RU2533804C2 - Получение домашней птицы и других животных, устойчивых к вирусному заболеванию - Google Patents
Получение домашней птицы и других животных, устойчивых к вирусному заболеванию Download PDFInfo
- Publication number
- RU2533804C2 RU2533804C2 RU2007140235/10A RU2007140235A RU2533804C2 RU 2533804 C2 RU2533804 C2 RU 2533804C2 RU 2007140235/10 A RU2007140235/10 A RU 2007140235/10A RU 2007140235 A RU2007140235 A RU 2007140235A RU 2533804 C2 RU2533804 C2 RU 2533804C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- virus
- germ cell
- genome
- Prior art date
Links
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims abstract description 62
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 33
- 244000144977 poultry Species 0.000 title description 22
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims abstract description 28
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 24
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 19
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 9
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 37
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 21
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 14
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 12
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 9
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 9
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 7
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 6
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 4
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 241001222053 Akabane virus Species 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 3
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 3
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 3
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 3
- 208000000705 Rift Valley Fever Diseases 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 201000005332 contagious pustular dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 208000008034 Contagious Ecthyma Diseases 0.000 description 2
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 2
- 206010048768 Dermatosis Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010031071 Orf Diseases 0.000 description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 208000012936 Sheep disease Diseases 0.000 description 2
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 2
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 2
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 1
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101000834255 Bos taurus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000412174 Ectima Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710081048 Endonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 101500025134 Gallus gallus Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 101500027503 Gallus gallus Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 101500028973 Gallus gallus Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000652362 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108050000307 Ribonucleotide reductase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091061763 Triple-stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101150053425 US1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000002687 Venezuelan Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010582 ecthyma Diseases 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229940079938 nitrocellulose Drugs 0.000 description 1
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000012331 ruffled feather Diseases 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/30—Bird
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
- C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложена трансгенная зародышевая клетка не являющегося человеком позвоночного. Клетка содержит конструкцию, которая включает последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома вируса ящура (FMDV) или птичьего гриппа. Также раскрыто получение трансгенного не являющегося человеком позвоночного из указанных клеток, которые обладают устойчивость к указанным вирусным заболеваниям. Изобретение может быть использовано в животноводстве и ветеринарии. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 20 ил., 4 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 60/666636, поданной 31 марта 2005 г., которая включена в описание в качестве ссылки для любых целей.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к применению технологии интерференции РНК для получения животных, устойчивых к вирусным инфекциям.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Центры контроля заболеваемости (CDC) и Всемирная организация здравоохранения сообщили, что высоко летальный штамм вируса птичьего гриппа H5N1 обнаружен более чем в 47 странах, которые распространились, по меньшей мере, по 3 континентам. См., например, <http://www.cdc.gov/flu/avian/outbreaks/current.htm>. Птичий грипп представляет собой инфекцию, вызванную вирусами гриппа. Эти вирусы гриппа встречаются у птиц в природе. Дикие птицы по всему миру несут вирусы в своем кишечнике, и обычно это проходит бессимптомно. Однако, птичий грипп очень контагиозен для птиц и может вызвать серьезное заболевание и гибель домашних птиц, включая кур, уток и индеек.
Инфицированные птицы распространяют вирус гриппа через слюну, носовые выделения и кал. Чувствительные к заболеванию птицы становятся инфицированными, если они контактируют с контаминированными секретами или выделениями или с поверхностями, которые контаминированы секретами или выделениями инфицированных птиц. Домашние птицы могут инфицироваться вирусом птичьего гриппа через прямой контакт с инфицированной водной домашней птицей или другой инфицированной домашней птицой, или путем контакта с поверхностями (такими как грязь или клетки) или материалами (такими как вода или корм), контаминированными вирусом. Инфекция вирусом птичьего гриппа у домашней птицы вызывает две основные формы заболевания, которые различаются низким и высоким экстремумами вирулентности. "Низко патогенная" форма может проходить невыявленной и обычно вызывает только мягкие симптомы (например, взъерошенные перья и перерыв в продукции яиц). Однако высоко патогенная форма распространяется по группам птиц. Данная форма может вызывать заболевание, которое затрагивает множественные внутренние органы и имеет степень смертности, которая часто достигает 90-100%, часто в течение 48 часов. Таким образом, возможные экономические потери птицеферм могут быть значительно снижены при наличии способов получения птицы, устойчивой к птичьему гриппу. Данная устойчивая к вирусу птица может размножаться с получением новых видов домашней птицы, которые будут передавать свою устойчивость к вирусу от поколения к поколению.
По оценкам, глобальный рынок домашней птицы дает более 50 млрд голов в год. Таким образом, что еще важнее, возможность получения устойчивых к вирусу животных, например, домашних птиц, может предотвратить распространение пугающего "птичьего гриппа", таким образом, предотвращая пандемию птичьего гриппа у людей.
Существуют и другие типы вирусных заболеваний, которые также имеют важное значение для птицеводства. Например, болезнь Марека часто вызывает тяжелые потери среди кур, и является основной причиной убытков хозяйств по продукции бройлеров. Болезнь Марека является лимфопролиферативным заболеванием, вызванным вирусом MD (MDV), принадлежащих к семейству герпесвирусов, и является основной проблемой птицеводства в течение последних 50 лет. Выявлены три серотипа штаммов MDV. Все онкогенные штаммы классифицированы как серотип 1 (MDV-I), в то время как природные неонкогенные куриные штаммы и герпесвирусы индеек (HVT) относятся к серотипам 2 (MD V-2) и 3, соответственно. Мировые ежегодные экономические потери от болезни Марека оцениваются масштабами миллиарда долларов США, несмотря на большие кампании по вакцинации. Хотя кампании по вакцинации снижают число заболевших групп по всему миру, в большей части мира происходит большое количество вспышек заболевания, что вызывает потребность в лучших способах контроля заболевания.
Имеются ограниченные количества вирусных заболеваний, у которых возможно успешное лечение. В настоящее время вакцинация является единственным способом борьбы с вирусными заболеваниями у животных. Во многих случаях, особенно при вирусных заболеваниях домашнего скота, этот подход не применим из-за невозможности получения высокоэффективных вакцин. Другой причиной неэффективности некоторых вакцин является высокая скорость мутаций, которая приводит к антигенному дрейфу или потере эффективности вакцин. Как только вакцина теряет свою эффективность, заболевание может прогрессировать и способно вызывать большие экономические потери в случае вирусных заболеваний домашней птицы и скота.
Имеются два классических вида вакцины; один вид представляет аттенуированную живую вакцину, которая является наиболее мощной, поскольку индуцирует гуморальное и клеточное звено иммунной системы. Недостатком этого вида вакцины является риск повторного возникновения высоко вирулентных мутантов-беглецов. По данной причине многие страны воздерживаются от одобрения применения данных видов вакцин. Вторым типом является инактивированная вирусная вакцина, которая во многих случаях намного менее эффективна, поскольку индуцирует лишь гуморальную иммунную систему. В последние несколько лет были разработаны некоторые виды рекомбинантных вакцин, такие как субъединичные вакцины и ДНК-вакцины. К сожалению, многие из них не имеют широкого применения. Одним из недостатков вакцинации является высокие ежегодные экономические расходы, что показано примером болезни Марека. Согласно данным Всемирной организации ветеринарии (OIE), общее число животных, вакцинированных против болезни Марека в 2002, составляло 2,457 миллиардов. См., например, <www.oie.com>.
Имеется два известных пути вакцинации. Первый способ является бесклеточной (лиофилизованной) формой вакцины стоимостью примерно около $3/1000 единиц. Вторая форма представляет собой содержащую клетки ("влажную") форму стоимостью примерно $8/1000 единиц. По оценкам, мировые расходы на вакцинацию от болезни Марека в 2002 примерно составляли от $7,4 миллиардов до $19,7 миллиардов.
С начала 1970-х большинство кур вакцинировали против MD с использованием аттенуированных штаммов серотипа 1 или HVT. Начиная с 1983 г., для защиты наиболее вирулентных полевых штаммов стали применять бивалентные и поливалентные комбинации. Хотя вакцинация очень эффективна в плане защиты кур, MD остается одним из основных в списке приоритетных заболеваний. Основной причиной высокого приоритета является постоянная эволюция штаммов MDV против повышенной вирулентности, что вызывает взлом вакцины.
Таким образом, имеется необходимость в способе профилактики или снижения переносимости вирусных заболеваний животных, например, птичьего гриппа и болезни Марека у домашней птицы. Из-за происходящих в настоящее время вспышек птичьего гриппа имеется высокая необходимость в способах, которыми можно получить генетически модифицированных животных, например, птиц, устойчивых к вирусным инфекциям, таким как птичий грипп.
В последние десять лет был описан новый подход инактивации генов посредством сайленсинга генов, называемый "интерференция РНК" (РНКи). См., например, Fire et al., Nature 391: 806-811 (1998) и патент США 6506559. Интерференция РНК относится к событию, которое происходит, когда полинуклеотид РНК действует посредством эндогенных клеточных процессов, специфично подавляющих экспрессию гена, последовательность которого соответствует таковой РНК. Сайленсинг гена-мишени происходит после деградации мРНК посредством двухцепочечной РНК (дцРНК) животного-хозяина, иногда путем расщепления РНКазой эндонуклеазой III. Расщепление приводит к образованию молекул, которые составляют примерно 21-23 нуклеотида (или основания) в длину, хотя их размер может быть и 30 оснований.
Данные короткие виды РНК опосредуют деградацию соответствующих матричных РНК и РНК-транскриптов, возможно через комплекс нуклеазы с РНКи, называемый индуцированным РНК комплексом сайленсинга (RISC), и данный комплекс помогает малым дцРНК распознавать комплементарные мРНК посредством взаимодействий за счет пар оснований. После взаимодействия миРНК с ее субстратом, мРНК направляется на деградацию, возможно, ферментами, которые присутствуют в RISC. Этот тип механизма, оказывается, используется организмами при ингибировании вирусных инфекций, перемещения транспозонов, и сходных феноменов, и для регуляции экспрессии эндогенных генов. Активность РНКи уже доказана в растениях, насекомых, нематодах и позвоночных, среди прочих организмов. Для общей информации по предпосылкам, см., например, Schutz et al., Virology 344(l):151-7 (2006); Leonard et al., Gene Ther. 13(6):532-40 (2006); Colbere-Garapin et al., Microbes Infect. 7(4):767-75 (2005); Wall, Theriogenology 57(l):189-201 (2002); El-Bashir, et al., Nature 411: 494-498 (2001); Fire, A., et al. Science 391: 806-811 (1998); Gitlin et al., Nature 418: 430-434 (2002); Gitlin, et al., J Virol. 79:1027-1035 (2005); Kahana, et al., J Gen. Virol. 85, 3213-3217 (2004); Kronke et al., J Virol. 78: 3436-3446 (2004); Leonard et al., J. Virol. 79:1645-1654 (2005); and Yokota, et al., EMBO Rep. 4: 602-608 (2003).
Благодаря широко распространенной проблеме различных вирусных заболеваний животных, в частности, домашней птицы, необходим другой подход к эффективному контролю вирусных инфекций домашней птицы и скота для решения указанной проблемы. Как таковое, описанное здесь изобретение относится к решению данной проблемы путем предоставления способов создания трансгенных, не являющихся человеком позвоночных, например, домашней птицы и скота, несущих и экспрессирующих молекулы, направленные на блокирование важных вирусных функций, которые будут значимо ингибировать репликацию патогенных вирусов, а также к самим генетически модифицированным особям домашней птицы и скота.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к зародышевым клетками, кодирующим миРНК, которая направлена на вирусные последовательности и способам ее получения. Изобретение также относится к не являющимся человеком позвоночным, которые устойчивы к вирусной инфекции, и к способам их получения.
В одном из аспектов изобретение относится к зародышевой клетке не являющегося человеком позвоночного, содержащего конструкцию, включающую последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома, в которой данная последовательность функционально связана с промотором. В одном из вариантов осуществления конструкция включает последовательности, кодирующие множественные миРНК к вирусному геному. В другом варианте осуществления клетка содержит множественные конструкции, включающие последовательность, кодирующую множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома, где указанная последовательность функционально связана с промотором. В другом варианте осуществления позвоночное представляет собой не являющееся человеком животное. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус ящура (FMDV). В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления позвоночное представляет собой вид птицы. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус птичьего гриппа. В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей, показанных на фиг. 1-16. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус болезни Марека (MDV). В другом варианте осуществления зародышевая клетка представляет собой сперму.
В другом аспекте изобретение относится к не являющемуся человеком позвоночному, которое устойчиво к вирусному заболеванию, где большинство клеток в позвоночном включают последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области генома вируса, вызывающего заболевание, в котором последовательность функционально связана с промотором. В одном из вариантов осуществления конструкция включает последовательности, кодирующие множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления клетка содержит множественные конструкции, включающие последовательности, кодирующие множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления позвоночное представляет собой не относящееся к человеку млекопитающее. В другом варианте осуществления вирусное заболевание представляет собой FMDV. В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления позвоночное представляет вид птицы. В другом варианте осуществления вирус представляет собой вирус птичьего гриппа. В другом варианте осуществления консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей на фиг. 1-16. В другом варианте осуществления вирус представляет собой MDV.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения зародышевой клетки не относящегося к человеку позвоночного, включающему инкубацию зародышевой клетки с конструкцией, содержащей последовательность, кодирующую миРНК к консервативному участку вирусного генома, где данная последовательность функционально связана с промотором, в условиях, которые приводят к попаданию конструкции внутрь клетки. В одном из вариантов осуществления конструкция интегрируется в геном клетки хозяина.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения не являющегося человеком позвоночного, которое устойчиво к вирусному заболеванию, включающему (a) инкубацию зародышевой клетки с конструкцией, включающей последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома, где данная последовательность функционально связана с промотором, в условиях, в которых она образует диплоидную клетку; и (b) инкубацию диплоидной клетки по (a) в условиях, в которых она образует не являющееся человеком позвоночное.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1-8 показаны последовательности вируса птичьего гриппа H5N1, которые могут использоваться для генома 7 данного штамма вируса птичьего гриппа.
На фиг.9-12 показаны последовательности вируса птичьего гриппа H5N1, которые могут использоваться для генома 1 данного штамма вируса птичьего гриппа.
На фиг.13-16 показаны последовательности вируса птичьего гриппа H5N1, которые могут использоваться для генома 5 данного штамма вируса птичьего гриппа.
На фиг.17 показано получение библиотеки стабильных клеточных линий с последовательностями миРНК AVA. Клетки MDCK в дополнение к экспрессии GFP инфицировали лентивирусным вектором, экспрессирующим различные миРНК или пустым вектором. Клеточные линии отбирали по устойчивости к пуромицину, выращивали в течение 2 недель до заражения гриппом. Клетки исследовали на флуоресцентном микроскопе Nikon (Х100). Для каждой контрольной линии при свете или с фильтром GFP наблюдали идентичные поля.
На фиг.18 показаны результаты количественной оценки эффективности миРНК AVA в отношении вируса гриппа H9N2. 5 различных клеточных линий (MDCK, пустой вектор, миРНК 1, миРНК 2, миРНК 3) высевали в 96-луночные планшеты, 10000 клеток на лунку. Через 3 часа после высевания клетки инфицировали вирусом гриппа H9N2, разведенным до 1:50 1:100, 1:200 1:400, 1:800, 1:1600 (представлено разведение 1:400). Инфицирование проводили в присутствии трипсина для стимуляции проникновения вируса в клетки. Клетки оценивали на наличие вирусного белка НА способом ELISA через 3 суток после инфицирования. Статистические расчеты (среднее и стандартное отклонение) основаны на 4 повторах для каждой клеточной линии. Результаты нормализованы по неинфицированным клеткам.
На фиг.19 показана оценка эффективности миРНК AVA в отношении вируса гриппа PR8.
На фиг.20 показана оценка эффективности миРНК AVA в отношении вируса гриппа H9N2 посредством анализа вестерн-блоттинга. А. За 2 часа до инфекции вируса H9N2 (разведенного 1:200) 105 клеток 4 клеточных линий MDCK (пустой вектор, миРНК №1, миРНК №2, миРНК №3) помещали в 24-луночный планшет. Через 48 часов после инфекции клетки лизировали 80 мкл буфера RIPA, содержащего смесь ингибиторов протеаз (разбавленную 1:1000). Лизаты клеток центрифугировали в течение 10 мин с максимальной скоростью (16 д) и супернатант, содержащий экстракт общего белка, помещали в новую чистую 1,5 мл пробирку. Концентрации белка определяли способом Брэдфорда (Bradford, 1976). 8 мкг экстракта общего белка разделяли посредством SDS-PAGE на 10% геле и переносили на нитро-целлюлозную мембрану (Whatman, Maidstone, England). Однородность переноса белков подтверждали окрашиванием красным Ponso (не показано). Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком и 0,05% Tween-20 в PBS (фосфатно-солевой буфер) в течение 1 часа при комнатной температуре и промывали 0,05% Tween-20 в PBS. Затем мембраны инкубировали с антителами к нуклеопротеину гриппа A (Chemicon (Millipore), Billerica, MA) разведенными 1:1000 bPBSc 0,05% Tween-20 и 5% BSA в течение 2 часа при комнатной температуре. Перед 1 часовой инкубацией с конъюгированными с HRP антителами козы к IgG (H+L) мыши AffiniPure (JacksonIR, WestGrove, РА), разбавленными 1:10000 в0,05% Tween-20 bPBS, содержащем 5% обезжиренное сухое молоко, проводили три 5 минутные промывки (0,05% Tween-20 в PBS). После трех подобных 5 мин отмывок мембраны помещали в субстрат для хемилюминесценции SuperSignal (ECL) (Pierce, Rockford, IL) в течение 5 мин и экспонировали на световую пленку FUGI в течение 5 мин. Для проверки уровней гомогенности общего белка использовали моноклональные антитела мыши к актину (MPBiomedicals, Solon, Oh), разбавленные 1:1000 в PBS с 0,05% Tween-20 и 5% BSA, с использованием того же вторичного антитела и протокола. В. Уровни сигналов 4 белковых экстрактов тестировалис антителами к гриппу (синий) или к актину (желтый). Интенсивность сигнала определяли посредством программного обеспечения ImageJ. C. Уровни ингибирования киРНК нормализовали с результатами против актина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к животным, устойчивым к вирусным инфекциям, и к способам получения данные типы трансгенных животных. Вирусные гены-мишени подлежат сайленсингу за счет присутствия молекул сайленсинга, таких как описанные молекулы миРНК, и, таким образом, они не могут выполнять свою роль в вирусном клеточном цикле. Исходом данного процесса является значимое блокирование репликации вируса, что приводит к неспособности инфекции индуцировать заболеваемость и/или смертность данных животных. Так, изобретение имеет существенный экономический эффект для фермеров, а также для общества в целом, обеспечивая постоянные поставки мяса и других продуктов животноводства. В осуществлении настоящего изобретения используют обычные способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах экспертизы в данной области. Такие способы в полной мере раскрыты в литературе, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) и Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999).
Все ссылки, патенты, и заявки на выдачу патента, цитируемые в данной заявке на выдачу патента включены в описание полностью в качестве ссылки для любых целей.
Определения
Все научные и технические термины, используемые в данной заявке, имеют значения, обычно принятые в данной области, за исключением определенных иначе. При использовании в данной заявке следующие слова или выражения имеют определенное значение.
Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота", используемые здесь взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме любой длины, к рибонуклеотидам или дезоксирибонуклеотидам. Данные термины включают в себя одно-, двух- или трехцепочечную ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК, ДНК-РНК-гибрид или полимер, включающий в себя пуриновые и пиримидиновые основания, или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания.
"Промотор" представляет собой последовательность контроля, которая представляет собой область полинуклеотидной последовательности, в которой инициация и скорость транскрипции контролируются. Она может содержать генетические элементы, с которыми могут связываться регуляторные белки и молекулы, например, РНК-полимераза и другие факторы транскрипции. Промоторы могут быть конститутивными, индуцируемыми, репрессируемыми, или, например, тканеспецифичными. Фразы "функционально связанный", "функционально расположенный", "под контролем" и "под транскрипционным контролем" означают, что промотор находится в правильном функциональном положении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии данной последовательности. Промотор может или может не использоваться в связи с "энхансером", что относится к действующей в цис-положении регуляторной последовательности, вовлеченной в активацию транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты. Один промотор может регулировать экспрессию одного или нескольких генов.
Мишени РНКи
Изобретение относится к способам сайленсинга генов, так что могут продуцироваться устойчивые к вирусу животные. В одном из вариантов осуществления в изобретении используется технология сайленсинга генов, такая как РНКи, ассоциированная с липофекцией, для создания трансгенной домашней птицы и скота с внутренним иммунитетом. В предпочтительном варианте осуществления в изобретении применяется опосредованная рестрикционными ферментами интеграция ("REMI"), как описано, например, в WO 99/42569, для создания устойчивых к вирусу животных. Животные несут и экспрессируют единичные или множественные молекулы сайленсинга генов, направленные на вирусные гены (например, необходимые для репликации вируса гена).
Малая интерферирующая РНК ("миРНК") по настоящему изобретению обеспечивает модулирование и/или аттенуацию экспрессии гена-мишени, когда такой ген присутствует и способен экспрессироваться в клетке. Модулирование экспрессии может представляться собой частичное, более предпочтительно, полное ингибирование клеточной функции, или даже положительную регуляцию других вторичных генов-мишеней или усиление экспрессии таких генов в ответ на ингибирование первичного гена-мишени.
Ослабление генной экспрессии может включать в себя частичную или полную супрессию или ингибирование функции гена, процессинг транскрипта или трансляцию транскрипта. В контексте РНК-интерференции, полагают, что модуляция генной экспрессии осуществляется комплексом белков и РНК, конкретно, включающих в себя малые dsРНК, которые могут действовать, "управляя" РНК. Поэтому полагают, что миРНК эффективная, когда ее нуклеотидная последовательность в достаточной мере соответствует, по меньшей мере, части нуклеотидной последовательности гена-мишени. Хотя настоящее изобретение не ограничено механистической гипотезой, очень предпочтительно, чтобы последовательность нуклеотидов в миРНК была, по существу, идентичной, по меньшей мере, части последовательности гена-мишени. В одном из вариантов осуществления идентичность последовательности между вирусным нуклеотидом-мишенью и миРНК равна 100%, т.е., соответствует точной гомологии. В другом варианте осуществления имеется различие в 1 паре оснований (н.п.). В другом варианте осуществления имеется различие в 2 парах оснований. В другом варианте осуществления имеется различие в 3 парах оснований.
"Ген-мишент" или "последовательность-мишень" в основном означает полинуклеотид, включающий в себя область, которая кодирует генный продукт, такой как полипептид, или полинуклеотидную область, которая регулирует репликацию, транскрипцию или трансляцию или другие процессы, значимые при экспрессии полипептида, или полинуклеотид, включающий в себя область, кодирующую полипептид, и область, функционально связанную с ней, которая регулирует экспрессию. Последовательность-мишень не обязательно должна кодировать целый генный продукт. В контексте изобретения "функционально связанный" относится к промотору, находящемуся в правильном функциональном расположении и/или ориентации по отношению к полинуклеотидной последовательности, для контроля инициации и/или экспрессии данной последовательности.
В одном из аспектов гены-мишени миРНК представляют собой вирусные гены. В одном из вариантов осуществления вирусные гены представляют собой гены, вовлеченные в распространение вирусных заболеваний птиц (например, птичий грипп и болезнь Марек). Генные последовательности, относящиеся к объему изобретения, включают последовательности, показанные на фиг. 1-16.
миРНК имеет длину, достаточную для значимого блокирования репликации вируса, но не для того, чтобы вызвать разрушение клеток, и обычно находящуюся в интервале примерно от 19 пар оснований до 27 пар оснований. В одном из вариантов осуществления миРНК составляет 21 н.п. в длину. В другом варианте осуществления миРНК составляет 21 н.п. в длину. В других вариантах осуществления миРНК составляют примерно 19, 20, 23, 24, 25, 26, или 27 н.п. в длину. В другом варианте осуществления миРНК составляют примерно 28, 29, или 30 н.п. в длину. Специалисту в данной области ясно, что длина миРНК не может быть очень большой, поскольку это запустит один из механизмов саморазрушения клетки, в которой находится миРНК. Например, в Elbashir et al. указано, что длина 21 н.п. была эффективной для индукции противовирусных механизмов в клетке, например, интерфероновой реакции (см. Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001)).
Как показано на фиг. 1-16, в качестве интерферирующей РНК могут использоваться РНК различной длины. В одном из предпочтительных осуществлений длина составляет 21 н.п. Специалист в данной области может использовать последовательности, обозначенные на фиг. 1-16 и двигаться, изменяя последовательность с шагом в одну пару оснований, для получения другой миРНК длиной 21 нм. Некоторые из таких изменений показаны на данных фигурах. Однако, показаны не все возможные последовательности миРНК длиной 21 н.п., поскольку если, как на фиг. 1-16, показана основная последовательность, для специалиста в данной области будет рутинной процедурой пошагово двигаться ниже по последовательности. Кроме того, длины, отличные от 21 н.п., также относятся к данному изобретению. Как обсуждалось выше, в одном из осуществлений миРНК составляет примерно от 21 н.п. до 27 н.п. в длину. Специалист в данной области может использовать последовательности, показанные на фиг. 1-16, и применять требуемую длину и двигаться вниз по последовательности с шагом в одну н.п. для получения другой рамки. Например, если следовало бы сделать миРНК длиной 23 н.п., специалист начал бы с одного конца последовательности и использовал бы первые 23 н.п. в качестве одной из комбинаций миРНК. Затем он мог бы сдвинуться на одну пару оснований вниз по последовательности, и следующие 23 пары оснований стали бы следующей комбинацией, и так далее.
Данные по последовательностям, определенные экспериментально, или доступные через общественные базы данных могут подвергаться скринингу биоинформационными инструментами. Анализ гомологии выполняют с использованием общественно доступных или коммерчески доступных программ (например, программы PILEUP и PRETTY в пакете GCG). Поиск гомологии необязательно проводят с использованием общественно доступных последовательностей (например, Genbank) с использованием программ PILEUP и PRETTY или программы FASTA (Pearson et al, PNAS 85: 2444-2448 (1988)).
Последовательности вирусных генов, особенно тех, которые воздействуют на здоровье и безопасность животных, рассматриваются в качестве генов-мишеней по изобретению. Идеальными вирусными последовательностями, которые служат в качестве мишеней, являются те, которые высоко консервативны. Высокая степень консервативности в основном является указанием давления селекции не мутировать за пределами консервативной последовательности. Для многих вирусов неструктурные гены имеют тенденцию к высокой консервативности среди их различных серотипов и поэтому являются хорошей мишенью для технологии РНКи. Другие вирусные гены, которые также хороши как мишени, представляют собой гены, значимые или необходимые для репликации вируса и последующего его размножения. В одном из аспектов для создания миРНК используют структурный (S) ген вируса Акабане.
В других аспектах последовательности-мишени являются короткими участками последовательности, которые являются консервативными среди различных штаммов птичьего гриппа. В одном из вариантов осуществления последовательность-мишень, используемая для миРНК происходит из генома 1 штамма H5N1 вируса птичьего гриппа. Ее неограничивающие примеры показаны на фиг. 9-12. Выделенный(-е) жирным шрифтом нуклеотид(ы) указывает(-ют) на место, где было выявлено различие пары оснований при анализе гомологии. В другом варианте осуществления последовательность-мишень, используемая для миРНК происходит из генома 5 штамма H5N1 вируса птичьего гриппа. Ее неограничивающие примеры показаны на фиг. 13-16. В другом варианте осуществления последовательность-мишень, используемая для миРНК происходит из генома 7 штамма H5N1 вируса птичьего гриппа. Ее неограничивающие примеры показаны на фиг. 1-8. В других вариантах осуществления последовательность-мишень происходит из других типов генома H5N1. Более того, миРНК для борьбы с другими штаммами птичьего гриппа (например, H5N2, H5N3, и т.д.) также входят в объем изобретения и могут быть получены специалистом в данной области, следуя приведенным здесь сведениям.
В другом аспекте, консервативные участки вируса ящура (FMDV) используют в качестве последовательностей-мишеней для конструирования миРНК. В других аспектах для конструирования миРНК в качестве последовательностей-мишеней могут использоваться последовательности неограниченного списка вирусов, которые вызывают следующие заболевания: ньюкаслская болезнь, лихорадка Западного Нила, оспа птиц, инфекционный бронхит птиц, энцефаломиелит птиц, лейкоз птиц, вирусный гепатит уток, вирусный энтерит уток, нодулярный дерматоз, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота, вирусная диарея крупного рогатого скота, лейкоз крупного рогатого скота, лихорадка Рифт-Вэлли, чума рогатого скота, инфекционная катаральная лихорадка овец, чума мелких жвачных (PPR), оспа овец и коз, контагиозный пустулярный дерматит (эктима), пограничная болезнь овец, маеди-висна, трансмиссивный гастроэнтерит (TGE), грипп лошадей, африканская болезнь лошадей, венесуэльский энцефаломиелит лошадей, и весенняя виремия карпа.
Конструкции, кодирующие миРНК
Конструкции, кодирующие миРНК, включают в себя несколько компонентов, включая в качестве неограничивающих примеров промоторы и последовательности, "направляющие" миРНК на правильную мишень в клетке. Промоторы, которые могут использоваться, включают в себя в качестве неограничивающих примеров промоторы РНК-полимеразы II и РНК-полимеразы III. Промоторы РНК-полимеразы III работают особенно хорошо в качестве промоторов для конструкции миРНК. Неограничивающие примеры промоторов (pol II и pol III), которые могут использоваться, включают в себя: промотор 5S рибосомальной (р) РНК, мышиный U6, человеческий U6, мышиный HI, человеческий HI, цитомегаловирусный промотор, промотор куриного убиквитина C, человеческий промотор 7SK, бычий промотор U6, куриный промотор U6, промотор гена фосфорилированного белка массой 38 кДа (pp38) вируса болезни Марека, промотор куриной мРНК длиной 1,8 тыс.н.п., промотор человеческого, бычьего бета-актина, куриный промотор PRL, промотор куриных генов SPATA4, промотор куриного Poll, промотор гена US1 вируса болезни Марека, промотор гена малой субъединицы рибонуклеотидредуктазы вируса болезни Марека, LTR вирусов лейкоза и саркомы птиц, RSV-LTR, синтетические поксвирусные промоторы, промотор вируса коровьей оспы Pl 1, промоторы вируса коровьей оспы P 174 и P 190, ранний/поздний промотор P.E/L вируса оспы птиц, промотор тимидинкиназы вируса оспы птиц, промотор коровьей оспы p7.5 и промотор PFLl вируса оспы птиц.
С использованием стандартных способов молекулярной биологии данные промоторы функционально связаны с последовательностями, которые направлены на вирусные гены и подвергают их сайленсингу. Один промотор может регулировать экспрессию одной или нескольких последовательностей-мишеней. Промотор(-ы) и последовательность(-и)-мишень(-и) клонируют в стандартные клонирующие или экспрессирующие векторы. Используемый здесь термин «вектор» относится к молекулам нуклеиновой кислоты, способным доставлять другие молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Векторы могут происходить из плазмид, бактериофагов, растений или других вирусов животных.
Конструкции миРНК получают таким образом, что они становятся способны экспрессировать миРНК. Специалисту в данной области понятно, что некоторые типы промоторов лучше регулируют экспрессию миРНК в одних позвоночных, чем в других позвоночных, в зависимости от физиологии позвоночных, и следует принимать меры по использованию промотора, который наилучшим образом подходит конкретному позвоночному. Промотор также может регулировать экспрессию одной или нескольких миРНК. Вектор может содержать последовательности, которые кодируют одну или несколько миРНК. Энхансеры, селективные маркеры и другие стандартные молекулярные инструменты могут также использоваться для упрощенных молекулярных манипуляций. При использовании способа REMI следует конструировать вектор, который облегчает применение способа REMI. Подходящие указания для данного способа находятся в WO 99/42569.
В одном из аспектов изобретения может использоваться вектор с несколькими генами миРНК, который соответствует различным мишеням на вирусном геноме. Данный тип векторной конструкции гарантирует значительное, вплоть до полного, ингибирование вследствие одновременного расщепления в различных участках. Кроме того, он будет активным, если одна из вирусных последовательностей-мишеней мутирует или изменится. Для двухцепочечной миРНК возможно наличие стандартного липкого конца в 2 н.п., а также липкий конец в 1 н.п., или отсутствие липкого конца.
Конструирование зародышевых клеток
Используемый здесь термин «зародышевая клетка» определяется как сперматозоиды и яйцеклетки, и их предшественники. Зародышевые клетки являются гаплоидными и имеют только один набор хромосом, тогда как другие незародышевые клетки имеют два набора хромосом. Настоящее изобретение относится к конструированию зародышевой клетки не являющегося человеком позвоночного, содержащей конструкцию, которая кодирует миРНК к консервативной области вирусного генома, где последовательность функционально связана с промотором. Зародышевая клетка может содержать конструкцию, которая включает в себя последовательности, кодирующие множественные миРНК к вирусному геному. Примеры вирусных последовательностей, которые могут использоваться, приведены выше. В одном из вариантов осуществления вирусная последовательность представляет собой вирус ящура (FDMV). В другом варианте осуществления вирусная последовательность представляет собой вирус птичьего гриппа.
Изобретение относится к способу получения зародышевой клетки не относящегося к человеку животного, в котором зародышевая клетка содержит конструкцию, содержащую последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома. Для воплощения способа по изобретению специалист в данной области инкубирует зародышевую клетку с конструкцией, кодирующей миРНК к консервативной области вирусного генома, в которой последовательность функционально связана с промотором, в условиях, которые обеспечивают захват конструкции внутрь клетки. В одном из вариантов осуществления конструкция интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI.
В одном из аспектов зародышевые клетки содержат множественные конструкции, включающие в себя последовательность, кодирующую множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома, где последовательность функционально связана с промотором. В другом варианте осуществления зародышевая клетка не являющегося человеком позвоночного относится к не являющемуся человеком млекопитающему. Неограничивающие примеры не являющихся человеком позвоночных включают в себя кур, уток, гусей, дичь, крупный рогатый скот, коров, свиней, рыб, овец, коз и лошадей. В другом варианте осуществления позвоночное является видом птицы. В другом аспекте зародышевая клетка содержит один вектор, содержащий несколько генов под контролем различных промоторов.
В одном из вариантов осуществления зародышевая клетка содержит конструкцию, содержащую последовательность, кодирующую миРНК, которая направлена на вирус ящура (FMDV). Примерами таких последовательностей-мишеней являются: i). 5′-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-S′ (SEQ ID NO:1) в нуклеотидах 4900-4922, расположенных в области 3B; (ii) 5′-GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3′ (SEQ ID NO:2) в нуклеотидах 6934-6992, расположенных в области 3D; и (iii) 5′-GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-S′ (SEQ ID NO:3) в нуклеотидах 6892-6917, расположенных в области 3D. Все положения относятся к последовательности FMDV серотипа O1 (G) (инвентарный номер GenBank AF189157).
В одном из аспектов зародышевая линия содержит конструкцию, включающую в себя последовательность, кодирующую миРНК, которая направлена на вирус птичьего гриппа. В вариантах осуществления данного аспекта зародышевая клетка содержит конструкцию, в которой консервативная последовательность выбрана из любой из последовательностей, обозначенных на фиг. 1-16.
В другом аспекте зародышевая клетка содержит конструкцию, включающую в себя последовательность, которая кодирует миРНК, направленную на вирус болезни Марека (MDV). В любом из указанных выше случаев зародышевая клетка представляет собой сперму.
Конструирование трансгенных животных
Описанные выше конструкции затем вводят в животные клетки любыми стандартными способами, например, липофекцией. Однако, некоторые из ранних способов, например, липофекция, дают очень малый процент успеха. Авторы изобретения нашли, что предпочтительный способ достижения успешного введения данных конструкций, кодирующих миРНК, является применение опосредованной ферментом рестрикции интеграции ("REMI") по WO 99/42569. В соответствии с этим, в одном из вариантов осуществления полинуклеотид, кодирующий миРНК, вводят в зародышевые клетки животного (например, в сперматозоиды) с использованием REMI. Животные, полученные в результате применения данных зародышевых клеток, становятся устойчивыми к заболеваниям. Данных трансгенных животных можно подвергать скрещиванию с получением целой популяции устойчивых к вирусу животных. В случае домашней птицы вирусы, которые являются мишенями миРНК, включают в себя в качестве неограничивающих примеров вирусы болезни Марека, инфекционного бурсита, и птичьего гриппа.
Число миРНК, введенное в клетку животного (например, в зародышевую клетку) может меняться. В одном из вариантов осуществления вводят 1 или несколько миРНК. Специалисту в данной области понятно, что могут вводиться различные комбинации миРНК на основе вирусного заболевания-мишени.
Изобретение относится к получению не являющегося человеком позвоночного, устойчивого к вирусному заболеванию, где большинство клеток позвоночного включают в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области генома вируса, вызывающего данное заболевание, где последовательность функционально связана с промотором. Примеры вирусных последовательностей обсуждаются выше. В одном из вариантов осуществления конструкция включает в себя последовательности, кодирующие множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления клетки содержат множественные конструкции, включающие в себя последовательность, которая кодирует множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома. В другом варианте осуществления не являющееся человеком позвоночное является не являющимся человеком млекопитающим.
В одном из вариантов осуществления большинство клеток не являющегося человеком позвоночного содержат конструкцию, включающую в себя последовательность, кодирующую миРНК, которая направлена на вирус ящура (FMDV). Примерами таких последовательностей-мишеней являются: i). 5′-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-S′ (SEQ ID NO:1) в нуклеотидах 4900-4922, расположенных в области 3B; (ii) 5′-GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3′ (SEQ ID NO:2) в нуклеотидах 6934-6992, расположенных в области 3D; и (iii) 5′-GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-S′ (SEQ ID NO:3) в нуклеотидах 6892-6917, расположенных в области 3D. Все положения относятся к последовательности FMDV серотипа O1 (G) (инвентарный номер GenBank AF189157).
Неограничивающие примеры не являющихся человеком позвоночных включают в себя кур, уток, гусей, дичь, крупный рогатый скот, коров, свиней, рыб, овец, коз и лошадей. В другом варианте осуществления позвоночное относится к виду птицы. Еще в одном варианте осуществления не являющееся человеком позвоночное имеет клетки, содержащие конструкцию, кодирующую миРНК, где консервативная последовательность выбрана из любой из последовательностей, обозначенных на фиг. 1-16. В другом варианте осуществления не являющееся человеком позвоночное устойчиво к MDV.
Изобретение относится к способу получения не являющегося человеком позвоночного, устойчивого к вирусному заболеванию, включающему стадии: (a) инкубации зародышевых клеток, описанных выше, в условиях, в которых они образуют диплоидную клетку; и (b) инкубации диплоидной клетки по (a) в условиях, в которых она образует не являющееся человеком позвоночное.
Изобретение также относится к получению не являющегося человеком позвоночного, устойчивого к вирусному заболеванию, посредством клонирования. В таких случаях одна или несколько миРНК может быть встроена в геном клонируемой клетки. Различные способы данной технологии доступны коммерчески, например, протоколы трансплантации ядра компании Advanced Cell Technology.
Варианты применения
Изобретение относится к способу получения домашней птицы, устойчивой к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров ньюкаслскую болезнь, лихорадку Западного Нила, оспу птиц, инфекционный бронхит птиц, энцефаломиелит птиц, лейкоз птиц, вирусный гепатит уток и вирусный энтерит уток.
Изобретение относится к способу получения крупного рогатого скота, устойчивого к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров нодулярный дерматоз, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота, вирусную диарею крупного рогатого скота, лейкоз крупного рогатого скота, лихорадку Рифт-Вэлли, чуму рогатого скота, инфекционную катаральную лихорадку.
Изобретение относится к способу получения овец и коз, устойчивых к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров чуму мелких жвачных (PPR), оспу овец и оспу коз, контагиозный пустулярный дерматит (эктиму), пограничную болезнь овец, инфекционную катаральную лихорадку, маеди-висна, и лихорадку Рифт-Вэлли.
Изобретение относится к способу получения лошадей, устойчивых к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров грипп лошадей, африканскую болезнь лошадей, венесуэльский энцефаломиелит лошадей.
Изобретение относится к способу получения рыбы, устойчивой к вирусным заболеваниям. Данные заболевания включают в себя в качестве неограничивающих примеров весенную виремию карпа.
Изобретение может применяться к свиньям для создания устойчивости против классической чумы свиней, африканской чумы свиней, трансмиссивного гастроэнтерита (TGE) и ящура. В общем, приведенные здесь сведения могут относиться к любому животному, чувствительному к вирусному заболеванию.
В случае развитой индустрии птицеводства, которая испытывает большие экономические потери вследствие заболеваний практическое решение лежит в области воплощения технологии миРНК для создания племенных птиц бройлеров и несушек, устойчивых к птичьему гриппу и болезни Марека, инфекционному бурситу и другим вирусам птиц. Применение описанного здесь изобретения предоставляет безопасный источник птицы для потребителей и всей популяции, поскольку останавливается распространение птичьих вирусов от птиц человеку.
Следующее предоставлено для иллюстрации изобретения, но не для его ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение животных, устойчивых к ящуру
Трансгенных животных, устойчивых к ящуру, получали встраиванием миРНК, сконструированной из последовательностей вируса ящура (FMDV), в зародышевые клетки животных. В общем, животные, чувствительные к FMDV, являются парнокопытными.
Конструирование миРНК ящура
Для конструирования миРНК вначале идентифицировали вирусную последовательность-мишень. Один способ выполнения этого состоит в проведении анализа локальной гомологии на последовательностях FMDV из различных штаммов или серотипов и в идентификации коротких участков гомологии последовательности. В одном из вариантов осуществления гомология составляет 100%, то есть абсолютно одинаковая последовательность во всех серотипах. В другом варианте осуществления наблюдается различие в 1 или 2 парах оснований. Анализ гомологии проводят с использованием общественно доступных или коммерчески доступных программ (например, программы PILEUP и PKETTY в пакете GCG). Поиск гомологии необязательно проводят с использованием общественно доступных последовательностей (например, Genbank) с использованием программ PILEUP и PRETTY или программы FASTA (Pearson et al, PNAS 85: 2444-2448 (1988)).
Как только короткие участки гомологии идентифицированы, синтезируют миРНК с использованием коммерчески доступных служб. миРНК синтезируют различной длины. Некоторые миРНК составляют 19 н.п. длиной, тогда как другие составляют 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 н.п. длиной. Каждая из данных миРНК является на 100% консервативной среди всех серотипов, или в каждой миРНК имеется различие на 1-2 н.п. Данные консервативные последовательности необязательно связаны, по меньшей мере, с одним промотором в векторе, подходящем для доставки в зародышевую клетку. Другой альтернативой является применение миРНК, которая уже была синтезирована, см., например, миРНК, описанную в Kahana et al. J. Gen. Virol. 85: 3213-3217 (2004).
Данные конструкции миРНК затем встраивают в зародышевые клетки (например, сперматозоиды или яйцеклетки) парнокопытных животных с использованием способа REMI, описанного в WO 99/42569, с получением зародышевой клетки со стабильно интегрированной миРНК. Зародышевые клетки затем используют для продукции трансгенных животных способами, известными в данной области (например, оплодотворение in vitro, искусственное осеменение) с получением животного, устойчивого к вирусу ящура.
Пример 2
Получение спермы, содержащей миРНК для вируса Акабане
Линию сперматозоидов из не являющегося человеком позвоночного получают инкубацией спермы с конструкцией, включающей в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вируса Акабане, где последовательность функционально связана с промотором в условиях, которые обеспечивают захват конструкции в клетку. Неограничивающие примеры включают в себя применение липофекции или сходного механизма, хлорида кальция или протамина. В качестве альтернативы, конструкция стабильно интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI. миРНК конструируют по двум критериям: области имеют высокую гомологию среди различных изолятов, и имеется высокая вероятность сайленсинга, что определяется программами поиска мишени для миРНК. Применение молекул миРНК, направленных на консервативные последовательности, должно гарантировать способность данных молекул расщеплять большинство, если не все вирусы одного штамма, независимо от их происхождения. Вторая и более важная причина состоит в том, что консервативность последовательности указывает на сильное давление отбора против изменения. Давление отбора, как ожидается, сохранило данные области-мишени неизменными, хотя если они изменяться, это может подавить противовирусную активность молекул миРНК.
Пример 3
Получение спермы, содержащей миРНК против вируса ящура
Линию сперматозоидов из не являющегося человеком позвоночного получают инкубацией спермы с конструкцией, включающей в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вируса ящура, где последовательность функционально связана с промотором в условиях, которые обеспечивают захват конструкции в клетку. Неограничивающие примеры включают в себя применение липофекции или сходного механизма, хлорида кальция или протамина. В качестве альтернативы, конструкция стабильно интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI.
Пример 4
Получение спермы, содержащей миРНК против вируса птичьего гриппа
Линию сперматозоидов из не являющегося человеком позвоночного получают инкубацией спермы с конструкцией, включающей в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вируса птичьего гриппа, где последовательность функционально связана с промотором в условиях, которые обеспечивают захват конструкции в клетку. Неограничивающие примеры включают в себя применение липофекции или сходного механизма, хлорида кальция или протамина. В качестве альтернативы, конструкция стабильно интегрируется в геном клетки хозяина с использованием технологии REMI.
Claims (22)
1. Трансгенная зародышевая клетка не являющегося человеком позвоночного, содержащая конструкцию, которая включает в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома, где последовательность функционально связана с промотором, где вирусный геном является геномом вируса ящура (FMDV) или геномом вируса птичьего гриппа, и где последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и последовательностей, показанных на фиг.1-16.
2. Зародышевая клетка по п.1, где конструкция включает в себя последовательности, кодирующие множественные миРНК к вирусному геному.
3. Зародышевая клетка по п.1, где клетка содержит множественные конструкции, содержащие последовательность, которая кодирует множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома, где последовательность функционально связана с промотором.
4. Зародышевая клетка по любому из пп.1-3, где позвоночное представляет собой не являющееся человеком млекопитающее.
5. Зародышевая клетка по п.4, где вирус является вирусом ящура (FMDV).
6. Зародышевая клетка по п.5, где консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
7. Зародышевая клетка по любому из пп.1-3, где позвоночное представляет собой вид птицы.
8. Зародышевая клетка по п.7, где вирус представляет собой вирус птичьего гриппа.
9. Зародышевая клетка по п.8, где консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей, показанных на фиг.1-16.
10. Зародышевая клетка по любому из пп.1-3, где зародышевая клетка является сперматозоидом.
11. Не являющееся человеком позвоночное, устойчивое к вирусному заболеванию, где большинство клеток позвоночного включает в себя последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области генома вируса, вызывающего заболевание, где последовательность функционально связана с промотором, где вирусный геном является геномом вируса ящура (FMDV) или геномом вируса птичьего гриппа, и где последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и последовательностей, показанных на фиг.1-16.
12. Не являющееся человеком позвоночное по п.11, где конструкция включает в себя последовательности, кодирующие множественные миРНК к вирусному геному.
13. Не являющееся человеком позвоночное по п.11, где клетка содержит множественные конструкции, содержащие последовательность, которая кодирует множественные миРНК к консервативным областям вирусного генома.
14. Не являющееся человеком позвоночное по любому из пп.11-14, где позвоночное представляет собой не являющееся человеком млекопитающее.
15. Не являющееся человеком позвоночное по п.14, где вирусное заболевание представляет собой FMDV.
16. Не являющееся человеком позвоночное по п.15, где консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
17. Не являющееся человеком позвоночное по любому из пп.11-13, где позвоночное относится к виду птиц.
18. Не являющееся человеком позвоночное по п.17, где вирус является вирусом птичьего гриппа.
19. Не являющееся человеком позвоночное по п.18, где консервативная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей, показанных на фиг.1-16.
20. Способ получения зародышевой клетки не являющегося человеком позвоночного, где зародышевая клетка является зародышевой клеткой по п.1, включающий инкубацию зародышевой клетки с конструкцией, содержащей последовательность, кодирующую миРНК к консервативной области вирусного генома, где последовательность функционально связана с промотором, в условиях, которые обеспечивают захват конструкции в клетку, где вирусный геном является геномом вируса ящура (FMDV) или геномом вируса птичьего гриппа, и где последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и последовательностей, показанных на фиг.1-16.
21. Способ по п.20, в котором конструкция интегрируется в геном клетки хозяина.
22. Способ получения не являющегося человеком позвоночного по п.11, где способ содержит:
(a) инкубацию зародышевой клетки по любому из пп.1-10, в условиях, в которых она образует диплоидную клетку; и
(b) инкубацию диплоидной клетки по (a) в условиях, в которых она образует не являющееся человеком позвоночное.
(a) инкубацию зародышевой клетки по любому из пп.1-10, в условиях, в которых она образует диплоидную клетку; и
(b) инкубацию диплоидной клетки по (a) в условиях, в которых она образует не являющееся человеком позвоночное.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US66663605P | 2005-03-31 | 2005-03-31 | |
US60/666,636 | 2005-03-31 | ||
PCT/IB2006/002675 WO2007017759A2 (en) | 2005-03-31 | 2006-03-31 | Creating poultry and other animals resistant to viral disease |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007140235A RU2007140235A (ru) | 2009-05-10 |
RU2533804C2 true RU2533804C2 (ru) | 2014-11-20 |
Family
ID=37727684
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007140235/10A RU2533804C2 (ru) | 2005-03-31 | 2006-03-31 | Получение домашней птицы и других животных, устойчивых к вирусному заболеванию |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090064352A1 (ru) |
EP (2) | EP1863913A2 (ru) |
JP (2) | JP2008534004A (ru) |
KR (1) | KR20070122506A (ru) |
CN (1) | CN101184842A (ru) |
AU (1) | AU2006277679B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0609485A2 (ru) |
CA (1) | CA2602797A1 (ru) |
IL (1) | IL186365A0 (ru) |
MX (1) | MX2007012056A (ru) |
RU (1) | RU2533804C2 (ru) |
WO (1) | WO2007017759A2 (ru) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070213293A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-09-13 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Rnai therapeutic for respiratory virus infection |
KR20080086440A (ko) | 2005-11-01 | 2008-09-25 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인플루엔자 바이러스 복제의 RNAi 억제 |
GB2432419A (en) * | 2005-11-16 | 2007-05-23 | Agency Science Tech & Res | Influenza A virus detection method |
CN101918558B (zh) * | 2007-05-16 | 2016-12-07 | Mat马耳他先进技术有限公司 | 流感的治疗及预防 |
US20100279273A1 (en) * | 2007-07-17 | 2010-11-04 | Universite Laval | Nucleic acid sequences for the amplification and detection of respiratory viruses |
JP5502077B2 (ja) | 2008-06-05 | 2014-05-28 | グラクソ グループ リミテッド | 新規な化合物 |
EP2280705B1 (en) | 2008-06-05 | 2014-10-08 | Glaxo Group Limited | Novel compounds |
EP2300437B1 (en) | 2008-06-05 | 2013-11-20 | Glaxo Group Limited | Benzpyrazol derivatives as inhibitors of pi3 kinases |
EP2406255B1 (en) | 2009-03-09 | 2015-04-29 | Glaxo Group Limited | 4-oxadiazol-2-yl-indazoles as inhibitors of pi3 kinases |
WO2010125656A1 (ja) * | 2009-04-28 | 2010-11-04 | 株式会社カネカ | 外来性rnaを発現する抗病性トランスジェニック鳥類 |
JO3025B1 (ar) | 2009-04-30 | 2016-09-05 | Glaxo Group Ltd | الأندازولات المستبدلة بالأوكسازول كمثبطات كيناز pi3 |
WO2010129558A1 (en) * | 2009-05-04 | 2010-11-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Identification of swine-origin influenza a (h1n1) virus |
SG168423A1 (en) * | 2009-07-13 | 2011-02-28 | Agency Science Tech & Res | Influenza detection method and kit therefor |
CN102212520B (zh) * | 2011-03-23 | 2013-04-24 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 特异性沉默鸡马立克氏病病毒gI、gE基因的siRNA序列及其载体和应用 |
AU2013204327B2 (en) * | 2012-04-20 | 2016-09-01 | Aviagen | Cell transfection method |
TWI461541B (zh) * | 2012-07-23 | 2014-11-21 | Univ Nat Cheng Kung | 檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組 |
CN103184235A (zh) * | 2013-03-20 | 2013-07-03 | 广西大学 | 多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用 |
EP3183368B1 (en) | 2014-08-22 | 2020-08-05 | Cepheid | Methods of detecting influenza |
AU2016305490B2 (en) * | 2015-08-07 | 2022-07-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Method for producing an animal comprising a germline genetic modification |
CN105586438B (zh) * | 2015-11-17 | 2021-06-25 | 天津海关动植物与食品检测中心 | 用于检测赤羽病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法 |
KR102136132B1 (ko) * | 2018-01-31 | 2020-07-22 | 서울대학교 산학협력단 | CRISPR/Cas9 시스템을 통한 닭 백혈병 바이러스(Avian Leukosis Virus, ALV) 저항성 조류의 제조방법 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2215029C2 (ru) * | 1999-02-11 | 2003-10-27 | Ханми Фарм. Ко., Лтд. | Способ получения установившейся эмбриональной зародышевой клеточной линии птиц, линия куриных эмбриональных зародышевых клеток, способ получения соматических или половых химер, способ трансфекции чужеродного гена в эмбриональные зародышевые клетки |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6506559B1 (en) * | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
IL123411A0 (en) | 1998-02-22 | 1998-09-24 | Kimron Veterinary Inst | High efficiency methods and compositions for integrating exogenous dna into genomic dna of sperm |
US20030084471A1 (en) * | 2000-03-16 | 2003-05-01 | David Beach | Methods and compositions for RNA interference |
US20030149259A1 (en) * | 2001-05-18 | 2003-08-07 | Callahan Johnny Dale | Foot and mouth disease virus diagnostic and methods |
US7277788B2 (en) * | 2002-07-31 | 2007-10-02 | Caterpillar Inc | Charge density control for an internal combustion engine |
US20040242518A1 (en) * | 2002-09-28 | 2004-12-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Influenza therapeutic |
AU2003297474A1 (en) * | 2002-12-18 | 2004-07-14 | Salk Institute For Biological Studies | Methods of inhibiting gene expression by rna interference |
WO2006026238A2 (en) * | 2004-08-25 | 2006-03-09 | Avigenics, Inc. | Rna interference in avians |
NZ563845A (en) * | 2005-04-08 | 2010-09-30 | Marina Biotech Inc | RNAi sequences against the Influenza A segment 1 PB2 gene and uses thereof as anti-viral therapeutic |
-
2006
- 2006-03-31 WO PCT/IB2006/002675 patent/WO2007017759A2/en active Application Filing
- 2006-03-31 JP JP2008503622A patent/JP2008534004A/ja active Pending
- 2006-03-31 AU AU2006277679A patent/AU2006277679B2/en not_active Ceased
- 2006-03-31 EP EP06808899A patent/EP1863913A2/en not_active Withdrawn
- 2006-03-31 KR KR1020077024532A patent/KR20070122506A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-03-31 CN CNA2006800191642A patent/CN101184842A/zh active Pending
- 2006-03-31 RU RU2007140235/10A patent/RU2533804C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-03-31 BR BRPI0609485-6A patent/BRPI0609485A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-03-31 CA CA002602797A patent/CA2602797A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-31 EP EP10013080A patent/EP2366710A3/en not_active Withdrawn
- 2006-03-31 US US11/910,213 patent/US20090064352A1/en not_active Abandoned
- 2006-03-31 MX MX2007012056A patent/MX2007012056A/es active IP Right Grant
-
2007
- 2007-10-07 IL IL186365A patent/IL186365A0/en unknown
-
2012
- 2012-03-29 JP JP2012077496A patent/JP2012125256A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2215029C2 (ru) * | 1999-02-11 | 2003-10-27 | Ханми Фарм. Ко., Лтд. | Способ получения установившейся эмбриональной зародышевой клеточной линии птиц, линия куриных эмбриональных зародышевых клеток, способ получения соматических или половых химер, способ трансфекции чужеродного гена в эмбриональные зародышевые клетки |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KAHANA R. ET AL: "Inhibition of foot-and-mouth disease virus replication by smal interfering RNA" JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 85, November 2004 (2004-11), - November 2004 (2004-11) pages 3213-3217. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1863913A2 (en) | 2007-12-12 |
BRPI0609485A2 (pt) | 2010-04-13 |
RU2007140235A (ru) | 2009-05-10 |
US20090064352A1 (en) | 2009-03-05 |
JP2012125256A (ja) | 2012-07-05 |
KR20070122506A (ko) | 2007-12-31 |
CN101184842A (zh) | 2008-05-21 |
MX2007012056A (es) | 2008-03-10 |
IL186365A0 (en) | 2008-01-20 |
JP2008534004A (ja) | 2008-08-28 |
AU2006277679A1 (en) | 2007-02-15 |
EP2366710A2 (en) | 2011-09-21 |
WO2007017759A2 (en) | 2007-02-15 |
AU2006277679B2 (en) | 2012-08-02 |
WO2007017759A3 (en) | 2007-07-12 |
CA2602797A1 (en) | 2007-02-15 |
EP2366710A3 (en) | 2011-10-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2533804C2 (ru) | Получение домашней птицы и других животных, устойчивых к вирусному заболеванию | |
US10130701B2 (en) | Coronavirus | |
Laconi et al. | Deletion of accessory genes 3a, 3b, 5a or 5b from avian coronavirus infectious bronchitis virus induces an attenuated phenotype both in vitro and in vivo | |
Salvesen et al. | Current and prospective control strategies of influenza A virus in swine | |
Lee et al. | Chicken melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) recognizes infectious bursal disease virus infection and triggers MDA5-related innate immunity | |
US10004797B2 (en) | Method of rapidly producing improved vaccines for animals | |
Kapczynski et al. | Homologous and heterologous antigenic matched vaccines containing different H5 hemagglutinins provide variable protection of chickens from the 2014 US H5N8 and H5N2 clade 2.3. 4.4 highly pathogenic avian influenza viruses | |
Sun et al. | Tembusu virus infection in Cherry Valley ducks: the effect of age at infection | |
Campbell et al. | Pattern recognition receptor signaling and innate responses to influenza A viruses in the mallard duck, compared to humans and chickens | |
Assavalapsakul et al. | Identification and characterization of a Penaeus monodon lymphoid cell-expressed receptor for the yellow head virus | |
US20110209231A1 (en) | Treatment and prevention of influenza | |
Thangaraj et al. | Cyprinid herpesvirus‐2 (CyHV‐2): a comprehensive review | |
Samir et al. | Small non-coding RNAs associated with viral infectious diseases of veterinary importance: potential clinical applications | |
JP2020521494A (ja) | 鳥類における形質選択 | |
Dortmans et al. | Field vaccinated chickens with low antibody titres show equally insufficient protection against matching and non-matching genotypes of virulent Newcastle disease virus | |
Niu et al. | Chicken DDX3X Activates IFN-β via the chSTING-chIRF7-IFN-β Signaling Axis | |
Chen et al. | A recombinant canine distemper virus expressing interleukin-7 enhances humoral immunity | |
Goraya et al. | Innate immune responses against avian respiratory viruses | |
Liu et al. | Identification of feline interferon regulatory factor 1 as an efficient antiviral factor against the replication of feline calicivirus and other feline viruses | |
Peterhans et al. | How to succeed as a virus: strategies for dealing with the immune system | |
Rice | Investigating pathogenicity of Spring Viraemia of Carp virus (SVCV) and the development of diagnostic tools | |
WO2013066665A1 (en) | Method of rapidly producing improved vaccines for animals | |
Banerjee | Dynamics of bat-coronavirus interactions: role of innate antiviral responses | |
Hassan | Molecular, Pathogenesis and Immunological Studies of the Canadian Delmarva (DMV/1639) Infectious Bronchitis Virus (IBV) Variant | |
Lund | Immunological and physiological effects of Piscine orthoreovirus infection in Atlantic salmon (Salmo salar) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20110322 |
|
FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20110801 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150401 |