

Despues de la descelularizacion, el tejido se puede congelar (es decir, crioconservar) y opcionalmente, liofilizar. Antes de la congelacion, el tejido puede incubarse en una solucion de crioconservacion. Esta solucion generalmente contiene uno o mas crioprotectores para minimizar el dano del cristal de hielo a la matriz estructural que podna ocurrir durante la congelacion. Si el tejido va a liofilizarse, la solucion generalmente tambien contendra uno o mas componentes de proteccion en seco, para minimizar el dano estructural durante el secado y puede incluir una combinacion de un disolvente organico y agua que no sufre expansion o contraccion durante la congelacion. Los agentes crioprotectores y de proteccion en seco pueden ser la misma sustancia o algunas otras. Si el tejido no va a liofilizarse, se puede congelar colocandolo (en un recipiente esterilizado) en un congelador a aproximadamente -80 °C, o sumergiendolo en nitrogeno lfquido esteril, y posteriormente almacenando a una temperatura inferior a -160 °C hasta su uso. La muestra puede descongelarse antes de su uso, por ejemplo, sumergiendo un recipiente esteril no permeable (vease a continuacion) que contiene un bano de agua a aproximadamente 37 °C o permitiendo que el tejido llegue a la temperatura ambiente en condiciones ambientales.

Si el tejido debe congelarse y liofilizarse, despues de la incubacion en la solucion de crioconservacion, el tejido puede empaquetarse dentro de un recipiente esteril que sea permeable al vapor de agua pero impermeable a las bacterias, por ejemplo, una bolsa permeable al vapor de agua o un vial de vidrio. Un lado de la bolsa preferido consiste en una membrana Tyvek® porosa de calidad medica, un producto de marca registrada de DuPont Company of Wilmington, DE. Esta membrana es porosa al vapor de agua e impermeable a las bacterias y el polvo. La membrana Tyvek se sella termicamente con una lamina laminada de polietileno impermeable, dejando un lado abierto, formando asf una bolsa de dos lados. La bolsa abierta se esteriliza por irradiacion (por ejemplo, irradiacion Y) antes del uso. El tejido se pone asepticamente (a traves del lado abierto) en la bolsa esteril. El lado abierto se sella asepticamente por calor para cerrar la bolsa. El tejido empaquetado a partir de ahora se protege de la contaminacion microbiana a lo largo de los pasos de procesamiento posteriores.

El recipiente que contiene el tejido se enfna a baja temperatura a una velocidad especificada que es compatible con la formulacion crioprotectora espedfica para minimizar el dano por congelacion. Vease la Patente de Estados Unidos n.° 5.336.616 para ejemplos de protocolos de enfriamiento apropiados. El tejido se seca despues a baja temperatura en condiciones de vado, de manera que el vapor de agua se elimina secuencialmente de cada fase de cristal de hielo.

Al finalizar el secado de las muestras en el recipiente permeable al vapor de agua, el vado del aparato de liofilizacion se invierte con un gas inerte seco tal como nitrogeno, helio o argon. Mientras se mantiene en el mismo entorno gaseoso, el recipiente semipermeable se pone dentro de un recipiente impermeable (es decir, impermeable al vapor de agua asf como a los microorganismos) (por ejemplo, una bolsa) que se sella adicionalmente, por ejemplo, mediante calor y/o presion. Cuando la muestra de tejido se congela y se seca en un vial de vidrio, el vial se sella a vado con un tapon inerte apropiado y el vado del aparato de secado se invierte con un gas inerte antes de la descarga. En cualquier caso, el producto final esta sellado hermeticamente en una atmosfera gaseosa inerte. El tejido liofilizado se puede almacenar en condiciones de refrigeracion hasta la fragmentacion o, si se desea, la rehidratacion.

Las partfculas de MTA tienen una forma generalmente esferica o incluso irregular, con la dimension mas larga que no es mayor de 1000 micrometres. La MTA particulada puede fabricarse a partir de cualquiera de las MTA no particuladas descritas anteriormente mediante cualquier proceso que tenga como resultado la preservacion de las

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funciones biologicas y estructurales descritas anteriormente y, en particular, se debe minimizar el dano a las fibras de colageno, incluidos los extremos de fibras cortadas.

Un metodo apropiado para fabricar MTA particuladas se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 6.933.326. El proceso se describe brevemente a continuacion con respecto a una MTA dermica liofilizada, pero un experto en la tecnica podna adaptar facilmente el metodo para su uso con MTA congelada o liofilizada derivada de cualquiera de los otros tejidos enumerados en este documento.

La matriz dermica acelular se puede cortar en tiras (utilizando, por ejemplo, un mallador Zimmer equipado con una rueda de corte "continua" sin interrupcion). Las tiras largas resultantes se cortan entonces en longitudes de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 2 cm. Un homogeneizador y una sonda homogenizadora esterilizada (por ejemplo, un homogeneizador LabTeck Macro disponible en OMNI International, Warrenton, VA) se ensamblan y se enfna a temperaturas criogenicas (es decir, de aproximadamente -196 °C a aproximadamente -160 °C) utilizando nitrogeno lfquido esteril que se vierte en la torre homogeneizadora. Una vez que el homogeneizador ha alcanzado una temperatura criogenica, se anaden trozos de MTA a la torre de homogeneizacion que contiene el nitrogeno lfquido. El homogeneizador se activa entonces para fracturar criogenicamente las piezas de MTA. El tiempo y la duracion de la etapa de fracturacion criogenica dependeran del homogeneizador utilizado, el tamano de la camara de homogeneizacion, y la velocidad y el tiempo de funcionamiento del homogeneizador, y son facilmente determinables por un experto en la tecnica. Como alternativa, el proceso de criofracturacion se puede llevar a cabo en refrigeracion criogenica a una temperatura criogenica.

La MTA particulada crio-fracturada se clasifica, opcionalmente, por el tamano de partfcula lavando el producto de la homogeneizacion con nitrogeno lfquido esteril a traves de una serie de tamices metalicos que tambien se han enfriado a una temperatura criogenica. En general, es util eliminar partfculas grandes no deseadas con un tamiz de un tamano de poro relativamente grande antes de proceder a uno (o mas tamices) con un tamano de poro mas pequeno. Una vez aisladas, las partfculas se pueden liofilizar para asegurarse de que se elimine toda la humedad residual que pueda haber sido absorbida durante el procedimiento. El producto final es un polvo (habitualmente blanco o blanquecino) que generalmente tiene un tamano de partfcula de aproximadamente 1 micrometro a aproximadamente 900 micrometros, de aproximadamente 30 micrometros a aproximadamente 750 micrometros, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 micrometros.

Los fragmentos de MTA tambien pueden ser fibras o hilos. Dichas fibras o hilos generalmente no debenan ser mayores de 5 cm (por ejemplo, no superiores a: 4,5 cm, 4,0 cm, 3,5 cm, 3,0 cm, 2,5 cm, 2,0 cm, 1,5 cm, 1,0 cm, 0,5 cm, 0,25 cm; 0,1 cm; 0,05 cm; o 0,02 cm) de longitud y no mas de 3 mm (por ejemplo, no superiores a: 2,5 mm; 2,0 mm; 1,5 mm; 1,0 mm; 0,5 mm; 0,2 mm; 0,1 mm; 0,05 mm; 0,02 mm o 0,01 mm) en su punto mas ancho. Los metodos para producir fibras e hilos a partir de MTA congeladas o liofilizadas senan evidentes para los expertos en la tecnica e incluyen tanto el corte manual como el mecanizado de la MTA congelada o liofilizada.

La MTA fragmentada se rehidrata facilmente mediante suspension en solucion salina normal o cualquier otro agente rehidratante adecuado conocido en la tecnica. Tambien puede suspenderse en cualquier vehnculo adecuado conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.284.655 incorporada en su totalidad en este documento como referencia). Si se suspende a una alta concentracion (por ejemplo, a aproximadamente 600 mg/ml), la MTA fragmentada puede formar una "masilla", y si se suspende a una concentracion algo menor (por ejemplo, aproximadamente 330 mg/ml), puede formar una "pasta". El metodo descrito anteriormente puede aplicarse a cualquier forma de MTA almacenada, por ejemplo, una MTA fragmentada que se ha liofilizado o mTa fragmentada que se ha congelado.

Una MTA liofilizada muy adecuada se produce a partir de dermis humana LifeCell Corporation (Branchburg, NJ) y se comercializa en forma de laminas pequenas como AlloDerm®. Dichas laminas se comercializan por LifeCell Corporation como laminas rectangulares con unas dimensiones de, por ejemplo, 1 cm x 2 cm, 3 cm x 7 cm, 4 cm x 8 cm, 5 cm x 10 cm, 4 cm x 12 cm y 6 cm x 12 cm. El crioprotector utilizado para congelar y secar AlloDerm® es una solucion del 35 % de maltodextrina y etilendiaminotetraacetato (EDTA) 10 mM. De este modo, el producto seco final contiene aproximadamente el 60 % en peso de MTA y aproximadamente el 40 % en peso de maltodextrina. LifeCell Corporation tambien fabrica un producto analogo fabricado con dermis porcina (designada XenoDerm™) con las mismas proporciones de MTA y maltodextrina que AlloDerm®. Ademas, LifeCell Corporation comercializa una matriz dermica acelular particulada fabricada mediante crio-fractura de AlloDerm® (como se ha descrito anteriormente) bajo el nombre de Cymetra®. El tamano de partfcula para Cymetra esta en el intervalo de aproximadamente 60 micrometros a aproximadamente 150 micrometros, segun lo determinado por la masa. Las partfculas de MTA particuladas o pulverizadas (en polvo) seran menores a 1,0 mm en su dimension mas larga. Los trozos de MTA con dimensiones superiores a esta son matrices acelulares no particuladas.

Matriz osea desmineralizada

Como se usa en el presente documento, "matriz osea desmineralizada" (MOD) se refiere al hueso que se ha tratado para eliminar la totalidad o sustancialmente la totalidad de los componentes minerales inorganicos. La MOD de la cual se ha eliminado sustancialmente la totalidad de los componentes minerales es una matriz osea que tiene

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menos del 5 % de la concentracion mineral de la encontrada en el hueso del que se preparo la MOD. Los procedimientos de extraccion responsables de la desmineralizacion tambien eliminan todas o sustancialmente todas las celulas viables de la matriz osea. La MOD de la cual se han eliminado sustancialmente todas las celulas viables es una matriz osea que tiene menos del 1 % (por ejemplo, menos del: 0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, 0,0001 %, 0,00001 %, 0,000001 % o 0,0 %) de la concentracion de celulas viables encontradas en el hueso del que se preparo la MOD.

El componente proteico principal de la MOD es el colageno, que representa el 70-90 % del componente no mineralizado de la matriz osea. Otros constituyentes de protema de matriz no colageno incluyen glicoprotemas, por ejemplo, osteonectina y trombospondina; proteoglicanos, por ejemplo, biglicano y decorina; sialoprotemas, por ejemplo, osteopontina y sialoprotema osea; y protemas Gla de hueso, por ejemplo, osteocalcina. La matriz osea es rica en factores de crecimiento, un grupo diverso de peptidos y pequenas protemas que regulan la formacion de nuevos tejidos a traves de sus efectos sobre el crecimiento, la funcion y la motilidad de las celulas. La MOD normalmente incluye protemas morfogeneticas oseas (PMO), una familia de factores de crecimiento multifuncionales con fuertes capacidades para inducir la formacion de hueso o cartflago nuevo, asf como otros factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante p1 (TGF-p1) y el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que desempena papeles cnticos en la regulacion del crecimiento oseo.

La MOD posee la mayona, idealmente todas, las propiedades biologicas del hueso nativo que son importantes para un injerto oseo exitoso. La MOD es osteoinductiva. Las PMO y otros factores de crecimiento en la MOD indican a las celulas pluripotenciales mesenquimales para que diferencien en celulas osteoprogenitoras para producir nuevo crecimiento oseo. Por lo tanto, la MOD permite que ocurra la regeneracion a lo largo de un defecto que necesita reparacion en lugar de solo en los bordes de un defecto. La MOD tambien es osteoconductiva, ya que es compatible con la neovascularizacion y la invasion de los osteoblastos.

La MOD se puede preparar a partir de uno o mas individuos de la misma especie que el receptor de la CIO; tambien se puede preparar a partir de individuos de una especie diferente que el receptor de la CIO. Por lo tanto, por ejemplo, una MOD se puede haber preparado a partir de un tejido porcino y usarse para hacer una CIO que se pueda implantar en un paciente humano. Las especies que pueden servir como receptoras de la CIO y donantes de tejidos u organos para la produccion de la MOD incluyen, sin limitacion, seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, mandriles o chimpances), cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, perros, gatos, conejos, conejillos de indias, jerbos, hamsteres, ratas o ratones. La MOD tambien se puede producir a partir de animales (por ejemplo, cerdos) que se han modificado geneticamente para que carezcan del resto galactosa-a-1,3-galactosa terminal. La produccion de dichos animales transgenicos se ha descrito anteriormente.

La MOD se puede producir a partir de huesos largos, de la boveda craneal o cualquier otro tipo de hueso. Normalmente, la MOD puede derivarse, por ejemplo, del tejido oseo de cadaver humano que se recoge no mas de aproximadamente 24 horas post mortem. La recoleccion se realiza despues de revisar el historial medico detallado del donante y la familia del donante. La sangre del donante se analiza para detectar diversas afecciones patogenas, por ejemplo, anticuerpos contra la hepatitis A, antfgeno de superficie de la hepatitis B, anticuerpos del nucleo de la hepatitis B, anticuerpos contra la hepatitis C, anticuerpos del virus VIH-1 y 2, antfgeno directo del VIH, anticuerpo del virus-1/2 de linfoma de celulas T humanas, sffilis y bacterias aerobicas y anaerobicas. Los tejidos circundantes tambien se analizan para contaminantes superficiales y medulares.

La MOD se puede preparar por una variedad de metodos. Todo lo que se requiere es que el metodo utilizado de como resultado la produccion de la MOD con las propiedades biologicas y estructurales descritas anteriormente (vease mas arriba). Las normas y directrices para la preparacion de la MOD a partir de tejidos humanos han sido desarrolladas por la United States Pharmacopeia y la American Association of Tissue Banks. Esencialmente, las muestras oseas se tratan para eliminar tejido, sangre y lfpidos, se fragmentan a un tamano relativamente uniforme, se desmineralizan por extraccion con acido, se esterilizan y liofilizan para su almacenamiento a largo plazo.

Despues de la prueba inicial, las muestras oseas se despojan de tejido blando. Para el transporte, el hueso puede incubarse en una solucion de agentes antimicrobianos, por ejemplo, bacitracina y polimixina B. Las muestras de hueso se pueden cortar en trozos pequenos utilizando metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, utilizando sierras y rectificadoras, y posteriormente se tratan para eliminar la medula osea, la sangre y los lfpidos. Los procedimientos tfpicos para la extraccion de medula osea, sangre y lfpidos pueden incluir la incubacion en etanol al 70% o una mezcla 1:1 de cloroformo:metanol durante 6 horas a temperatura ambiente. La desmineralizacion puede llevarse a cabo mediante extraccion con acido, por ejemplo, acido clorhndrico 0,6 N durante 3-24 horas. La extraccion de acido reduce el contenido de calcio a menos del 5 % del encontrado en la matriz osea no desmineralizada. Los expertos en la tecnica conocen los metodos para medir el contenido de calcio en los huesos. Las muestras luego se pueden enjuagar con agua y neutralizarse en un tampon biologicamente compatible, por ejemplo, fosfato de sodio 0,1 M. Tambien se pueden incluir otros procedimientos de extraccion diferencial, por ejemplo, extraccion con alcali-urea para eliminar moleculas que puedan tener efectos inhibidores sobre la osteoinduccion [Behnam et al. (2004) Connective Tissue Research 45: 257-60]. La MOD tambien se puede preparar como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 5.284.655. Para la produccion de la CIO, generalmente se usan MOD en forma de fragmentos (por ejemplo, partmulas, fibras e hilos) (vease a continuacion). Los fragmentos

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de la MOD se pueden producir mediante cualquiera de una variedad de metodos. Todo lo que se requiere es que los pasos utilizados en su produccion den como resultado matrices con las propiedades biologicas y estructurales descritas anteriormente. Dichos procedimientos son similares a los utilizados para fabricar fragmented de MTA de MTA congeladas o secas (por ejemplo, liofilizadas) (vease mas arriba). Los fragmented de la MOD pueden tener una forma irregular y una distribucion de tamano no uniforme. La molienda de la matriz osea en partteulas de tamano apropiado se puede llevar a cabo en varios puntos durante la preparacion, por ejemplo, despues de la eliminacion de lfpidos o despues de la extraccion de acido. El proceso de molienda normalmente se lleva a cabo usando una trituradora o mezcladora convencional y se puede realizar en matriz osea humeda o seca. Las fibras de la MOD se pueden producir como virutas de matriz osea. Los tamanos de partteula de la MOD generalmente son los mismos que los de MTA particuladas (vease mas arriba). Por ejemplo, la dimension mas larga para una partteula de la MOD puede variar de 50-3000 micrometros; por ejemplo, 100-250 micrometros; 100-500 micrometros; 100-850 micrometros; 100-1000 micrometros; 100-1500 micrometros; 100-2000 micrometros; 100-2500 micrometres; 1003000 micrometros; 125-300 micrometros; 125-500 micrometros; 125-600 micrometros; 125-850 micrometros; 200500 micrometros; 200-850 micrometros; 200-1000 micrometros; 200-1500 micrometros; 200-2000 micrometros; 2003000 micrometros; 500-1000 micrometros; 500-1500 micrometros; 500-2000 micrometros; 500-2500 micrometros; 500-3000 micrometros; 1000-2000 micrometros; 1000-2500 micrometros; o 1000-3000 micrometros. Se pueden obtener partteulas de tamanos particulares usando tamices disponibles en el mercado. Los fragmentos de la MOD se pueden preparar como se describe en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.284.655 y 5.510.396. Para el almacenamiento a largo plazo, la MOD fragmentada puede someterse a uno o mas ciclos de liofilizacion. La liofilizacion se puede llevar a cabo como se describe para la MTA (vease mas arriba). La esterilizacion puede realizarse en las muestras de la MOD usando cualquier metodo convencional, por ejemplo, tratamiento con oxido de etileno, irradiacion y, irradiacion con haz de electrones, irradiacion con rayos X o irradiacion ultravioleta.

La MOD tambien se puede obtener de fuentes comerciales, incluido cualquier banco de tejidos de la AATT, por ejemplo, LifeLink (Tampa, FL), LifeNet (Virginia Beach, VA) o AlloSource (Centennial, Colorado). Los ejemplos de la MOD incluyen Accell DBM100 (IsoTis OrthoBiologics, Irvine, California), Accell Connexus™ (IsoTis OrthoBiologics, Irvine, California), Allogro (AlloSource, Denver, Colorado), AlloMatrix Putty (Wright Medical Technologies, Arlington, Tennessee), DBX® Putty (Synthes, Paoli, Pennsylvania), DynaGraft™ (GenSci Regeneration Sciences and Innova Technologies Corporation, Toronto, Ontario, Canada), Grafton™ Allogenic Bone Matrix (Osteotech, Shrewsbury, Nueva Jersey), InterGro™ Putty (Interpore Cross International, Irvine, California), Opteform (Exactech, Gainesville, Florida), Optium (LifeNet, Virginia Beach, Virginia) y Osteofil™ (Regeneration Technologies, Alachua,

Se proporciona una preparacion muy adecuada de la MOD particulada con AlloCraft-MOD™ (LifeCell Corporation, Branchburg, NJ).

II. Preparacion de la CIO

Formacion de la CIO

La CIO proporcionada en este documento es un compuesto de MTA fragmentada y MOD fragmentada. La MTA fragmentada y la MOD fragmentada se pueden mezclar en cualquier proporcion que vane, en peso, desde el 5 % de MTA:95% de MOD hasta el 95% de MTA:5 % de MOD, por ejemplo, 5% de MTA:95 % de MOD; 10% de MTA:90 % de MOD; 15 % de MTA:85 % de MOD; 20 % de MTA:80 % de MOD; 25 % de MTA:75 % de MOD; 30 % de MTA:70 % de MOD; 35 % de MTA:65 % de MOD; 40 % de MTA:60 % de MOD; 45 % de MTA:55 % de MOD; 50 % de MTA:50 % de MOD; 55 % de MTA:45 % de MOD; 60 % de MTA:40 % de MOD; 65 % de MTA:35 % de MOD; 70 % de MTA:30 % de MOD; 75 % de MTA:25 % de MOD; 80 % de MTA:20 % de MOD; 85 % de MTA:15 % de MOD; 90 % de MTA:10 % de MOD, 95 % de MTA:5 % de MOD.

Se puede combinar cualquier tipo de MTA fragmentada y MOD fragmentada. Por lo tanto, se puede combinar cualquier forma de MTA fragmentada, por ejemplo, partteulas, hilos o fibras con cualquier forma de MOD fragmentada, por ejemplo, partteulas, hilos o fibras. Tambien se puede combinar mas de un tipo de MTA fragmentada y MOD fragmentada, por ejemplo, la MTA fragmentada puede incluir una mezcla de partteulas, fibras o hilos de MTA y la MOD puede incluir una mezcla de partteulas, fibras o hilos de MOD. Se puede usar cualquier combinacion de diferentes formas de MTA fragmentada y MOD fragmentada. Por lo tanto, tanto la MTA fragmentada como la MOD fragmentada pueden haberse liofilizado; o la MTA fragmentada y liofilizada o la MOD fragmentada y liofilizada se pueden combinar con MTA fragmentada congelada o MOD fragmentada congelada, o tanto la MTA fragmentada como la MOD fragmentada pueden haberse congelado.

Las mezclas de MTA fragmentada/MOD fragmentada utilizadas para la formacion de la CIO estan sustancialmente hidratadas. Las mezclas sustancialmente hidratadas pueden tener niveles de humedad entre el 20 % y el 70 %, es decir, al menos el 20-30 % de matrices totalmente hidratadas. Las matrices totalmente hidratadas son matrices que contienen la cantidad maxima de agua unida y no unida posible para esa matriz a presion atmosferica.

Tal como se usa en la presente memoria, las mezclas de MTA fragmentada/MOD fragmentada que estan sustancialmente hidratadas contienen no menos del 20 % (por ejemplo, no menos del: 20 %; 25 %; 30 %; 35 %; 40 %; 45 %; 50 %; 55 %; 60 %; 65 %; 70 %) del agua que contiene la mezcla de MTA fragmentada/MOD

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fragmentada relevante cuando esta completamente hidratada. Como se usa en el presente documento, una "mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada totalmente hidratada" es una mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada que contiene la cantidad maxima de agua unida y no unida posible para dicha mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada a presion atmosferica. Al comparar las cantidades de agua (unida y/o no unida) en dos (o mas) mezclas de MTA fragmentadas/MTA fragmentadas totalmente hidratadas, dado que la cantidad maxima de agua que una mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada preparada a partir de cualquier tejido en particular vana con la temperatura de la mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada, naturalmente, es importante que las mediciones para las dos (o mas) mezclas de MTA fragmentada/MOD fragmentada se realicen a la misma temperatura. El agua unida en una mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada es el agua en la mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada cuya movilidad molecular (rotacional y traslacional) es reducida (en comparacion con la pura voluminosa) debido a las interacciones moleculares (por ejemplo, enlaces de hidrogeno) entre el agua y las moleculas de la mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada y/u otros fenomenos (por ejemplo, tension superficial y restriccion geometrica) que limitan la movilidad del agua en la mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada. El agua no unida dentro de la mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada tiene las mismas propiedades de movilidad molecular que el agua voluminosa en soluciones acuosas diluidas tales como, por ejemplo, fluidos biologicos. Tal como se usa en la presente memoria, una "mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada sustancialmente hidratada" es una mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada que contiene, a presion atmosferica, mas del 20 % (por ejemplo, mas del 20 %; 25 %; 30 %; 35 %; 40 %; 45 %; 50 %; 55 %; 60 %; 65 %; 70 %) del agua no unida y/o unida que contendna la misma mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada a presion atmosferica cuando estuviera completamente hidratada. Las mediciones de las cantidades de agua en la mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada sustancialmente hidratada y completamente hidratada se deben hacer a la misma temperatura.

Como se usa en el presente documento, el termino "temperatura ambiente" significa temperaturas de entre 2 °C y 30 °C (por ejemplo, 4 °C a 10 °C; 4 °C a 15 °C; 4 °C a 25 °C; 4 °C a 30 °C; 10 °C a 15 °C; 10 °C a 20 °C; 10 °C a 25 °C; 10 °C a 30 °C; 15 °C a 20 °C; 15 °C a 25 °C; 15 °C a 30 °C; 20 °C a 25 °C; 20 °C a 25 °C; 20 °C a 30 °C; o 25 °C a 30 °C).

Con respecto a la MTA fragmentada liofilizada, es importante minimizar las fuerzas osmoticas y los efectos de la tension superficial durante la rehidratacion. El objetivo de la rehidratacion es aumentar la conservacion selectiva de la matriz de soporte extracelular. La rehidratacion apropiada se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante una incubacion inicial de la MTA fragmentada seca en un entorno de aproximadamente el 100 % de humedad relativa, seguido de la inmersion en una solucion de rehidratacion adecuada. Como alternativa, la MTA fragmentada seca puede sumergirse directamente en la solucion de rehidratacion, sin incubacion previa, en un entorno de alta humedad. La rehidratacion no debe causar dano osmotico a la muestra. La rehidratacion con vapor idealmente debena alcanzar un nivel de humedad residual de al menos el 15 % y la rehidratacion de fluidos debena dar como resultado un nivel de humedad de la MTA fragmentada de entre el 20 % y el 70 %. Dependiendo de la MTA fragmentada que se rehidrate, la solucion de rehidratacion puede ser, por ejemplo, solucion salina normal, PBS, lactato de Ringer o un medio de cultivo celular estandar. Cuando la mTa fragmentada esta sujeta a la accion de colagenasas endogenas, elastasas o actividad autolttica residual de celulas previamente eliminadas, se preparan aditivos para la solucion de rehidratacion y se incluyen inhibidores de la proteasa. Cuando haya presente actividad residual de radicales libres, se usan agentes para proteger contra radicales libres que incluyen antioxidantes y agentes enzimaticos que protegen contra el dano de radicales libres. Tambien se pueden incluir antibioticos para inhibir la contaminacion bacteriana. Tambien se pueden incluir agentes oncoticos en forma de proteoglicanos, dextrano y/o aminoacidos para prevenir el dano osmotico a la matriz durante la rehidratacion. La rehidratacion de una muestra seca es especialmente adecuada para este proceso, ya que permite una distribucion rapida y uniforme de los componentes de la solucion de rehidratacion. Ademas, las soluciones de rehidratacion pueden contener componentes espedficos, por ejemplo, difosfonatos para inhibir la fosfatasa alcalina y prevenir la calcificacion posterior. Tambien se pueden incluir agentes en la solucion de rehidratacion para estimular la neovascularizacion y la infiltracion de la celula huesped despues del trasplante de la matriz extracelular rehidratada. La rehidratacion y las etapas de mezcla pueden tener lugar en cualquier orden. Por lo tanto, la MTA fragmentada y la MOD fragmentada pueden rehidratarse por separado y posteriormente mezclarse, o mezclarse y posteriormente rehidratarse.

La MTA fragmentada y la MOD fragmentada se pueden mezclar en cualquier metodo que mantenga las propiedades osteoinductivas de la CIO. Por ejemplo, la MTA fragmentada y la MOD fragmentada pueden ponerse en un contenedor o recipiente y mezclarse con una espatula. Otro metodo adecuado de mezcla es a traves del movimiento redproco de la MTA fragmentada y MOD fragmentada en dos jeringas luer bloqueadas para formar una masilla homogenea.

La consistencia de la mezcla utilizada para hacer la CIO puede variar dependiendo de la concentracion de los componentes de la matriz. Si las matrices se suspenden a una concentracion relativamente baja, el material puede formar una pasta; en concentraciones mas altas, el material puede formar una masilla semisolida. Los expertos en la tecnica podnan establecer, utilizando experimentacion completamente rutinaria, proporciones relativas de una MTA fragmentada de interes y una MOD fragmentada de interes para mezclar con el fin de obtener una mezcla con una consistencia particular deseada.

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Una vez que los componentes de la MTA fragmentada y la MOD fragmentada se han mezclado, se pueden moldear en una forma adecuada para su uso en injertos oseos. Los materiales se pueden alicuotar directamente en jeringas para su posterior procesamiento. Como alternativa, la mezcla se puede moldear o conformar en cualquier forma que sea de un tamano o forma conveniente para su uso en injertos oseos. Dichas formas pueden incluir, sin limitacion, hojas, cubos, rectangulos, discos, cunas, esferas, ovalos, cilindros, conos o poliedros o cualquier forma que imite la forma del hueso nativo. La CIO tambien se puede moldear o conformar alrededor de un componente de andamiaje preparado a partir de cualquier material natural o sintetico apropiado.

La mezcla puede secarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica que de como resultado la conservacion de la osteoinductividad, por ejemplo, secado al aire, secado en atmosfera, o bajo una corriente, de gas inerte (por ejemplo, nitrogeno o argon), o secado en fno. La liofilizacion es una tecnica de rutina utilizada en la materia (vease, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos n.°: 4.619.257; 4.676.070; 4.799.361; 4.865.871; 4.964.280; 5.024.838; 5.044.165; 5.154.007; 6.194.136; 5.336.616; 5.364.756; y 5.780.295) y el equipo adecuado esta disponible en fuentes comerciales como Labconco (Kansas City, MI, Estados Unidos). La liofilizacion implica la eliminacion de agua u otro disolvente de un producto congelado mediante un proceso llamado sublimacion. La sublimacion ocurre cuando un lfquido congelado pasa directamente al estado gaseoso sin pasar por la fase lfquida. Los expertos en la tecnica son conscientes de las diferentes metodologfas de liofilizacion disponibles en la materia [vease, por ejemplo, "A Guide to Freeze-drying for the Laboratory"- una publicacion de servicio de la industria de Labconco, (2004); y Franks (1994) Proc. Inst. Refrigeration. 91: 32-39]. La liofilizacion se puede llevar a cabo mediante cualquiera de una variedad de metodos, que incluyen, por ejemplo, los metodos de colector multiple, por lotes o a granel.

Generalmente, la CIO se rehidrata antes del injerto o la implantacion. Como alternativa, la CIO se puede injertar o implantar sin rehidratacion previa; en este caso, la rehidratacion ocurre in vivo. Para la rehidratacion, la CIO puede incubarse en cualquier solucion biologicamente compatible, por ejemplo, solucion salina normal, solucion salina tamponada con fosfato, lactato de Ringer o medio de cultivo celular estandar. La CIO se incuba en una solucion durante un tiempo suficiente para que la CIO se hidrate por completo o para que recupere sustancialmente la misma cantidad de agua que contiene la mezcla con la que se fabrico la CIO. En general, el tiempo de incubacion en la solucion de rehidratacion sera de aproximadamente dos minutos a aproximadamente una hora, por ejemplo, de aproximadamente cinco minutos a aproximadamente 45 minutos, o de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos. La solucion de rehidratacion opcionalmente puede reemplazarse con solucion nueva tantas veces como se desee. Esto puede ser deseable cuando uno o mas de los agentes de reemplazo de agua utilizados en el proceso de reemplazo de agua no sea biologicamente compatible o sea toxico. La temperatura de las incubaciones generalmente sera temperatura ambiente (por ejemplo, de la habitacion) o puede estar entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 40 °C, por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 35 °C, y el recipiente que contiene la CIO y la solucion de rehidratacion se puede agitar suavemente durante la incubacion si asf se desea. Despues de la rehidratacion, la CIO se puede conformar o moldear adicionalmente en una forma adecuada para la implantacion.

La consistencia de la CIO rehidratada vana segun la cantidad de lfquido anadido a la CIO. Por ejemplo, si se anade una cantidad relativamente grande de fluido, la CIO puede formar una pasta despues de su adicion; si se anade una cantidad relativamente baja de fluido, la CIO puede formar una masilla semisolida despues de su adicion. Los expertos en la materia podran establecer, utilizando experimentacion completamente rutinaria, cantidades relativas de fluido para anadir a una CIO de interes con el fin de obtener una CIO rehidratada con una consistencia deseada.

La CIO puede contener una o mas sustancias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) (por ejemplo, compuestos de maltodextrina y polihidroxilo en general) que pueden mejorar la capacidad de la MOD para formar composiciones similares a pasta o de tipo masilla tras la rehidratacion. En general, los componentes de la MTA de la CIO proporcionan esta funcion y la CIO de la invencion puede no contener dichas sustancias portadoras. Cuando la CIO contiene las sustancias portadoras, se pueden anadir a la mezcla que se seca (por ejemplo, por liofilizacion) para crear la CIO (vease mas arriba). Asf, por ejemplo, la MTA, la MOD o ambas preparaciones de MTA y MOD utilizadas para crear dichas mezclas, pueden contener las sustancias portadoras. Como alternativa, las sustancias portadoras se pueden anadir a la CIO antes, al mismo tiempo que, o despues de la rehidratacion de la CIO. Sustancias portadoras adecuadas, y en particular los compuestos de polihidroxilo adecuados, se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 5.284.655 y 5.510.396, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en este documento como referencia.

Osteoinductividad

La CIO como se proporciona en este documento es osteoinductiva, es decir, puede inducir la formacion de hueso nuevo en o sobre tejido oseo o en o sobre tejido no oseo en un receptor estimulando el reclutamiento de celulas pluripotenciales formadoras de hueso. Aunque la invencion no esta limitada por ningun mecanismo de accion particular, el crecimiento oseo generalmente esta mediado por tres tipos de celulas, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos que son responsables respectivamente de la produccion, mantenimiento y resorcion del hueso. La osteoinductividad de la CIO puede evaluarse mediante metodos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica. Se han desarrollado ensayos tanto in vivo como in vitro para la osteoinductividad. Los modelos in vivo pueden incluir la implantacion de la CIO en un sitio intramuscular en un modelo animal comprometido con el sistema

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inmunitario, por ejemplo, una rata o un raton sin pelo, o un analisis de la CIO en modelos de defectos esqueleticos. La cantidad de hueso producido en un sitio de implantacion puede evaluarse mediante metodos convencionales que incluyen analisis histomorfometricos, mediciones de contenido de calcio o ensayos enzimologicos que controlan los niveles de enzimas que son abundantes en osteoblastos formadores de hueso, por ejemplo, fosfatasa alcalina. Los modelos de cultivo celular in vitro tambien se pueden usar para evaluar el potencial osteoinductivo. Se ha demostrado que ciertas lmeas celulares, por ejemplo, celulas de osteosarcoma Saos 2, proliferan cuando se cultivan en presencia de agentes osteoinductores; un mdice de esta actividad proliferativa puede correlacionarse con el potencial osteoinductor de la CIO.

Almacenamiento

La CIO deshidratada puede almacenarse durante un penodo de tiempo prolongado, por ejemplo, 1 dfa, 2 dfas, 5 dfas, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos. El almacenamiento puede realizarse a temperatura ambiente o en refrigeracion, por ejemplo, en lfquido N2 o a -80 °C, - 50 °C, -20 °C, -10 °C, 0 °C, 4 °C, 10 °C, 20 °C o 25 °C.

Opcionalmente, la CIO puede someterse a tratamientos para disminuir la biocarga. Se espera que este proceso disminuya el nivel de microorganismos infecciosos dentro de la CIO. Como se usa en este documento, un proceso utilizado para inactivar o matar "sustancialmente todos" los microorganismos (por ejemplo, bacterias, hongos (incluyendo levaduras) y/o virus) en la CIO es un proceso que reduce el nivel de microorganismos en la CIO por lo menos 10 veces (por ejemplo, al menos: 100 veces, 1000 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces, 108 veces, 109 veces o incluso 1010 veces) en comparacion con el nivel en la CIO antes del proceso. Se puede usar cualquier metodo de ensayo convencional para determinar si el proceso ha tenido exito. Estos ensayos pueden incluir tecnicas que miden directamente el crecimiento microbiano, por ejemplo, el cultivo de muestras de hisopo en medios de crecimiento artificiales, o metodos de deteccion molecular, tales como PCR cuantitativa. La CIO segun la invencion se irradia, en particular la CIO puede exponerse a radiacion y, x, haz de electrones, y/o ultravioleta (longitud de onda de 10 nm a 320 nm, por ejemplo, de 50 nm a 320 nm, de 100 nm a 320 nm, de 150 nm a 320 nm, de 180 nm a 320 nm, o de 200 nm a 300 nm) para disminuir el nivel de, o eliminar, bacterias viables y/o hongos y/o virus infecciosos. Mas importante que la dosis de radiacion a la que esta expuesto la CIO es la dosis absorbida por la CIO. Mientras que para una CIO mas gruesa, la dosis absorbida y la dosis de exposicion generalmente estaran cercanas, en una CIO mas delgada la dosis de exposicion puede ser mayor que la dosis absorbida. Ademas, si se administra una dosis particular de radiacion a una tasa de dosis baja durante un penodo de tiempo prolongado (por ejemplo, de dos a 12 horas), se absorbe mas radiacion que si se administra a una tasa de dosis alta durante un breve penodo de tiempo (por ejemplo, de 2 segundos a 30 minutos). Un experto en la tecnica sabra como evaluar si, para una CIO particular, la dosis absorbida es significativamente inferior a la dosis a la que esta expuesta la CIO y como explicar esa discrepancia al seleccionar una dosis de exposicion. Las dosis absorbidas apropiadas de irradiacion con rayos y, x o haz de electrones pueden ser de 6 kGy-45 kGy, por ejemplo, 8 kGy-38 kGy, 10 kGy-36 kGy, 12 kGy-34 kGy. Por lo tanto, la dosis de irradiacion con rayos y, x o haz de electrones puede ser, por ejemplo, de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 kGy.

Los componentes de la CIO, la MTA fragmentada y la MOD fragmentada, mezclados o separados, pueden irradiarse (a cualquiera de las dosis anteriores) en cualquier etapa de la preparacion de la CIO. Ademas, la irradiacion de la CIO puede ser la segunda o incluso la tercera exposicion de los componentes de la CIO a la irradiacion. Asf, por ejemplo, la MTA fragmentada y la MOD fragmentada pueden irradiarse por separado, mezclarse para formar la CIO y posteriormente la CIO puede irradiarse.

La CIO tambien se puede esterilizar con acido peracetico. (Vease, Patente de Estados Unidos n.° 5.460.962 cuya descripcion se incorpora en su totalidad en este documento como referencia). De este modo, el acido peracetico se puede anadir, por ejemplo, a la mezcla de MTA fragmentada/MOD fragmentada antes del secado de la mezcla.

Generalmente, la CIO se transporta al hospital o centro de tratamiento apropiado antes de la rehidratacion y la rehidratacion la realiza el personal clmico inmediatamente antes del injerto o la implantacion. Sin embargo, la rehidratacion se puede realizar antes del transporte al hospital o centro de tratamiento; en este caso, la CIO generalmente se transportara en condiciones de refrigeracion. El transporte puede realizarse a traves de portadores convencionales y bajo condiciones convencionales relativas a la exposicion a la temperatura y tiempos de entrega normales.

III. Tratamiento de trastornos oseos Trastornos oseos

Las CIO proporcionadas en este documento son utiles para tratar cualquiera de una amplia gama de trastornos oseos que requieren mejora o reparacion. Los trastornos oseos pueden surgir de diversas condiciones medicas, por ejemplo, lesiones traumaticas, malformaciones congenitas, resecciones oncologicas e infeccion. Comun a todos estos trastornos son los defectos en el sitio de curacion que son particularmente vulnerables a uniones o no uniones retrasadas. Por lo tanto, las aplicaciones de injerto oseo incluyen aumento de curacion de fracturas, reconstruccion

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de defectos esqueleticos, fusion de articulaciones, procedimientos de reconstruccion articular, fracturas de calcaneo conminutas, empaquetaduras para artrodesis, es decir, fusion inducida quirurgicamente o espontanea de una articulacion, relleno de espacios en el hueso que surgen como resultado de la reseccion de tumores oseos y relleno de espacios en el hueso infectado desbridado.

Ciertos grupos de pacientes tienen un alto riesgo de trastornos oseos. La CIO proporcionada en este documento se puede usar para tratar afecciones derivadas de estos trastornos. Por ejemplo, los pacientes con afecciones que resultan en huesos debiles, por ejemplo, osteoporosis u osteogenesis imperfecta, tienen una alta propension a la fractura o lesion grave. Otras condiciones medicas pueden impedir el proceso normal de curacion de fracturas. Los individuos en desventaja para la curacion osea incluyen aquellos con condiciones en las que la resorcion osea se produce a un ritmo mayor que la deposicion osea tal como osteoporosis, osteopenia, neuroartropatfa de Charcot, asf como aquellos pacientes expuestos a agentes que comprometen la curacion osea, por ejemplo, agentes quimioterapeuticos, medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o nicotina sistemica resultante del tabaquismo.

Por lo tanto, la CIO proporcionada en este documento se puede usar para la reparacion de huesos con cualquiera de los danos o defectos descritos anteriormente. La CIO se puede usar en cualquiera de sus formas y prepararse mediante cualquiera de los procesos enumerados anteriormente. Los huesos a los que se pueden aplicar dichos metodos de tratamiento incluyen, sin limitacion, huesos largos (por ejemplo, tibia, femur, humero, radio, cubito o perone), huesos de la mano y el pie (por ejemplo, hueso calcaneo o hueso del escafoides), huesos de la cabeza y el cuello (por ejemplo, hueso temporal, hueso parietal, hueso frontal, maxilar superior, mandfbula) o vertebras. Como se ha mencionado anteriormente, los defectos de separacion cntica del hueso se pueden tratar con la CIO. En dichos defectos de separacion cntica, las separaciones pueden llenarse con, por ejemplo, una masilla de la CIO rehidratada o con cualquier forma de la CIO moldeada y conformada como se ha descrito anteriormente.

La CIO tambien se puede utilizar para ayudar en la incorporacion de otros materiales de injerto oseo, andamiajes o dispositivos estructurales de soporte. Por ejemplo, la CIO se puede usar junto con un trasplante o implante que muestre resistencia mecanica, para aumentar los injertos corticales o en procedimientos de alargamiento para aumentar la conectividad del injerto estructural con el hueso del huesped. Estos otros materiales de injerto oseo, andamiajes o dispositivos estructurales de soporte pueden incluir metales, ceramicas y polfmeros naturales y sinteticos. Los materiales ceramicos pueden incluir ceramicas derivadas de fuentes naturales, por ejemplo, hidroxiapatita coralina o compuestos sinteticos, por ejemplo, hidroxiapatita sintetica o p-fosfato tricalcico. Los polfmeros naturales utiles en el injerto oseo pueden incluir almidon, fibrina, colageno, quitosano, acido hialuronico y polihidroxibutirato. Los polfmeros sinteticos adecuados pueden ser poli (a-hidroxiacidos, poli (£-caprolactona, poli (propilen fumaratos), poli (iminocarbonatos de BPA), poli (fosfacenos). Se entiende que dichos soportes adicionales o componentes de soporte ffsico pueden tener cualquier tamano o forma convenientes, por ejemplo, hojas, cubos, rectangulos, discos o esferas.

La CIO puede: (a) envolverse alrededor de un hueso que esta danado o que contiene un defecto; (b) ponerse en la superficie de un hueso que esta danado o tiene un defecto; (c) enrollarse e insertarse en una cavidad, separacion o espacio en el hueso; o (d) colocarse en un sitio no oseo para inducir la formacion de hueso. Uno o mas (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 o mas) de dichas CIO se pueden utilizar en cualquier sitio en particular. Los injertos se pueden mantener en su lugar mediante, por ejemplo, suturas, grapas, tachuelas o pegamentos o selladores tisulares conocidos en la tecnica. Como alternativa, si, por ejemplo, se empaquetan con suficiente fuerza en un defecto o cavidad, es posible que no necesiten ningun dispositivo de seguridad.

Se entiende que la CIO se puede aplicar a un tejido u organo con el fin de reparar o regenerar ese hueso y/o un hueso vecino. Asf, por ejemplo, una CIO puede insertarse en un defecto de separacion cntica de un hueso largo para generar un equivalente de periosteo que rodea el defecto de separacion y el equivalente de periostio a su vez puede estimular la produccion de hueso dentro de la separacion en el hueso. De manera similar, se puede implantar una CIO en un alveolo de extraccion dental para promover la regeneracion de cualquier hueso en la base del alveolo que se haya perdido como resultado, por ejemplo, de la extraccion del diente. Una CIO tambien se puede usar en fusion espinal.

Administracion de agentes terapeuticos

La CIO tambien se puede usar como andamiaje para la formacion de hueso nuevo y/o como vehfculo para el suministro de agentes que ayudan en la curacion osea y la formacion de hueso nuevo. Estos agentes pueden incluir celulas, factores de crecimiento o terapias de moleculas pequenas. Estos agentes se pueden incorporar a la CIO antes de colocar las matrices en el sujeto. Como alternativa, se pueden inyectar en la CIO que ya esta en su lugar en un sujeto. Estos agentes se pueden administrar solos o en combinacion. Por ejemplo, una CIO se puede usar para suministrar celulas, factores de crecimiento y terapias de molecula pequena al mismo tiempo, o para administrar celulas mas factores de crecimiento, o celulas mas agentes terapeuticos de molecula pequena, o factores de crecimiento mas agentes terapeuticos de molecula pequena.

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Naturalmente, la administracion de los agentes mencionados anteriormente puede ser unica o multiple (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 80, 90, 100 o tantas como sea necesario). Cuando sean multiples, las administraciones pueden ser a intervalos de tiempo facilmente determinables por un experto en la tecnica. Las dosis de las diversas sustancias y factores variaran enormemente segun la especie, edad, peso, tamano y sexo del sujeto y tambien pueden determinarse facilmente por un experto en la materia.

Las celulas histocompatibles y viables pueden restaurarse en la CIO para producir un injerto aceptado permanentemente que puede ser remodelado por el huesped. Las celulas se pueden derivar del destinatario deseado o de un donador alogenico. Los tipos de celulas con los que se puede repoblar la CIO incluyen, pero no se limitan a, celulas pluripotenciales embrionarias (ESC), celulas pluripotenciales mesenquimales (MSC) adultas o embrionarias, procondroblastos, condroblastos, condrocitos, pro-osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, monocitos, celulas pluripotenciales hematopoyeticas, celulas epiteliales gingivales, celulas endoteliales, fibroblastos o celulas pluripotenciales del ligamento periodontal. Se puede usar cualquier combinacion de dos o mas de estos tipos de celulas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez) para repoblar la CIO. Los metodos para aislar tipos celulares espedficos son bien conocidos en la tecnica. Las celulas donantes se pueden usar directamente despues de la recogida o pueden cultivarse in vitro usando tecnicas convencionales de cultivo de tejidos. Las celulas donantes pueden infundirse o inyectarse en la CIO in situ justo antes de la colocacion de la CIO en un sujeto mairnfero. Las celulas donantes tambien se pueden cocultivar con la CIO usando metodos de cultivo de tejidos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica.

Los factores de crecimiento que pueden incorporarse en la CIO incluyen cualquiera de una amplia gama de factores de crecimiento celular, factores angiogenicos, factores de diferenciacion, citoquinas, hormonas y quimioquinas conocidas en la tecnica. Se puede administrar cualquier combinacion de dos o mas de los factores a un sujeto por cualquiera de los medios enumerados a continuacion. Los ejemplos de factores relevantes incluyen protemas morfogeneticas oseas (PMO), en particular, PMO 2, 4, 6 y 7 (PMO-7 tambien se llama OP-1), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) (por ejemplo, FGF1-10), factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de queratinocitos, factores de crecimiento de celulas endoteliales vasculares (VEGF) (por ejemplo, VEGF A, B, C, D y E), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF) I e IGF-II, interferones (IFN) (por ejemplo, IFN-a, p, o y), factores de crecimiento transformantes (TGF) (por ejemplo, TGF a o p), factor de necrosis tumoral a, una interleucina (IL) (por ejemplo, IL-1-IL-18), Osterix, Hedgehogs (por ejemplo, sonicos o desiertos), SOX9, hormona paratiroidea, calcitonina, prostaglandinas o acido ascorbico.

Los factores que son protemas tambien pueden administrarse a un sujeto receptor administrando al sujeto: (a) vectores de expresion (por ejemplo, plasmidos o vectores virales) que contienen secuencias de acido nucleico que codifican uno cualquiera o mas de los factores anteriores que son protemas; o (b) celulas que han sido transfectadas o transducidas (de forma estable o transitoria) con dichos vectores de expresion. Dichas celulas transfectadas o transducidas se derivaran preferentemente de, o seran histocompatibles con, el receptor. Sin embargo, es posible que solo se requiera una breve exposicion al factor y, por lo tanto, tambien se pueden usar celulas histoincompatibles.

La CIO tambien se puede usar como vehmulo para la administracion localizada de farmacos de molecula pequena. La osteomielitis, es decir, la infeccion de hueso, generalmente se trata mediante legrado de la region infectada, seguido de injerto oseo y administracion sistemica a largo plazo de antibioticos. La incorporacion de agentes antimicrobianos en la CIO puede proporcionar altas concentraciones locales de antibioticos, lo que minimiza el riesgo de efectos adversos asociados con altas dosis sistemicas a largo plazo. Un agente antimicrobiano puede ser un antibiotico. Los ejemplos de antibioticos incluyen, sin limitacion, cualquier clase representativa de antibioticos, por ejemplo, 1) los aminoglucosidos, tales como gentamicina, kanamicina, neomicina, estreptomicina o tobramicina; 2) las cefalosporinas, tales como cefaclor, cefadroxilo o cefotaxima; 3) los macrolidos, tales como azitromicina, claritromicina o eritromicina; 4) las penicilinas, tales como amoxicilina, carbenicilina o penicilina; 5) los peptidos, como la bacitracina, polimixina B o vancomicina; 6) las quinolonas, tales como ciprofloxacina, levofloxacina o enoxacina; 7) las sulfonamidas, tales como sulfametazol, sulfacetimida; o sulfametoxazol; 8) las tetraciclinas, tales como doxiciclina, minociclina o tetraciclina; 9) otros antibioticos con diversos mecanismos de accion como la rifampicina, el cloranfenicol o la nitrofuratoma.

La CIO tambien se puede usar como vehmulo de administracion para otros agentes antimicrobianos, por ejemplo, agentes antifungicos y agentes antivirales.

La CIO tambien se puede usar para la administracion localizada de agentes quimioterapeuticos. Los tumores oseos malignos generalmente se tratan mediante reseccion tumoral y administracion sistemica de farmacos contra el cancer. La incorporacion de agentes anticancengenos en la CIO puede proporcionar altas concentraciones locales de quimioterapia, mitigando asf la toxicidad asociada con dosis sistemicas altas a largo plazo. Los ejemplos de clases de agentes quimioterapeuticos incluyen, sin limitacion, 1) agentes alquilantes, por ejemplo, ciclofosfamida; 2) antraciclinas, por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina; 3) disruptores cicloesqueleticos, por ejemplo, paclitaxel; 4) inhibidores de topoisomerasa, por ejemplo, etoposido; 5) analogos de nucleotidos, por ejemplo, azacitidina, fluorouracilo, gemcitabina; 6) peptidos, por ejemplo, bleomicina; 7) agentes basados en platino, por ejemplo,

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carboplatino, cisplatino; 8) retinoides, por ejemplo, acido retinoico todo trans; y 9) alcaloides de la vinca, por ejemplo, vinblastina o vincristina.

IV. Artfculos de manufactura

La CIO proporcionada en este documento puede incluirse en un artfculo de fabricacion o como kit. En una realizacion, el kit puede incluir la CIO, material de embalaje o un prospecto, que comprende instrucciones para un metodo de tratamiento. El material de embalaje puede incluir componentes que promuevan la estabilidad a largo plazo y la esterilidad de la CIO. En otra realizacion, un kit puede incluir componentes de la CIO, de modo que el usuario puede preparar la CIO directamente. Dichos kits pueden incluir un componente de MOD fragmentada, un componente de MTA fragmentada, instrucciones para un metodo de mezcla de los componentes para fabricar la CIO y los materiales de embalaje adecuados. Los kits tambien pueden incluir tampones biologicamente compatibles para la hidratacion de los componentes y la CIO.

Se han descrito varias realizaciones de la invencion. Sin embargo, se entendera que pueden realizarse diversas modificaciones sin apartarse del alcance de la invencion. Por consiguiente, otras realizaciones estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1

Metodos y materiales

Preparacion de matriz osea desmineralizada

La MOD utilizada en los experimentos descritos en los Ejemplos 4 y 5 era un componente del kit AlloCraft MOD™ fabricado por LifeCell Corporation y suministrado por LifeLink. La MOD se puede preparar de la siguiente manera. Las muestras de hueso de cadaver se lavan para quitar el tejido blando y la sangre. El hueso lavado se corta en trozos pequenos, se desinfecta mediante una serie de incubaciones en peroxido de hidrogeno y alcohol, y se muele en partfculas de 125-850 micrometros de tamano.

Despues del tratamiento con HCl diluido para reducir el contenido de calcio a menos del 5 %, la MOD resultante se liofiliza y se usa para los experimentos descritos en los Ejemplos 4 y 5 a continuacion.

Preparacion de matriz de tejido acelular

En los experimentos descritos en los Ejemplos 4 y 5 a continuacion, las MTA pertinentes se produjeron utilizando la metodologfa patentada de LifeCell y eran componentes de los kits AlloCraft-MOD™ fabricados por LifeCell Corporation. Cuando la MTA se preparo a partir de la dermis, se denomina matriz dermica acelular (MDA). Se obtuvo piel de donantes humanos de varios bancos de tejidos y hospitales por todo Estados Unidos que recolectaron muestras de piel de donantes fallecidos despues de obtener el consentimiento de los familiares.

La piel adquirida se coloco en medio de cultivo de tejidos RPMI 1640 que contema antibioticos (penicilina y estreptomicina) y se envio a las instalaciones de LifeCell en Branchburg, Nueva Jersey, sobre hielo humedo, en el mismo medio. Al llegar, se midio la temperatura del recipiente del tejido de la piel y el tejido de la piel se descarto si la temperatura era superior a 10 °C. El medio RPMI 1640 se cambio en condiciones asepticas y la piel se almaceno a 4 °C, mientras se realizaban pruebas serologicas para varios patogenos (Treponema pallidum (analizado por los metodos RPR y VDRL), VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) I y II, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y HTLV (virus linfotropico humano T) I y II) en una muestra de la piel. La piel se descarto si se detecta alguno de los patogenos. De lo contrario, se transfirio a una solucion acuosa precongelacion del 35 % en peso a volumen (p/v) de maltodextrina (M180) en solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Despues de 2 a 4 horas a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C), la solucion que contema la piel se congelo a -80 °C y se almaceno en un congelador a -80 °C hasta que se proceso como se describe a continuacion.

La piel congelada se descongelo a 37 °C en un bano de agua hasta que no se vefa hielo. El lfquido residual se dreno y la piel se sometio a las siguientes etapas de procesamiento: (i) desepidermizacion; (ii) descelularizacion; (iii) lavado.

(i) Desepidermizacion: se elimino la epidermis cutanea incubando la muestra de tejido con agitacion suave en una solucion de desepidermizacion (NaCl 1 M, Triton X100 al 0,5% en p/v, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) 10 mM) durante 8-32 horas a temperatura ambiente. Para la piel de cerdo, esta incubacion se realizo durante 30-60 horas a temperatura ambiente. La capa epidermica se elimino ffsicamente de la dermis. La epidermis se descarto y la dermis se sometio a un procesamiento adicional como se describe a continuacion.

(ii) Descelularizacion: para eliminar celulas muertas y eliminar componentes y restos celulares, la dermis se enjuago durante 5 a 60 minutos con una solucion de descelularizacion (desoxicolato sodico al 2 % en p/v, EDTA

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10 mM, tampon HEPES 10 mM, pH 7,8-8,2) y posteriormente se incubaron con agitacion suave en un lote nuevo de la misma solucion durante 12-30 horas a temperatura ambiente.

(iii) Lavado: el regimen de lavado sirve para lavar las celulas muertas, los restos celulares y los productos qmmicos residuales utilizados en las etapas de procesamiento previos. La dermis descelularizada se transfirio a una primera solucion de lavado (solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Triton X-100 al 0,5 % en p/v y EDTA 10 mM), que luego se incubo con agitacion suave durante 5 a 60 minutos a temperatura ambiente. La dermis se sometio luego a tres lavados secuenciales en una segunda solucion de lavado (PBS que contema EDTA 10 mM) con agitacion suave a temperatura ambiente. Los primeros dos lavados fueron cortos (15-60 minutos cada uno) y el tercer lavado fue largo (6-30 horas).

Despues del regimen de lavado, la matriz de tejido acelular resultante se uso para preparar MTA particulada como se ha descrito anteriormente en la seccion "matrices de tejido acelular".

Preparacion de la CIO. La CIO se preparo a partir de dos componentes, la MTA particulada y la MOD particulada, suministrados con los kits AlloCraft-MOD™. La MTA particulada incluida en el kit era Cymetra, una matriz dermica acelular proporcionada en forma de partfculas micronizadas (50-150 pm) de AlloDerm®, que se habfa lavado para eliminar el crioprotector y se resuspendio en solucion salina esteril. Para preparar el componente de MTA particulada, se suspendieron 5 g de Cymetra en aproximadamente 200 ml de solucion salina de NaCl al 0,9 % esteril (Irrigation USP, Abbott, Laboratories, Abbott Park, Illinois) en un vaso de plastico, se agito y posteriormente se centrifugo. Se retiro el sobrenadante y se anadieron 10 ml de solucion salina a la copa para resuspender la MTA. Luego se transfirieron 8 ml de MTA resuspendida a una jeringa de 10 ml. Para preparar la MOD particulada, 1 ml (~0,4 g) de la MOD particulada se coloco en una jeringa de 3 ml y se hidrato mediante la adicion de 1 ml de solucion salina esteril. La MTA particulada hidratada (8 ml) y la MOD particulada hidratada (6 ml) se mezclaron mediante una mezcla de jeringa a jeringa con movimiento redproco de dos jeringas luer bloqueadas. La mezcla se transfirio luego en alfcuotas de 1 ml a una serie de jeringas de 3 ml, se congelo a -80 °C y posteriormente se seco a vacfo en condiciones convencionales usando un liofilizador (sistema de secado por congelacion Savant Modulyo, Newark, NJ). A continuacion, las jeringas se taparon con tapones de sellado y se sellaron en bolsas de aluminio. La composicion de injerto oseo resultante tema forma cilmdrica y aproximadamente 15 mm de largo y 0,7 mm de diametro. Para su uso, la composicion de injerto oseo liofilizada se hidrato con 1,0 ml de solucion salina durante 15 minutos antes de la implantacion.

Irradiacion de muestra. Las muestras se irradiaron con rayos y a -80 °C en un contenedor aislado de hielo seco en STERIS Isomedix Services (Whippany, NJ) a una dosis administrada de 26,6-28,9 kGy. Las muestras se irradiaron con haz de electrones a temperatura ambiente en Titan Scan Technologies (Denver, CO) a una dosis administrada de 14-16 kGy.

Preparacion de los animales e implantacion de muestras. Se llevaron a cabo estudios de implantes en animales en Toxikon Laboratories (Bedford, mA). Se anestesiaron ratas atfmicas sin pelo y se creo quirurgicamente una bolsa en la pata trasera entre los musculos semimembranoso y aductor corto. Se administro aproximadamente 0,1-0,2 ml de material de prueba a traves de una jeringa dentro de la bolsa muscular. Despues de 28 dfas, las ratas se sacrificaron con CO2 gaseoso y los implantes se extirpan quirurgicamente. La muestra de biopsia de cada sitio se dividio en dos partes iguales. La mitad se fijo en formalina tamponada neutra al 10 % y se proceso para la histologfa. La otra mitad se congelo a -80 °C y se proceso para el analisis de la actividad de la fosfatasa alcalina.

Evaluacion histologica de la formacion de hueso nuevo. Las muestras de biopsia se evaluaron histologicamente para determinar la presencia de cartflago recien depositado y matriz osea recien mineralizada. Las muestras fijas se procesaron para histologfa usando tecnicas convencionales y se tineron con hematoxilina/eosina y azul de toluidina. El analisis microscopico se realizo en muestras codificadas. Cada muestra se puntuo para la presencia de nueva formacion osea en una escala de 0 a 5 basada en el siguiente sistema de puntuacion:

0 = sin hueso nuevo

1 = al menos 1 sitio de formacion de hueso nuevo.

2 = mas de 1 sitio de hueso nuevo con < 10 % de area de hueso nuevo en la biopsia total.

3 = sitios multiples de hueso nuevo con > 10% de area de hueso nuevo en la biopsia total, aunque con distribucion no uniforme de los sitios.

4 = numero multiple y significativo de sitios de hueso nuevo bien distribuidos con una distribucion uniforme durante toda la biopsia.

5 = formacion extensa de hueso nuevo durante toda la biopsia que representa la mayona de la biopsia.

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Evaluacion enzimatica de la formacion de hueso nuevo. Los osteoblastos, o celulas formadoras de hueso, sintetizan la enzima fosfatasa alcalina que desempena un papel clave en la mineralizacion del hueso nuevo. Los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina en una muestra pueden ser un indicador de la formacion de hueso nuevo.

Las muestras de biopsia congeladas se descongelaron y se diseccionaron para que queden visualmente libres de tejido muscular. Las muestras se homogeneizaron en tampon AP (2-amino-2-metil-1-propanol 1,2 M, pH 10,5 a 25 °C) y los lisados resultantes se centrifugaron para sedimentar los restos no solubilizados. Para realizar el ensayo, se anadieron 200 pl del sobrenadante a 250 pl de tampon AP que contema el sustrato de fosfatasa alcalina (fosfato de p-nitrofenol, 4 mg/ml) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. La produccion del producto de n-nitrofenol se controlo por espectrofotometna a 415 nm. Se uso una curva de calibracion separada (derivada usando cantidades conocidas de n-nitrofenol) para determinar la cantidad de producto generado por las muestras de biopsia. El contenido total de protema de los extractos se midio usando un kit de ensayo de protema BCA de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Illinois). La actividad de la fosfatasa alcalina en las muestras experimentales se normalizo para la concentracion de protema y se expreso como pm de pNP/mg de protema/h.

Criterios de aceptacion. Una puntuacion histologica de > 1 y una actividad AP de > 1 pm/mg de protema/min se consideraron como evidencia de nueva formacion de hueso.

Ejemplo 2. Osteoinductividad de la CIO: esterilizacion con rayos y.

Diseno experimental. La osteoinductividad de la CIO se comparo con la de las formulaciones en las que el componente particulado de la MOD se habfa sometido a tratamientos (resumidos en la Tabla 1 a continuacion) disenados para explorar sistematicamente la relacion entre las condiciones de almacenamiento y la osteoinductividad. Las variables relevantes incluyeron la temperatura de almacenamiento, la esterilizacion con rayos Y y el momento de mezcla de los componentes de la MOD particulada y la MTA particulada en relacion con el almacenamiento del material particulado MOD, es decir, si la MOD particulada y la MTA particulada se combinaron antes o despues del almacenamiento de la MOD particulada. Todas las muestras experimentales se almacenaron durante 6 meses antes de la implantacion. En este estudio se utilizaron 16 animales. Se implantaron muestras en animales de prueba como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, "Preparacion de animales e implantacion de muestras". Cada animal recibio un implante en cada extremidad posterior. Para controlar la variabilidad entre animales individuales, el material de prueba en cada grupo (A a H) se dividio en 4 almuotas y cada almuota se implanto en un sitio diferente en un animal diferente. Despues de 28 dfas, las muestras se sometieron a biopsia y se evaluo el potencial osteoinductivo de las muestras como se describe en el Ejemplo 1 bajo "Evaluacion histologica de formacion de hueso nuevo" y "Evaluacion enzimatica de la formacion de hueso nuevo".

Los grupos experimentales se designaron A a H y estaban sujetos a las siguientes condiciones. En los grupos F y G, la MOD particulada se combino con MTA particulada para formar una CIO. La CIO se preparo de acuerdo con el metodo ("Preparacion de la CIO") descrito en el Ejemplo 1. Es decir, la MOD particulada y la MTA particulada se hidrataron, se combinaron para formar una mezcla, se liofilizaron, se irradiaron y se almacenaron durante 6 meses antes de la implantacion. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en estas muestras se combinaron antes del almacenamiento. El Grupo F se almaceno a -80 °C y el Grupo G se almaceno a temperatura ambiente.

En los Grupos A y B, la MOD particulada (en forma de polvo) se almaceno como un polvo seco irradiado con rayos Y. Al final del penodo de almacenamiento, la MOD particulada se hidrato, se combino con MTA particulada hidratada y se implanto. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en estas muestras se combinaron despues del almacenamiento. El Grupo A se almaceno a -80 °C y el Grupo B se almaceno a temperatura ambiente.

En los Grupos C, D y E, la MOD particulada se almaceno como una pasta, es decir, despues de la hidratacion. Para estas muestras, se combino 1 ml (~0,4 g) de la MOD particulada con 1 ml de solucion salina como se describe anteriormente en "Preparacion de la CIO". La pasta de la MOD particulada en las Muestras D y E se irradio con rayos Y despues de la hidratacion y la pasta de la MOD particulada en la Muestra C no se irradio con rayos Y. Todas las muestras de este grupo se almacenaron y, al final del penodo de almacenamiento, se combinaron con MTA particuladas hidratadas y se implantaron. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en estas muestras se combinaron despues del almacenamiento. El Grupo D se almaceno a -80 °C y los Grupos C y E se almacenaron a temperatura ambiente.

En el Grupo H, un control para los factores relacionados con el almacenamiento y la irradiacion, polvo de la MOD particulada no irradiado se hidrato y se mezclo con MTA particulada hidratada inmediatamente antes de la implantacion. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en este grupo se combinaron sin ningun penodo intermedio de almacenamiento.

Tabla 1: Diseno experimental

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTA y MOD combinadas (en relacion con el penodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion Y

A: polvo despues del almacenamiento -80 °C sf

B: polvo despues del almacenamiento TA sf

C: pasta despues del almacenamiento TA no

D: pasta despues del almacenamiento -80 °C sf

E: pasta despues del almacenamiento TA sf

F: CIO(seca) antes del almacenamiento -80 °C sf

G: CIO(seca) antes del almacenamiento TA sf

H: polvo no aplicable Sin almacenamiento no

Resultados. Las puntuaciones de histologfa para cada alfcuota implantada (las columnas marcadas 1, 2, 3 y 4) se muestran en la Tabla 2. Ambos implantes de CIO (Grupos F y G) teman puntuaciones histologicas de > 1 y por lo 5 tanto mostraron evidencia histologica de formacion de hueso nuevo.

Tabla 2: Puntuaciones histologicas

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTA y MOD combinadas (en relacion con el penodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion Y Numero de alfcuota Promedio

1: 2 3 4

A: polvo despues del almacenamiento O o o 00 sf 2,5 2,0 1,5 2,3 2,1

B: polvo despues del almacenamiento TA sf 2,5 2,3 2,3 2,3 2,4

C: pasta despues del almacenamiento TA no 0,5 0 0 0 0,1

D: pasta despues del almacenamiento O o O CO sf 2,5 1,3 2,3 2,3 2,1

E: pasta despues del almacenamiento TA sf 2,0 0,5 1,0 0,5 1,0

F: CIO(seca) antes del almacenamiento O o O CO sf 2,0 2,5 1,0 2,5 2,0

G: CIO(seca) antes del almacenamiento TA sf 2,0 ** 4,0 ** 3,0

H: polvo no aplicable Sin almacenamiento no 1,0 2,0 3,0 2,0 2,0

** Faltaban los implantes en estas secciones, por lo que las muestras de biopsia no se analizaron.

Las puntuaciones de actividad de fosfatasa alcalina para cada alfcuota implantada (las columnas marcadas 1,2, 3 y 10 4) se muestran en la Tabla 3. En general, las muestras de la CIO (Grupos F y G) mostraron niveles mas altos de

actividad AP que las muestras comparables hechas de pasta de la MOD particulada almacenada (muestras D y E).

Tabla 3: Actividad de la fosfatasa alcalina (pmol/mg de proteina/h)

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTA y MOD combinadas (en relacion con el perlodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion Y Numero de allcuota Promedio

1: 2 3 4

A: polvo despues del almacenamiento l 00 o 6 si 1,63 - 0,97 2,02 1,54

B: polvo despues del almacenamiento TA si 0,8 1,39 1,88 1,81 1,47

C: pasta despues del almacenamiento TA no 0,57 0,57 1,08 0,69 0,72

D: pasta despues del almacenamiento 1 00 o 6 si 0,77 - 0,95 1,48 1,07

E: pasta despues del almacenamiento TA si 0,53 0,60 0,72 0,87 0,68

F: CIO(seca) antes del almacenamiento 1 00 o 6 si 1,45 1,58 1,37 0,92 1,33

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1: 2 3 4

G: CIO(seca) antes del almacenamiento TA si 0,54 2,02 0,45 ** 1,00

H: polvo no aplicable Sin almacenamiento no 0,73 1,79 2,36 ** 1,62

Los perfiles de osteoinductividad (OI) de las muestras se resumen en la Tabla 4. Las muestras se consideraron osteoinductivas cuando la actividad de AP era > 1 y la puntuacion histologica > 1. Ambas muestras de la CIO (Grupos F y G) eran osteoinductivas; ademas, la CIO almacenada a temperatura ambiente (Grupo G) retuvo la osteoinductividad, mientras que las muestras en las que se habfa almacenado la pasta de la MOD a temperatura ambiente (Grupo E) no.

Tabla 4: Osteoinductividad^ de muestras de prueba

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTAy MOD combinadas (en relacion con el periodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion Y Actividad AP promedio (pmol/mg de proteina/hora) Puntuacion histologica (promedio) Osteoinductividad

A: polvo despues del almacenamiento O o op si 1,54 2,1 Si

B: polvo despues del almacenamiento TA si 1,47 2,4 Si

C: pasta despues del almacenamiento TA no 0,72 0,1 No

D: pasta despues del almacenamiento O o CO si 1,07 2,1 Si

E: pasta despues del almacenamiento TA si 0,68 1,0 No

F: CIO (seca) antes del almacenamiento O o CO si 1,33 2,0 Si

G: CIO (seca) antes del almacenamiento TA si 1,0 3,0 Si

H: polvo no aplicable Sin almacenamiento no 1,62 2,0 Si

Las muestras de control adicionales no mostradas en las tablas anteriores consistieron en una masilla fabricada mezclando MTA y MOD antes de 6 meses de almacenamiento, irradiacion y e implantacion como se ha descrito anteriormente. Estas muestras teman una puntuacion histologica promedio de 1,0 y una actividad AP promedio de 0,8 y, por lo tanto, no cumplfan con el criterio de osteoinductividad mencionado anteriormente.

Ejemplo 3. Osteoinductividad de la CIO: Esterilizacion por haz de electrones

Diseno experimental. La osteoinductividad de la CIO se comparo con la de las formulaciones en las que el componente particulado de la MOD se habfa sometido a tratamientos (resumidos en la Tabla 5 a continuacion) disenados para explorar sistematicamente la relacion entre las condiciones de almacenamiento y la osteoinductividad. Las variables relevantes incluyeron el almacenamiento templado, la esterilizacion con haz de electrones (haz de e) y el momento de mezcla de los componentes de la MOD particulada y la MTA particulada en relacion con el almacenamiento de la MOD particulada, es decir, si la MOD particulada y la MTA particulada se combinaron antes o despues del almacenamiento de la MOD particulada. Todas las muestras experimentales se almacenaron durante 6 meses. En este estudio se utilizaron diecisiete animales. Se implantaron muestras en animales de prueba como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, "Preparacion de animales e implantacion de muestras". Cada animal recibio dos implantes, uno en cada extremidad posterior, de 0,2 ml cada uno. Para controlar la variabilidad entre animales individuales, el material de prueba en cada Grupo (A a G) se dividio en 5 alfcuotas y cada alfcuota se implanto en un sitio diferente en un animal diferente. Despues de 28 dfas, las muestras se sometieron a biopsia y se evaluo el potencial osteoinductivo de las muestras como se describe en el Ejemplo 1 en "Evaluacion histologica de la formacion de hueso nuevo".

Los grupos experimentales fueron designados de A a G y estaban sujetos a las siguientes condiciones. En los Grupos F y G, la MOD particulada se combino con MTA particulada para formar una CIO. La CIO se preparo de acuerdo con el metodo ("Preparacion de la CIO") proporcionado en el Ejemplo 1. Es decir, la MOD particulada y la MTA particulada se hidrataron, se combinaron para formar una mezcla, se liofilizaron, se irradiaron y se almacenaron para 6 meses antes de la implantacion. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en estas

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muestras se combinaron antes del almacenamiento. El Grupo E se almaceno a -80 °C y el Grupo F se almaceno a temperature ambiente.

En los Grupos A y B, la MOD particulada (en forma de polvo) se almaceno como un polvo seco irradiado con haz de electrones. Al final del penodo de almacenamiento, la MOD particulada se hidrato, se combino con MTA particulada hidratada y se implanto. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en estas muestras se combinaron despues del almacenamiento. El Grupo A se almaceno a -80 °C y el Grupo B se almaceno a temperatura ambiente.

En los Grupos C y D, la MOD particulada se almaceno como una pasta, es decir, despues de la hidratacion. (Para estas muestras, se combino un ml (~0,4 g) de la MOD particulada con 1 ml de solucion salina como se describe anteriormente en "Preparacion de la CIO". Tras la hidratacion, la pasta de la MOD particulada en estos grupos se irradio con haz de electrones, se almaceno y al final del penodo de almacenamiento, se combino con MTA particulada hidratada y se implanto. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en estas muestras se combinaron despues del almacenamiento. El Grupo C se almaceno a -80 °C y el Grupo D se almaceno a temperatura ambiente.

En el Grupo G, un control para los factores relacionados con el almacenamiento y la irradiacion, polvo de la MOD particulada no irradiado, se hidrato y se mezclo con MTA particulada hidratada inmediatamente antes de la implantacion. Por lo tanto, la MOD particulada y la MTA particulada en este grupo se combinaron sin ningun penodo intermedio de almacenamiento.

Tabla 5: Diseno experimental

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTA y MOD combinadas (en relacion con el penodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion con haz de electrones

A: polvo despues del almacenamiento -80 °C sf

B: polvo despues del almacenamiento TA sf

C: pasta despues del almacenamiento -80 °C sf

D: pasta despues del almacenamiento TA sf

E: CIO(seca) antes del almacenamiento -80 °C sf

F: CIO(seca) antes del almacenamiento TA sf

G: polvo no aplicable Sin almacenamiento no

Resultados. Las puntuaciones de histologfa para cada alfcuota implantada (las columnas marcadas con 1, 2, 3, 4 y 5) se muestran en la Tabla 6. Ambos Grupos de la CIO mostraron evidencia histologica de formacion de hueso nuevo.

Tabla 6: Puntuaciones histologicas

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTA y MOD combinadas (en relacion con el periodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion con haz de electrones Numero de alicuota Promedio

1: 2 3 4 5

A: polvo despues del almacenamiento o o 00 si 2,5 1,0 2,0 3,5 2,5 2,3

B: polvo despues del almacenamiento TA si 3,3 ** 3,3 1,5 3,3 2,9

C: pasta despues del almacenamiento o o 00 si 0 3,5 2,5 2,5 2,3 2,2

D: pasta despues del almacenamiento TA si 2,0 1,5 2,0 2,0 2,3 2,0

E: CIO seca antes del almacenamiento o o 00 si 3,5 2,0 3,5 2,5 3,5 3,0

F: CIO seca antes del almacenamiento TA si 2,8 3,0 3,0 2,5 2,5 2,8

G: polvo no aplicable Sin almacenamiento no 2,3 3,3 2,5 2,0 ** 2,5

Faltaban los implantes en estas secciones, por lo que las muestras de biopsia no se analizaron.

Las actividades de fosfatasa alcalina correspondientes para cada alfcuota implantada (las columnas marcadas con 1, 2, 3, 4 y 5) se muestran en la Tabla 7. La mayona de las muestras de la ClO mostraron evidencia enzimologica de formacion de hueso nuevo.

Tabla 7: Actividad de fosfatasa alcalina (pmol/mg de proteina/h)

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTA y MOD combinadas (en relacion con el periodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion con haz de electrones Numero de alicuota Promedio ± SE

1: 2 3 4 5

A: polvo despues del almacenamiento o o 00 si 1,97 1,59 3,63 1,54 5,48 3,0 ± 0,8

B: polvo despues del almacenamiento TA si 8,2 0,62 1,27 0,57 3,34 2,8 ± 1,6

C: pasta despues del almacenamiento o o 00 si 0,58 0,83 0,52 0,83 1,66 0,8 ± 0,2

D: pasta despues del almacenamiento TA si 0,47 0,65 0,46 0,49 0,53 0,52 ± 0,04

E: CIO (seca) antes del almacenamiento o o 00 si 4,69 3,20 2,12 3,85 0,53 2,9 ± 0,8

F: CIO (seca) antes del almacenamiento TA si 0,44 0,78 1,18 0,8 1,17 0,9 ± 0,2

G: polvo no aplicable Sin almacenamiento no 1,62 2,06 0,72 0,40 ** 1,2 ± 0,4

Los perfiles de osteoinductividad (OI) de las muestras se resumen en la Tabla 8. En este estudio, una muestra se considero osteoinductora si la puntuacion histologica era > 1. Las muestras de composicion de injerto oseo 5 almacenadas a -80 °C (muestra E) mostraron una mayor actividad osteoinductiva que las muestras comparables hechas de pasta hidratada y almacenada (muestra C). Se observo una tendencia similar con las muestras de composicion de injerto oseo almacenadas a temperatura ambiente.

Tabla 8: Osteoinductividad de muestras de prueba

Grupo: Forma de almacenamiento de la MOD MTA y MOD combinadas (en relacion con el penodo de almacenamiento) Temperatura de almacenamiento de la MOD Irradiacion con haz de electrones Puntuacion histologica (promedio) Actividad AP promedio (pmol/mg de protema/hora)

A: polvo despues del almacenamiento O o o 00 sf 2,3 3,0 ± 0,8

B: polvo despues del almacenamiento TA sf 2,9 2,8 ± 1,6

C: pasta despues del almacenamiento O o O CO sf 2,2 0,8 ± 0,2

D: pasta despues del almacenamiento TA sf 2,0 0,52 ± 0,04

E: CIO(seca) antes del almacenamiento O o O CO sf 3,0 2,9 ± 0,8

F: CIO(seca) antes del almacenamiento TA sf 2,8 0,9 ± 0,2

G: polvo no aplicable Sin almacenamiento no 2,5 1,2 ± 0,4

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Las muestras de control adicionales que no se muestran en las tablas anteriores consistieron en una masilla hecha mezclando MTA y MOD antes de 6 meses o 1 ano de almacenamiento, irradiacion con haz de electrones e implantacion como se ha descrito anteriormente. Las muestras almacenadas durante 6 meses tuvieron una puntuacion histologica promedio de 1,9 y una actividad AP promedio de 0,5 y, por lo tanto, aunque cumplieron con el 15 criterio de osteoinductividad mencionado anteriormente, teman puntuaciones histologicas mas bajas (y actividad AP) que cualquiera de las otras muestras enumeradas en la Tabla 8. Las muestras almacenadas durante 1 ano teman una puntuacion histologica promedio de 0 y una actividad AP promedio de 0,2 y, por lo tanto, no cumplfan con el criterio de osteoinductividad mencionado anteriormente.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para hacer una composicion de injerto oseo (CIO); caracterizado porque dicho metodo comprende:

combinar fragmented de una matriz de tejido acelular (MTA) con fragmentos de matriz osea desmineralizada (MOD) para crear una mezcla, en la que los fragmentos de MTA y los fragmentos de MOD en la mezcla estan sustancialmente hidratados; secar e irradiar la mezcla para proporcionar una forma que se ha secado e irradiado; en el que dicha forma puede almacenarse durante seis meses y posteriormente puede rehidratarse para proporcionar una CIO osteoinductiva.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la MTA comprende la dermis de la que se han eliminado todas, o sustancialmente todas, las celulas viables.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la MTA comprende un tejido del que se han eliminado todas, o sustancialmente todas, las celulas viables, en el que dicho tejido se selecciona del grupo que consiste en fascia, tejido pericardico, duramadre, tejido de cordon umbilical, tejido placentario, tejido de la valvula cardfaca, tejido del ligamento, tejido del tendon, tejido arterial, tejido venoso, tejido conectivo neural, tejido de la vejiga urinaria, tejido del ureter y tejido intestinal.
4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la MTA y/o MOD estan compuestas de tejido humano.
5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la MTA y/o MOD estan compuestas de tejido de mairnfero no humano.
6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el mam^era no humano se modifica por ingeniena genetica para que carezca de expresion de restos de a-1,3-galactosilo.
7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la CIO o la mezcla se irradia de manera que absorba de 6 kGy a 30 kGy de la radiacion.
8. Una CIO preparada por el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una CIO como se describe en cualquier reivindicacion anterior, para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o de un animal mediante cirugfa o terapia.
10. Una CIO como se describe en la reivindicacion 9 para el uso descrito en la misma; en el que dicho tratamiento es el tratamiento del hueso.
11. Una CIO como se describe en la reivindicacion 9 o 10 para el uso descrito en la misma; en el que la CIO se usa en combinacion con un dispositivo estructural de soporte.
12. Un artteulo de fabricacion que comprende una CIO como se describe en cualquier reivindicacion anterior.
13. Un artteulo de fabricacion de acuerdo con la reivindicacion 12;

en el que el artteulo comprende material de embalaje, o un prospecto, que comprende instrucciones para un metodo de tratamiento; el metodo que comprende

(i) identificar un sujeto mamffero que tiene un organo receptor, o tejido, que necesita una mejora o reparacion; y

(ii) poner la CIO en o sobre el organo o tejido.