ES2586615T3

ES2586615T3 - Método para producir una composición ósea implantable

Info

Publication number: ES2586615T3
Application number: ES09716106.1T
Authority: ES
Inventors: Zsombor Lacza; Miklós WESZL
Original assignee: Lacerta Technologies Inc
Current assignee: Lacerta Technologies Inc
Priority date: 2008-02-26
Filing date: 2009-02-26
Publication date: 2016-10-17
Anticipated expiration: 2029-02-26
Also published as: SI2259804T1; US9381272B2; CA2716745C; HRP20160994T1; US20140044792A1; US20100303885A1; US8551170B2; DK2259804T3; EP2259804A2; CA2716745A1; EP2259804B1; HU0800134D0; PL2259804T3; PT2259804T; WO2009107088A2; HUE030562T2; LT2259804T; WO2009107088A3

Abstract

Método para la producción de una composición ósea implantable adecuada para la unión de células madre a la misma, caracterizada porque se hace que una solución proteica que comprende albúmina entre en contacto con partículas óseas y dicha solución proteica se seca sobre dichas partículas óseas por liofilización.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para producir una composicion osea implantable Campo de la invencion

La invencion se refiere a metodos para producir composiciones oseas implantables adecuadas para unir celulas madre a las mismas, caracterizados porque las particulas oseas se ponen en contacto con una solucion que comprende albumina. Dichas particulas oseas pueden ser particulas oseas mineralizadas y/o liofilizadas de origen animal o humano. En una realizacion preferente la solucion que comprende albumina no inmunogena se liofiliza sobre dichas particulas oseas. La invencion se refiere tambien a composiciones oseas adecuadas para su uso en implantacion de injerto que pueden obtenerse mediante dichos metodos.

Antecedentes de la invencion

Los injertos oseos son unos de los tejidos transplantados mas comunes. En todo el mundo se realizan anualmente mas de 2,2 millones de procedimientos de injerto oseo para reparar defectos oseos en ortopedia, neurocirugia y odontologia (9, 10, 12, l3). Los autoinjertos y los aloinjertos oseos se usan convencionalmente para reemplazar los defectos oseos.

Los autoinjertos son la referencia para rellenar los defectos oseos, debido a que proporcionan la incorporacion mas rapida sin complicaciones inmunologicas (15, 17). Pocos osteoblastos maduros sobreviven al transplante, pero el numero de celulas precursoras que permanecen vivas es adecuado. El potencial osteogenico se deriva de estas celulas precursoras. Es bien conocido en la tecnica que existen graves limitaciones en el uso de autoinjertos, incluyendo estas un tiempo de operacion prolongado, una biodisponibilidad limitada y una morbilidad significativa relacionada con la perdida de sangre, complicaciones de heridas, perdida sensorial local y, lo mas importante, un dolor cronico (14, 16, 18, 19).

Los aloinjertos como enfoque alternativo ofrecen caracteristicas similares con la exclusion de celulas osteogenicas (9, 10). No existe una norma estandar relacionada con la preparacion de aloinjertos oseos y, asi, se divulgan varios tipos de los mismos en publicaciones, tales como aloinjertos oseos frescos, frescos congelados, liofilizados o desmineralizados (9, 10). Los aloinjertos poseen propiedades osteoconductoras y osteoinductoras, pero estas ultimas pueden no reconocerse a menos que el injerto se use en una forma morselizada o desmineralizada. Las complicaciones asociadas con aloinjertos incluyen fracturas, falta de union, complicaciones inmunologicas e infeccion.

Urist y otros (3, 20, 21, 22, 23, 24) demostraron el efecto de la matriz osea desmineralizada o la proteina morfogenetica osea en la induccion osea. Tambien demostraron que los componentes activos de la matriz osea desmineralizada son las proteinas de bajo peso molecular (LMWP). Bolander y col. (1, 2) recubrieron el injerto oseo desmineralizado con proteinas de bajo peso molecular adicionales. Este metodo podria potenciar el potencial osteoinductor del injerto. Actualmente, el aloinjerto desmineralizado se considera aun el sustituto alogenico mas apropiado para reemplazar defectos oseos debido a que posee capacidad osteoinductora y osteoconductora; no obstante, sus propiedades mecanicas no son adecuadas (22). Ademas, la fabricacion de matriz osea desmineralizada con propiedad osteoinductora alta constante representa aun un desafio. Los aloinjertos oseos mineralizados o no desmineralizados, por ejemplo liofilizados, frescos o frescos congelados poseen buenas propiedades mecanicas, pero su capacidad osteoinductora es muy pobre en comparacion con una matriz osea desmineralizada. Rust y col. (4) demostraron que las celulas madre mesenquimales (MSC) podrian diferenciarse en osteoblastos en la superficie de un aloinjerto oseo mineralizado, que contiene las proteinas originales del hueso normal. Encontraron que las MSC podrian no diferenciarse en la superficie de aloinjertos tratados termicamente. Esta observacion muestra que ciertas proteinas oseas particulares pueden tener un papel clave en la adherencia y el compromiso de MSC. Booland y col. (5) probaron que las celulas sobreviven a la fuerza del impacto sobre el aloinjerto mineralizado, que puede ser durante el uso clinico. Lewandrowski y col. (6) recubrieron injertos oseos corticales con biopolimeros para fomentar la adherencia de celulas oseas derivadas del periostio a la superficie del injerto. El documento WO 01/82993 (26) divulga un implante oseo reticulado osteogenico.

Se han desarrollado actualmente nuevos biomateriales combinados con celulas osteogenicas como una alternativa a los injertos oseos (11). Los biomateriales se crean para construir un armazon tridimensional al que pueden adherirse celulas, proliferar y diferenciarse en celulas osteogenicas funcionales (7, 9). Ore y col. (8) demostraron la diferenciacion potenciada de las celulas derivadas de la medula osea humana sobre una apatita carbonatada al 70 %, que tenia una composicion similar a minerales oseos.

Los presentes inventores encontraron previamente que el recubrimiento de huesos esponjosos con proteinas que se sabe que ayudan a la adherencia celulas no habia ayudado siempre a la adherencia de celulas sobre el hueso. Aunque el recubrimiento con fibronectina aumento el numero de celulas unidas, el recubrimiento con colageno no ayudo a aumentar el numero de celulas unidas. Ademas, ninguno de los mismos fomento la proliferacion de las celulas unidas (
http://www.tdk.sote.hu/ortopedia.pdf).

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Un injerto optimo deberia tener todas las ventajas de los aloinjertos y los autoinjertos, incluidas la capacidad osteoinductora, buenas propiedades mecanicas y compatibilidad inmunologica con el huesped (10, 11). Ademas, preferentemente, esta facilmente disponible y no provoca una carga operativa al recogerlo, como los autoinjertos.

Nuestro objetivo era desarrollar un metodo de recubrimiento fiable y seguro que asegure la union de celulas madre a la superficie de aloinjertos oseos mineralizados. En otras palabras, el objetivo de la presente invencion era desarrollar nuevos metodos que proporcionen injertos oseos que sean compatibles con el huesped y no provoquen ninguna complicacion inmunologica, mientras que al mismo tiempo esten facilmente disponibles.

Sumario de la invencion

Los presentes inventores resolvieron el problema anterior segun la invencion recubriendo aloinjertos oseos de origen humano o animal con albumina de suero humano liofilizado. La presente invencion proporciona condiciones excelentes, no solo para la union, sino tambien para la proliferacion de celulas madre, por ejemplo celulas madre mesenquimales (MSC).

La presente invencion se refiere a un metodo para producir composiciones oseas implantables adecuadas para unir celulas madre a las mismas, caracterizado porque las particulas oseas se ponen en contacto con una solucion proteica que comprende albumina. Aunque la concentracion de albumina en dicha solucion no es un factor estrictamente limitante, preferentemente dicha solucion que comprende albumina es una solucion de albumina que comprende del 1 al 50 % de albumina, preferentemente del 3 al 30 % de albumina, mas preferentemente del 5 al 25 % de albumina y del modo mas preferente de aproximadamente el 10 % de albumina, siendo los porcentajes porcentajes peso/peso. Preferentemente, dicha albumina es albumina humana y mas preferentemente albumina humana de origen serico. Segun una realizacion preferente de la invencion, dichas particulas oseas son particulas oseas liofilizadas y/o particulas oseas mineralizadas que estan sustancialmente limpias de componentes organicos.

Dicha solucion que comprende albumina se seca sobre dicha composicion osea mineralizada por liofilizacion. Dichas particulas oseas pueden ser de origen humano o animal.

Ventajosamente, en el metodo anterior alguno/s de los ingredientes de dicha solucion que comprende albumina es/son de origen humano o es/son humanizado(s) inmunologicamente y/o dicha solucion que comprende albumina se obtiene de un paciente con necesidad de una implantacion osea. Preferentemente, dicha solucion que comprende albumina comprende el suero de dicho paciente o cualquier fraccion de dicho suero.

Segun otra realizacion preferente de la presente invencion, dicha solucion que comprende albumina comprende preferentemente albumina recombinante, comprendiendo dicha solucion que comprende albumina ademas opcionalmente fibronectina o colageno o una combinacion de los mismos.

Ventajosamente, dichas soluciones proteicas estan exentas de componentes que sean potencialmente inmunogenos para pacientes para los que se ha disenado dicha composicion osea segun la invencion. Los metodos para analizar la inmunogenicidad potencial de una solucion proteica son bien conocidos en la tecnica.

La invencion se refiere a un metodo en el que los metodos anteriores comprenden ademas la etapa de unir celulas capaces de potenciar la formacion osea a la superticie de dichas particulas oseas.

En una realizacion preferente de la presente invencion en los metodos anteriores dichas celulas capaces de potenciar la formacion osea se obtienen de un paciente con necesidad de una implantacion osea, siendo dichas celulas preferentemente celulas madre mesenquimales (MSC).

La invencion se refiere tambien a una composicion osea adecuada para su uso en implantacion de injertos que puede obtenerse mediante los metodos de la invencion anteriores.

La invencion tambien se refiere, ademas, al uso de dichas composiciones en tratamientos.

Un injerto preparado a partir de una composicion osea segun la presente invencion combina las propiedades beneficiosas de aloinjertos y de autoinjertos. Se uso aloinjerto oseo mineralizado humano como armazon. Un experto en la tecnica apreciara que en vez de aloinjertos oseos mineralizados humanos podrian usarse de forma igualmente satisfactoria aloinjertos mineralizados de origen animal. El aloinjerto humano se limpio de las proteinas originales del hueso. De este modo, el armazon proporciona una estabilidad mecanica buena al injerto; ademas, dado que esta mineralizado, reduce la posibilidad de cualquier complicacion inmunologica. La superticie del armazon se recubre con proteinas de origen humano, como fibronectina o albumina, para suministrar la adherencia al sembrado de MSC humanas y proliferacion. Sorprendentemente se encontro que el recubrimiento con una solucion serica (suero de bovino fetal, FCS) fomentaba la adherencia de MSC en una medida incluso superior. El recubrimiento es necesario para la viabilidad celular sobre el aloinjerto de la presente invencion y la liofilizacion de dichas proteinas o soluciones proteicas sobre el hueso potencio el numero de celulas que se unieron y fomento

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tambien su proliferacion. En una realizacion preferente de la presente invencion, el injerto consiste en materiales de origen humano, como albumina autologa y MSC. Esta propiedad podria permitir que el injerto de la invencion se incorpore rapidamente en el huesped sin complicaciones inmunologicas y podria apoyar una recuperacion temprana de los pacientes.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra la fluorescencia medida, provocada por las celulas adheridas a la superficie de aloinjertos sin tratar 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC.

La figura 2A muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos sobre los que se liofilizo colageno de tipo I, mientras que la figura 2B muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos que se sumergieron en una solucion de colageno de tipo I.

La figura 3A muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos sobre los que se liofilizo fibronectina, mientras que la figura 3B muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos que se sumergieron en una solucion de fibronectina.

La figura 4A muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos sobre los que se liofilizo colageno de tipo I y fibronectina, mientras que la figura 4B muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos que se sumergieron en una solucion de colageno de tipo I y fibronectina.

La figura 5 muestra la comparacion de la fluorescencia medida, provocada por los materiales de recubrimiento exentos de albumina.

La figura 6A muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos sobre los que se liofilizo albumina humana, mientras que la figura 6B muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos que se sumergieron en una solucion de albumina humana.

La figura 7A muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos sobre los que se liofilizo albumina humana y fibronectina, mientras que la figura 7B muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos que se sumergieron en una solucion de albumina humana y fibronectina.

La figura 8A muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos sobre los que se liofilizo suero de bovino fetal, mientras que la figura 8B muestra la fluorescencia medida 3, 10 y 18 dias despues de la adicion de MSC, provocada por las celulas adheridas sobre la superficie de aloinjertos que se sumergieron en una solucion de suero de bovino fetal.

La figura 9 muestra la comparacion de la fluorescencia medida, provocada por los materiales de recubrimiento que contienen albumina.

La figura 10A muestra la superficie de un aloinjerto oseo de rata recubierto con albumina humana liofilizada cuya dosis no contiene celulas madre adheridas (actua como control), mientras que la figura 10B muestra celulas madre derivadas de medula osea de rata viables adheridas sobre la superficie de aloinjerto oseo de rata recubierto con albumina humana liofilizada.

La figura 11A-B muestra instantaneas micro-CT de los espaciadores de PMMA insertados entre los extremos del hueso diseccionado, mientras que la figura 11C-D muestra que el aloinjerto de hueso humano liofilizado no recubierto no facilito una nueva formacion de tejido oseo, por lo tanto no pudo integrarse en el sitio del defecto oseo.

La figura 12A-B muestra que un injerto oseo humano recubierto con albumina humana liofilizada promovio la formacion de hueso nuevo en el hueco de la osteotomia despues de 4 semanas de la implantacion.

Descripcion detallada de la invencion

La expresion "hueso mineralizado" en el contexto de la presente invencion significa que el hueso esta en su forma nativa en el sentido de que contiene todos sus componentes minerales y opcionalmente puede contener sus componentes organicos tambien. En otras palabras, la expresion "hueso mineralizado" se usa para distinguirlo de huesos desmineralizados en el sentido en que el hueso mineralizado es un hueso no desmineralizado.

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Segun el significado que se usa en el presente documento, una composicion osea se dice que esta "sustancialmente limpia de componentes organicos", por ejemplo, si se preparo mediante el metodo descrito en los ejemplos en la seccion "Preparacion de aloinjerto mineralizado liofilizado" o mediante cualquier otro metodo de mineralizacion osea que comprenda una etapa de lavado realizada en un disolvente organico y subsiguiente digestion en un compuesto acido. Un experto en la tecnica entendera que existen numerosas vias para producir una composicion osea mineralizada equivalente.

Se observo, sorprendentemente, que el recubrimiento de aloinjertos con diferentes proteinas potenciaba el numero de MSC unidas a la superficie del injerto y tambien facilitaba la proliferacion de celulas. Los aloinjertos usados como armazon se limpiaron de casi todas las proteinas alogenicas del hueso para reducir la posibilidad de cualesquiera complicaciones inmunologicas en el huesped. Las proteinas eliminadas, como las proteinas de bajo peso molecular (LMWP) o la proteina morfogenetica osea (BMP) son importantes para la adherencia y la proliferacion de celulas oseas y osteoprogenitoras (1,2, 22, 24). Dado que estas proteinas se han eliminado, las MSC no pudieron unirse a la superficie del aloinjerto mismo, que consistian principalmente en compuestos inorganicos, tales como hidroxido de apatita. Los presentes inventores han hallado que si las proteinas eliminadas se reemplazan por otras, por ejemplo por fibronectina, albumina o colageno, preferentemente y del modo mas sorprendente con albumina, estas proteinas facilitan la adherencia de celulas a la superficie. Ademas, esta adherencia facilitada tambien se observo usando una solucion serica. Los datos muestran sorprendentemente que no solo las LMWP o las BMP pueden fomentar exclusivamente la union de celulas progenitoras oseas, sino de otros tipos de celulas tambien. Se observo proliferacion sobre los injertos recubiertos, excepto en aquellos que se recubrieron con fibronectina o colageno de tipo I solamente. No obstante, la combinacion de fibronectina con albumina y la combinacion de colageno de tipo I con fibronectina proporcionan buenas condiciones para la proliferacion de MSC. La mejor proliferacion se observo cuando se uso FCS como material de recubrimiento. Se observo proliferacion a lo largo de todo el periodo de investigacion sobre los injertos que se recubrieron con albumina sola o en combinacion con fibronectina y en los que contenian suero de bovino fetal (FCS).

Nuestros resultados muestran que la albumina, la fibronectina y el suero mismo podrian ser el material de recubrimiento mas apropiado para el aloinjerto oseo. Estos materiales de recubrimiento estan facilmente disponibles y proporcionan la adherencia y la proliferacion de MSC. No escapo a nuestra atencion que en una realizacion preferente de la invencion la albumina, la fibronectina, el suero y por supuesto las MSC podrian ser autologos. Un armazon, que esta exento de proteinas oseas alogenicas y que contiene proteinas autologas de MSC derivadas de medula osea de origen serico y autologa, podria incorporarse al huesped mas rapidamente que los aloinjertos o los autoinjertos usados convencionalmente y posibilita una recuperacion mas temprana del paciente (9, 10, 11, 17).

Aunque algunas MSC podrian adherirse incluso a la superficie de aloinjertos sin recubrir, la superficie de hueso mineralizado que se limpio de sustancialmente todos las BMP no podria proporcionar buenas condiciones para la supervivencia de las MSC (figura 1).

La viabilidad de celulas unidas se investigo con colorante alamar azul despues de 3, 10 y 18 dias. El cambio de color de alamar azul indico que las celulas unidas estaban vivas en todos los injertos al comienzo del experimento. El alamar azul tambien indico que las celulas unidas no estaban vivas cuando su numero hubo empezado a decrecer en los injertos. La viabilidad de las celulas unidas tambien se investigo con colorante fluorescente calceina AM para confirmar los resultados que se obtuvieron en las mediciones con alamar azul.

El colageno de tipo I no pudo proporcionar la supervivencia de MSC, sin embargo facilito su adherencia a los injertos (figuras 2A, B). Aunque la fibronectina se usa habitualmente para fomentar la union de celulas a diferentes superficies, no facilito ni la adherencia ni la expansion de las MSC sobre aloinjertos de hueso mineralizado (figuras 3A, B). Sobre aquellos injertos que contenian fibronectina y colageno de tipo I en combinacion se observo proliferacion al comienzo, pero las celulas no mostraron actividad metabolica despues de 10 dias (figuras 4A, B). El contenido de humedad de las composiciones proteicas usadas no influyo en los resultados. Estos datos muestran que aunque la fibronectina y el colageno de tipo I son proteinas estructurales oseas importantes, por si mismas no pueden generar un medio apropiado para las supervivencia de las MSC (figura 5).

Sorprendentemente, la presencia de albumina liofilizada sola o en combinacion con otras proteinas secadas de origen serico sobre injertos potencio el numero de MSC unidas y proporciono buenas condiciones para la proliferacion de celulas a lo largo de todo el periodo experimental. Cuando las proteinas de recubrimiento de albumina o con carga de albumina no se sometieron a liofilizacion en injertos despues de la incubacion en solucion proteica, la cantidad de celulas se redujo a lo largo de toda la duracion del periodo experimental (figuras 6B, 7B, 8B).

Sobre los injertos que se recubrieron con albumina liofilizada solo no se unieron muchas mas MSC que sobre aloinjertos sin tratar. No obstante, se observo que habia una diferencia significativa y esta fue que la albumina facilito la proliferacion de MSC (figura 6A). La combinacion de albumina liofilizada y fibronectina proporciono la adherencia y tambien la expansion de MSC (figura 7A). La mayor tasa de proliferacion en los ultimos 8 dias del experimento se observo en los injertos que contenian suero de bovino fetal liofilizado (figura 8A) (datos no mostrados en la figura 9).

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En conclusion, nuestros datos muestran que el recubrimiento de particulas oseas mineralizadas con suero y/o albumina no solo fomento la union de celulas madre sobre aloinjertos oseos mineralizados, sino que tambien fomento la proliferacion celular. Por lo tanto, se desarrollo un metodo de recubrimiento fiable por parte de los presentes inventores, metodo de recubrimiento que hace que la superficie de aloinjertos oseos, preferentemente aloinjertos oseos mineralizados y/o liofilizados, sea apropiada para proporcionar la union y la supervivencia de MSC.

Ejemplos

Fuente de materiales usados

Biochrom AG, Alemania Gibco, Invitrogen, Estados Unidos Biochrom AG, Alemania Biochrom AG, Alemania BIOTEST HUNGARIA KFT., Hungria

Medio Eagle modificado de Dulbecco Suero de bovino fetal Penicilina-estreptomicina L-glutamina Albumina humana

1000 ml de solucion contiene:

200 g de proteina de plasma humano de la que la albumina es al menos el 96 %

Fibronectina Sigma Aldrich

Colageno de tipo I Colageno de cerdo, 1,5 %, Biom’ up, Francia

Colorantes Vybrant Molecular Probes, Invitrogen, Estados Unidos

Calceina AM Molecular Probes, Invitrogen, Estados Unidos

Alamar azul Biosource, Invitrogen, Estados Unidos

Los porcentajes de la presente descripcion, si no se indica lo contrario, son siempre porcentajes peso/peso.

Ejemplo 1. Preparacion e investigacion de aloinjertos Aislamiento y cultivo de celulas madre mesenquimales

Se aislaron celulas madre mesenquimales (MSC) derivadas de medula osea a partir de medula osea humana y se expandieron en medio de cultivo DMEM que contenia el 10 % de suero de bovino fetal, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Las muestras de medula osea se obtuvieron de hombres y mujeres jovenes de 2-20 anos de edad. Solo se usaron los tejidos que de otro modo se habrian descartado. Semmelweis Orthopedic Clinic Management Committee, Budapest, Hungria, aprobo el uso de estos tejidos. La medula osea se recogio en matraces T75 y se diluyo con medio de cultivo DMEM. Esta mezcla se almaceno en incubadora a 37 °C en CO2 al 5 % durante 3 dias. Despues del periodo de incubacion, las MSC adheridas a la superficie del matraz y los componentes remanentes de medula osea se eliminaron mediante lavado con PBS. Las celulas usadas se sometieron a entre 1 y 5 pasajes durante el experimento.

Caracterizacion de MSC

La identidad de las celulas adheridas se confirmo mediante la presencia de marcadores de superficie celular especificos del linaje con citometria de flujo (BD® FacsCalibur, Beckton Dickinson, NJ, Estados Unidos). Se investigaron marcadores de superficie especificos de linaje hematopoyeticos, tales como CD34, CD45, y marcadores de superficie mesenquimales, tales como CD73, CD90, CD 105 y CD166.

Preparacion de aloinjerto mineralizado liofilizado

Los huesos usados se obtuvieron de cadaveres o de intervenciones quirurgicas. En la primera etapa, los huesos se lavaron en metanol durante 4 horas. El metanol se cambio continuamente durante el procedimiento. Despues del lavado, los huesos se digirieron en una solucion que consistia en solucion salina tamponada con fosfatos (PBS) 0,1 M, azida de sodio 10 mM y acido monoyodoacetico 10 mM durante 24 horas. Subsiguientemente, los huesos se sometieron a descalcificacion parcial con HCl 0,6 M a temperatura ambiente durante 4 a 6 horas y despues se lavaron en PBS. Las estructuras oseas mineralizadas producidas (matrices) se esterilizaron en dioxido de etileno a 27 0C y despues se liofilizaron asepticamente. Proceso de la liofilizacion: primer secado a 32 0C, 2 Pa durante 12 horas; segundo secado a 32 0C, 0 Pa durante 12 horas.

Preparacion de aloinjerto recubierto

El aloinjerto mineralizado se corto en piezas de forma cubica o redonda. Las superficies de las piezas del aloinjerto

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eran de un centimetro cuadrado y su altura era de 5 milimetros. Los aloinjertos preparados de este modo se incubaron en solucion proteica a +4 0C durante la noche. Las soluciones proteicas usadas fueron de 10-20 mg/ml de fibronectina y el 10-20 % de albumina de origen serico humano, ademas suero de bovino fetal y el 1,5 % de colageno de tipo I se derivo de cerdo. Las proteinas tambien se usaron en combinacion, como fibronectina con albumina, fibronectina con colageno de tipo I. Estos huesos se usaron o bien directamente para los experimentos “sin secado” o bien subsiguientemente los huesos incubados se liofilizaron a 32 °C a 1 Pa durante 24 horas. Los aloinjertos recubiertos se sometieron a irradiacion UV para su descontaminacion durante 30 minutos.

Preparation del aloinjerto recubierto con celulas madre

Las MSC se marcaron con el colorante de membrana fluorescente Vybrant DID (excitacion/emision: 644/665 nm) durante 30 minutos a 37 0C. Las marcadas con DID se suspendieron en medio de cultivo DMEM y se anadieron gota a gota con una pipeta a la superficie de los aloinjertos recubiertos. Se usaron 60.000 celulas/armazon en todos los experimentos. Las MSC se expandieron en el aloinjerto in vitro durante 18 dias.

Investigation de las MSC sembradas

Se observo proliferacion de las MSC marcadas con DiD sembradas con microscopia confocal (Zeiss LSM 510 META, Carl Zeiss, Jena, Alemania) sobre el aloinjerto recubierto. Se seleccionaron aleatoriamente zonas individuales del injerto en las que la cantidad de las celulas adheridas se midio por fluorescencia. La viabilidad de las celulas se investigo con colorantes alamar azul y calceina AM.

Ejemplo 2. Hueso animal recubierto con albumina humana liofilizada

Preparation y recubrimiento de aloinjertos de hueso de rata

Se recogieron femures de ratas Wistar (400-450 g) para usarlos como aloinjertos oseos de rata. Despues de la retirada de la medula osea los femures de rata se trituraron en particulas oseas homogeneas con un diametro de 1 mm. Subsiguientemente, las particulas de hueso de rata obtenidas se sumergieron en solucion de albumina humana y se incubaron a +4 0C durante la noche y a continuacion la albumina humana se liofilizo en la superficie de dichas particulas oseas. Las condiciones de la liofilizacion: 32 0C, a 0,5 Pa durante 24 horas.

Recuperation de celulas madre derivadas de medula osea de rata

Se recogieron femures de ratas Wistar (400-450 g) para recuperar celulas madre derivadas de medula osea. Despues de la recogida de femures de rata se diseccionaron sus extremos proximal y distal y se descargo la medula osea en placas de Petri usando medio de cultivo DMEM que comprendia el 10 % de FCS, 100 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM y 1 g/l de glucosa. Las celulas adheridas al fondo de las placas de Petri se cultivaron a 37 0C en atmosfera totalmente humidificada del 5 % de CO2 (condiciones de cultivo estandar) hasta que las celulas se volvieron confluentes. Subsiguientemente, las celulas se tripsinizaron y se sembraron 80.000 celulas en la superficie de aloinjertos oseos de rata individuales recubiertos con albumina humana liofilizada. Los injertos preparados de este modo se almacenaron en condiciones de cultivo estandar durante 7 dias y a continuacion se investigo la viabilidad de las celulas unidas con colorante microscopio confocal (Zeiss LSM 510 META, Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Resultados

Encontramos que los aloinjertos oseos de rata recubiertos con albumina condiciones adecuadas para la union y la supervivencia de celulas madre en incubacion (figuras 10A, B).

Ejemplo 3. Modelo animal

Materiales y metodos

La capacidad de osteointegracion de injertos oseos liofilizados recubiertos con albumina de suero humano liofilizada se investigo en un modelo animal. En la primera etapa del estudio se desarrollo un modelo de seudoartrosis. En el femur de ratas Wistar (400-450 g) se realizo una osteotomia diafiseal media transversal amplia de 2-3 mm y a continuacion los extremos del hueso se fijaron mediante placa y tornillos. Se dispuso un espaciador de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) entre los sitios de la osteotomia y el periostio se retiro del femur preparado para bloquear la curacion natural del hueso. Despues de 4 semanas de operacion la placa de PMMA se retiro y el hueco de la osteotomia se dejo vacio otras 4 semanas. Despues de 4 semanas de periodo posoperativo los animales se sacrificaron y sus femures se recogieron y se sometieron a examen con mCT para comprobar el desarrollo de una seudoartrosis. En la segunda etapa, el modelo de seudoartrosis se preparo exactamente como se ha detallado anteriormente, pero despues de la eliminacion de los espaciadores de PMMA se implantaron aloinjertos oseos liofilizados sin recubrir (como control) y recubiertos con albumina humana liofilizada en los huecos de la osteotomia.

fluorescente calceina AM usando

humana liofilizada proporcionaron la superficie durante el periodo de

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4 semanas despues de la implantacion de injertos oseos los animales se sacrificaron y los femures recogidos se sometieron a examen por mCT (25).

Resultados

No se observo nueva formacion de huesos en los huecos de la osteotomia que se dejaron vacios despues de la retirada del espaciador de PMMA. Esto prueba que el modelo es adecuado para la investigacion de la capacidad de osteointegracion de los injertos oseos segun la presente invencion (figura 11A, B).

Los aloinjertos oseos liofilizados sin recubrir (controles) no fueron capaces de integrarse en el sitio de defectos oseos (figura 11C, D). Por otra parte, la fusion osea pudo detectarse 4 semanas despues de la implantacion del injerto oseo humano liofilizado con albumina. El hueso esponjoso entre los bordes de osteotomia con una estructura suelta y los agujeros mas anchos se refieren a los remanentes del injerto implantado Los rayos X muestran la curacion del defecto (figura 12A, B).

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26. Documento WO 01/82993

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Metodo para la produccion de una composicion osea implantable adecuada para la union de celulas madre a la misma, caracterizada porque se hace que una solucion proteica que comprende albumina entre en contacto con particulas oseas y dicha solucion proteica se seca sobre dichas particulas oseas por liofilizacion.
2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha solucion proteica que comprende albumina es una solucion de albumina.
3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha albumina es albumina humana y es ventajosamente de origen serico.
4. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas particulas oseas son particulas oseas liofilizadas.
5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas particulas oseas son particulas oseas mineralizadas que estan sustancialmente limpias de componentes organicos.
6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que alguno/s de los ingredientes de dicha solucion proteica es/son de origen humano o es/son humanizado(s) inmunologicamente.
7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha solucion proteica se ha obtenido de un paciente con necesidad de una implantacion osea.
8. El metodo segun la reivindicacion 7, en el que dicha solucion proteica comprende el suero de dicho paciente o cualquier fraccion del mismo.
9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha solucion proteica comprende adicionalmente una proteina recombinante.
10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha solucion proteica comprende adicionalmente fibronectina o colageno o una combinacion de los mismos.
11. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha solucion proteica este exenta de componentes que son potencialmente inmunogenos para un paciente destinado a recibir dicha composicion osea mineralizada como implante.
12. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que ademas comprende una etapa de unir celulas capaces de potenciar la formacion osea a la superficie de dichas particulas oseas, siendo dichas celulas ventajosamente celulas madre mesenquimales.
13. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dichas celulas capaces de potenciar la formacion osea se obtienen de un paciente con necesidad de una implantacion osea.
14. Una composicion osea implantable adecuada para su uso en implantacion de injerto, obtenible mediante los metodos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Una composicion segun la reivindicacion 14 para su uso en terapia.