CN103184235A - 多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用，属于基因工程、病毒学领域。本发明构建了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，并利用慢病毒介导方法将该载体转入BHK-21细胞中获得对口蹄疫病毒复制有抑制作用的转基因细胞，后将该慢病毒载体注入动物皮下，获得抗口蹄疫嵌合体动物。此外，利用多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体制备出抗口蹄疫转基因小鼠，对O型口蹄疫病毒具有一定抗性，在5LD50病毒滴度下乳鼠的存活率获得明显提高。因此，应用本发明可望通过抗口蹄疫转基因家畜的制备，对现有普通品种进行改良从而提高易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。
Description
技术领域
本发明属于基因工程、病毒学领域，具体涉及一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、其构建方法及其应用技术领域。
背景技术
口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)，是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)引起的以侵害偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触性人畜共患传染病，在国际上受到高度重视。该病毒属于小RNA病毒科FMDV属，有O型，A型，C型，SAT I型，SAT II型，SATIII型及Asia I型等7个血清型，70多个亚型，各型之间无交叉反应。流行病学调查和实验感染证明，有100多种动物可以感染。口蹄疫已被世界动物卫生组织(world organization of animal health，OIE)列为A类动物传染病之首。
(一)口蹄疫的发生和危害：
口蹄疫的发生早在五六百年前就已经有记载，在14-15世纪就有类似口蹄疫的牛病的描述。最早对于口蹄疫发生和流行的描述，应追溯到1546年，意大利学者GirolamoFracastor较为详细地记录了1514年在意大利Friuli、Venice、Verona等地先后暴发口蹄疫的情况。
自意大利发生口蹄疫以来，口蹄疫在欧洲大陆流行了几百年，17-18世纪，口蹄疫在法国、意大利、德国、瑞士、奥地利等国经常大规模流行。英国也在1839年发生了口蹄疫。此后欧洲在1845-1894年之间均有口蹄疫的广泛流行。1991年保加利亚发生了一次规模较大的疫情。2001年口蹄疫在英国流行，同年9月欧洲各国声称口蹄疫在欧洲已经被消灭，然而在2007年8月英国由于实验室管道泄漏，再次出现口蹄疫。
根据联合国粮农组织(food and agriculture organization of the United Nation，FAO)和OIE发表的家畜卫生年鉴统计资料，1951-1953年亚洲每年都曾发生口蹄疫的大流行，1959年亚洲有16个国家或地区发生口蹄疫，1977年有13个，1979年多达30个，1982-1983年有27个，1984年有16个，1985年有10个，1987年又上升为22个，1989年仍有17个国家或地区流行口蹄疫。到了90年代后，亚洲口蹄疫疫情更为严峻。最严重的是1997年和2000年中国台湾和日本、韩国暴发大规模口蹄疫，损失严重。
中北美国家是世界上最早消灭口蹄疫的国家和地区，美国于1929年、加拿大于1952年、墨西哥于1954年宣布消灭口蹄疫。此前美国历史上口蹄疫曾发生了9次，墨西哥在1926年和1946年曾2次暴发口蹄疫，经过采取许多周密而有效的措施扑灭了疫情。南美国家口蹄疫的疫情较为严重，多年来造成很大的经济损失。不过经过南美各国在防制方面的努力，1981年智利宣布为无口蹄疫国家；到90年代，OIE曾将乌拉圭、阿根廷、巴拉圭、巴西划为“疫苗免疫的无口蹄疫国家或地区”。几年之后，口蹄疫又入侵阿根廷南部地区，只有智利一直保持着无口蹄疫国家的地位。
口蹄疫的发生和流行对当地的发展有着巨大的危害，以我国台湾地区1997年3月的疫情为例。这场口蹄疫风暴前后历时3个多月，共波及6147个养猪场，1011674头猪发病，184231头猪死亡，扑杀了600万头猪，直接经济损失高达15.52亿美元，相关行业的间接经济损失为62.08亿美元，国民经济总产值损失达104.76亿美元。
(二)RNAi技术在抗病毒上的应用：
由于病毒的入侵，很有可能造成宿主细胞的复制、代谢及其它正常生理功能受到影响，甚至使宿主细胞死亡，最终导致宿主的发病乃至死亡。目前抵抗和消除病毒感染给宿主带来的不良后果，主要依赖于抗病毒的药物和干扰素，然而病毒为了生存会在进化中不断形成新的耐药性，而且某些药物和干扰素对动物机体会产生很大的副作用。RNAi能阻断病毒感染途径，或抑制其作用过程中关键蛋白质的表达，是对抗病毒感染最有效的方式。因此，RNAi的出现给抗病毒研究提供了新思路，为病毒病治疗带来了新希望。
然而，科学家们至今已针对FMDV不同基因在细胞和动物等不同水平对RNAi抗FMDV效果进行了研究和探索。据报道，在长期使用siRNA抑制病毒复制的治疗过程中会使病毒基因变异而产生RNAi抗性，导致病毒逃逸。而为了解决这一问题，人们开始针对病毒基因组保守区或同时以不同基因序列作为靶基因。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，利用该多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体可生产转基因动物，用于对现有普通品种进行改良从而提高易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。
本发明的另一个目的在于公开了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法。
本发明的第三个目的在于公开了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其中，所述表达载体为载体一或载体二，其中载体一为pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；或载体二为LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。
上述技术方案所述的一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其中，多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体中Cons1如序列1所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。
上述技术方案所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，包括下述步骤：
(1)、根据GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守区，化学合成3个shRNA串联的Cons1-Cons2-Cons3片段，连入pMD-18T载体，得到p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP载体；其中Cons1-Cons2-Cons3中在Cons1的5’端设有XbaI\SacI双酶切位点，在Cons1和Cons2之间设有ClaI/XhoI双酶切位点，在Cons2和Cons3之间设有BglII\MluI双酶切位点，在Cons3的3’端设有LoxP\NotI双酶切位点；
(2)、以水牛基因组为模板，以SEQ No.4/SEQ No.5为引物扩增出水牛7SK的启动子bu7SK；以水牛基因组为模板，以SEQ No.6/SEQ No.7为引物扩增出水牛U6的启动子buU6；以牛基因组为模板，以SEQ No.8/SEQ No.9为引物扩增出牛U6的启动子boU6；
(3)、对步骤(2)中得到的启动子片段和步骤(1)得到的载体分别进行双酶切后连接，依次将启动子bu7SK、启动子buU6和启动子boU6连入步骤(1)的p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP载体中，得到载体p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP；
(4)、用XbaI/NotI双酶切载体p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI；以慢病毒载体质粒pSicoR为载体骨架，用XbaI/NotI双酶切载体骨架后，用T4连接酶将XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI连接入XbaI/NotI双酶切后的pSicoR质粒中，得到多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；
(5)、将载体一与慢病毒包装质粒pNRF和pVsvg在293T细胞中共转染，得到载体二LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。
上述技术方案所述多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，其中，步骤(3)具体方法如下：
(a)、首先用内切酶XbaI/SacI将p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将bu7SK启动子用T4连接酶连接至Cons1的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP；
(b)、其次用内切酶ClaI/XhoI将p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将buU6启动子用T4连接酶连接至Cons2的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP；
(c)、最后用内切酶MluI/BglII将p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP切开，将boU6启动子用T4连接酶连接至Cons3的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP。
上述技术方案所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体在检测由该载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制方面的应用或者在构建转基因小鼠方面的应用。
上述技术方案所述的应用，其中，检测步骤为：用载体二转染BHK-21细胞获得转基因细胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分别感染转基因细胞BHK-LV和非转基因BHK-21细胞，在不同时间点通过实时定量PCR测定病毒拷贝数，以制作病毒复制曲线，将转基因细胞BHK-LV与非转基因BHK-21细胞的病毒复制曲线做比较，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在BHK细胞中对口蹄疫病毒复制的抑制作用。
上述技术方案所述的应用，其中，所述应用为在小鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测；本技术方案的具体操作方法为：用所述载体二注射到乳鼠颈后皮下，24h后再颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在乳鼠中对口蹄疫病毒抵抗作用。
上述技术方案所述的应用，其中，所述应用为在转基因乳鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测；本技术方案的具体操作方法为：颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一在转基因乳鼠中对口蹄疫病毒抵抗作用。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用水牛7SK、U6及牛U6启动子串联表达针对口蹄疫病毒基因的3个shRNA，构建了多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体及慢病毒表达载体，用慢病毒载体生产抗口蹄疫的转基因细胞及嵌合体小鼠，并采用原核注射法，将非慢病毒多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体转入动物基因组中，使转基因动物对口蹄疫病毒有一定抵抗能力，建立了抗口蹄疫转基因动物。通过对抗口蹄疫转基因细胞和嵌合体小鼠的分析检测，确定细胞中有shRNA的表达，且转基因细胞对口蹄疫病毒的复制有明显抑制作用，嵌合体乳鼠对口蹄疫病毒也具有明显的抵抗力。通过对抗口蹄疫转基因乳鼠的分析检测，确定转基因乳鼠对口蹄疫病毒有一定抵抗力，尤其是在LD50滴度上相比普通乳鼠，死亡率较低。本发明通过多个针对口蹄疫病毒不同保守区的shRNA在细胞和动物体内进行表达，既能有效减少口蹄疫病毒的免疫逃逸，又能达到广谱抑制口蹄疫病毒的效果。因此，应用本发明可望通过转基因家畜的制备，对现有普通品种进行改良从而提高易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。
附图说明：
1、图1为p18T-3shRNA质粒启动子酶切鉴定电泳图；
2、图2为载体一酶切鉴定图；
3、图3为载体一目的片段bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP测序图；
4、图4为多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP的结构图；
5、图5为包装慢病毒载体转染后72h荧光细胞照片；
6、图6为图5的常光照片；
7、图7为纯化后慢病毒滴度测定时第八孔荧光照片；
8、图8为图7的常光照片；
9、图9为生产的转基因细胞BHK-LV的荧光照片；
10、图10为图9的常光照片；
11、图11是应用茎-环法进行实时定量PCR检测3个抗口蹄疫shRNA在转基因细胞BHK-LV中的表达图；
12、图12是FMDV在转基因细胞BHK-LV中的复制曲线；
13、图13是经载体二慢病毒载体预处理后的乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力检测图；
14、图14为F2代转基因小鼠与普通小鼠交配获得F3代后代PCR检测；
15、图15为F2代转基因小鼠之间交配获得F3代后代PCR检测；
16、图16是转基因乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力检测结果图；
17、图17是接种口蹄疫病毒72h后，转基因小鼠各组织病毒含量测定结果图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体、该表达载体的构建方法以及该表达载体的应用作进一步的说明。
一、实验材料和方法
所用载体、细胞系和试剂来源：pMD18T载体(购自Takara公司)，pSicoR、pNRF和pVsvg载体由本实验室保存，Cons1-Cons2-Cons3-LoxP序列合成由南京金斯瑞公司完成，水牛7SK、U6和牛U6启动子由发明人自行克隆。引物合成以及序列测定由上海生工有限公司完成，Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶、QRT-PCR相关试剂均购自Takara公司，小提质粒以及胶回收试剂盒购自TIANGEN公司，去内毒小提质粒试剂盒购自OMEGA公司，细胞转染以及胞质内注射用外源基因胶回收试剂盒购自QIAGEN公司，293T细胞系为申请人保存，BHK-21细胞系由中国农科院兰州兽医研究所提供，细胞、乳鼠用口蹄疫病毒由中国农科院兰州兽医研究所提供。
所用基因组提取、总RNA提取、PCR扩增、反转录、酶切、胶回收、连接、转化、质粒提取、脂质体转染法、显微注射法、QRT-PCR等实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》(2000年，科学出版社)或相应的试剂盒说明书。转基因小鼠的生产由广州赛业公司代理。
实施例1：抗口蹄疫shRNA设计和多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体及慢病毒载体的构建：
根据NCBI上公布的各血清型口蹄疫的全基因组序列(AF189157、AY304994、AY593751和AF274010)，利用BLAST软件进行多重序列比对，在3B和3D基因中选择三段保守区域：(1)3B区域中5’-CCT GTC GCT TTG AAA GTG AAA GC-3’位于4900-4922nt；(2)3D区域中5’-GAG ATT CCA AGC TAC AGA TCA CTT TAC CTG CGT TGG GTG AAC GCC GTG TGCGGT GAC GC-3’位于6934-6992nt；(3)3D区域中5’-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTTGAG CC-3’位于6892-6917nt。三段根据口蹄疫病毒基因组中3B和3D保守区域设计的shRNA的双链DNA序列如序列表1-3所示，其中Cons1为序列1，Cons2为序列2，Cons3为序列3；
化学合成3个shRNA串联的片段Cons1-Cons2-Cons3，其中Cons1-Cons2-Cons3中在Cons1的5’端设有XbaI\SacI双酶切位点，在Cons1和Cons2之间设有ClaI/XhoI双酶切位点，在Cons2和Cons3之间设有BglII\MluI双酶切位点，在Cons3的3’端设有LoxP\NotI双酶切位点，该片段包含酶切位点的完整序列为EcoRI-XbaI-SacI-Cons1-ClaI-XhoI-Cons2-Bg1II-MluI-Cons3-LoxP-NotI-HindIII；经EcoRI/HindIII双酶切，连入pMD-18T载体构建成p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP，酶切体系如表1所示，T4连接体系如表5所示：。
表1 EcoRI/HindIII酶切体系(1×)
根据GenBank中水牛7SK(JN417658)、U6(JN417659)以及牛U6(DQ150532)启动子序列，以水牛、牛基因组为模板扩增出水牛7SK、U6以及牛U6启动子
水牛7SK启动子上游引物5’-GAG ACA GAC CTG GCT CCA C-3’(序列表4)，下游引物5’-CAC ATC CGA GAC ACT CTG C-3’(序列表5)，PCR反应过程如表3所示，扩增退火温度按表3中“水牛7SK：55℃”进行；
水牛U6启动子上游引物5’-GAG CAT TCA GTC CGG CAG-3’(序列表6)，下游引物5’-GCA CGG TAA ACA TGG CTT C-3’(序列表7)，PCR反应过程如表3所示，扩增退火温度按表3中“水牛U6：58℃”进行；
牛U6启动子上游引物5’-TGC TCC CAG CAT GCT CCA C-3’(序列表8)，下游引物5’-CAT TTA CCC CCC ACA GAA TAT ATA AG-3’(序列表9)，PCR反应过程如表3所示，扩增退火温度按表3中“牛U6：62℃”进行。
扩增水牛7SK、U6以及牛U6启动子的PCR反应体系均采用表2所示的反应体系：
表2 PCR反应体系(1×)
表3 扩增水牛7SK、U6以及牛U6启动子的PCR反应过程
载体构建步骤如下：
1、首先用内切酶XbaI/SacI将p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将bu7SK启动子用T4连接酶连接至Cons1的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP；酶切体系如表4所示，T4连接体系如表7所示：
表4 XbaI/SacI酶切体系(1×)
2、其次用内切酶ClaI/XhoI将p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将buU6启动子用T4连接酶连接至Cons2的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP；酶切体系如表5所示，T4连接体系如表7所示：
表5 ClaI/XhoI酶切体系(1×)
3、接着用内切酶MluI/BglII将p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP切开，将boU6启动子用T4连接酶连接至Cons3的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP；酶切体系如表6所示，T4连接体系如表7所示：
表6 MluI/BglII酶切体系(1×)
表7 T4连接体系(1×)
4、分别用内切酶XbaI/SacI，ClaI/XhoI，MluI/BglII酶切检测三个启动子的连接，酶切体系见表4-6，酶切电泳图如图1所示，图1为p18T-3shRNA质粒启动子酶切鉴定电泳图，其中1：Marker III；2：水牛7SK启动子酶切(430bp)；3：水牛U6启动子酶切(357bp)；4：牛U6启动子酶切(321bp)；5：p18T-3shRNA质粒对照；6：Supercoiled DNA ladder marker。
5、用XbaI/NotI双酶切步骤3中的p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到约1298bp大小的XbaI-bu7SK-Cons1--buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI片段，用T4连接酶连接入pSicoR质粒中获得载体一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP，通过XbaI/NotI双酶切和测序验证正确性，其中酶切体系如表8所示，T4连接体系如表7所示，酶切电泳图如图2所示，测序图谱如图3所示，载体一中bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP序列如序列10所示；图2为载体一酶切鉴定图，其中1：Marker III；2：pSicoR-3shRNA质粒XbaI/NotI双酶切(小片段为1298bp)；3：pSicoR-3shRNA质粒对照(8502bp)；4：Supercoiled DNA ladder marker。图3为载体一目的片段bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP测序图。
表8 XbaI/NotI酶切体系(1×)
获得的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP结构如图4所示。
5、将载体一与慢病毒包装质粒pNRF和包膜质粒pVsvg在293T细胞中以3∶2∶1的比例用脂质体转染法(方法依照invitrogen公司lipofectamine2000说明书)共转染，转染后72小时收集上清，经0.22μm滤器过滤，所得液体为慢病毒原液，原液中含有所述多个抗口蹄疫shRNA串联表达慢病毒载体，即载体二LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP(如图5-6所示，其中图5为包装慢病毒载体转染后72h荧光细胞照片，图6为图5的常光细胞照片)。
实施例2：细胞水平上多个抗口蹄疫shRNA串联表达慢病毒滴度测定：
以约2×105cells/mL的密度将293T细胞接种于96孔板中，每孔加100μl 10％FBS+DMEM培养基。测定时设定每8孔为1组，在第1孔中加入实施例一中制备的慢病毒原液10μl，此后每孔依次按10∶1倍比稀释，最后一孔做空白对照。接毒后48h在荧光显微镜下观察表达绿色荧光细胞的数量，如前一孔发光细胞多于5个，而此孔及以后各孔无荧光表达；或如以后各孔无荧光表达，而此孔发光细胞少于5个，则此孔作为计量孔(计为1IU)，并计发光细胞数m，进而计算病毒的滴度。公式如下：
病毒滴度＝m×(1IU×计量孔相对于第1孔的稀释倍数)/第1孔加入病毒的体积
纯化后的慢病毒载体滴度约为1×108IU/ml。如图7和图8所示，图7为纯化后慢病毒滴度测定时第八孔荧光照片，图8为图7的常光照片。
实施例3：由多个抗口蹄疫shRNA串联表达慢病毒载体转化获得转基因BHK-LV细胞：
(1)BHK-21细胞以浓度2×105cells/mL接种于35m细胞培养皿中，加1.5ml无双抗10％FBS+MEM培养基培养过夜；
(2)将500μl未经超速离心的慢病毒原液(不低于1×106IU/ml)与9μl浓度为1μg/μl聚凝胺(Polybrene)充分混合，静置5min；
(3)将混合液成滴加入细胞培养皿中，轻轻摇晃以使培养基混合均匀，置于37℃二氧化碳培养箱孵育12～24h后，换成10％FBS+MEM培养基；
(4)慢病毒载体感染BHK-21后72h后通过荧光显微镜观察细胞荧光表达情况；由于pSicoR无筛选抗性基因，采用流式细胞仪分选，得到转基因BHK-LV细胞系，绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞内稳定表达，可证明目的片段在细胞基因组中整合(如图9和图10所示，其中图9为生产的转基因细胞BHK-LV的荧光照片；图10为图9的常光照片)。
实施例4：转基因BHK-LV细胞中shRNA表达情况检测：
收集部分转基因细胞BHK-LV，提取总RNA，应用茎-环法进行实时定量PCR，结果显示，3个针对FMDV的shRNA在BHK-LV细胞中均有表达，而在普通BHK-21细胞中几乎没有表达。比较3个shRNA的相对表达量，发现Cons1相对表达量最高，而Cons3的表达量相对最低。实时定量PCR结果见图11，其中图11是应用茎-环法进行实时定量PCR检测3个抗口蹄疫shRNA在转基因细胞BHK-LV中的表达，白色斜杠柱状图为野生型BHK-21阴性对照。
实施例5：转基因BHK-LV细胞对口蹄疫病毒复制的抑制检测：
将抗口蹄疫转基因细胞BHK-LV以及阴性对照BHK-21细胞以浓度2×105cells/mL接种于24孔板中。根据接毒后测定病毒RNA拷贝数的时间点，将细胞分别接种7个24孔板中，每板每种细胞接种3个孔。24h后，将O型口蹄疫病毒HKN/2002用无双抗无血清的MEM稀释到106～107TCID50/ml，并将混合液以5×103TCID50/cell的比例接种于转基因细胞以及阴性对照细胞。病毒作用1h后将7个24孔板中含有FMDV的MEM吸出，用PBS洗2遍以彻底洗掉细胞外残留的病毒，加入无双抗无血清MEM，并立即将1个24孔板放入-80℃冰箱冷冻。此后，分别在接毒后6h、12h、18h、24h、36h和48h将一个24板放入-80℃冰箱冷冻。之后反复冻融7个24孔板中的细胞，使细胞破裂释放出细胞内的病毒。用枪头刮下24孔底部细胞并反复吹打，以收集细胞及所有上清，置于1.5ml EP离心管中，用于总RNA提取或-80℃保存。
每组细胞吸取200μl混合液至96孔RNA提取板中，用QIAGEN全自动高通量核酸提取工作站(QIAxtractor)提取总RNA后，吸取等体积的总RNA，用One Step PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒进行荧光定量PCR。通过FMDV复制的标准曲线回归方程计算出每个时间点的病毒RNA拷贝数，绘制转基因细胞BHK-LV和阴性对照BHK-21接O型FMDV后1h～48h内的病毒复制曲线。
结果如图12显示，图12是FMDV在转基因细胞BHK-LV中的复制曲线(图中方形块线状图为口蹄疫病毒在野生型BHK-21中的复制情况，圆点线状图为口蹄疫病毒在转基因细胞BHK-LV中的复制情况)，接107TCID50滴度O型FMDV强毒后6h，复制曲线上两种细胞病毒RNA拷贝数几乎没有差别，因此这一时间点可视为shRNA作用导致病毒复制差异的起始点，此时，两种细胞的病毒RNA拷贝数均达到约1.50×107。在接毒后12h时普通和转基因细胞中病毒的含量都在有飙升，均达到峰值(分别是1.33×108和8.10×107。而在接毒后18h时，两种细胞中病毒含量以大幅度降低。在接毒后18h至48h，两种细胞的病毒RNA拷贝数基本没有太大变化，然后转基因细胞BHK-LV中的病毒含量在24h时有一个明显的降低。对比普通BHK-21细胞和转基因BHK-LV细胞，接毒后12 h shRNA对病毒的抑制率达到39.06％，24h时的抑制率高达67.48％，48h时抑制率也达31.65％；图12证明BHK-LV中表达的shRNA对口蹄疫病毒的复制有一定抑制效果。
实施例6：经抗口蹄疫慢病毒载体预处理后乳鼠对口蹄疫病毒抵抗检测：
1×108TU/ml滴度的纯化后抗口蹄疫慢病毒载体(LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP)用PBS稀释10倍，以每只0.2ml的剂量颈后皮下注射接于3～5日龄乳鼠，阴性对照用PBS代替慢病毒接种。经LV-3shRNA处理24h后，分别注射0.2ml剂量5，20，100and1000LD50滴度的0型FMDV至乳鼠颈后皮下。1000LD50滴度设两只乳鼠，其余滴度组各设4只乳鼠。在接毒后12h、24h、30h、36h、48h、72h和7d观察LV-3shRNA组以及阴性对照组各滴度的死亡情况。
结果如图13显示，图13是经载体二慢病毒载体预处理后的乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力检测，图中框内“-”表示健康，“×’’表示死亡，“+”表示发病，“△”表示濒死。图13中显示大多数LV组乳鼠在存活时间较同滴度的NC组乳鼠稍延长，而且在20LD50滴度上LV组乳鼠有三只存活，反正在NC组同滴度上没有存活。经本试验，可证明所述多个抗口蹄疫shRNA串联表达慢病毒载体对口蹄疫病毒具有明显抵抗能力，并能将半数致死滴度水平提高一个数量级，通过此图可证明，经载体二处理的乳鼠抵抗口蹄疫病毒的能力得到明显提高。
实施例7：抗口蹄疫转基因小鼠的制备以及对口蹄疫病毒的反应：
一、抗口蹄疫转基因小鼠的制备
将载体一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP用XbaI/KpnI进行双酶切，获得XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP-KpnI片段，酶切体系如表9所示：
表9 XbaI/KpnI酶切体系(1×)
通过显微注射的方法将XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP-KpnI片段注入FVB近交系小鼠受精卵的原核内，再将此受精卵移植入受体母鼠的输卵管壶腹部。
受体母鼠产下乳鼠，经PCR阳性检测，其中能检测出阳性条带的小鼠即为转基因亲代(F0)小鼠，方法同下。
二、抗口蹄疫转基因小鼠模型传代及PCR阳性检测：
以鼠尾基因组DNA为模板，以普通小鼠鼠尾基因组DNA作为阴性对照；根据目的片段设计上下游引物：tg-mF5’-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’(序列11)和tg-mR5’-GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’(序列12)，PCR检测体系如表10所示：
表10 PCR检测体系
PCR反应条件为：94℃变性5min后进行循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃延伸1.5min。反应结束后，取5μl PCR产物1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，进行照相。
转基因亲代(F0)小鼠与普通FVB异性健康小鼠合笼交配后，其子一代(F1)小鼠通过上述PCR检测，约有50～60％遗传获得转基因，F1转基因小鼠成熟后再与普通异性健康小鼠交配，其后代(F2、F3)小鼠经上述PCR阳性检测，转基因阳性后代比率仍保持在50～60％；而当F2代转基因小鼠之间进行交配后，其得到的后代100％获得转基因遗传(图14和图15所示为转入载体一的F3代转基因小鼠尾尖基因组DNA PCR检测电泳图，其中图14为F2代转基因小鼠与普通小鼠交配获得F3代后代PCR检测；图15为F2代转基因小鼠之间交配获得F3代后代PCR检测，图14和15中：0为灭菌水为模板的阴性对照，M为天根公司的MarkerI，1～10为鼠尾基因组为模板的PCR结果)。
二、转基因小鼠对口蹄疫病毒抵抗力检测：
分别对3～5日龄的转基因小鼠和普通小鼠颈后皮下注射不同滴度O型FMDV(1000LD50、100LD50、20LD50和5LD50)，观察乳鼠在各时间点发病、濒死或死亡的情况。接种后72h的结果显示，结果显示：在小鼠死亡时间上有微弱区别，转基因小鼠在100LD50和20LD50两个滴度内的死亡时间均略晚于普通小鼠，而不同于慢病毒处理后乳鼠接毒试验结果，转基因乳鼠对FMDV的抵抗力并没有在LD50上提高一个数量级。接种后72h在每个滴度随机抽取一只，进行实时定量PCR检测，存活乳鼠胴体中FMDV含量均略低于死亡小鼠(如图16所示，图16是转基因乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力检测，图中“-”表示健康，“×”表示死亡，“+”表示发病，“△”表示濒死，括号内数值为乳鼠胴体病毒拷贝数的log10值。通过此图可看出，转入的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一对转基因乳鼠抵抗口蹄疫病毒的能力有一定作用，存活时间有所增加，但并无明显保护作用)。
随机挑选3～5日龄转基因小鼠和普通小鼠各20只，分别接种5LD50和20LD50滴度的O型FMDV稀释液。检测得到存活率比较结果显示：在5LD50滴度下，接种后72h普通小鼠仅有3只存活，7只乳鼠死亡，存活率约为30％，而转基因小鼠则有8只存活，仅仅死亡2只，存活率约为80％；20LD50滴度下，无论转基因小鼠或普通小鼠均无存活，见表11。
表115LD50和20LD50滴度下普通小鼠和转基因小鼠的存活率
三、转基因小鼠各组织中病毒抑制情况：
在4个滴度中选取之前试验解剖的转基因乳鼠和普通乳鼠用于测定心、肝、肾等组织内的病毒量；除了5LD50滴度组选取存活的小鼠进行解剖外，其它滴度中均待小鼠濒死或死亡后进行解剖。
各个滴度组的转基因小鼠和普通小鼠以及分别计算的平均值，比较小鼠的各组织病毒拷贝数，结果如图17所示(图17是接种口蹄疫病毒72h后，转基因小鼠各组织病毒含量测定，5LD50滴度选用存活小鼠进行测定；TG表示转基因小鼠，NC表示普通小鼠)，无论是转基因还是普通小鼠，心脏中病毒含量都是三种组织中最高的，其次是肝脏，最后是肾脏。在20、100和1000LD50滴度组死亡小鼠各组织病毒RNA拷贝数的Log10值显示，随着滴度的升高，转基因小鼠和普通小鼠心脏中FMDV病毒量基本成线性增加，转基因小鼠心脏中的病毒量均高于普通小鼠；我们还可以清楚地看到，两种小鼠肝脏中的FMDV拷贝数变化无规律，大多数滴度内变化不大，除了5LD50滴度外，其它滴度中，转基因小鼠肝脏中的病毒量均高于普通组；肾脏中的病毒量变化基本和肝脏保持一致。然而在5LD50滴度组，两只存活的小鼠中，转基因和普通小鼠各组织病毒量均低于其它滴度组，但与其它滴度组不同的是，转基因小鼠各组织中检测到的病毒RNA拷贝数低于普通小鼠的各组织，这与之前小鼠胴体检测结果相似。
上述试验结果表明，本发明成功构建出多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体以及通过显微注射方法成功制备抗口蹄疫转基因小鼠，并通过一系列检测，证明其有效性和抑制口蹄疫病毒复制的能力，转基因小鼠存活率有所提高。该模型为日后进一步生产抗口蹄疫转基因猪、牛、水牛等大家畜奠定了良好基础，通过本发明所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体对现有普通品种进行改良从而提高易感物种对口蹄疫病毒的抵抗力，在一定程度上减少口蹄疫带来的经济损失。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其特征在于：所述表达载体为载体一或载体二，其中载体一为pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；或载体二为LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。
2.根据权利要求1所述的一种多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体，其特征在于：多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体中Cons1如序列1所示；Cons2如序列2所示；Cons3如序列3所示。
3.权利要求1或2所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，包括下述步骤：
(1)、根据GenBank中口蹄疫病毒3B和3D基因的高保守区，化学合成3个shRNA串联的Cons1-Cons2-Cons3片段，连入pMD-18T载体，得到p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP载体；其中Cons1-Cons2-Cons3中在Cons1的5’端设有XbaI\SacI双酶切位点，在Cons1和Cons2之间设有ClaI/XhoI双酶切位点，在Cons2和Cons3之间设有BglII\MluI双酶切位点，在Cons3的3’端设有LoxP\NotI双酶切位点；
(2)、以水牛基因组为模板，以SEQ No.4/SEQ No.5为引物扩增出水牛7SK的启动子bu7SK；以水牛基因组为模板，以SEQ No.6/SEQ No.7为引物扩增出水牛U6的启动子buU6；以牛基因组为模板，以SEQ No.8/SEQ No.9为引物扩增出牛U6的启动子boU6；
(3)、对步骤(2)中得到的启动子片段和步骤(1)得到的载体分别进行双酶切后连接，依次将启动子bu7SK、启动子buU6和启动子boU6连入步骤(1)的p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP载体中，得到载体p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP；
(4)、用XbaI/NotI双酶切载体p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP，得到XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI；以慢病毒载体质粒pSicoR为载体骨架，用XbaI/NotI双酶切载体骨架后，用T4连接酶将XbaI-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-NotI连接入XbaI/NotI双酶切后的pSicoR质粒中，得到多个抗口蹄疫shPRNA串联表达载体一pbu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP；
(5)、将载体一与慢病毒包装质粒pNRF和pVsvg在293T细胞中共转染，得到载体二LV-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP-CMV-EGFP-LoxP。
4.根据权利要求3所述多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(3)具体方法如下：
(a)、首先用内切酶XbaI/SacI将p18T-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将bu7SK启动子用T4连接酶连接至Cons1的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP；
(b)、其次用内切酶ClaI/XhoI将p18T-bu7SK-Cons1-Cons2-Cons3-LoxP切开，将buU6启动子用T4连接酶连接至Cons2的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP；
(c)、最后用内切酶MluI/BglII将p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-Cons3-LoxP切开，将boU6启动子用T4连接酶连接至Cons3的5’端，得到p18T-bu7SK-Cons1-buU6-Cons2-boU6-Cons3-LoxP。
5.由权利要求1或2所述的多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体在检测由该载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制方面的应用或者在构建转基因小鼠方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，检测步骤为：用载体二转染BHK-21细胞获得转基因细胞BHK-LV，用O型口蹄疫病毒分别感染转基因细胞BHK-LV和非转基因BHK-21细胞，在不同时间点通过实时定量PCR测定病毒拷贝数，以制作病毒复制曲线，将转基因细胞BHK-LV与非转基因BHK-21细胞的病毒复制曲线做比较，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在BHK细胞中对口蹄疫病毒复制的抑制作用。
7.根据权利要求5所述的应用，其中，所述应用为在小鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测。
8.根据权利要求7所述的检测，其特征在于：用所述载体二注射到乳鼠颈后皮下，24h后再颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体二在乳鼠中对口蹄疫病毒抵抗作用。
9.根据权利要求5所述检测方法，其中，所述应用为在转基因乳鼠上进行对载体表达的shRNA抑制口蹄疫病毒复制的检测。
10.根据权利要求9所述的检测，其特征在于：颈后皮下注射不同滴度的O型口蹄疫病毒，在不同时间点观察乳鼠死亡情况，确定多个抗口蹄疫shRNA串联表达载体一在转基因乳鼠中对口蹄疫病毒抵抗作用。
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| WO2007017759A2 (en) * | 2005-03-31 | 2007-02-15 | Ronen Kahana | Creating poultry and other animals resistant to viral disease |
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