WO2006134921A1 - 移植材料及び骨質改善剤 - Google Patents

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WO2006134921A1
WO2006134921A1 PCT/JP2006/311842 JP2006311842W WO2006134921A1 WO 2006134921 A1 WO2006134921 A1 WO 2006134921A1 JP 2006311842 W JP2006311842 W JP 2006311842W WO 2006134921 A1 WO2006134921 A1 WO 2006134921A1
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administration
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Yoichi Yamada
Minoru Ueda
Akihiro Yajima
Tomoyuki Kohgo
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    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/115—Platelets, megakaryocytes

Definitions

  • the present invention relates to a transplant material and a bone quality improving agent.
  • a therapeutic method for repairing or regenerating a bone defect site due to such osteoporosis or the like includes autologous transplantation using an autologous tissue such as fat, fascia, cartilage, bone fragment and the like.
  • autologous transplantation there are problems that sufficient transplantation material cannot be secured for the bone defect site and that the healthy site is invaded.
  • allogeneic transplantation and xenotransplantation there are problems with supply as well as autotransplantation, as well as problems with immunity and viral infection.
  • transplant materials cement type and porous type
  • fix an artificial joint made of titanium or the like with two types of cement there are transplant materials (cement type and porous type) that fix an artificial joint made of titanium or the like with two types of cement.
  • Japanese Patent Publication No. W02 002/040071 discloses a transplant material containing mesenchymal stem cells (MSC) and platelet-rich plasma (PRP).
  • MSC mesenchymal stem cells
  • PRP platelet-rich plasma
  • osteoporosis can occur systemically rather than only locally in the femur.
  • JP-A-2003-55226 and JP-A-2004-43476 disclose therapeutic methods using drugs, as well as dietary and exercise methods. Generally known. Disclosure of the invention
  • one object of the present invention is to provide a transplant material that can improve systemic or local bone quality by cell transplantation.
  • Another object of the present invention is to provide a transplant material capable of improving local bone quality by cell transplantation without using local administration.
  • the present inventors examined systemic administration or local administration of mesenchymal stem cells and the like for the purpose of improving bone quality. It was found that this can be improved and the decrease in local bone density can be reliably suppressed. It was also found that even local administration can effectively suppress a decrease in local bone density. That is, according to the knowledge of the present inventors, the following means are provided.
  • the transplant material is selected from the group consisting of embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, preosteoblasts, chondrocytes, and cells having osteogenic ability 1
  • a transplant material containing a seed or two or more types of cells and used for systemic or local administration for bone quality improvement is provided.
  • bone quality improvement means any power of bone formation, promotion of bone formation, increase of bone density, and prevention or treatment of bone disease.
  • the transplant material of the present invention is capable of promoting an increase in bone density in human or non-human bone parts, and the cells that are preferably mesenchymal stem cells or cells that have bone-forming ability may be used. I like it.
  • the cell is preferably an autologous cell.
  • the transplant material of the present invention is preferably for intravascular administration or intravenous injection, and the transplant material of the present invention is preferably for intramedullary administration.
  • the transplant material of the present invention can be used for the prevention or treatment of bone diseases, and is useful for systemic bone diseases and local bone diseases, but particularly in the case of systemic administration forms. Is useful for systemic bone disease.
  • the transplant material of the present invention can be used as any force for orthopedic surgery, cosmetic surgery, plastic surgery, dental and oral medicine.
  • the transplant material of the present invention may be used for treatment of spinal cord injury in plastic surgery or the like, or for treatment of jaw bone extension in oral surgery.
  • a bone quality improving agent comprising any of the transplant materials described above, wherein the administration form is systemic administration or local administration.
  • the systemic dosage form is preferably intravascular administration.
  • a local administration form is intramedullary administration.
  • a method for producing a transplant material comprising the step of preparing one or more cells selected from the group consisting of cells having the following.
  • the cells are preferably autologous cells, and further, embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, preosteoblasts, chondrocytes and bone formation It is preferable to include a step of culturing one or more cells selected from the group consisting of cells having ability.
  • one or more cells selected from the group consisting of embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, preosteoblasts, chondrocytes and cells capable of osteogenesis are stored. It is preferable to provide a process. Furthermore, according to this invention, the manufacturing method of the bone quality improving agent provided with the process of preparing one of the said transplant materials is also provided.
  • a bone quality improving method comprising the step of systemic administration or local administration of any of the above transplant materials.
  • the administration step is preferably vascular administration such as intravenous administration.
  • local administration it is intramedullary.
  • systemic administration and local administration may be used in combination. That is, prior to the systemic administration or the local administration step, simultaneously with the systemic administration step or the local administration step, or after the systemic administration step or the local administration step, the transplant material of the present invention is locally applied where bone quality improvement is required. It may be administered locally or the entire transplant material of the present invention may be administered. It should be noted that only components other than cells such as skihold, PRP, PRP genore, various growth factors, ECM protein, gelling material, and thickener may be administered locally. May be administered locally. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a diagram showing the administration mode of mesenchymal stem cells in Examples.
  • Fig. 2 is a graph showing the results of measuring bone density in the systemic administration group of the example.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of ⁇ CT imaging in the example.
  • Fig. 4 is a diagram showing the results of bone density measurement in the locally administered group of the examples.
  • the present invention provides one or more cells selected from the group consisting of embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, preosteoblasts, chondrocytes and cells having osteogenic potential. Contained and used for systemic or local administration for bone quality improvement use, transplantation material, bone quality improvement agent containing the transplant material, production of the transplant material or bone quality improvement agent, and transplant material or bone quality improvement.
  • the present invention relates to a method for improving bone quality using an agent, in particular, a method for preventing or treating bone diseases.
  • the transplant material of the present invention can increase bone density, that is, regenerate bone tissue at a site where bone density has decreased by systemic administration such as vascular administration or local administration into the bone marrow cavity. It is. Therefore, according to the transplant material of the present invention, systemic or local bone density can be improved without depending on local administration. In addition, since bone quality can be improved without local administration, it can also be used in combination with other locally administered bone graft materials or drugs intended to improve bone quality. Furthermore, it is possible to effectively improve bone quality by locally administering a scaffold separately to a site requiring bone quality improvement. In addition, the transplant material of the present invention can increase bone density and regenerate bone tissue even by local administration.
  • transplant material of the present invention systemic administration and local administration can be performed in combination. Furthermore, according to the regenerative treatment using the transplant material for improving bone quality, it is possible to prevent bone deterioration or improve bone quality in a minimally invasive manner as well as supplemental or additional bone quality in a timely manner.
  • the present invention will be described in detail below.
  • the transplant material of the present invention includes embryonic stem cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, preosteoblasts, cartilage
  • the cells include cells selected from the group consisting of cells and cells having osteogenic potential.
  • the cell used for the transplant material of the present invention may be only one type or two or more types.
  • embryonic stem cells and / or mesenchymal stem cells are preferably used. More preferred are mesenchymal stem cells. Such cells may be collected from human or non-human animals which are these cell sources, or may be further cultured. Or it may have been established by an artificial method. The cells may be heterogeneous cells as long as rejection can be effectively avoided, but preferably are allogeneic cells, and more preferably autologous cells are used. The cells may be genetically modified as needed. Further, it may be stored frozen.
  • mesenchymal stem cells can be collected using iliac bone marrow, jaw bone marrow, peripheral blood, dental pulp, periosteum or umbilical cord blood as a source. Methods for collecting mesenchymal stem cells from these sources are well known to those skilled in the art. The collected mesenchymal stem cells can be used as they are, or they can be cultured to obtain a necessary amount.
  • the mesenchymal stem cell culture method is as follows: Boo, JS, Yamada, Y "Hibino, Y., Okazaki, ⁇ ⁇ , Okada K., Hata, K" Yoshikawa, ⁇ ⁇ , Sugiura ⁇ ⁇ , and Ueda, M Tissue-Engineered Bone Using Mesenchy mal Stem Cells and a Biodegradable scaffold.
  • J. Craniofac. Surg. 13, 231-239, 2002, Yamada, Y., Boo, JS, Ozawa, R., Nagasaka ⁇ T., Okazaki, Y., Hata, K., and Ueda, M. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold.
  • J. Cranio-maxillofac. Surg. 31, 27—33, 2003? In addition, it is well known to those skilled in the art.
  • the cell having the ability to form bone refers to a cell capable of forming bone tissue including osteoblasts, osteoblasts, preosteoblasts, mesenchymal stem cells differentiated into bone cells, ES cells and the like.
  • mesenchymal stem cells differentiated into bone cells are used.
  • the term “differentiated into bone cells” means a state in which mesenchymal stem cells or embryonic stem cells in an undifferentiated state are directed to bone cells.
  • the mesenchymal stem cell differentiated into the bone system is preferably an autologous cell, but may be an allogeneic cell or a human-derived cell.
  • Osteoblasts, preosteoblasts and chondrocytes are iliac Bone marrow, jaw bone marrow, peripheral blood, dental pulp, periosteum or umbilical cord blood force can be collected.
  • the mesenchymal stem cells differentiated into bone cells can be prepared, for example, by culturing the collected mesenchymal stem cells under conditions that induce differentiation into bone cells in vitro.
  • a medium containing / 3-glycose phosphate, dexamethasone, and L-ascorbic acid can be mentioned.
  • the culture conditions are not limited to these, and conventionally known differentiation induction conditions for bone cells may be used.
  • the mesenchymal stem cells differentiated into bone cells may be those that have been frozen.
  • bone marrow such as iliac bone marrow and jaw bone marrow
  • peripheral blood, dental pulp, periosteum or umbilical cord blood force can be collected.
  • mesenchymal stem cells are selected on the basis of their adhesiveness. That is, undifferentiated mesenchymal stem cells can be obtained by selecting cells having adhesion among cells contained in bone marrow or the like.
  • the transplant material of the present invention is preferably in the form of a suspension in which cells are suspended in an appropriate medium, whether for systemic administration or local administration.
  • a medium is not particularly limited, and a physiological saline solution or an appropriate buffer solution can be selected.
  • the transplant material of the present invention may contain blood or a part thereof as a medium.
  • plasma, platelet-rich plasma (PRP), or the like can be used as a part (component) of blood.
  • PRP is based on the trade name: Rich Platelet “Nichika” (manufactured by Japanese Red Cross Society).
  • PRP can be prepared by, for example, centrifuging the collected blood.
  • the PRP is preferably self-derived PRP.
  • PRP may be administered separately from the transplant material of the present invention without being included in the transplant material of the present invention.
  • the transplant material of the present invention may contain a growth factor.
  • a growth factor for example, platelet-derived plasma growth factors (PDGF), transforming growth factor / 3 (TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2), vascular endothelial growth factor (VEGF), EGF, Insulin-like growth factor (IGF) —I, basic fibroblast illustrator factor (b—FGF), osteoinductive factor (BMP), and the like can be included.
  • PDGF platelet-derived plasma growth factors
  • TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2 transforming growth factor / 3
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EGF Insulin-like growth factor
  • IGF Insulin-like growth factor
  • BMP basic fibroblast illustrator factor
  • the growth factor is not included in the transplant material of the present invention, and It may be administered separately from the transplant material.
  • the transplant material of the present invention when used for topical administration, it may be administered alone (using physiological saline or the like as a medium) alone, or in addition to the above-mentioned PRP and various growth factors, skil hold, ECM protein 1 type or 2 types or more selected from a gelling material and a thickener may be included.
  • physiological saline or the like the cells can reach the entire bone marrow, whereas when using a scaffold, the cells are placed in a certain area of the bone. It is possible to improve the bone quality of only the necessary parts.
  • Examples of such a ski hold include various artificial bones and living bones (including autologous bones), and polymer materials that are decomposed and absorbed in vivo.
  • Examples of such a polymer material include polylactic acid, polydaricholic acid, a copolymer of lactic acid and dalcholic acid, a poly_ ⁇ _force prolatatone, a copolymer of ⁇ -force prolatatone and lactic acid or glycolic acid, and polytaenoic acid.
  • Polymalic acid Polyhistanoacrylate, Poly ⁇ -hydroxybutyric acid, Polytrimethylenoxalate, Polytetramethylene oxalate, Polyorthoester, Polyorthocarbonate, Polyethylene carbonate, Polypropylene carbonate, Poly ⁇ —Benzyru L glutamate, poly ⁇ -methyl-L-glutamate, poly-L-Aranin of any synthetic polymer, starch, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, polysaccharides such derivatives of pectin acid and its, or gelatin, collagen (collagen type and its extraction Les, good in deviation Les,), and the like.
  • PRP gel obtained by gelling platelets and fibrinogen contained in PRP with thrombin or the like can also be used as the ski hold.
  • PRP genore can function as an effective scaffold for bone formation in combination with the above polymer materials.
  • PRP Genore also builds a good ski hold in terms of including various growth factors as described above
  • ECM extracellular matrix
  • the gelling material can contain, for example, thrombin or calcium chloride. like this By topically administering the gelled material, thrombin acts on fibrinogen in the PRP to produce fibrin, and the viscosity increases due to the aggregation action of fibrin.
  • thrombin acts on fibrinogen in the PRP to produce fibrin, and the viscosity increases due to the aggregation action of fibrin.
  • a material that acts on a component in PRP to increase the viscosity as described above may be used, or a material that exerts a thickening effect by itself may be used.
  • a second gelling material that acts after transplantation and changes the fluidity (viscosity) of the grafting material of the present invention may be used.
  • the gelling material include collagen paste fibrin glue.
  • the thickener include thickening polysaccharides such as sodium alginate, and thickeners such as glycerin and petrolatum.
  • the transplant material of the present invention can take the form of systemic administration or local administration.
  • the form of systemic administration is not particularly limited, but is preferably intravascular administration via blood vessels or lymphatic vessels from the viewpoint of whole administration intended for cell transplantation targeting bone tissue.
  • intravascular administration such as veins is preferable.
  • injection, infusion, force taper and the like can be used as the administration method.
  • local administration is not particularly limited, it can be administered intramedullarily or the like.
  • administration method injection, infusion, catheter or the like can be used.
  • transplant material of the present invention PRP, a growth factor, and the like, which are components other than the cells described above, can be administered in combination.
  • Such components other than cells may be contained in the transplant material together with the cells, or may be administered separately from the transplant material.
  • systemic administration when the transplant material of the present invention is administered intravenously, it is suitably prepared to have a liquid property (viscosity, liquid property, etc.) that can be injected into a blood vessel or the like with a catheter or syringe.
  • a liquid property that can be injected into the bone marrow cavity with a syringe or force taper.
  • various pharmacologically acceptable carriers and additives can be used to formulate the transplant material as an injection or infusion.
  • the number of cells of the cell suspension administered systemically can be 1 x 10 5 cells Zml or more, but preferably 1 x 10 6 cells Zml or more and 1 x 10 8 cells Zml or less. Also for local administration Even if it hits, it can be set to the same number of cells.
  • the site (bone disease site, orthopedic treatment or prevention site) where bone formation or bone formation is to be promoted prior to the administration of the transplant material (transplant) or together with the transplant.
  • Bone quality improvement sites sites requiring bone quality improvement, etc.
  • skihold, gelling material, and thickener those already exemplified for use at the time of topical administration can be used.
  • the transplant material of the present invention may be administered systemically, and local administration of the transplant material of the present invention may be used in combination with a bone quality improvement site.
  • mesenchymal stem cells may be administered intravenously, and cells having osteogenic potential may be locally administered by bone marrow injection or the like.
  • synergistic effects can be expected, and significant bone quality improvement can be expected locally.
  • the transplant material of the present invention may be administered systemically in combination with conventional treatment with an artificial construct such as an implantable artificial bone or joint. In this way, it is possible to promote the survival of artificial structures.
  • the transplant material of the above-described various aspects of the present invention can be used for bone quality improvement.
  • it can typically be used to suppress, maintain, or increase bone density due to bone formation or bone formation promotion, and to treat, prevent, and improve various bone diseases.
  • the transplant material of the present invention can also be applied to the fields of orthopedic surgery, cosmetic surgery, plastic surgery, dental and oral surgery.
  • bones such as hip joints, bone heads, knee joints, etc.
  • it can also be used to treat spinal cord injury
  • in the oral surgery field it can also be used to extend the jawbone.
  • the transplant material of the present invention is preferably used for bone quality improvement or prevention / treatment in bone diseases of humans and non-human animals (preferably humans).
  • the bone disease is a disease accompanied by a decrease in bone mass due to symptoms such as a decrease in bone density and deterioration of bone tissue.
  • Such bone diseases include: (1) primary osteoporosis (primary osteoporosis associated with aging, osteoporosis associated with menopause, osteoporosis associated with ovariectomy, etc.), (2) secondary Osteoporosis (e.g., gnolecocorticoid-induced osteoporosis, hyperthyroid osteoporosis, osteoporosis due to renal failure, inflammatory osteoporosis, osteoporosis associated with Cushing syndrome, rheumatic osteoporosis, etc. ), (3) cancer bone metastasis, hypercalcemia, Paget's disease, bone defect (alveolar bone defect, mandible bone defect, childhood sudden bone defect, etc.), osteonecrosis and the like.
  • primary osteoporosis primary osteoporosis associated with aging, osteoporosis associated with menopause, osteoporosis associated with ovariectomy, etc.
  • secondary Osteoporosis e.g., gnolecocortico
  • the method for producing a transplant material of the present invention can provide a process for preparing cells used for the transplant material of the present invention. That is, a step of collecting or establishing any of the above-described cells can be provided, and additionally, a step of culturing the cells can be provided. Furthermore, a step of inducing differentiation may be performed. Differentiation induction has already been explained. Furthermore, the method for producing a transplant material of the present invention can include a step of preserving any of the cells described above. Transplanting can be performed in a timely manner by storing the obtained cells until the time of use. In the preservation step, it is preferred that the cells be frozen prior to preservation, and a cell preservative can be added as appropriate during freezing.
  • the bone quality-improving agent and the preventive / therapeutic agent for bone diseases according to the present invention include the transplant material of the present invention.
  • the bone quality improving agent or the like of the present invention is used by systemic administration and / or local administration for bone quality improvement use or bone disease prevention / treatment use.
  • the bone substance improving agent or the like of the present invention can be used in the same manner for the same use as the transplant material of the present invention.
  • the bone substance improving agent of the present invention is intended for systemic administration such as intravascular administration. And forms formulated for topical administration such as intramedullary administration.
  • Such bone quality improving agents may include known bone quality improvement estrogen, vitamin! ⁇ , Bisphosphonate, etc., or may be used in combination with these, .
  • the bone substance improving agent of the present invention can be obtained by using a well-known pharmaceutical carrier or the like with the transplant material of the present invention.
  • the method for improving bone quality and the method for preventing or treating bone disease according to the present invention includes the steps of systemic administration and Z or local administration of the transplant material or bone quality improving agent of the present invention.
  • the transplant material or the like of the present invention By using the transplant material or the like of the present invention, it becomes possible to improve bone quality and prevent or treat bone diseases as already described.
  • an osteoporosis model rat was produced, and it was confirmed that the transplant material of the present invention can improve the decrease in bone density.
  • Osteoporosis model rats were established by removing the ovaries. This method was performed according to J Bon e Miner Res 1997; 12: 1844-1850, Hitoshi Saino et al. After treatment, the bone density (using a CT machine called DXA (Double Energy X-ray Absorber)) is measured before cell transplantation, which will be described later, and an osteoporosis model is established. confirmed.
  • DXA Double Energy X-ray Absorber
  • MSCs Mesenchymal stem cells collected from femur bone marrow fluid of GFP rats were isolated, cultured, and cultured to the desired number of cells.
  • the culture method is Boo, JS, Yamada, Y., Hibi no, ⁇ ⁇ , Okazaki, ⁇ ⁇ , Okada K., Hata, K., Yoshikawa, T., Sugiura Y., and Ueda, M.
  • the cultured MSCs were suspended in physiological saline to prepare a cell suspension having 5 ⁇ 10 6 cells Zml and 1 ⁇ 10 7 cells / m 1.
  • This cell suspension was injected from the tail vein of a model rat (nude rat) that was confirmed to be an osteoporosis model (see Fig. 1).
  • the bone density measurement for the establishment of an osteoporosis model was performed for about 2 weeks, 1 month, 2 months, and 3 months after ovariectomy.
  • the femoral strength undifferentiated mesenchymal stem cells of the GFP rat were collected, and mesenchymal stem cells that had been induced to differentiate and differentiated into bone cells were prepared.
  • bone marrow containing undifferentiated mesenchymal stem cells was collected by bone marrow puncture of the thigh bone of the GFP rat, and the bone marrow cells were cultured in basic medium, low glucose DMEM, and growth supplement (manufactured by Cambrex).
  • Two supplements (dexamethasone, ⁇ -glycose sodium phosphate, and L-ascorbic acid diphosphate) induced differentiation of mesenchymal stem cells into bone cells.
  • Mesenchymal stem cells differentiated into bone cells were confirmed by detecting alkaline phosphatase activity using ⁇ -nitrophenyl phosphatase as a substrate. Mesenchymal stem cells were treated with trypsin before being used for transplantation.
  • the mesenchymal stem cells prepared as described above were injected into the femur of a rat (nude rat) using a bone marrow puncture needle together with physiological saline or PRP.
  • the number of transplanted cells was 5 ⁇ 10 6 Zml and 1 ⁇ 10 7 Zml.
  • PRP collects whole blood from rat peripheral blood, centrifuges for 5 minutes at lOOrpm, collects yellow plasma (including buffy coat along with platelets and leukocytes) in a neutral monovet with a long force, Platelets were prepared as a single pellet by centrifugation at 2500i "pm for 1 minute. The PRP was resusbended into residual plasma and used for PRP gelling. PRP gelation was performed by adding thrombin / salt to the PRP. The thrombin / salt-calcium solution was prepared by dissolving 10, OOOU citrombin in 10 ml of 10% calcium chloride solution. did.
  • the bone density measurement for confirming the formation of the osteoporosis model rat is performed in the same way after the transplantation, after 1 month, 2 months and 3 months. The density was measured, and the state of cell transplantation was confirmed based on the bone density.
  • Fig. 2 shows the results of bone density measurements before, at, and 1 month after transplantation in the systemic administration group. He was killed when bone density was improved and ⁇ CT was taken. In the systemic administration group, the spine was imaged, and in the local administration group, the femur was imaged.
  • Figure 3 shows the ⁇ CT results.
  • Figure 4 also shows bone density measurements before, at, and 1 month after transplantation in the locally administered group. Results are shown.
  • transplant material of the present invention is effective for local treatment of osteoporosis occurring systemically. It was also found that the transplant material of the present invention is effective for local bone diseases and bone quality improvement sites.
  • the transplant material of the present invention includes, for example, bone regenerative medicine in orthopedics, cosmetic surgery, dentistry, oral surgery, otolaryngology, etc. Useful for the prevention and treatment of bone diseases.

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Abstract

　本発明は、全身的な骨質の改善を細胞移植により実現可能な移植材料を提供することを目的とする。この目的のため、本発明では、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞を含有し、骨質改善用途に全身投与又は局所投与して使用する移植材料を用いる。

Description

移植材料及び骨質改善剤
技術分野
本発明は、移植材料及び骨質改善剤に関する。 背景技術
[0002] 現在、 日本においては、団塊世代というエルダー世代が 50%以上を占める高齢化 社会になっている。その中で、高齢化とともに骨粗しょう症に罹患する患者層も増加し てきている。例えば、骨粗しょう症による骨質低下に伴う大腿骨類部骨折の患者は年 間約 10万人に及んでいる。
[0003] こうした骨粗しょう症などによる骨欠損部位の修復や再生のための治療方法として は、 自己の組織、例えば、脂肪、筋膜、軟骨、骨片等を用いる自家移植が挙げられる 。しかしながら、自家移植の場合、骨欠損部位に対して十分な移植材料を確保でき ないという問題や健全部位を侵襲するという問題がある。また、同種移植や異種移植 にあっては、 自家移植と同様供給量に問題があるほか、免疫、ウィルス感染の問題も 指摘されている。
[0004] 一方、こうした問題を解決するために、チタンなどでできた人工関節を 2種類のセメ ントなどにより固定する移植材料 (セメント型とポーラス型）がある。また、特再表 W02 002/040071号公報には、間葉系幹細胞（MSC)と多血小板血漿（PRP)を含む 移植材料が開示されている。また、骨粗しょう症は大腿骨などの局所にのみ生じるも のではなぐ全身的に生じうるものである。全身的な骨粗しょう症に対応する治療法と しては、特開 2003— 55226号公報ゃ特開 2004— 43476号公報などに薬剤による 治療法が開示されるほか、食事や運動による方法などが一般的に知られている。 発明の開示
し力しながら、現在までのところ、全身的な骨密度低下や骨粗しょう症に有効な予 防方法や治療方法も局所的な骨疾患に有効な予防方法や治療方法も見出されてレ ない。また、非局所的な手法によって局所の骨密度の低下を改善するのに有効な方 法も見出されていない。特に、全身的な骨粗しょう症に有効な予防'治療方法は少な ぐ上記した局所補充的あるいは局所再生用の移植材料によれば、局所的な骨質改 善がある程度は可能であっても全身的な骨粗しょう症には有効ではない。また、薬剤 を用いる治療法では、疾患の性質上長期投与が要請されることから副作用等の問題 が生じかねない。さらに、食事や運動による方法では、重度の骨粗しょう症患者には もはや有効ではない。
[0006] そこで、本発明は、全身的又は局所的な骨質の改善を細胞移植により実現可能な 移植材料を提供することを 1つの目的とする。また、本発明は、局所投与によらなくて も局所の骨質の改善を細胞移植により実現可能な移植材料を提供することを他の一 つの目的とする。
[0007] 本発明者らは、骨質改善を目的として間葉系幹細胞等の全身投与又は局所投与 について検討したところ、全身投与形態であっても、全身的な骨密度の低下傾向を 効果的に改善することができるとともに局所の骨密度の低下も確実に抑制できるとい う知見を得た。また、局所投与であっても有効に局所の骨密度の低下を抑制できるこ とを見出した。すなわち、本発明者らの知見によれば、以下の手段が提供される。
[0008] 本発明によれば、移植材料であって、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前 骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される 1種又は 2種以上の細胞を含有し、骨質改善用途に全身投与又は局所投与して使用する移 植材料が提供される。なお、本発明において、「骨質改善」とは、骨形成、骨形成の 促進、骨密度の増加、及び骨疾患の予防又は治療のいずれ力を意味している。
[0009] 本発明の移植材料は、ヒト又は非ヒトの骨部における骨密度増加を促進可能である ことが好ましぐ前記細胞は、間葉系幹細胞又は骨形成能を有する細胞であることが 好ましレ、。また、前記細胞は自家細胞であることが好ましい。さらに、本発明の移植材 料は、脈管内投与用又は静脈内注入用であることが好ましぐまた、本発明の移植材 料は、骨髄腔内投与用であることが好ましい。さらにまた、本発明の移植材料は、骨 疾患の予防用又は治療用とすることができ、全身性骨疾患にも局所性骨疾患にも有 用であるが、特に、全身投与形態の場合には、全身性骨疾患に有用である。また、 本発明の移植材料は、整形外科用、美容形成用、形成外科用、歯科用及び口腔外 科用のいずれ力として使用できる。また、本発明の移植材料は、成形外科などにお ける脊髄損傷に対する治療用であってもよいし、口腔外科における顎骨延長の治療 用であってもよい。
[0010] 本発明によれば、上記いずれかに記載の移植材料を含み、投与形態が全身投与 又は局所投与である、骨質改善剤が提供される。全身投与形態は、脈管内投与であ ることが好ましい。また、局所投与形態は、骨髄腔内投与であることが好ましい。
[0011] 本発明によれば、上記いずれかに記載の移植材料の製造方法であって、、胚性幹 細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細 胞からなる群から選択される 1種又は 2種以上の細胞を準備する工程を備える、製造 方法が提供される。本発明の移植材料の製造方法においては、前記細胞は、自家 細胞であることが好ましぐさらに、、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽 細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される 1種又は 2種 以上の細胞を培養する工程を備えることが好ましい。また、胚性幹細胞、間葉系幹細 胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選 択される 1種又は 2種以上の細胞を保存する工程を備えることが好ましい。さらに、本 発明によれば、上記いずれかの移植材料を準備する工程を備える、骨質改善剤の 製造方法も提供される。
[0012] 本発明によれば、骨質改善方法であって、上記いずれかの移植材料を全身投与 又は局所投与する工程を備える、方法が提供される。前記投与工程は、全身投与の 場合、好ましくは、静脈投与などの脈管投与である。また、局所投与の場合、骨髄腔 内投与である。さらに、全身投与と局所投与とを組み合わせて使用してしてもよい。 すなわち、前記全身投与又は局所投与工程に先立って、又は前記全身投与工程又 は局所投与工程と同時に、あるいは前記全身投与工程又は局所投与工程の後に骨 質改善を要する局所に本発明の移植材料を局所投与し又は本発明の移植材料を全 身投与するようにしてもよレ、。なお、局所には、スキヤホールド、 PRP、 PRPゲノレ、各 種成長因子、 ECMタンパク質、ゲル化材料、増粘剤などの細胞以外の成分のみを 投与してもよレ、し、これらと細胞とを局所投与してもよレ、。 図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、実施例における間葉系幹細胞の投与形態を示す図である。
[図 2]図 2は、実施例の全身投与群の骨密度測定結果を示す図である。
[図 3]図 3は、実施例における μ CT撮影の結果を示す図である。
[図 4]図 4は、実施例の局所投与群の骨密度測定結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨 形成能を有する細胞からなる群から選択される 1種又は 2種以上の細胞を含有し、骨 質改善用途に全身投与又は局所投与して使用すること移植材料に関し、さらに、当 該移植材料を含む骨質改善剤、当該移植材料又は骨質改善剤の製造並びに当該 移植材料又は骨質改善剤を用いる骨質改善方法、特には、骨疾患の予防若しくは 治療方法に関する。
[0015] 本発明の移植材料は、脈管系投与等に全身投与又は骨髄腔内等に局所投与する ことで骨密度が低下した部位において骨密度の上昇、すなわち、骨組織の再生が可 能である。したがって、本発明の移植材料によれば、局所投与によらないで、全身的 あるいは局所的な骨密度等の改善が可能である。また、局所投与によらないでも骨 質改善が可能であることから、局所投与される他の骨質改善を目的とする移植材料 や薬剤などと併用することも可能である。さらに、骨質の改善を要する部位に別途ス キヤホールドを局所投与するなどすることで効果的に骨質改善することが可能である 。また、本発明の移植材料は、局所投与によっても骨密度の上昇及び骨組織の再生 が可能である。したがって、本発明の移植材料によれば、全身投与と局所投与とを組 み合わせて行うことができる。さらに、こうした骨質改善用の移植材料を用いた再生医 療によれば、低侵襲でしかも適時に補充的若しくは追加的な骨質低下予防や骨質 改善が可能となる。以下、本発明を詳細に説明する。
[0016] (移植材料）
(移植材料として使用する細胞）
本発明の移植材料は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨 細胞及び骨形成能を有する細胞からなる群から選択される細胞を含んでレ、る。本発 明の移植材料に用いる細胞は、これらのうち 1種類のみであってもよいし、 2種類以上 であってもよい。
[0017] 全身投与用には、好ましくは、胚性幹細胞及び/又は間葉系幹細胞を用いる。より 好ましくは間葉系幹細胞である。こうした細胞は、これらの細胞源であるヒトあるいは 非ヒト動物から採取されたものであってもよいし、さらに培養されたものであってもよい 。あるいは人工的な手法により確立されたものであってもよレ、。細胞は、拒絶反応を 有効に回避できる限りにおいて異種細胞であってもよレ、が、好ましくは同種細胞であ り、さらに好ましくは自家細胞を用いる。また、細胞は、必要に応じて遺伝的に修飾が なされていてもよレ、。さらに、凍結保存されたものであってもよい。
[0018] 例えば、間葉系幹細胞は、腸骨骨髄、顎骨骨髄、末梢血、歯髄、骨膜又は臍帯血 などを供給源として採取することができる。これらの供給源から間葉系幹細胞を採取 する方法は当業者において周知である。採取した間葉系幹細胞は、そのまま用いる こともできるし、培養して必要量を取得するようにしてもよい。また、間葉系幹細胞の 培養の方法は Boo, J.S., Yamada, Y" Hibino, Y.， Okazaki, Υ·， Okada K. , Hata, K" Yoshikawa, Τ·, Sugiura Υ·, and Ueda, M. Tissue-Engineered Bone Using Mesenchy mal Stem Cells and a Biodegradable scaffold. J. Craniofac. surg. 13， 231-239, 2002 、 Yamada, Y. , Boo, J.S., Ozawa, R.， Nagasaka^ T.， Okazaki, Y., Hata, K., and Ueda , M. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glu e with a biodegradable scaffold. J. Cranio-maxillofac. surg. 31， 27—33, 2003? と こ 記載されるほか、当業者においては周知である。
[0019] また、局所投与用には、骨形成能を有する細胞が好ましレ、。骨形成能を有する細 胞とは、骨芽細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨系細胞に分化した間葉系幹細胞や E S細胞等を含む骨組織を形成しうる細胞をいう。好ましくは、骨系細胞に分化した間 葉系幹細胞を用いる。なお、「骨系細胞に分化した」とは、未分化状態の間葉系幹細 胞ゃ胚性幹細胞が骨系細胞へ方向付けされた状態をいう。骨系へ分化した間葉系 幹細胞は ES細胞は、自家細胞であることが好ましいが、同種他家細胞であってもよく 、また、ヒト由来の細胞を利用できる。骨芽細胞、前骨芽細胞及び軟骨細胞は、腸骨 骨髄、顎骨骨髄、末梢血、歯髄、骨膜又は臍帯血力 採取することができる。また、 骨系細胞に分化した間葉系幹細胞は、例えば、採取した間葉系幹細胞をインビトロ で骨系細胞への分化を誘導する条件下で培養することで調製できる。前記骨系細胞 への分化を誘導するには、たとえば、 /3—グリセ口リン酸、デキサメタゾン、及び L—ァ スコルビン酸を含む培地が挙げられる。なお、培養条件はこれに限定するものではな ぐ従来公知の骨系細胞についての分化誘導条件を利用してもよい。骨系細胞へ分 化した間葉系幹細胞は凍結処理をしたものであってもよい。また、未分化間葉系幹 細胞の供給源としては、腸骨骨髄、顎骨骨髄などの骨髄、末梢血、歯髄、骨膜又は 臍帯血力 採取することができる。これらから従来公知の方法で採取した後、間葉系 幹細胞をその接着性の有無に基づき選択する。すなわち、骨髄等に含まれる細胞の うち、接着性を有するものを選択することで未分化間葉系幹細胞を得ることができる。
[0020] (細胞以外の成分）
本発明の移植材料は、全身投与用であっても局所投与用であっても、適当な媒体 に細胞を懸濁させた懸濁液の形態を採ることが好ましい。こうした媒体としては特に 限定しないが、生理食塩液や適当な緩衝液などを選択できる。本発明の移植材料は 、媒体としては、血液あるいはその一部を含んでいてもよレ、。たとえば、血液の一部（ 成分）としては、血漿、多血小板血漿 (PRP)などを用いることができる。 PRPは、例え ば、商品名：濃厚血小板「日赤」（日本赤十字社製）に準じるものである。 PRPは、採 取した血液を遠心分離処理するなどして調製できる。なお、 PRPは自己由来の PRP であることが好ましい。なお、 PRPは、本発明の移植材料に含まれずに、本発明の移 植材料とは別個に投与されてもよい。
[0021] また、本発明の移植材料は、成長因子を含むことができる。例えば、多血小板血漿 に含まれる成長因子である、血小板由来成長因子（PDGF)、トランスフォーミング増 殖因子 /3 (TGF- β 1、 TGF- β 2)、血管内皮増殖因子（VEGF)、 EGF、インスリ ン様成長因子 (IGF)— Iや塩基性線維芽細胞絵師長因子 (b— FGF)、骨誘導因子（ BMP)などを含むことができる。特に、 PRP又は 1種又は 2種以上の成長因子との併 用によれば、骨形成又は骨形成を促進すべき部位において効果的に骨密度を増進 させること力できる。なお、成長因子は、本発明の移植材料に含まれずに、本発明の 移植材料とは別個に投与されてもよい。
[0022] 本発明の移植材料を局所投与用として用いる場合、単独で局所投与 (生理食塩水 などを媒体として）されてもよいし、上記した PRPや各種成長因子のほか、スキヤホー ルド、 ECMタンパク質、ゲル化材料、増粘剤から選択される 1種又は 2種以上を含ん でいてもよい。例えば、細胞を生理食塩水などを用いて局所に単独投与した場合に は、細胞を骨髄全体に到達させることが可能であり、一方スキヤホールドを用いた場 合には、細胞を骨の一定領域に留めてぉレ、て必要な部分のみを骨質改善することが できる。
[0023] こうしたスキヤホールドとしては、各種の人工骨や生体骨（自家骨などを含む）のほ か、生体内で分解吸収される高分子材料が挙げられる。かかる高分子材料としては、 例えば、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸とダルコール酸との共重合体、ポリ _ ε _ 力プロラタトン、 ε—力プロラタトンと乳酸あるいはグリコール酸との共重合体、ポリタエ ン酸、ポリリンゴ酸、ポリ ひーシァノアクリレート、ポリ βーヒドロキシ酪酸、ポリトリメ チレンォキサレート、ポリテトラメチレンォキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソ カーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリプロピレンカーボネート、ポリ γ —べ ンジルー L グルタメート、ポリ Ίーメチルー L グルタメート、ポリ Lーァラニンな どの合成高分子、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ぺクチン酸およびそ の誘導体などの多糖、あるいはゼラチン、コラーゲン (コラーゲンのタイプおよびその 抽出法はレ、ずれでもよレ、）などが挙げられる。
[0024] また、スキヤホールドとして、 PRPに含まれる血小板及びフイブリノ一ゲンをトロンビ ン等を用いてゲル化させた PRPゲルを用いることもできる。 PRPゲノレは、上記の高分 子材料と共役して骨形成の有効なスキヤホールドとして機能できる。 PRPゲノレは、ま た、上記のように各種成長因子を含む点においても良好なスキヤホールドを構築する
[0025] さらに、骨質改善部位に対して、供給可能な他の成分としては、細胞外マトリックス（ ECM)タンパク質が挙げられる。 ECMは自家であることが好ましいが、同種他家であ つてもよい。
[0026] ゲル化材料は、例えば、トロンビンや塩化カルシウムを含むことができる。このような ゲル化材料を局所投与することで、トロンビンが PRP中のフイブリノ一ゲンに作用して フイブリンが生成し、そしてフイブリンの凝集作用により粘性が増加する。ゲル化材料 としては、このように PRP中の成分に作用して粘性を増加させるものであってもよいし 、それ自身により増粘効果を奏するものを使用してもよい。また、ゲル化材料に加え て、移植後に作用して本発明の移植材料の流動性 (粘度）を変化させる第 2のゲル 化材料を用いてもよい。使用時には適度な流動性を有しかつ移植後には粘度が増 すことにより適用部位における定着性が向上し、骨形成が効果的となる。前記ゲル化 材料としては、コラーゲンゃフイブリン糊が挙げられる。また、増粘剤としては、アルギ ン酸ナトリウム等の増粘多糖類、グリセリン、ワセリン等の増粘剤が挙げられる。
[0027] (移植材料の投与形態）
本発明の移植材料は、全身投与又は局所投与の形態を採ることができる。全身投 与の形態は、特に限定されないが、骨組織をターゲットとした細胞移植を意図する全 身投与の観点から、好ましくは、血管やリンパ管を経由する脈管内投与である。なか でも、静脈など血管内投与とすることが好ましい。投与手法としては、注射、点滴、力 テーテルなどを用いることができる。
[0028] また、局所投与についても特に限定されないが、骨髄腔内等に投与することができ る。投与手法としては、注射、点滴、カテーテルなどを用いることができる。
[0029] 本発明の移植材料の投与にあたっては、上記した細胞以外の成分である PRPや 成長因子などを組み合わせて投与することができる。なお、こうした細胞以外の成分 は、移植材料に細胞とともに含まれていてもよいし、移植材料とは別個に投与される ものであってもよい。全身投与にあたり、本発明の移植材料を静脈内投与等するの にあたっては、カテーテルあるいは注射器で血管等に注入可能な程度の液性 (粘性 、液性等）に適宜調製される。また、局所投与にあたっては、骨髄腔内に注射器や力 テーテルで注入可能な程度の液性に適宜調製される。なお、移植材料を注射剤ある いは注入剤などとして製剤化するには、薬理学的に許容される各種の担体や添加剤 などを用いることができる。
[0030] 全身投与する細胞懸濁液の細胞数は、 1 X 105細胞 Zml以上とすることができるが 、好ましくは 1 X 106細胞 Zml以上 1 X 108細胞 Zml以下である。また、局所投与に あたっても、同様の細胞数とすることができる。
[0031] (全身投与とスキヤホールド等の他の成分の単独局所投与との併用）
本発明の移植材料を全身投与するのにあたっては、移植材料の投与 (移植）に先 立ってあるいは移植とともに骨形成又は骨形成を促進しょうとする部位 (骨疾患部位 、整形外科における治療又は予防部位、美容形成における治療又は予防部位、形 成外科における治療又は予防部位、歯科における治療又は予防部位、 口腔外科に おける治療又は予防部位等)などの骨質改善部位 (骨質の改善を要する部位、以下 同じ。 )にスキヤホールド、 PRP、各種成長因子、 ECMタンパク質、ゲル化材料、増粘 剤等を供給しておくことができる。こうすることで、移植した細胞の骨疾患部位等にお ける生着や骨疾患部位での細胞増殖等を促進して、骨疾患部位での骨形成 (再生） を促進することが可能となる。こうしたスキヤホールド、ゲル化材料、増粘剤としては、 すでに局所投与時に用レ、るものとして例示したものを使用できる。
[0032] (全身投与と本発明の移植材料の局所投与との併用）
本発明の移植材料は、全身投与するものであるため、本発明の移植材料を全身投 与するとともに、骨質改善部位へ本発明の移植材料の局所投与を併用してもよい。 例えば、間葉系幹細胞を静脈内に投与するとともに、骨形成能を有する細胞を骨髄 腔注入などにより局所投与してもよい。局所投与と全身投与とを併用することにより、 相乗的効果が期待できるとともに、局所における重点的な骨質改善が期待できる。
[0033] 本発明の移植材料は、従来の埋め込み型人工骨や関節などの人工構築物による 治療と併用して全身投与してもよい。こうすることで、人工構築物の生着を促進するこ とが可能である。
[0034] (移植材料の用途）
本発明の上記した各種態様の移植材料は、骨質改善用に用いることができる。す なわち、典型的には骨形成又は骨形成促進による骨密度の低下抑制、維持、増加 や、各種骨疾患の治療、予防、改善に利用できる。また、本発明の移植材料は、整 形外科、美容形成、形成外科、歯科及び口腔外科の領域にも適用することができる 。例えば、整形外科領域では、股関節や骨頭，膝関節などの骨'関節軟骨の再生や 骨延長等、美容形成領域では、軟骨再生による隆鼻術、しわとり、歯科及び口腔外 科領域では、インプラント（人工歯根）の植立のための顎骨の骨質強化や再建、歯槽 骨の増強'再生、外科手術後の顎骨再建、唇顎口蓋裂の顎裂部の再建等に用いる ことができる。整形外科領域においては、さらに、脊髄損傷に対する治療にも用いる こと力 Sでき、口腔外科領域においては、顎骨延長にも用いることができる。
[0035] 本発明の移植材料は、ヒト及び非ヒト動物（好ましくはヒト）の骨疾患における骨質改 善ないし予防 ·治療に用いることが好ましい。前記骨疾患としては、骨密度の低下や 骨組織の劣化等の症状を伴うなどして骨量の低下を伴う疾患である。こうした骨疾患 としては、（1 )原発性骨粗しょう症 (加齢に伴う原発性骨粗しょう症、閉経に伴う骨粗し よう症、卵巣摘出に伴う骨粗しょう症等）、 （2)二次性骨粗しょう症 (例えば、グノレココ ルチコイド誘発性骨粗しょう症、甲状腺機能亢進性骨粗しょう症、腎不全による骨粗 しょう症、炎症性骨粗しょう症、クッシング症候群に伴う骨粗しょう症リューマチ性骨粗 しょう症等）、（3)癌骨転移、高カルシウム血症、ページエツト病、骨欠損 (歯槽骨欠損 、下顎骨欠損、小児期突発性骨欠損等)、骨壊死等が挙げられる。
[0036] (移植材料の製造方法）
本発明の移植材料の製造方法は、本発明の移植材料に用いる細胞を準備するェ 程を供えること力 Sできる。すなわち、上記した細胞のいずれかを採取ないし確立する 工程を備えることができ、また、加えて当該細胞を培養する工程を備えることができる 。さらに、分化誘導する工程を実施してもよい。分化誘導についてはすでに説明した とおりである。さらに、本発明の移植材料の製造方法においては、上記した細胞のい ずれかを保存する工程を含むことができる。一旦取得した細胞を使用時期まで保存 することで適時に移植を行うことができる。保存工程は、保存に先立って細胞は凍結 することが好ましぐまた、凍結に際しては適宜細胞保存剤を添加することができる。
[0037] (骨質改善剤及び骨疾患の予防'治療剤）
本発明の骨質改善剤及び骨疾患の予防'治療剤 (以下、単に骨改善剤等）は、本 発明の移植材料を含んでいる。本発明の骨質改善剤等は、骨質改善用途や骨疾患 の予防'治療用用途に全身投与及び/又は局所投与して使用するものである。本発 明の骨質改善剤等は、本発明の移植材料と同様の用途に同様の方法で用いること ができる。特に、本発明の骨質改善剤等としては、脈管内投与用など全身投与用とし て製剤化された形態や骨髄腔内投与用など局所投与用として製剤化された形態が 挙げられる。こうした骨質改善剤等としては、公知の骨質改善であるエストロゲン、ビ タミン!^、ビスフォスフォネート等が含まれていてもよいし、また、これらと併用投与する ものであってもよレ、。なお、本発明の骨質改善剤は、本発明の移植材料により、周知 の医薬品担体等を用いることにより取得することができる。
[0038] (骨質改善方法及び骨疾患の予防'治療方法）
本発明の骨質改善方法及び骨疾患の予防'治療方法は、本発明の移植材料又は 骨質改善剤等を全身投与及び Z又は局所投与する工程を含んでいる。本発明の移 植材料等を用いることで、既に説明したように骨質改善並びに骨疾患の予防又は治 療が可能となる。なお、移植材料の投与形態で既に説明したように、本発明の移植 材料等を全身投与するのに先立ってあるいは全身投与とともに、スキヤホールド、成 長因子、 PRP、 ECMタンパク質、ゲル化材料及び増粘剤や本発明の移植材料 (細 胞を単独であるいはスキヤホールド等を同時にあるいは別個に投与する態様を含む 。）やその他の移植材料の局所投与や人工構築物の導入などを行うこともできる。 実施例
[0039] 以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明する。ただし、本実施例は本発明 を限定するものではない。
[0040] 本実施例では、骨粗しょう症モデルラットを作製し、本発明の移植材料が骨密度低 下を改善できることを確認した。
[0041] (骨粗しょう症モデルラットの作製）
骨粗しょう症モデルラットは、卵巣を摘出することにより確立した。この方法は、 J Bon e Miner Res 1997;12: 1844-1850,Hitoshi Sainoらに準じて行った。処置後のラットにつ いて、後述する細胞移植の前に骨密度（DXA (2重工ネルギー X線吸収計）という CT 機を用いて）を計測し、骨粗鬆症モデルが成立してレ、ることを確認した。
[0042] (間葉系幹細胞の採取及び培養）
GFPラットの大腿骨骨髄液より採取した間葉系幹細胞（以下 MSCsと略す）を分離、 培養し、 目的の細胞数まで培養を行った。培養の方法は Boo, J.S., Yamada, Y.， Hibi no, Υ·, Okazaki, Υ·, Okada K.， Hata, K.， Yoshikawa, T., Sugiura Y. , and Ueda, M.
Tissue-Engineered Bone Using Mesenchymal Stem Cells and a Biodegradable scaffo Id. J. Craniofac. surg. 13, 231—239, 2002、 Yamada, Y. , Boo, J.S., Ozawa, R. , Nagas aka、 Τ· , Okazaki, Y.， Hata, K., and Ueda, M. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold. J. Cranio- maxillofac. surg. 31, 27-33， 2003)に準じて行った。 GFPラットは大阪大学の岡部先 生らが開発したものを、 日本 SLC社を介して購入した。このラットは GFP遺伝子が全 ての組織において組み込まれており、移植細胞の動向を追うことができるものである 。このラットは、 J. Am Soc Nephrol 12:2625—2635,2001， Takahito Ito et al.，に記載さ れている。
[0043] (間葉系幹細胞の経静脈的全身投与）
培養した MSCsを生理食塩水で懸濁して細胞数が 5 X 106個 Zml、 1 X 107個/ m 1の細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を、骨粗しょう症モデルの成立を確認し たモデルラット (ヌードラット）の尾静脈よりそれぞれ注入した（図 1参照）。なお、骨粗 しょう症モデル成立のための骨密度測定は、卵巣摘出後、 2週、 1ヶ月、 2ヶ月、 3ヶ月 程度とした。
[0044] (骨系細胞に分化した間葉系幹細胞の調整）
上記 GFPラットの大腿骨力 未分化間葉系幹細胞を採取し、分化誘導して骨系細 胞に分化した間葉系幹細胞を調製した。
[0045] 間葉系幹細胞の分化誘導の方法は、 Boo, J.S., Yamada, Y.， Hibino, Y.， Okazaki, Y. , Okada Κ·， Hata, K.， Yoshikawa, T. , Sugiura Y.， and Ueda, M. Tissue-Engineer ed Bone Using Mesenchymal Stem Cells and a Biodegradaole scaffold. J. Craniofac. surg. 13， 231—239, 2002、 Yamada, Y.， Boo, J.S., Ozawa, R.， Nagasaka, T.， Okazaki ， Y.， Hata, K., and Ueda, M. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold. J. Cranio-maxillofac. surg. 31， 27-33, 2003、 Yamada, Υ· , Ueda, M.， Naiki, T.， Takahashi, M., Hata, K.， and N agasaka, T. Autogenous injectable Bone for Regeneration with Mesenchymal Stem し ells (MSCs) and Platelet-Rich Plasma (PRP) - Tissue-engineered bone regeneratio n -. Tissue Eng. 10 (5/6), 955-964， 2004.に準じた。すなわち、前記 GFPラットの大 腿骨の骨髄穿刺により未分化間葉系幹細胞を含む骨髄を採取し、骨髄細胞を、基 本培地、低グルコース DMEM、増殖サプリメント（Cambrex社製）で培養し、 3つのサ プリメント（デキサメタゾン、 β—グリセ口リン酸ナトリウム、及び L—ァスコルビン酸 2リ ン酸）によって間葉系幹細胞の骨系細胞への分化を誘導した。骨系細胞に分化した 間葉系幹細胞は、 ρ—ニトロフエニルホスファタ一ゼを基質として使用したアルカリホ スファターゼ活性を検出することで確認した。間葉系幹細胞は、移植に使用する前に トリプシン処理を施した。
[0046] (局所投与）
前述のとおりに調製した間葉系幹細胞を、生理食塩水又は PRPとともに、図 1に示 すとおり、ラット (ヌードラット）の大腿骨に骨髄穿刺針を用いて注入した。移植した細 胞数は、 5 X 106個 Zml、 1 X 107個 Zmlとした。
[0047] (PRPの調製）
PRPは、ラット末梢血から全血を採取し、 5分間 l lOOrpmの遠心分離後、イェロー プラズマ（血小板及び白血球とともにバフィ一コートを含む）を、長い力ニューレで中 性のモノベットに回収し、 10分間、 2500i"pmの遠心分離で血小板を単一ペレットとし て調製した。前記 PRPは、残存血漿にリサスベンドし、 PRPのゲルイ匕に使用した。 PR Pのゲル化は、前記 PRPにトロンビン/塩ィ匕カルシウム溶液を添カ卩し、気泡を含ませ ながら混合することにより行った。前記トロンビン/塩ィ匕カルシウム溶液は 10mlの 10 %塩化カルシウム溶液に、 10, OOOUのゥシトロンビンを溶解して調製した。
[0048] (評価）
骨粗しょう症モデルラットに所定の方法で細胞を移植直後、移植後 1ヶ月、 2ヶ月及 び 3ヶ月経過後に同様にして骨粗しょう症モデルラット成立確認のための骨密度測定 と同様の方法で骨密度を測定し、骨密度に基づいて細胞移植の状態を確認した。図 2に、全身投与群における移植前、移植時、移植後 1ヶ月の骨密度の測定結果を示 す。また、骨密度の改善が得られた状態でと殺し、 μ CTを撮影した。全身投与群で は、脊椎を撮影し、局所投与群では大腿骨を撮影した。 μ CT結果を図 3に示す。ま た、図 4には、局所投与群における移植前、移植時、移植後 1ヶ月の骨密度の測定 結果を示す。
[0049] 全身投与群について、図 2及び図 3に示すように、コントロール群では骨密度値の 変化は見られなかったが、卵巣摘出（骨粗しょう症コントロール)群では骨密度値の低 下が観察され、骨粗しょう症モデルが成立していた。また、細胞移植群では細胞移植 時までは骨密度値の低下傾向が見られた力 細胞移植を行うことにより、骨密度値の 上昇が確認された。特に、 1 X 107個 Zmlの投与群では、移植 1ヶ月後には移植直 後にコントロールと比較して 10%程度の骨密度の増加が観察された。さらに、 z CT においても骨密度の改善が確認された。細胞数は 1 X 107個の方が効果的であった。 従来の薬物治療による骨密度の増加が 3〜4%程度であることを考慮すると、本発明 の移植材料による骨密度改善効果が優れていることがわかった。
[0050] また、局所投与群について、図 3及び図 4に示すように、細胞移植群で骨密度値の 上昇が確認されるとともに、 μ CTにおいても骨密度の改善が確認された。細胞移植 による骨密度はコントロールに比較して 10%程度の増加が観察された。したがって、 全身投与時と同様、本発明の移植材料は、局所投与した場合であっても骨密度改 善効果が優れてレ、ることがわかった。
[0051] 以上のことから、骨粗しょう症に対して間葉系幹細胞を全身投与することにより、骨 密度の改善が確認された。このことにより、本発明の移植材料によれば、全身的に起 こっている骨粗しょう症に対しても、また今まで局所的にしか対応できなかった症例に 対しても有効な治療又は予防が行えることがわかった。全身的な投与によって、脊髄 などの局所においても明ら力な骨密度低下抑制又は骨密度増加の効果が得られる ことがわかった。
[0052] また、骨粗しょう症に対して骨系細胞に分化した間葉系幹細胞を局所投与すること により、骨密度の改善が確認された。このことにより、全身的に起こっている骨粗しょう 症の局所治療に本発明の移植材料が有効であることがわかった。また、局所的な骨 疾患や骨質改善部位に対しても本発明の移植材料が有効であることがわかった。
[0053] なお、本明細書において引用された文献は、引用によりその内容の全てが本明細 書に編入される。また、本出願は 2005年 6月 13日に出願された米国仮出願第 60/ 689, 553号を優先権主張の基礎としており、引用によりその内容の全てが本明細書 に含まれる。 産業上の利用可能性
本発明の移植材料は、例えば、整形外科、美容整形、歯科、 口腔外科及び耳鼻咽 喉科等における骨再生医療分野及び骨密度の低下抑制、維持、増加など骨質改善 のほか、骨粗しょう症などの骨疾患の予防 ·治療に有用である。

Claims

請求の範囲
[I] 移植材料であって、
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を 有する細胞からなる群から選択される 1種又は 2種以上細胞を含有し、骨質改善用途 に全身投与又は局所投与して使用する移植材料。
[2] ヒト又は非ヒトの骨部における骨密度増加を促進する、請求項 1に記載の移植材料
[3] 前記細胞は、間葉系幹細胞又は骨形成能を有する細胞である、請求項 1又は 2に 記載の移植材料。
[4] 前記細胞は自家細胞である、請求項 1〜3のいずれかに記載の移植材料。
[5] 脈管内投与用又は静脈内投与用である、請求項 1〜4のいずれかに記載の移植材 料。
[6] 骨髄腔内投与用である、請求項 1〜4のいずれかに記載の移植材料。
[7] 骨疾患の予防用又は治療用である、請求項 1〜6のいずれかに記載の移植材料。
[8] 前記骨疾患は全身性又は局所性である、請求項 7に記載の移植材料。
[9] 前記骨疾患は、骨欠損、骨ページエツト病、パーキンソン病、変形性関節症、腰背 痛、慢性関節リウマチ、骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び骨軟化症から 選択されるいずれかである、請求項 7又は 8に記載の移植材料。
[10] 前記骨疾患は、変形性関節症、腰背痛及び慢性関節リウマチから選択されるいず れかである、請求項 9に記載の移植材料。
[II] 前記骨疾患は、骨粗しょう症、骨折、歯周疾患、骨減少症及び骨軟化症から選択さ れるレ、ずれかである、請求項 9に記載の移植材料。
[12] 前記骨粗しょう症は、閉経性骨粗しょう症である、請求項 9又は 11に記載の移植材 料。
[13] 整形外科用、美容形成用、形成外科用、歯科用及び口腔外科用のいずれかであ る、請求項 1〜8のいずれかに記載の移植材料。
[14] 請求項:!〜 13のいずれかに記載の移植材料を含み、投与形態が全身投与及び/ 又は局所投与である、骨質改善剤。
[15] 前記投与形態は、脈管内投与用又は骨髄腔内投与である、請求項 14記載の骨質 改善剤。
[16] 請求項 1〜： 13のいずれかに記載の移植材料の製造方法であって、
胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を 有する細胞からなる群から選択される 1種又は 2種以上の細胞を準備する工程を備 える、製造方法。
[17] 前記細胞は自家細胞である、請求項 16に記載の製造方法。
[18] 胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を 有する細胞からなる群から選択される 1種又は 2種以上の細胞を培養する工程を備 える、請求項 16又は 17に記載の製造方法。
[19] 胚性幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、軟骨細胞及び骨形成能を 有する細胞からなる群から選択される 1種又は 2種以上の細胞を保存する工程を備 える、請求項 16〜： 18のいずれかに記載の製造方法。
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