CN101903031A - 人骨形成细胞治疗炎性风湿性疾病 - Google Patents

人骨形成细胞治疗炎性风湿性疾病 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分离的骨形成细胞的新治疗用途，特别是在治疗炎性风湿性疾病中的用途。

Description

人骨形成细胞治疗炎性风湿性疾病
技术领域
本发明涉及骨形成细胞在治疗炎性风湿性疾病(inflammatoryrheumatic disease，IRD)中的治疗性应用，特别是在治疗IRD(之炎症部分)的炎症中的治疗性应用。
背景技术
风湿性疾病包括影响运动系统(特别是包括关节、肌肉、结缔组织、关节和骨周围软组织)的多种痛性疾病。
炎症和/或自身免疫反应是许多风湿性疾病的病因。这些病症(常称为“炎性风湿性疾病”或“IRD”)包括但不限于各种起源的关节炎、骨关节炎等。
目前IRD的可用治疗手段主要包括针对病因的抗风湿药(disease-modifying antirheumatic drug，DMARD)、糖皮质激素、非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)和止痛药。
因此，需要另外的IRD治疗方式，特别是针对IRD之炎症部分的治疗方式。
WO 2005/089127包括在支架装置中的骨生成细胞，用以使骨关节炎的骨软骨面再生。WO 2007/093431建议使用成骨细胞治疗类风湿性关节炎和骨坏死。这些文献并未公开骨形成细胞的抗炎作用，也未公开使用骨形成细胞来抑制风湿性疾病的炎症部分。
Liu等，2006(J Immunol 176(5)：2864-71)公开了在同种异体组织移植中从间充质干细胞分化的骨生成细胞具有免疫豁免(immunoprivileged)和免疫调节性能。然而，同种异体移植中的组织排斥机制与风湿性疾病中炎症的机制显然不同。这也体现在目前使用不同类型的药物来治疗这些病症中。因此，Liu等，2006并未公开骨形成细胞的任何抗炎作用，也未公开骨形成细胞抑制风湿性疾病之炎症部分的用途。
发明内容
本发明人出人意料地发现，骨形成细胞除了具有预期的骨再生作用以外，还表现出强效的免疫抑制和特异性抗炎作用，因此对于治疗对象中的炎性风湿性疾病(IRD)特别有用，更特别地用于治疗对象中IRD的炎症，即IRD的炎症部分。
因此，本发明的一些方面提供了用于治疗IRD的分离的骨形成细胞，以及分离的骨形成细胞在制备用于治疗IRD之药物中的用途。还公开了用于治疗IRD(之炎症部分)中炎症的分离的骨形成细胞，以及分离的骨形成细胞在制备用于治疗IRD(之炎症部分)中炎症之药物中的用途。
本发明还涉及用于在有此治疗需要的对象中预防和/或治疗IRD的方法，其包括向所述对象施用预防或治疗有效量的分离的骨形成细胞。还公开了用于在有此治疗需要的对象中预防和/或治疗IRD(之炎症部分)中炎症的方法，其包括向所述对象施用预防和/或治疗有效量的分离的骨形成细胞。同时，本发明还涉及用于治疗IRD之包含分离的骨形成细胞的药物组合物。此外，还公开了用于治疗IRD(之炎症部分)中炎症的包含分离的骨形成细胞的药物组合物。
还描述了用于治疗炎症的分离的骨形成细胞，以及分离的骨形成细胞在制备用于治疗炎症之药物中的用途。还描述了用于在有此治疗需要的对象中预防和/或治疗炎症的方法，其包括向所述对象施用预防或治疗有效量的分离的骨形成细胞。此外描述了用于治疗炎症之包含分离的骨形成细胞的药物组合物。
本文所用的与细胞或细胞群有关的术语“分离的”意指这些细胞或细胞群不形成动物或人体的一部分，而是从其取出或分离而来的。
所述骨形成细胞可以优选地为哺乳动物来源的，包括非人哺乳动物来源，更优选地为人来源的。骨形成细胞通常可获得自或源自对象(例如优选人或非人哺乳动物对象)的生物样品(即，从对象取出并包含其细胞的样品)。
对象优选地包括温血动物，更优选地是哺乳动物对象(包括人和非人哺乳动物对象)，更优选地是灵长类对象(包括人和非人灵长类对象)，更加优选地是人对象。所述骨形成细胞因而可以来自这些来源。
所述骨形成细胞可优选地用于自体施用(即，施用给获得所述细胞或所述细胞来源的同一对象)或同种异体施用(即，施用给与获得所述细胞或所述细胞来源的对象属于同一物种但非该对象本身的对象)。还可以异种施用所述骨形成细胞(即，将从一个物种之对象获得或来源的细胞施用给另一物种的对象)。
优选地，本文中的人骨形成细胞自体施用或同种异体施用给患有IRD的人对象。自体施用可以是特别优选的。
本文所用的术语“骨形成细胞”泛指能有助于形成骨材料和/或骨基质的细胞或者能够发育成有助于形成骨材料和/或骨基质之细胞的细胞，特别是指具有以下特征的分离的细胞或细胞群：a)能够进行骨生成分化，或b)定向于骨生成分化，或c)至少部分地已经沿骨生成进行分化，更优选地是指符合b)或c)中任一项的分离的细胞或细胞群。不受限制地，骨形成细胞特别地包括骨原细胞(osteoprogenitor)、成骨细胞(osteoblast)、骨细胞以及本领域已知的其它骨生成谱系的细胞类型。
因此，本领域技术人员一般理解本文中术语“骨形成细胞”的界限。然而，作为进一步指导并且不受限制地，本发明的骨形成细胞可表现出以下任一、多个或所有特征：
a)所述细胞包含碱性磷酸酶(ALP)的表达(更特别地是骨-肝-肾型ALP的表达)或骨钙蛋白的表达，或二者均表达；
b)任选地，所述细胞包含前胶原1型氨基端前肽(procollagen type 1amino-terminal propeptide，P1NP)、骨粘连蛋白(osteonectin，ON)、骨桥蛋白(osteopontin，OP)和骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)中任何一种或多种的表达；
c)任选地，所述细胞包含间充质标记物CD105、CD73和CD90中任何一种或多种的表达；
d)所述细胞显示矿化外部环境或者合成含钙细胞外基质的能力(例如，当暴露于骨生成介质时；参见Jaiswal等，1997.J Cell Biochem 64：295-312)。钙在细胞内的积累以及在基质蛋白质中的沉积可通过常规方法来测量，例如通过在45Ca2+中培养、清洗以及再次培养，然后测定细胞内存在的或细胞外基质中沉积的任何放射性(美国专利No.5,972,703)来测量，或者通过使用Ca2+试剂盒(Sigma试剂盒#587)测定针对矿化的培养底物来测量，或者如实施例中所述地来测量；
e)所述细胞基本上不分化成脂肪细胞谱系(例如脂肪细胞)或软骨细胞谱系(例如软骨细胞)中的任一细胞，并且优选地不分化成上述两类细胞。可使用本领域成熟的标准分化诱导条件(例如参见Pittenger等，1999.Science 284：143-7)和测定方法(例如，经诱导后，脂肪细胞通常用油红O染色以显示脂质累积；软骨细胞通常用爱茜蓝(alcian blue)和番红O染色)来测试不向所述细胞谱系分化。基本上缺乏向脂肪生成和/或软骨生成分化的倾向可通常意味着，当应用各测试时，少于50％、或少于30％、或少于5％、或少于1％的测试细胞显示脂肪生成或软骨生成分化的迹象。
在一个实施方案中，所述骨形成细胞可表现出上述a)、d)和e)中的所有特征。
当细胞中某特定组分(例如标记物或酶)为阳性时，这意味着本领域技术人员将会推断出独特信号的存在或证据，例如与合适的对照相比，当进行适当的测量时，可通过抗体检测或通过逆转录聚合酶链式反应检测该组分。当所述方法允许对组分进行定量评估时，阳性细胞一般可产生与对照显著不同的信号，例如且不受限制地，至少比对照产生的该信号高出1.5倍，例如高出至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍，甚至更高。
可使用本领域已知的任何合适的免疫学技术(例如免疫细胞化学或亲和吸附、Western印迹分析、FACS、ELISA等)、或通过任何合适的酶活性生化测定(例如，针对ALP的测定)、或通过测量标记物mRNA之量的任何合适的技术(例如，Northern印迹、半定量或定量RT-PCR等)来检测上述细胞特异性标记物的表达。本公开内容中列出的标记物序列数据是已知的并可通过公共数据库(如GenBank(htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/))获得。
用于本发明的分离的骨形成细胞或细胞群可通过本领域已知的任何合适的方式获得或来源。在一个实施方案中，骨形成细胞或细胞群可通过使用已知的分化实验方案从分化程度相对较低的成人祖细胞或干细胞(例如从间充质干细胞)分化而得到。不受限制地，在WO 2007/093431中公开了一种获得形成骨之成骨细胞的合适方法，其包括在血浆和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)存在下培养分离的骨髓干细胞(BMSC)或间充质干细胞(MSC)。在另一个实例中，如Pittenger等，1999(Science 284：143-7)和Jaiswal等，1997(同上)所述，骨生成细胞谱系可通过在骨生成介质中分化MSC而获得。在另一实施方案中，骨形成细胞或细胞群可以从含有该细胞的生物样品中分离出来以及任选地进行培养和/或扩增。例如，如Skjodt等，1985(J Endocrinol 105：391-6)所述，成骨细胞可直接从骨小梁分离并培养。
本文所用的术语“炎性风湿性疾病”或“IRD”一般地包括所有涉及炎性组分和/或自身免疫组分、特别是涉及至少一种炎性组分的风湿性疾病。例如且不受限制地，IRD特别地包括骨关节炎(OA)、银屑病性关节病、痛风、假性通风以及多种起因的关节炎(包括类风湿性关节炎(RA)、肠病性关节炎、反应性关节炎和赖特尔综合征(Reiter syndrome)、骨坏死、幼年型少关节类风湿性关节炎(pauciarticular juvenile rheumatoidarthritis)、斯蒂尔病(Still disease)、贝赫切特病(Behcet disease)、系统性红斑狼疮、脓毒性关节炎和脊柱关节病(例如强直性脊柱炎、肠病性脊柱炎和未区分的脊柱关节病等)等)。
因此，在一个实施方案中，本公开内容可涉及选自以下的任一种IRD：骨关节炎(OA)、银屑病性关节病、痛风、假性痛风以及各种起因的关节炎(包括类风湿性关节炎(RA)、肠病性关节炎、反应性关节炎和赖特尔综合征、骨坏死、幼年型少关节类风湿性关节炎、斯蒂尔病、贝赫切特病、系统性红斑狼疮、脓毒性关节炎和脊柱关节病(例如强直性脊柱炎、肠病性脊柱炎和未区分的脊柱关节病等)等)。
在另一实施方案中，本公开内容可涉及除了骨关节炎(OA)、骨坏死和类风湿性关节炎(RA)以外的任一种IRD。
在又一实施方案中，本公开内容可涉及选自以下的任一种IRD：银屑病性关节病、痛风、假性痛风以及各种起因的关节炎(包括肠病性关节炎、反应性关节炎和赖特尔综合征、幼年型少关节类风湿性关节炎、斯蒂尔病、贝赫切特病、系统性红斑狼疮、脓毒性关节炎和脊柱关节病(例如强直性脊柱炎、肠病性脊柱炎和未区分的脊柱关节病等)等)。
本发明的骨形成细胞可特别地用于治疗IRD疾病(或治疗所述疾病的炎症或炎症部分)，其包括(具有或不具有自身免疫部分的)炎症以及骨损伤例如糜烂或软骨下损伤。在该实施方案中，所述骨形成细胞可协同改善所述两种病变，从而可实现更显著的治疗改善。
在另一实施方案中，所述骨形成细胞可用于治疗IRD疾病(或治疗所述疾病的炎症或炎症部分)，其中所述疾病包括炎症但不包括骨损伤。例如，可以治疗存在炎症部分但随后无骨损伤之患者中的IRD疾病。骨形成细胞在此类疾病中的应用先前并未指明，这是因为在有关骨形成细胞之抗炎作用的本公开内容之前，无法预期施用骨形成细胞对此类疾病的任何益处。
预防和/或治疗IRD(即IRD之炎症部分)的炎症可特别地包括抑制、减少或降低所述IRD中的全身性和/或局部炎症(即，抑制、减少或降低炎症(炎症部分))的水平或程度。所述炎症的水平或程度可通过已知的方式进行适当评价，例如但不限于，通过测量炎症的症状(例如发热、组织肿胀、疼痛、功能损失等)和/或通过测量炎症的细胞和/或分子标记物(例如，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和TNFα)(例如所述标记物的局部和/或全身性水平)来实现。
本发明中所用的分离的骨形成细胞可被适当地配制成药物组合物并作为药物组合物施用。
除了本文所述的骨形成细胞以外，这样的药物组合物还可包含可药用的赋形剂、载体、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂或本领域技术人员熟知的其它材料。这些材料应当是无毒性的，并且不应干扰细胞活性。载体或其它材料的精确性质将取决于施用途径。例如，所述组合物可采用可胃肠外施用的水性溶液形式，同时无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。对于药物制备的一般原则来说，读者可参考Cell Therapy：Stem CellTransplantation，Gene Therapy and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn& W.Sheridan编，Cambridge University Press，1996；以及HematopoieticStem Cell Therapy，E.D.Ball，J.Lister & P.Law，Churchill Livingstone，2000。
这样的药物组合物可包含确保其中细胞存活的其它组分。例如，所述组合物可包含合适的缓冲系统(例如磷酸盐或碳酸盐缓冲系统)以获得期望的pH(更通常为接近中性pH)，并且可包含足够的盐以确保细胞的等渗条件从而防止渗透压应激。例如，如本领域中所知，为这些目的的合适溶液可以是磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化钠溶液、林格氏注射液或乳酸盐林格氏注射液。此外，所述组合物还可包含载体蛋白质例如白蛋白(其可增强细胞的存活力)。
所述药物组合物可包含用于修复骨创伤和缺陷的其它组分。例如，这样的组分可包括但不限于羟基磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP)、明胶、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸、透明质酸、壳聚糖、多聚L-赖氨酸以及胶原。例如，所述骨形成细胞可与脱矿物质的骨基质(demineralised bone matrix，DBM)或其它基质联用从而使该复合材料具有骨生成性质(在其中正确地形成骨)以及诱导骨生成的性质。使用自体骨髓细胞及同种异体DBM的类似方法也获得了好的结果(Connolly等，1995.Clin Orthop 313：8-18)。
所述药物组合物还可包含补充性生物活性因子(例如骨形态发生蛋白，如BMP-2或BMP-4、BMP-7)或任何其它生长因子)或与其共施用。其它可能的伴随组分包括适用于辅助骨再生的钙或磷酸盐的无机来源(WO00/07639)。需要时，可利用载体基质或材料来施用细胞制备物以提供改善的组织再生。例如，所述材料可以是颗粒状陶瓷或生物聚合物(如明胶、胶原、骨粘连蛋白、纤维蛋白原或骨钙蛋白)。多孔基质可通过标准技术进行合成(例如Mikos等，Biomaterials 14：323，1993；Mikos等，Polymer 35：1068，1994；Cook等，J.Biomed.Mater.Res.35：513，1997)。
所述药物组合物还可包括可用于IRD的本领域任何已知疗法或者与其共施用，所述疗法例如但不限于针对病因的抗风湿药(DMARD)、糖皮质激素、非甾体抗炎药(NSAID)或止痛药。因此，本发明还提供了包含骨形成细胞以及选自DMARD、糖皮质激素、NSAID和止痛药的药剂的药物组合物，以同时、依次或分开用于治疗IRD。
所述骨形成细胞以“预防有效量”(即，研究人员、兽医、医生或其它临床工作者找出的抑制或延缓对象发病的量)或以“治疗有效量”(即，研究人员、兽医、医生或其它临床工作者找出的引起对象中生物学或医学应答的量，其可包括缓解所治疗之疾病或病症的症状等)。所用骨形成细胞(任选地与一种或多种其它活性剂联用)的剂量或量取决于个体病例，并且有针对性地根据个体情况以实现最佳效果。因此，其取决于所治疗疾病的性质和严重程度，还取决于性别、年龄、体重、健康状况、饮食、施用方式和时间以及待治疗对象的个体应答，取决于施用途径、效力、稳定性和作用时间，取决于所述治疗为急性或慢性或预防性，或者取决于除了本发明的骨形成细胞以外是否还施用其它活性化合物。
例如且不受限制地，可向对象(优选非人哺乳动物或人对象)局部和/或全身性施用约1×103至约1×109剂量的骨形成细胞、或约1×104至约1×108剂量的骨形成细胞、或约1×105至约1×107剂量的骨形成细胞、或约1×106至约1×108剂量的骨形成细胞。这样的施用可以为一次或重复的，或者可通过体积单位来施用。例如且不受限制地，重复施用的频率可以为每天一次或两次；每周一次、二次或多次；每月一次、二次或多次。
本发明还包括制备所述药物组合物的方法，其中所述药物组合物意在用于治疗IRD，其通过将本文公开的骨形成细胞与一种或多种另外组分的混合来实现。
所述骨形成细胞或包含其的药物制剂可通过使它们移植或迁移至目标组织位点并重建或再生功能缺陷区域的方式施用。所述组合物的施用将取决于待修复的骨骼肌位点。例如，在关节疾病的情形中，可通过直接注射或移植进关节腔来施用。在另一些情形中，所述骨形成细胞或包含其的药物制剂可全身性施用，从而它们可在全身发挥抗炎作用或者它们可迁移至患病区域。因此，在一般性实例中，所述施用可以是全身性、局部、关节内或关节周围施用。
因此，在一个实施方案中，上述药用细胞制剂可采用液体组合物的形式施用。
在另一实施方案中，所述骨形成细胞或细胞群可移至和/或培养在合适的基底上以用于移植。其上可施加和培养细胞的基底可以是金属(例如钛、钴/铬合金或不锈钢)、生物活性表面(例如磷酸钙)、聚合物表面(例如聚乙烯)等。尽管并非优选地，还可使用硅质材料例如玻璃陶瓷作为基底。最优选的是金属(例如钛)和磷酸钙，然而磷酸钙并非基底的必要组分。所述基底可以是多孔的或无孔的。
例如，如有必要，可将已在培养皿中增殖或分化的细胞移至三维固体支持物上，从而使它们通过在本发明液体营养培养基中孵育固体支持物来扩增和/或继续分化过程。细胞可被移至三维固体支持物上，例如通过用含有所述细胞的液体悬液注入支持物来实现。可将如上获得的经注入支持物移植进人对象中。还可通过将其浸入液体培养基中再次培养该经注入的支持物。
所述三维固体支持物需要是生物相容性的，从而能够将其移植进入体中。它可采用任何合适的形状，如圆柱、球形、盘状或任意形状的一部分。就适于作为生物相容性三维固体支持物的材料而言，特别要提及碳酸钙，特别是霰石(尤其以珊瑚骨骼的形状)、基于氧化铝的多孔陶瓷、基于氧化锆的多孔陶瓷、基于磷酸三钙的多孔陶瓷、和/或羟基磷灰石、通过水热交换使碳酸钙转化成羟基磷灰石而获得的仿制珊瑚骨骼、或者其它磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷、生物活性玻璃陶瓷例如Bioglass(TM)玻璃。
一般定义
除非另有定义，本发明公开的所有术语(包括技术和科学术语)均具有本发明所述领域之技术人员常规理解的含义。
本文使用的无数量词修饰的形式包括单数和复数的所指对象，除非文中另有指明。例如，“细胞”是指一种(个)或多于一种(个)细胞。
本文使用的术语“包含”和“包括”是“含有”或“涵盖”等的同义词，是开放式的，不排除未记载的其它成员、要素或方法步骤。
通过端点记载的数值范围包括纳入该范围内的所有数值以及所记载的端点。
当涉及测量值例如参数、数量、持续时间等时，本文使用的术语“约”意在包括从该特定数值起的+/-10％或更少、优选+/-5％或更少、更优选+/-1％或更少、尤其优选+/-0.1％或更少的差异，其中这些差异适于进行本发明的公开内容。应当理解，“约”所修饰的数值本身是具体、优选地公开的。
本说明书中引用的所有文献均通过引用全部并入本文中。特别的，本文具体涉及的所有文献的教导内容均通过引用并入本文。
附图说明
图1显示骨形成细胞中间充质和骨标记物的表达。
图2显示骨形成细胞的矿化(A)和ALP(B)染色。
图3显示用CARRA治疗的动物(浅灰色)、用CARRA+DEX治疗的动物(深灰色)、用CARRA+OB治疗的动物(黑色)以及用CARRA+OB+DEX治疗的动物(虚线)之踝部直径之间的比较。直径表示为与基线相比的百分比增加。
图4显示用CARRA治疗的动物(菱形)、用CARRA+DEX治疗的动物(正方形)、用CARRA+OB治疗的动物(三角形)之爪直径之间的比较。直径表示为与基线相比的百分比增加。
图5显示用ADJ治疗的动物(菱形)、用ADJ+DEX治疗的动物(正方形)以及用ADJ+OB治疗的动物(三角形)之爪直径之间的比较。直径表示为与基线相比的百分比增加。
附图中使用的缩略语如下：CARRA：角叉藻聚糖0.7％；ADJ：完全弗氏佐剂75μg；DEX：地塞米松1mg/kg；OB：成骨细胞1×106
具体实施方式
实施例1
实验操作
以下，所描述的操作得到骨形成细胞，其(A)来自基本如WO2007/093431所述的骨髓干细胞(BMSC)，或(B)通过在骨生成培养基中进一步分化(A)的细胞而得到，或(C)通过扩增来自骨小梁的成骨细胞而得到。
A.从BMSC获得成骨细胞
从患骨病患者的髂嵴获取20～60ml经肝素化的骨髓(BM)。将BM与磷酸盐缓冲液(PBS)混合(体积比2∶1)，并平铺在密度梯度Ficoll溶液上。离心后，从交界处收集单核细胞并用PBS清洗两次。平行地，将移至干燥试管的160ml血液离心后，从患者或健康供者获取血清。用补充有20％同种异体血浆和10ng/ml FGF2(或者使用本领域已知的诱导成骨细胞表型的另一种生长因子，例如BMP)的αMEM培养基将细胞重悬。在175cm2培养瓶中用1×107个细胞铺板，并维持在37℃、含5％CO2的湿润气氛中。使细胞附着4天，然后第一次更换培养基。在第7天和第11天进行另两次部分更换培养基(更换一半体积)。在第14天，使用胰蛋白酶-EDTA溶液于37℃下剥离细胞1～5分钟。对细胞计数，然后以1×106个细胞/175cm2再培养一周。
B.骨髓间充质细胞在骨生成培养基中分化
通过与胰蛋白酶-EDTA孵育来回收标准MSC扩增培养的骨髓间充质干细胞，并以60～120,000个细胞/孔铺板于6孔板的扩增培养基中(12500个细胞/cm2)。第二天，用2.5ml骨生成培养基替换所述培养基。将细胞培养2、3或4周。每3～4天更换培养基。
培养基
地塞米松稀释液：
Dex1(5.10-4M)：2μl地塞米松母液(5.10-2M)+198μl α-MEM
Dex2(10-6M)：2μl Dex1(5.10-4M)+998μl α-MEM
骨生成培养基(40ml)
               体积        终浓度
αMEM          31ml        /
FCS            6ml         15％
PenStrepGlu(100×)    400μl    1×
地塞米松(Dex2)        400μl    10-8M
抗坏血酸              200μl    50μg/ml
β-甘油磷酸盐         2ml       10mM
C.小梁成骨细胞扩增
从人骨标本仔细地去除软结缔组织和骨皮质，将余下的骨小梁切碎成为小片段(1mm2)。用PBS充分清洗所述骨片段以取出所附着的骨髓细胞，并将所述细胞接种于25cm2组织培养瓶中补充有自体血清、添加或不添加生长因子(如上)的培养基中。每周更换两次培养基。4周后，使用胰蛋白酶-EDTA溶液剥离细胞，计数并最后以5000个细胞/cm2的密度重新铺板。
流式细胞术
利用流式细胞术来分析细胞的免疫学-生物学细胞表面标记物。用下列经标记的单克隆抗体孵育骨形成细胞15分钟：HLA-I、HLA-DR、CD80、CD86、CTLA-4、CD40L和CD28，然后用PBS清洗，继而离心并用0.3mlPBS重悬。
在对细胞进行固定和透化处理后，用特异性抗体免疫检测OCN，利用流式细胞术对染色进行分析。
矿化测定
通过向细胞添加骨生成培养基来评价矿化能力的诱导。在补充有0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸和3mM甘油磷酸盐的5％自体血浆存在下，将～6000个骨形成细胞(如上)/cm2接种于6孔板中。培养2、3或4周后，用3.7％福尔马林/PBS固定细胞并用茜素红染色。
ALP染色
对细胞染色用于ALP检测。用PBS清洗骨形成细胞(如上)两次，然后在室温下用60％柠檬酸缓冲丙酮固定30秒钟，然后用蒸馏水再漂洗45秒。然后，在室温避光条件下用Fast Blue RR/Naphtol AS-MX磷酸盐溶液清洗细胞30分钟。用蒸馏水清洗细胞2分钟，随后用Mayer’s苏木精溶液染色10分钟。最后，用蒸馏水清洗细胞3分钟。
增殖测定
在存在或不存在PHA(一种T细胞有丝分裂活化剂)时，将来自个体A(外周血单核细胞，PBMCa)的200,000个人T细胞/ml与来自个体B的经辐射或CD3缺失的PMBC(APCb)以及来自第三个体的人骨形成细胞以总体积200μl接种于96孔微量滴定板中，孵育10天。以20,000、100,000和200,000/ml接种人骨形成细胞。在存在或不存在PHA下，当PBMCa和APCb共孵育时发生混合淋巴细胞反应，其中PBMCa细胞被APCb上的表面抗原激活。将所述培养物与1μCi/ml 3H-胸苷孵育18小时以测量T细胞增殖。用冰冷的PBS清洗细胞两次，然后用冰冷的三氯乙酸(TCA)清洗细胞两次。最后，用含有0.1N NaOH和0.1％Triton-X100的溶液裂解细胞。收集上清液并与闪烁液混合，以利用β计数器进行分析。
结果
骨重建性能
3周后利用流式细胞术对细胞标记物(骨和间充质标记物)或膜标记物水平进行评估(图1)。骨标记物(ALP、OCN)和间充质标记物(CD105、73、90)高度表达，而造血标记物(CD45)为阴性。
利用ALP产生(ALP染色)和钙沉积(矿化)评价与骨生物学功能的关联：在第21天，ALP在大多数细胞(如果不是所有的话)中表达，观察到重要的矿物质沉积(镜检中占总区域的65％以上)(图2)。
免疫调节性能
表1和2所示的结果表明，APC被PBMC识别为外来细胞，从而PBMC进行增殖。当PBMCa和APCb在自体BM来源之成骨细胞(来自个体B，BMOBb)存在下混合，该混合的淋巴细胞反应被抑制40～50％。
在PHA(一种强的T细胞增殖刺激物)(10μg/ml)存在下也观察到了同样的作用(表2)。成骨细胞的免疫抑制作用对于经刺激的T细胞来说更为重要(55～65％)。
令人感兴趣的是，当在同种异体BM来源之成骨细胞(来自个体C，BMOBc)存在下进行混合，混合的淋巴细胞反应也被显著地抑制(在标准条件下为30～40％(表1)，在PHA刺激条件下为60～65％)。来自个体C的BM来源之成骨细胞(BMOBc)被接种于96孔微量滴定板上，并与PBMCa和APCb共孵育。所述培养物与3H-胸苷孵育18小时以测量T细胞增殖情况。这些结果表明，所述抑制作用不具有针对HLA亚型的特异性。
表1
  MSC n°   PBMCa+APCb   PBMCa+APCb+BMOBb   PBMCa+APCb+BMOBc
  123   15,000+/-2,10014,000+/-1,75017,000+/-200   9,000+/-1,3507,000+/-35012,000+/-1,500   10,000+/-1,5009,000+/-55012,000+/-750
表2.BM来源的成骨细胞(BMOB)对PHA活化的T细胞增殖的抑制作用(数值表示为掺入[3H]胸苷的cpm)
  MSC n°   PBMCa+APCb+PHA   PBMCa+APCb+BMOBb+PHA   PBMCa+APCb+BMOBc+PHA
  123   25,000+/-2,80022,000+/-2,20035,000+/-3,400   12,000+/-1,7008,000+/-1,30015,000+/-1,200   13,000+/-1,30010,000+/-95013,000+/-1,100
结论
骨形成细胞例如骨原细胞、前成骨细胞或成骨细胞可用于治疗炎性风湿性疾病，因为它们表现出骨重建和抗炎的性能。这些细胞的特征在于高水平表达与ALP酶活性和矿化能力相关的间充质和骨表面标记物，表明其骨生物学模式。这些细胞还能在自体和同种异体的基础上下调经刺激T细胞的增殖应答。这表明，自体或同种异体骨髓来源的骨形成细胞产物对于炎性风湿性疾病的治疗特别有用。
实施例2：体内炎症模型(IRD)
角叉藻聚糖诱导的踝/爪炎症模型(1)
通过向8周龄的SWISS小鼠后爪注射含1％角叉藻聚糖(CARRA，Sigma，Switzerland)的PBS溶液来诱导炎症；每只动物的每一后爪接受单次注射(表3)。经角叉藻聚糖注射的动物在注射后立即接受PBS，或浓度为1mg/kg的地塞米松溶液(Dex；Sigma Switzerland)，或1×106个人骨形成细胞(OB)(如实施例1A中所述，其来自骨髓间充质基质细胞)，或DEX与OB的组合。
表3：实验步骤
分组(n＝4)   左后爪   右后爪
#1   CARRA 0.7％   CARRA 0.7％+DEX(1mg/kg)
#2   CARRA 0.7％   CARRA 0.7％+OB 106
#3   CARRA 0.7％   CARRA 0.7％+DEX+OB
#4   CARRA 0.7％   PBS
用异氟烷镇静后，在T0以及在T1、T4和T24注射之前，分别在施用CARRA之前以及在注射后1h、4h、6h和24h，用数码卡尺测量踝和爪的周长。
角叉藻聚糖诱导的踝/爪炎症模型(2)
通过向8周龄的SWISS小鼠后爪注射含1％λ角叉藻聚糖(CARRA，Sigma，Switzerland)的PBS溶液来诱导炎症；每只动物的每一后爪接受单次注射(表4)。经角叉藻聚糖注射的动物在注射后立即接受PBS，或浓度为1mg/kg的地塞米松溶液(DEX；Sigma Switzerland)，或1×106个人骨形成细胞(OB)(如实施例1A中所述，其来自骨髓间充质基质细胞)。
表4：实验步骤
分组(n＝4)   左后爪   右后爪
#1   CARRA 0.7％   CARRA 0.7％+DEX(1mg/kg)
#2   CARRA 0.7％   CARRA 0.7％+OB 106
#3   CARRA 0.7％   PBS
用异氟烷镇静后，在T0以及在T1、T4、T6和T24注射之前，分别在施用CARRA之前以及在注射后1h、4h、6h和24h，用数码卡尺测量踝和爪的周长。
佐剂诱导的踝/爪炎症模型
通过向8周龄的SWISS小鼠后爪注射含0.5％完全弗氏佐剂的PBS溶液来诱导炎症；每只动物的每一后爪接受单次注射(表5)。经佐剂注射的动物在注射后立即接受PBS，或浓度为1mg/kg的地塞米松溶液(DEX)，或1×106个人骨形成细胞(OB)(如实施例1A所述，其来自骨髓间充质基质细胞)。
表5：实验步骤
  分组(n＝4)  左后爪  右后爪
  #1  ADJ 75μg  ADJ 75μg+DEX(1mg/kg)
  #2  ADJ 75μg  ADJ 75μg+OB 106
  #2  ADJ 75μg  PBS
用异氟烷镇静后，在T0以及在T1、T4、T6和T24注射之前，分别在施用ADJ之前以及在注射后1h、4h、6h和24h，用数码卡尺测量踝和爪的周长。
结果：对角叉藻聚糖诱导之炎症的作用
注射角叉藻聚糖诱导随即的炎症反应，其可通过经注射动物的(爪或踝)直径增加来测量。与基线相比，直径在1小时后增加约20％，4小时后增加约25％，24小时后增加约17％(图3)。
在踝部，地塞米松(1mg/kg)诱导对炎症以及由注射角叉藻聚糖的踝/爪肿胀的有力抑制(图3)。地塞米松对炎症的抑制在1h和4h时为100％，但在之后逐渐减弱，在24h时完全消失。
通过踝部比较，施用骨形成细胞诱导中等程度但是重要的炎症抑制作用，其在1h和4h时分别降低30％和40％，然而这种抑制似乎维持时间较长，在24h时维持抑制40％。
令人感兴趣的是，在角叉藻聚糖诱导的炎症中，观察到骨形成细胞和地塞米松联用具有(强的)协同作用(图3)。在第1、4和24小时抗炎作用分别为50％、80％和75％。
骨形成细胞在爪中的抗炎作用更强且持续时间长。地塞米松在第1h、6h和24h时分别表现出100％、70％和38％的抑制作用，而骨形成细胞则分别为80％、90％和95％(图4)。这可能是由于注射细胞在爪中分布和扩散更好所致。
结果：对佐剂诱导之炎症的作用
在佐剂诱导的炎症中，尽管爪/踝炎症更加严重(即，与基线相比，在第4h至6h直径增加了40～50％)，骨形成细胞显示出强的抗炎作用(峰值效应为75～90％)，这与地塞米松的抑制作用类似(图5)，而前者维持了24h。

Claims (10)

1.用于治疗炎性风湿性疾病(IRD)之炎症部分的分离的骨形成细胞。
2.根据权利要求1所用的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞a)能够进行骨生成分化，或b)定向于骨生成分化，或c)至少部分地已经沿骨生成进行分化。
3.根据权利要求1或2中任一项所用的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞表现出以下特征：
i)所述细胞包含碱性磷酸酶(ALP)和/或骨钙蛋白(OCN)的表达，所述ALP更特别地是骨-肝-肾型ALP；
ii)所述细胞显示出矿化外部环境或者合成含钙细胞外基质的能力；和
iii)所述细胞基本上不分化成脂肪细胞谱系或软骨细胞谱系中的任一细胞，并且优选地不分化成上述两类细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所用的分离的骨形成细胞，其中所述骨形成细胞为人来源的，所述药物用于向人对象自体或同种异体施用。
5.根据权利要求4所用的分离的骨形成细胞，其中所述施用是全身性、局部的、关节内或关节周围的。
6.根据权利要求1至4中任一项所用的分离的骨形成细胞，其中所述IRD选自骨关节炎(OA)、银屑病性关节病、痛风、假性痛风以及各种起因的关节炎包括类风湿性关节炎(RA)、肠病性关节炎、反应性关节炎和赖特尔综合征、骨坏死、幼年型少关节类风湿性关节炎、斯蒂尔病、贝赫切特病、系统性红斑狼疮、脓毒性关节炎和脊柱关节病包括强直性脊柱炎、肠病性脊柱炎和未区分的脊柱关节病。
7.根据权利要求1至4中任一项所用的分离的骨形成细胞，其中所述IRD是除了骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)和骨坏死以外的其它炎性风湿性疾病。
8.根据权利要求1至7中任一项的分离的骨形成细胞，其中所述IRD包括炎症和骨损伤。
9.根据权利要求1至7中任一项的分离的骨形成细胞，其中所述IRD包括炎症但不包括骨损伤。
10.药物组合物，其包含骨形成细胞以及选自针对病因的抗风湿药(DMARD)、糖皮质激素、非甾体抗炎药(NSAID)和止痛药，以同时、依次或分开用于IRD之炎症部分的治疗。
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