JP2011505860A - 炎症性リウマチ性疾患の治療におけるヒト骨形成細胞 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a)細胞がアルカリホスファターゼ(ALP)、より具体的には骨−肝臓−腎臓型のALPの発現、又はオステオカルシンの発現、又はその両方の発現を有すること;
b)任意で、細胞が1型プロコラーゲンアミノ末端プロペプチド(P1NP)、オステオネクチン(ON)、オステオポンチン(OP)及び骨シアロタンパク質(BSP)のうちいずれか1つ又は複数の発現を有すること;
c)任意で、細胞が間葉系マーカーCD105、CD73及びCD90のうちいずれか1つ又は複数の発現を有すること;
d)細胞が外部環境を石灰化するか、又はカルシウム含有細胞外マトリクスを合成する能力の証拠を示すこと(例えば造骨培地に曝露した場合、ジャイスワル(Jaiswal)ら、「ジャーナル オブ セルラー バイオケミストリー(J Cell Biochem)」、1997年、第64巻、p.295−312を参照されたい)。細胞内でのカルシウム蓄積及びマトリクスタンパク質へのカルシウム沈着は、常法により、例えば45Ca2+中で培養し、洗浄し、再培養した後、細胞内に存在する又は細胞外マトリクスに沈着した全ての放射能を求めることにより(米国特許第5,972,703号明細書)、又は培養基質をCa2+アッセイキット(Sigma、キット番号587)を用いて石灰化について分析することにより、又は実施例に記載されるように測定することができる;
e)細胞が実質的に、脂肪細胞系列の細胞(例えば脂肪細胞)又は軟骨細胞系列の細胞(例えば軟骨細胞)のうちいずれか一方、好ましくはそのいずれにも分化しない。かかる細胞系列への分化の欠如は、当該技術分野で確立された標準的な分化誘導条件(例えば、ピッテンガー(Pittenger)ら、「サイエンス(Science)」、1999年、第284巻、p.143−147を参照されたい)、及び分析法(例えば、誘導されると、脂肪細胞は典型的には脂質の蓄積を示すオイルレッドOにより染色され、軟骨細胞は典型的にはアルシアンブルー又はサフラニンOにより染色される)を用いて試験され得る。脂肪細胞分化及び/又は軟骨細胞分化の傾向の実質的な欠如とは典型的には、それぞれの試験に適用される場合、試験された細胞の50%未満、又は30%未満、又は5%未満、又は1%未満しか脂肪細胞分化又は軟骨細胞分化の兆候を示さないことを意味し得る。
特に定義しない限り、本発明を開示するにあたって使用される、技術用語及び科学用語を含む全ての用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者(当業者)によって一般に理解される意味を有する。
以下に(A)特許文献2に実質的に記載されるような骨髄幹細胞(BMSC)からの骨形成細胞の誘導、又は(B)(A)の細胞を造骨培地においてさらに分化させることによる骨形成細胞の誘導、又は(C)骨梁から骨芽細胞を増殖させることによる骨形成細胞の誘導を引き起こす手順を記載する。
20ml〜60mlのヘパリン化骨髄(BM)を、骨疾患を患う患者の腸骨稜から得た。BMをリン酸緩衝生理食塩水(PBS、2v:v)と混合し、密度勾配Ficoll溶液上に重層した。遠心分離後、単核細胞を界面から採取し、PBS中で2回洗浄した。並行して、患者又は健常ドナーからの血清を、乾燥管(dry tube)に注いだ160mlの血液を遠心分離して得た。20%同種血漿及び10ng/mlのFGF2(又は骨芽細胞表現型を誘導する当該技術分野で既知の別の成長因子、例えばBMP)を添加したαMEM培地中に細胞を再懸濁した。細胞を1×107細胞/175cm2でフラスコにプレーティングし、5%CO2を含有する37℃の加湿雰囲気下で維持した。細胞を4日間付着させた後、初期培地を交換した。さらに2回の部分的培地交換(半量を交換)を7日目及び11日目に行なった。14日目に細胞を、37℃で1分〜5分間トリプシン−EDTA溶液を用いて分離した。細胞を計数し、1×106細胞/175cm2でプレーティングして、さらに1週間培養した。
標準的なMSC増殖培養から得た骨髄間葉系幹細胞を、トリプシン−EDTAと共にインキュベートすることにより回収し、6ウェルプレートにおいて、60細胞/ウェル〜120000細胞/ウェルで増殖培地にプレーティングした(12500細胞/cm2)。翌日、培地を2.5mlの造骨培地に取り替えた。細胞を2週間、3週間又は4週間培養した。培地は3日〜4日毎に取り替えた。
デキサメタゾン希釈物:
Dex1(5×10−4M):2μlのデキサメタゾン原液(5×10−2M)+198μlのα−MEM
Dex2(10−6M):2μlのDex1(5×10−4M)+998μlのα−MEM
造骨培地(40ml)
容量 最終濃度
αMEM 31ml /
FCS 6ml 15%
PenStrepGlu(100×) 400μl 1×
デキサメタゾン(Dex2) 400μl 10−8M
アスコルビン酸 200μl 50μg/ml
β−グリセロリン酸 2ml 10mM
ヒト骨検体から、軟結合組織及び皮質骨を慎重に除去し、残りの骨梁を小断片(1mm2)に刻んだ。骨断片をPBS中で十分に洗浄して、付着した骨髄細胞を除去し、25cm2の組織培養フラスコにおいて、自己血清を添加し、成長因子を添加した又は添加していない培養培地に播種した(上記を参照されたい)。培地を1週間に2回交換した。4週間後、トリプシン−EDTA溶液を用いて細胞を遊離させ、計数して、最後に5000細胞/cm2の密度で再プレーティングした。
細胞の免疫生物学的細胞表面マーカーをフローサイトメトリーにより解析した。骨形成細胞を、以下の標識モノクローナル抗体:HLA−I、HLA−DR、CD80、CD86、CTLA−4、CD40L及びCD28と共に15分間インキュベートした後、PBSで洗浄し、遠心分離し、0.3mlのPBS中に再懸濁した。
石灰化能の誘導を、細胞に造骨培地を添加することにより評価した。約6000個/cm2の骨形成細胞(上記を参照されたい)を、0.1μMデキサメタゾン、0.05mMアスコルビン酸、及び3mMグリセロリン酸塩を添加した5%自己血漿の存在下で6ウェルプレートにプレーティングした。2週間、3週間又は4週間の培養の後、細胞を3.7%ホルムアルデヒド/PBSで固定し、アリザリンレッドにより染色した。
細胞をALP検出のために染色した。骨形成細胞(上記を参照されたい)をPBSで2回洗浄した後、60%クエン酸緩衝アセトン中で室温にて30秒間固定し、蒸留水で45秒間再度リンスした。次いで、ファストブルーRR/ナフトールAS−MXホスフェート溶液を用いて室温にて暗所で30分間、細胞を染色した。細胞を2分間蒸留水で洗浄した後、マイヤーヘマトキシリン溶液中で10分間対比染色した。最後に、細胞を3分間蒸留水中で洗浄した。
個体Aから得た200000個/mlのヒトT細胞(末梢血単核細胞、PBMCa)を、個体Bから得た放射線照射PMBC又はCD3枯渇PMBC(APCb)、及び第3の個体から得たヒト骨形成細胞と共に96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、総体積200μlで、PHA(T細胞の細胞分裂活性化因子)の存在下又は非存在下で10日間平板培養した。ヒト骨形成細胞は20000個/ml、100000個/ml及び200000個/mlで播種した。PBMCa及びAPCbをPHAと共に又はPHAの非存在下で共インキュベートした場合、PBMCa細胞がAPCb上の表面抗原により活性化される混合リンパ球反応が起こった。培養物を培養期間18時間で1μCi/mlの3H−チミジンと共にインキュベートし、T細胞の増殖を測定した。細胞を氷冷PBSで2回、及び氷冷5%トリクロロ酢酸(TCA)で2回洗浄した。最後に、0.1N NaOH及び0.1%トリトンX100を含有する溶液により細胞を溶解した。上清を採取しシンチレーション液と混合してベータカウンター上で解析した。
骨再建特性
3週間後、細胞マーカー(骨マーカー及び間葉系マーカー)又は細胞膜マーカー(membrane markers)のレベルをフローサイトメトリーにより評価した(図1)。骨マーカー(ALP、OCN)及び間葉系マーカー(CD105、CD73、CD90)は、高度に発現していたが、造血マーカー(CD45)は陰性であった。
表1及び表2に示す結果は、APCがPBMCにより異物細胞として認識されたこと、その結果PBMCが増殖していたことを示す。PBMCa及びAPCbを、自己BM由来骨芽細胞(個体Bから得た、BMOBb)の存在下で混合した場合、混合リンパ球反応が40%〜50%抑制された。
骨前駆細胞、前骨芽細胞又は骨芽細胞等の骨形成細胞は、骨再建特性及び抗炎症特性の両方を示すため、炎症性リウマチ性疾患の治療において有用であり得る。これらの細胞は、ALP酵素活性及び石灰化能と相関し、それらの骨生物学的プロファイルを裏付ける、間葉系マーカー及び骨表面マーカーの高い発現レベルを特徴とする。細胞はさらに、刺激されたT細胞の増殖応答を自己レベル及び同種レベルで(on anautologous and allogeneic basis)下方制御することが可能である。このことは、自己骨髄又は同種骨髄に由来する骨形成細胞の産物が、炎症性リウマチ性疾患の治療に特に有用であり得ることを実証するものである。
カラギーナン誘発性足首/足炎症のモデル(1)
PBS中に1%のカラギーナン(CARRA;Sigma,Switzerland)を含有する溶液を、8週齢スイスマウスの後足に注射することにより炎症を誘発させた(表3)。各々の動物は各後足に単回注射を受けた。カラギーナン注射を受けた動物に、注射の直後に、PBSのみ、又はデキサメタゾン(DEX;Sigma,Switzerland)の溶液を1mg/kgの濃度で、又は1×106個のヒト骨形成細胞(OB)(実施例1のAに記載されるような骨髄間葉系間質細胞に由来する)、又はDEX及びOBの組み合わせを与えた。
PBS中に1%のλ−カラギーナン(CARRA;Sigma,Switzerland)を含有する溶液を、8週齢スイスマウスの後足に注射することにより炎症を誘発させた(表4)。各々の動物は各後足に単回注射を受けた。カラギーナン注射を受けた動物に、注射の直後に、PBSのみ、又はデキサメタゾン(DEX;Sigma,Switzerland)の溶液を1mg/kgの濃度で、又は1×106個のヒト骨形成細胞(OB)(実施例1のAに記載されるような骨髄間葉系間質細胞に由来する)を与えた。
PBS中に0.5%の完全フロインドアジュバント(ADJ;Sigma,Switzerland)を含有する溶液を、8週齢スイスマウスの後足に注射することにより炎症を誘発させた(表5)。各々の動物は各後足に単回注射を受けた。アジュバント注射を受けた動物に、注射の直後に、PBSのみ、又はデキサメタゾン(DEX)の溶液を1mg/kgの濃度で、又は1×106個のヒト骨形成細胞(OB)(実施例1のAに記載されるような骨髄間葉系間質細胞に由来する)を与えた。
カラギーナンの注射により、注射を受けた動物の(足又は足首)直径の増加により測定可能な即時型炎症性反応が誘発される。直径は、ベースラインより1時間後でおよそ20%、4時間後で25%、及び24時間後で17%増加する(図3)。
アジュバント誘発性炎症においては、足/足首のより激しい炎症、すなわち、4時間〜6時間の時点でベースラインに対して40%〜50%の直径の増加にもかかわらず、骨形成細胞はデキサメタゾンによる抑制と同様、強力な抗炎症効果(75%〜90%のピーク効果)を示す傾向があり(図5)、この効果は24時間維持される。
Claims (10)
- 炎症性リウマチ性疾患(IRD)の炎症性要素の治療において使用される単離骨形成細胞。
- 該骨形成細胞が、a)造骨分化を行なうことが可能であるか、又はb)造骨分化の方向に拘束されている(committed)か、又はc)少なくとも部分的に造骨分化が進行している、請求項1に記載の使用される単離骨形成細胞。
- 該骨形成細胞が、以下の特徴:
i)該細胞がアルカリホスファターゼ(ALP)、より具体的には骨−肝臓−腎臓型のALP、及び/又はオステオカルシン(OCN)の発現を有すること;
ii)該細胞が外部環境を石灰化するか、又はカルシウム含有細胞外マトリクスを合成する能力の証拠を示すこと;及び
iii)該細胞が実質的に、脂肪細胞系列又は軟骨細胞系列の細胞のうちいずれか一方、好ましくはそのいずれにも分化しないこと、
を示す、請求項1又は2に記載の使用される単離骨形成細胞。 - 該骨形成細胞がヒト起源のものであり、且つ該薬剤がヒト被験体への自家投与又は同種投与に採用される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用される単離骨形成細胞。
- 前記投与が全身、局所、関節内、又は関節周囲への投与である、請求項4に記載の使用される単離骨形成細胞。
- 該IRDが骨関節炎(OA)、乾癬性関節症、痛風、偽痛風、並びに関節リウマチ(RA)、腸疾患性関節炎、反応性関節炎及びライター症候群を含む様々な原因による関節炎、骨壊死、少関節型若年性関節リウマチ、スティル病、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、敗血症性関節炎、並びに強直性脊椎炎、腸疾患性脊椎炎及び未分化脊椎関節症を含む脊椎関節症から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用される単離骨形成細胞。
- 該IRDが骨関節炎(OA)、関節リウマチ(RA)及び骨壊死以外のものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用される単離骨形成細胞。
- 該IRDが炎症及び骨病変(複数可)の両方を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離骨形成細胞。
- 該IRDが炎症を含むが、骨病変(複数可)を含まない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離骨形成細胞。
- 骨形成細胞、並びにIRDの炎症性要素の治療において同時使用、逐次使用又は個別使用される、疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARD)、グルココルチコイド、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)及び鎮痛剤から選択される薬物を含む医薬組成物。
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