MX2007012056A - Creacion de aves de corral y otros animales resistentes a enfermedad viral. - Google Patents

Abstract

La invencion se dirige a animales geneticamente modificados que son resistentes a infecciones virales. Tambien se proporcionan metodos para crear animales que son resistentes a infecciones virales.

Description

CREACIÓN DE AVES DE CORRAL Y OTROS ANIMALES RESISTENTES A ENFERMEDAD VIRAL CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere al uso de tecnología de interferencia de ARN para crear animales que son resistentes a infecciones virales.

ANTECENDENTES DE LA INVENCION Los centros para control de enfermedad (CDC, por su siglas en inglés) y la Organización Mundial de la Salud reportan que la cepa H5N1 del virus de influenza aviar altamente letal se ha reportado en más de 47 países extendida a través de al menos 3 continentes. Ver, por ejemplo, <http://www.cdc.gov/flu/avian/outbreaks/current.htm>. La influenza es una infección causada por el virus de influenza (gripa) . Este virus de influenza se presenta naturalmente entre los pájaros. Los pájaros salvajes a nivel mundial portan los virus en sus intestinos y usualmente son asintomático. Sin embargo, la influenza aviar es muy contagiosa entre los pájaros y puede hacer a algunos pájaros domesticados, incluyendo pollos, patos y pavos muy enfermos y causarles la muerte. Los pájaros infectados portan el virus de la influenza en su saliva, secreciones nasales, y heces. Los pájaros Ref. : 186654 susceptibles se infectan cuando están en contacto con secreciones o excreciones contaminadas o con superficies que se contaminaron con secreciones o excreciones de pájaros infectados. Los pájaros domesticados pueden infectarse con el virus de influenza aviar a través del contacto directo con aves acuáticas infectadas u otras aves de corral infectadas, o a través del contacto con superficies (tales como excremento o jaula) o materiales (tales como agua o alimento) que han estado contaminados con el virus . La infección con el virus de influenza aviar en aves de corral domesticas causan dos de las principales formas de enfermedad que se distinguen por sus extremos de virulencia bajos y altos. La forma "patogénica inferior" puede ser no detectada y usualmente solo causa síntomas suaves (tales como plumas erizadas y una caída en la producción de huevos) . Sin embargo, la forma altamente patogénica se extiende más rápidamente a través de bandadas de aves de corral . Esta forma puede causar la enfermedad que afecta órganos internos múltiples y tiene una relación de mortalidad que puede alcanzar 90-100% frecuentemente dentro de 48 horas. De esta manera, el potencial para una pérdida económica enorme para granjas de aves de corral podría reducirse dramáticamente si hubieran métodos para crear aves de corral resistentes a la gripe aviar. Estas aves de corral resistente al virus se procrearían para crear una nueva especie de aves de corral que pasarían esta resistencia viral de generación a generación. El mercado global de aves de corral se estima que produce mas de 50 mil millones de cabezas de aves de corral por año. De esta manera, aún más importante, la capacidad para crear animales resistente a los virus, tales como aves de corral, podría prevenir la expansión del virus de "gripe aviar" temido para humanos, evitando de esta manera una pandemia de gripe aviar en humanos . Otros tipos de enfermedades virales existentes son también problemáticas para la industria de aves de corral. La enfermedad de Marek, por ejemplo, frecuentemente causa una pérdida por muerte severa en bandadas de pollos y es una causa principal de condenas en plantas procesadoras de pollos tiernos. La enfermedad de Marek es una enfermedad linfoproliferativa causa por el virus MD (MDV) que pertenece a la familia del virus de herpes, y es un problema mayor para la industria de aves de corral durante los últimos 50 años. Se reconocen tres serotipos de cepas MDV. Todas las cepas oncogénicas se clasifican como serotipo 1 (MDV-1) mientras que las cepas de pollo naturalmente no oncogénico y el virus del herpes de pavos (HTV) pertenecen a los serotipos 2 (MDV-2) y 3, respectivamente. Las pérdidas económicas anules debido a la enfermedad de Marek a través del mundo se estiman que están en el rango de mil millones de dólares americanos anualmente a pesar de grandes campañas de vacunación. No obstante que las campañas de vacunación han reducido el número de bandadas afectadas a través del mundo, hay un gran número de brotes de enfermedad en la mayor parte del mundo, que llama a mejores métodos para controlar la enfermedad. Hay números limitados de enfermedades virales que pueden tratarse exitosamente. Actualmente, la vacunación es el único método usado para combatir enfermedades virales en animales. En muchos casos, particularmente en enfermedades virales de ganado, este enfoque no aplica debido a la incapacidad para producir vacunas altamente eficaces. Otra razón para la no efectividad de algunas vacunas es la alta relación de mutación, que resulta en la inacción antigénica o pérdida de la efectividad de la vacuna. Una vez que la vacuna a perdido su efectividad, la enfermedad puede emerger y ser capaz de infligir grandes pérdidas económicas en el caso de enfermedades virales de aves de corral y ganado. Hay dos formas clásicas de vacuna; una es la vacuna viva atenuada, que es la más potente debido a que induce las armas tanto humorales como celulares del sistema inmune. La desventaja de este tipo de vacuna es el riesgo de reaparición de mutantes de escape altamente virulentos. Por esta razón, muchos países son renuentes a aprobar el uso de este tipo de vacunas. El segundo tipo es la vacuna viral inactivada, que es en muchos casos menos efectiva ya que sólo induce el sistema humoral. En los últimos años, varios tipos de vacunas recombinantes tales como vacunas de subunidad y vacunas de ADN se han desarrollado. Desafortunadamente, la mayoría de estas no está en amplio uso. Una de las desventajas de la vacunación es el alto gasto económico anual como se demuestra en el caso de la enfermedad Marek. De conformidad con la Organización Mundial para la Salud Animal (OIE) , el número total de animales que se han vacunado contra la enfermedad de Marek en el 2002 fue 2.457 mil millones. Ver, por ejemplo, <www. oie . com> . Hay dos formas conocidas para vacunar. El primer método es una forma libre de células (liofilizada) que consiste de alrededor de $3/1000 unidades. La segunda forma es una forma asociada con la célula ("húmeda") que consiste de alrededor de $8/1000 unidad. El gasto mundial estimado en la vacunación para la enfermedad de Marek en el 2002 fue de aproximadamente entre $7.4 mil millones hasta $19.7 mil millones. Desde el inicio de la década de 1970, la mayoría de los pollos se había vacunado contra MD usando cepas del serotipo 1 atenuadas o HVT. Comenzando en 1983, las combinaciones bivalentes y polivalentes se usaron para proteger contra las cepas de campo mas virulentas. No obstante que la vacunación es remarcablemente efectiva en pollos protegidos, MD se mantiene alta en la lista de prioridades de enfermedad. La principal razón para la alta prioridad es la continua evolución de las cepas MDV hacia virulencia incrementada que causa rupturas de la vacuna. En consecuencia, hay una necesidad para un método de prevenir o disminuir la transmisión de enfermedades virales en animales, por ejemplo, en influenza aviar y enfermedad Marek en aves de corral . Dado los actuales brotes de virus de influenza aviar, existe una fuerte necesidad para métodos que puedan crear animales genéticamente modificados, tales como aves de corral, que sean resistentes a las infecciones virales, tal como la influenza aviar. En la década pasada, un nuevo enfoque para la inactivación de genes por medio del silenciado de genes, llamada "interferencia de ARN" (ARNi) se ha descrito. Ver, por ejemplo, FIRE et al., Na ture 391: 806-811(1998) y patente E.U.A. 6,506,559. La interferencia de ARN se refiere a un evento que se presenta cuando un polinucleótido de ARN actúa a través del proceso celular endógeno para suprimir específicamente la expresión de un gen cuya secuencia corresponde a la del ARN. El silenciado del gen objetivo se presenta durante la degradación del mARN por ARN de hebra doble (ds) por el animal hospedero, algunas veces a través de la digestión de endonucleasa AR?asa III. La digestión resulta en moléculas que son de alrededor de 21 hasta 23 nucleótidos (o bases) en longitud (o tamaño) no obstante que el tamaño molecular puede ser tan grande como 30 bases.

Estas especies de ARN corto median la degradación de mensajes y transcriptos de ARN correspondientes, posiblemente por medio de un complejo AR?i nucleasa, llamado el complejo silenciador inducido por AR? (RISC) , que auxilia a los dsAR? pequeños a reconocer mAR? complementarios a través de las interacciones emparejadas por bases. Después de la interacción del siAR? con su substrato, el mAR? se direcciona para la degradación quizá por las encimas que se presentan en el RISC. Este tipo de mecanismos parece ser útil a los organismos para inhibir infecciones virales, salto de transposon, y fenómenos similares, y para regular la expresión de genes endógenos. La actividad de AR?i está bien documentada en plantas, insectos, nematodos y vertebrados entre otros organismos. Para información de respaldo general, ver por ejemplo, Schutz et al., Virology 344(1): 151-7 (2006); Leonard et al., Gene Ther . 13(6): 532-40 (2006); Colbere-Garapin et al., Mi crobes Infect . 7(4): 767-75 (2005); Wall, Theriogenology 57 (1) : 189-201 (2002); El-Bashir, et al., Na ture 411: 494-498 (2001); Fire, A., et al., Science 391: 806-811 (1998); Gitlin, et al. Na ture 418: 430-434 (2002); Gitlin, et al., J. Virol . 79:1027-1035 (2005); Kahana, et al., J. Gen Virol . 85, 3213-3217 (2004); Kronke et al., J. Virol . 78:3436-3446 (2004); Leonard et al., J. Virol . 79:1645-1654 (2005); y Yokota, et al., EMBO Rep . 4:602-608 (2003) .

Dado el problema extendido de varias enfermedades virales en animales, aves de corral en particular, un enfoque diferente para controlar efectivamente las enfermedades virales de aves de corral y ganado sería muy benéfico para solucionar este problema. Como tal, la invención descrita en la presente proporciona una solución a este problema al proporcionar métodos para crear vertebrados no humanos transgénicos, por ejemplo, aves de corral y ganado que portan y expresan moléculas direccionadas para bloquear funciones virales importantes que inhiben significativamente la replicación de virus patogénicos así como las aves de corral y ganado genéticamente modificadas, por sí mismas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La invención proporciona células reproductoras que codifican siARN que direccional secuencias virales y métodos para obtener las mismas . La invención también proporciona vertebrados no humanos que son resistentes a la infección viral y métodos para obtener los mismos . En un aspecto, la invención es una célula reproductora de un vertebrado no humano que contiene un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada del genoma viral, en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor. En una modalidad, el constructo comprende secuencias que codifican siARN múltiples al genoma viral. En otra modalidad, las células contienen constructos múltiples que comprenden una secuencia que codifica siARN múltiples a regiones conservadas del genoma viral, en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor. En otra modalidad, el vertebrado es un mamífero no humano. En otra modalidad el virus es un virus de glosopeda (FMDV, por sus siglas en inglés) . En otra modalidad, la secuencia conservada se selecciona del grupo que consiste de SEQ IN NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, el vertebrado es de una especie aviar. En otra modalidad, el virus es virus de influenza aviar. En otra modalidad, la secuencia conservada se selecciona del grupo que consiste de las secuencias en las Figuras 1-16. En otra modalidad, el virus es virus de enfermedad Marek (MDV) . En otra modalidad, la célula reproductora es esperma. En otro aspecto, la invención proporciona un vertebrado no humano que es resistente a una enfermedad viral, en donde la mayoría de las células en el vertebrado comprenden una secuencia que codifica un siARN a una región conservada de un genoma de un virus que causa la enfermedad, en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor. En una modalidad el constructo comprende secuencias que codifican siAR? múltiples a regiones conservadas del genoma viral. En otra modalidad, la célula contiene múltiples constructos que comprenden una secuencia que codifica siARn múltiples a regiones conservadas del genoma viral. En otra modalidad, el vertebrado es un mamífero no humano. En otra modalidad, la enfermedad viral es FMDV. En otra modalidad, la secuencia conservada se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO : 3. En otra modalidad, el vertebrado es de una especie aviar. En otra modalidad, el virus es virus de influenza aviar. En otra modalidad, la secuencia conservada se seleccionada del grupo que consiste de las secuencias en las Figuras 1-16. En otra modalidad, el virus es MDV. En otro aspecto, la invención proporciona un método para generar una célula reproductora de un vertebrado no humano que comprende incubar la célula reproductora con un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada o un genoma viral en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor bajo condiciones que causan que el constructo se tome en las células. En una modalidad, el constructo se integra en el genoma de la célula hospedera. En otro aspecto, la invención proporciona un método para general un vertebrado no humano que es resistente a una enfermedad viral que comprende (a) incubar la célula reproductora con un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada o un genoma viral en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor bajo condiciones que forman una célula diploide; y (b) incubar la célula diploide de (a) bajo condiciones que forman un vertebrado no humano .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1-8 muestran las secuencias H5N1 de la influenza aviar que pueden usarse para el genoma 7 de esta cepa de influenza aviar. Las Figuras 9-12 muestran las secuencias H5N1 de influenza aviar que pueden usarse para el genoma 1 de esta cepa de influenza aviar. Las Figuras 13-16 muestran las secuencias H5N1 de influenza aviar que pueden usarse para el genoma 5 de esta cepa de influenza aviar.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona animales que son resistentes a infecciones virales y métodos para crear estos tipos de animales transgénicos. Los genes virales objetivo se silencian en presencia de moléculas silenciadoras, tales como moléculas siARN descritas en la presente, y de esta manera, no serán capaces de realizar su papel en el ciclo de vida viral. El resultado de este proceso será un bloqueo importante de la replicación del virus que lleva a la incapacidad de la infección para inducir la morbidad y/o mortalidad en estos animales. De esta manera, esta invención tendrá un efecto económico substancial para los granjeros así como para la sociedad como un suministro constante seguro completo de carne y otros productos del ganado. La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la habilidad del arte. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tal como, Molecular Cloning: A Labora tory Manual , segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Síntesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Cul ture (R.I. Freshney), ed. , 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimen tal Immunology (D.M. Weir & C.C.

Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Curren t Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction , (Mullís et al., eds., 1994); Curren t Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) y Short Protocols in Molecular Biology (Woley and Sons, 1999) . Todas las referencias, patentes, y solicitudes de patentes citadas en esta solicitud de patente se incorporan en la presente para referencia, cada una en su respectiva totalidad para todos sus propósitos.

Definiciones Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen los significados comúnmente usados en la técnica salvo que se especifique de otra manera. Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados. Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" , usados intercambiablemente en la presente, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen un ADN de hebra doble, sencilla o triple, ADN genómico, cADN, ARN, híbrido AD?-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases naturales, modificadas químicamente, bioquímicamente, no naturales o derivadas de nucleótido. Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de polinucleótido en cuyo inicio y relación de transcripción están controlados. Esta puede contener elementos genéticos en las cuales las proteínas y moléculas reguladoras pueden enlazarse tal como polimerasa de AR? y otros factores de transcripción. Los promotores pueden ser constitutivos, inducidos, represores, o específicos de tejido, por ejemplo. Las frases "ligado operable", "colocado operativamente", "ligado operativamente", "bajo control", y "bajo control transcripcional" significan que el promotor esta en una ubicación y/u orientación funcional correcta con relación a la secuencia de ácido nucleótido para el inicio y/o expresión transcripcional de control de tal secuencia. Un promotor puede o no usarse en conjunto con un "aumentador", que se refiere a una secuencia reguladora de cis-actina involucrada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleótido. Un promotor puede regular la expresión de uno o mas genes.

ARNi Objetivo La invención proporciona métodos para genes silenciadores de tal manera que animales viralmente resistentes pueden producirse. En una modalidad, la invención usa tecnología silenciadora de genes, tal como ARNi, asociadas con la lipofección para crear aves de corral y ganado transgénico internamente inmune. En una modalidad preferida, la invención usa la Integración Mediada por Enzima de Restricción ("REMI"), como se describe por ejemplo, en W099/42569, para crear animales viralmente resistentes. Los animales portarán y expresarán una molécula silenciadora de genes sencilla o múltiple direccionada a genes virales (por ejemplo, genes virales indispensables de replicación) . El ARN de interferencia corta ("siARN") proporcionado por la presente invención permite la modulación y/o el alivio de la expresión del gen objetivo cuando tal gen se presenta y es capaz de la expresión dentro de una célula. La modulación de la expresión puede ser parcial, más preferiblemente una inhibición completa, de la función del gen, o aún la sobreregulación de otro, los genes objetivos secundarios o el aumento de la expresión de tales genes en respuesta a la inhibición del gen objetivo primario. El alivio de la expresión del gen puede incluir la supresión o inhibición parcial o completa de la función del gen, procesamiento o traducción del transcripto del transcripto. En el contexto de interferencia de ARN, la modulación de la expresión del gen se piensa que procede a través de un complejo de proteínas y AR?, específicamente incluyendo dsAR?, pequeño, que puede actuar como un ARN "guía" . El siAR?, por lo tanto, se piensa que es efectivo cuando su secuencia de nucleótido corresponde suficientemente a al menos parte de la secuencia de nucleótido del gen objetivo. ?o obstante que la presente invención no se limita por esta hipótesis mecánica, se prefiere altamente que la secuencia de nucleótidos en el siAR? sea substancialmente idéntica a al menos una porción de la secuencia de la secuencia de gen objetivo. En una modalidad, la identidad de secuencia entre el nucleótido viral objetivo y el siAR? es 100%, esto es, homología exacta. En otra modalidad, hay una diferencia de 1 par base (pb) . En otra modalidad, hay una diferencia de 2 pares bases. En otra modalidad, hay una diferencia de 3 pares bases. Un "gen objetivo" o "secuencia objetivo" significa generalmente un polinucleótido que comprende una región que codifica un producto de gen, tal como un polipéptido, o una región de polinucleótido que regula la replicación, transcripción o traducción u otros procesos importantes para la expresión del polipéptido, o un polinucleótido que comprende tanto una región que codifica un polipéptido como una región ligada operablemente a este que regula la expresión. La secuencia objetivo no tiene necesariamente que codificarse para el producto de gen completo. En el contexto de la invención, "ligado operablemente" se refiere a un promotor que está en una ubicación funcional correcta y/u orientación con relación a una secuencia de polinucleótido para el inicio y/o expresión de control de tal secuencia. En otro aspecto, los genes objetivos para el siARN son genes virales. En una modalidad los genes virales son aquellos involucrados en la propagación de la enfermedad viral aviares (por ejemplo, influenza aviar y enfermedad de Mark) . La secuencia de genes que se abarcan dentro del alcance de esta invención incluyen aquellas mostradas en las Figuras 1-16. El siAR? es de una longitud suficiente para bloquear significativamente la replicación del virus pero no para causar la destrucción celular y usualmente están en el rango de entre alrededor de 19 pares bases hasta alrededor de 27 pares bases. En una modalidad, el siARN es de 21 pb de longitud. En otra modalidad, el siARN es de 22 pb en longitud. Aún en otras modalidades, los siARN son de alrededor de 19, 20, 23, 24, 25, 26 ó 27 de pb de longitud. Aun en otra modalidad, los siARN son de alrededor de 28, 29 ó 30 pb de longitud. Será aparente para alguien de experiencia en el arte que la longitud del siARN no será muy larga debido a que dispara un tipo de mecanismo de autodestrucción para la célula en el cual el siARN reside. Por ejemplo, Elbashir et al., enseña que una longitud de 21 pb de longitud es efectiva para evadir los mecanismos antivirales de la célula, tal como la respuesta al interferon (ver Elbashir et al., Na ture 411: 494-498 (2001) ) . Como se muestra en las Figuras 1-16, pueden usarse varias longitudes como AR? de interferencia. Una modalidad preferida es de 21 pb de longitud. Alguien de experiencia en el arte puede usar las secuencias descritas en las Figuras 1-16 y mover en etapas hacia abajo la secuencia un par base al tiempo que avanza con un siAR? de 21 pb diferente. Algunas de las permutaciones se muestran en estas figuras. Sin embargo, no todas las secuencias de siAR? de 21 pb posibles se muestran debido a que una vez que se ha mostrado la secuencia general, como se da en las Figuras 1-16, sería de rutina para alguien de experiencia en el arte moverse en etapas hacia abajo la secuencias. Además, las longitudes diferentes a 21 pb también se abarcan dentro de esta invención. Como se discute arriba, en una modalidad, los siARN son de alrededor de 21 pb hasta alrededor de 27 pb en longitud. Un técnico experto usaría las secuencias descritas en las Figuras 1-16 y usando la longitud deseada y moviendo hacia abajo la secuencia un pb al tiempo de general una estructura diferente. Por ejemplo, si se hará un ARN de 23 pb, entonces el técnico experto iniciaría en un extremo de la secuencia y usa los primeros 23 pb como una permutación de un siARN. Entonces, se movería un par base hacia debajo de la secuencia y los siguientes 23 pares base para la siguiente permutación y así consecutivamente. Los datos de secuencia, ya sea determinados experimentalmente o accesibles de bancos de datos públicos pueden separarse por exclusión por herramientas bioinformáticas . El análisis de homología se realiza al usar programas públicamente disponibles o comercialmente disponibles (por ejemplo, programas PILEUP y PRET en el paquete GCG) . Las búsquedas de homología se conducen opcionalmente con secuencias públicamente disponibles (por ejemplo, Genbank) usando los programas PILEUP y PRET o el programa FASTA (Pearson et al., PNAS 85: 2444-2448 (1988)).

Las secuencias de genes virales, especialmente aquellas que afectan la salud y seguridad de los animales, se contemplan como genes objetivo en esta invención. Las secuencias virales ideales que sirven como objetivo son aquellas que son altamente conservadas. El alto grado de conservación generalmente es una indicación de presión selectiva que no muta más allá de la secuencia conservada. Para muchos virus, los genes no estructurales tienden a ser más altamente conservados a través de sus serotipos diversos y por lo tanto, son buenos objetivos para la tecnología de ARNi. Otros genes virales que también son buenos objetivos son aquellos genes que son importantes o esenciales para la replicación viral y la propagación posterior. En un aspecto, el gen estructural (S) del virus Akabane se usa para crear el siARN. En otros aspectos, las secuencias objetivo son estiramientos cortos de secuencia que se conservan a través de diferentes cepas de la influenza aviar. En otra modalidad, la secuencia usada para el siARN es del genoma 1 de la cepa H5?1 del virus de influenza aviar. Los ejemplos no limitantes de estos se muestran en las Figuras 9-12. Los nucleótidos en letras negritas indican donde se detectan diferencias en par base cuando se conduce un análisis de homología. En otra modalidad, la secuencia objetivo usada para el siAR? es del genoma 5 de la cepa H5?1 del virus de influenza aviar. Los ejemplos no limitantes de estos se muestran en las Figuras 13-16. En otra modalidad, la secuencia objetivo usada para el siARN es del genoma 7 de la cepa H5N1 del virus de influenza aviar. Los ejemplo no limitantes de esto se muestra en las Figuras 1-8. En otras modalidades, la secuencia objetivo es de otros tipos de genoma de H5N1. Adicionalmente, el siARN para combatir otras cepas de influenza aviar (por ejemplo, H5?2 , H5?3 , etc.) también se abarcan dentro del alcance de esta invención y pueden hacerse por un técnico experto siguiendo las enseñanzas en la presente. En otro aspecto, los estiramientos conservados del virus de glosopeda (FMDV) se usan como secuencia objetivo para construir el siAR?. Aún en otros aspectos, una lista no limitante en los virus que causan las siguientes enfermedades se usan como secuencias objetivo para la construcción de siARN : enfermedad de ?ewcastle, fiebre del West ?ile, viruela aviar, bronquitis infecciosa aviar, encefalomielitis aviar, leucosis aviar, virus de hepatitis del pato, virus de enteritis del pato, enfermedad de la piel deforme, rinotraqueitis bovina infecciosa, diarrea por virus de bovino, leucosis de bovino, fiebre Rift Valley, peste bovina, Bluetongue, Peste des petits de rumiantes (PPR) , viruela de ovejas y viruela de cabras, dermatitis pustular contagiosa (ectima) , enfermedad de frontera, Medai-visna, gastroenteritis transmisible (TGE) , influenza equina, enfermedad de caballos Africana, encefalomielitis equina de Venezuela, y viremia primaveral de carpas.

Constructos que codifican siARN Los constructos que codifican siARN involucran varios componentes, incluyendo pero no limitados a promotores y secuencias que "guían" el siARN al objetivo correcto en la célula. Los promotores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, promotores de polimerasa II de ARN y polimerasa III de ARN. Los promotores de pol III ARN trabajan especialmente bien como promotores para la construcción de siARN. Los ejemplos no limitantes de promotores (tanto pol II como pol III) que pueden usarse incluyen: ARN 5S ribosomal (r) , U6 de ratón, U6 de humano, Hl de ratón, Hl de humano, promotor del citomagalovirus, ubiquitina C de pollo, promotor 7SK humano, promotor U6 de bovino, promotor U6 de pollo, gen de proteína fosforilada (pp38) del virus de enfermedad de Marek de 38kd, mARN de pollo 1.8-kb, promotor PRL de humano, beta actina de bovino, de pollo, promotores de genes SPATA4 de pollo, promotor Poli de pollo, gen USl del promotor del virus de la enfermedad de Marek, subunidad pequeña del virus de enfermedad de Marek del gen de reductasa de ribonucleótido, leucemia aviar y virus LTR de sarcoma, RSV-LTR, promotores del poxvirus sintético, promotor Pll del virus de vacuna, P174 y P190 del virus de vacuna, promotor temprano/tardío de la viruela aviar P.E/L, promotor de timidina cinasa del virus de viruela aviar, promotor p7.5 de vacuna, y promotor de PFL1 de viruela aviar. Usando técnicas de biología molecular estándar, estos promotores se ligan operablemente a la secuencias que direccionan genes virales y los silencian. Un promotor puede regular la expresión de una o más secuencias objetivo. Los promotores y secuencias objetivo se clonan en vectores de expresión o clonación estándar. Como se usa en la presente, "vector" se refiere a moléculas de ácido nucleico que son capaces de administrar otras secuencias de ácido nucleico a las células. Los vectores pueden derivarse de plásmidos, bacteriófagos, plantas u otros virus de animales. Los constructos de siARN se hacen de tal manera que son capaces de expresar el siARN. El técnico experto apreciará que ciertos tipos de promotores regulan la expresión de siARN mejor en algunos vertebrados que en otros vertebrados, dependiendo de la fisiología del vertebrado y deberá tomar etapas para usar el promotor que es mejor apropiado paira tal vertebrado. Un promotor también puede regular la expresión de uno o más siARN. Un vector puede contener secuencias que codifican uno o más siARN . Los aumentadores, marcadores seleccionables y otras herramientas moleculares estándar también pueden usarse para facilitar la manipulación molecular. Cuando se usa la técnica REMI el vector deberá construirse de tal manera que facilite el uso de la técnica REMI . La guía apropiada para tal técnica se encuentra en WO 99/42569. En un aspecto de la invención, un vector puede usarse con varios genes de siARN que corresponde a diferentes objetivos en el genoma viral. Este tipo de construcción de vector seguro es importante para la inhibición completa previo al desdoblamiento simultáneo en varios sitios. Además, todavía será activo aún sí una de las secuencias objetivo virales muta o cambia. Para el siARN de hebra doble, es posible tener la colgadura de 2 pb estándar, así como la colgadura de 1 pb o sin colgadura en todo.

Construcción de Células Reproductoras Como se usa en la presente, una "célula reproductora" se define como células de esperma y huevo y sus precursores. Las células reproductoras o haploide y sólo tiene un conjunto de cromosomas mientras que otras células no reproductoras tienen dos conjuntos de cromosomas. La presente invención proporciona la construcción de una célula reproductora de un vertebrado no humano que contiene un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada del genoma viral, en donde la secuencia se liga operablemente al promotor. La célula reproductora puede contener un constructo que comprende secuencias que codifican siARN múltiples al genoma viral. Los ejemplos de secuencias virales que pueden usarse se describen supra . En una modalidad, la secuencia de virus es un virus de glosopeda (FDMV) . En otra modalidad la secuencia de virus es virus de influenza aviar. La invención proporciona un método para generar una célula reproductora de un vertebrado no humano en donde la célula reproductora contiene un constructo que contiene una secuencia que codifica un siARN a una región conservada del genoma viral. Para practicar el método de la invención, alguien experto en el arte incubaría la célula reproductora con un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada o un genoma viral en donde la secuencia se liga operablemente u un promotor bajo condiciones que causan que en constructo se tome en la célula. En una modalidad, el constructo se integra en el genoma de la célula reproductora usando la tecnología REMI . En un aspecto, la célula reproductora contiene múltiples constructos que comprende una secuencia que codifica siARN múltiples a regiones conservadas del genoma viral, en donde las secuencia se liga operablemente a un promotor. En otra modalidad, la célula reproductora de un vertebrado no humano es un mamífero no humano. Los ejemplos no limitantes de vertebrados no humanos incluyen pollos, patos, gansos, aves domésticas, ganado, vacas, cerdos, peces, ovejas, cabras y caballos. En otra modalidad, el vertebrado es de una especie aviar. En otro aspecto, la célula reproductora contiene un vector que contiene varios genes bajo el control de diferentes promotores. En una modalidad, la célula reproductora contiene un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN que se direcciona para el virus de glosopeda (FMDV) . Los ejemplos de tales secuencias objetivos son: i) 5'-CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-3' (SEQ ID N0:1) en 4900-4922 nt , localizada en la región 3B; (ii) 5'-GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3' (SEQ ID NO: 3) en 6934-6992 nt , localizada en la región 3D; y (iii) 5' -GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-3' (SEQ ID NO:3) en 6892-6917 nt , localizada en la región 3D. Todas las posiciones se refieren a la secuencia 01 (G) del serotipo FMDV (número de acceso al GenBank AF189157) . En un aspecto, la célula reproductora contiene un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN que direcciona la influenza aviar. En modalidades de este aspecto, la célula reproductora contiene un constructo en donde la secuencia conservada se selecciona de cualesquiera de las secuencias descritas en las Figuras 1-16. En otro aspecto, la célula reproductora contiene un constructo que contiene una secuencia que codifica un siARN que direcciona el virus de la enfermedad de Marek (MDV) . En cualesquiera de los anteriores, las célula reproductora es esperma.

Construcción de células reproductoras transgenicos Los constructos como se describe arriba se introducen en células animales usando cualquier número de técnicas estándar, por ejemplo, lipofección. Sin embargo, algunas de las técnicas más viejas, tales como lipofectina, proporcionan una relación de éxito muy baja. Los inventores han encontrado que una forma superior de generar la introducción exitosa de estos constructos que codifican el siARN es usar la integración mediada por enzima de restricción ("REMI"), como se enseña en WO 99/42569. En consecuencia, en una modalidad, un polinucleótido que codifica el siAR? se introducen las células reproductoras animales (por ejemplo, espermas) usando REMI . Los animales que resultan del uso de estas células reproductoras se vuelven resistentes a las enfermedades . Estos animales transgénicos pueden procrearse para crear un inventario completo de animales resistentes al virus. En el caso de aves de corral, los virus que direcionan el siAR? incluyen pero no se limitan a, enfermedad de Marek, gumboro, e influenza aviar. El número de siARN introducido en una célula animal (por ejemplo, célula reproductora) puede variar. En una modalidad, se introduce un constructo de siAR?. En otra modalidad, se introduce uno o más siARN. Un técnico experto apreciará que pueden introducirse diferentes combinaciones de siARN con base en la enfermedad viral a direccionarse . La invención proporciona la generación de un vertebrado no humano que es resistente a una enfermedad viral, en donde la mayoría de las células en el vertebrado comprenden una secuencia que codifica un siARN a una región conservada de un genoma de un virus que causa la enfermedad, en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor. Los ejemplos de secuencias virales se discuten supra . En una modalidad, el constructo comprende secuencias que codifican siARN múltiples a regiones conservadas del genoma viral. En otra modalidad las células contienen múltiples constructos que comprenden una secuencia que codifica múltiples siAR? a regiones conservadas del genoma viral. En otra modalidad, el vertebrado no humano es un mamífero no humano. En una modalidad, la mayoría de las células en el vertebrado no humano contienen un constructo que comprende una secuencia que codifica un siAR? que direcciona el virus de glosopeda (FMDV) . Los ejemplos de tales secuencias Objetivos son: i). 5' -CCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGC-3' (SEQ ID ?0:1) en 4900-4922 nt , localizada en la región 3B; (ii) 5'-GAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGC-3' (SEQ ID ?O:2) en 6934-6992 nt, localizada en la región 3; y (iii) 5' -GACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCC-3' (SEQ ID ?O : 3 ) en 6892-6917 nt , localizada en la región 3D. Todas la posiciones se refieren a la secuencia 01 (G) del serotipo FMDV (número de acceso al GenBank AF189157) . Los ejemplo no limitantes de vertebrados no humanos incluyen pollos, patos, gansos, aves domésticas, ganado, vacas, cerdos, peces, ovejas, cabras y caballos. En otra modalidad, el vertebrado es de una especie aviar. Aún en otra modalidad, el vertebrado no humano tiene células que contienen un constructo que codifica el siARN en donde la secuencia conservada se selecciona de cualesquiera de las secuencias descritas en las Figuras 1-16. En otra modalidad, el vertebrado no humano es resistente a MDV. La invención proporciona un método para generar un vertebrado no humano que es resistente a enfermedad viral, que comprende las etapas de: (a) incubar la célula reproductora descrita supra bajo condiciones que forman una célula diploide; e (b) incubar la célula diploide de (a) bajo condiciones que forman un vertebrado no humano. La invención también contempla la generación de un vertebrado no humano resistente a enfermedades virales por medio de clonación. En tales casos, uno o más siARN se insertarían en el genoma de la célula a clonarse. Varios métodos de esta tecnología están comercialmente disponibles, por ejemplo, los protocolos de transplante nuclear de Advanced Cell Technology.

Aplicaciones La invención proporciona en la presente un método para crear aves de corral que son resistentes a enfermedades virales. Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a, enfermedad de Newcastle, fiebre de West Nile, viruela aviar, bronquitis infecciosa aviar, encrfalomielitis aviar, leucosis aviar, virus de hepatitis del pato, y virus de enterirtis del pato. La invención proporciona en la presente un método para crear ganado que es resiente a enfermedades virales. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: enfermedad de piel deforme, rinotraqueitis bovina infecciosa, virus de diarrea bovina, leucosis de bovino, fiebre Rift Valley, peste bovina, y bluetongue (o fiebre catarral) . La invención proporciona en la presente un método para crear ovejas y cabras que son resistentes a enfermedades virales. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a: Peste des poetits de rumiantes (PPR) , viruela de ovejas y viruela de cabras, dermatitis pustular contagiosa (ectima) , enfermedad fronteriza, bluetongue, Maedi-visma, y fiebre Rift Valley. La invención proporciona en la presente un método para crear caballos que son resistentes a enfermedades virales. Estas enfermedades incluyen pero no se limitan a: influenza equina, enfermedad de caballo de África, y encefalomielitis equina de Venezuela. La invención proporciona en la presente un método para crear peces que son resistentes a enfermedades virales. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a viremia primaveral de carpas . La invención puede aplicarse a cerdos para crear resistencia contra la enfermedad de fiebre porcina clásica, enfermedad de fiebre porcina del África, gastroenteritis transmisible (TGE) y glosopeda. En general, las enseñanzas en la presente pueden aplicarse generalmente a cualquier animal que es susceptible de enfermedad viral . En el caso de la gran industria de aves de corral que establece pérdidas económicas grandes sostenidas debido a la enfermedad, la solución práctica cae en la implementación de la tecnología real de siARN para crear pollos tiernos y criaderos en capas que resisten contra la influenza aviar y enfermedad de Marek, enfermedad bursal infecciosa y otros virus de aves. El uso de la invención descrita en la presente proporciona una fuente segura de aves de corral para los consumidores y la población en general ya que la expansión de los virus aviares de pájaros a humanos se detiene. Lo siguiente se proporciona para ilustrar, pero no para limitar la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Creando Animales Resistentes a la Glosopeda Se generan animales transgénicos susceptibles a la glosopeda al insertar siARN construido de secuencias virales del virus de glosopeda (FMDV) en células reproductoras de los animales. Generalmente, los animales que son susceptibles a FMDV son animales de pata hendida.

Construcción de siARN de Glosopeda Para construir el siARN, la secuencia viral objetivo se identifica primero. Una forma en que esto puede alcanzarse es realizar un análisis de homología local en secuencias FMDV de diferente cepa o serotipo e identificar los estiramientos cortos de la homología de secuencia. En una modalidad, la homología es 100%, esto es, exactamente la misma secuencia a través de todos los serotipos. En otra modalidad, una diferencia de 1 ó 2 pares base se aprecia. El análisis de homología se realiza usando programas disponibles públicamente o comercialmente disponible (por ejemplo, programas PILEUP y PRETTY en el paquete GCG) . Las búsquedas de homología se conducen opcionalmente con secuencias públicamente disponibles (por ejemplo, Genbank) usando los programas PILEUP y PRETTY o el programa FASTA (Pearson et al., PNAS 85: 2444-2448 (1988)). Una vez que se identifican estiramientos cortos de homología, los siARN se sintetizan usando servicios comercialmente disponibles. Los siARN se sintetizan en varias longitudes. Algunos siARN son de 19 pb en longitud, mientras otros son de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ó 27 bp en longitud. Cada uno de estos siARN son ya sea 100% conservados a través de los serotipos o tienen 1-2 pb de diferencia en cada siARN . Estas secuencias conservadas se ligan operablemente a al menos un promotor en un vector apropiado para administrase a una célula reproductora. Otra alternativa es el usar siAR? que ya se ha sintetizado, ver por ejemplo, el siAR? descrito en Kahana et al. J. Gen. Virol. 85: 3213-3217 (2004) . Estos constructos de siAR? se insertan entonces en las células reproductoras (por ejemplo, esperma u óvulo) de animales de pata hendida usando la técnica REMI descrita en W099/42569 para producir una célula reproductora que integra establemente el siAR?. Las células reproductoras se usan entonces para producir animales transgénicos por los métodos conocidos en el arte (por ejemplo, fertilización in vitro, inseminación artificial) para producir un animal que es resistente a la glosopeda.

Ejemplo 2 Generación de Esperma que Contiene siAR? para Virus de Akabane Una línea de esperma de un vertebrado no humano se genera al incubar el esperma con un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada el virus Akabane en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor bajo condiciones que provocan que el constructo se tome en la célula. Los ejemplos no limitantes incluyen usar una lipofectina o un mecanismo similar, cloruro de calcio, o protamina. En una alternativa, el constructo se integra establemente en el genoma de la célula hospedera usando tecnología REMI . Los siARN se diseñan de conformidad con dos criterios : regiones que portan una alta homología entre los diferentes aislados, y alta similitud de actividad silenciadora como se determina por los programas que encuentran el siARN objetivo. El uso de moléculas de siARN direccionadas hacia secuencias conservadas deberá asegurar la capacidad de estas moléculas para desdoblar la mayoría, si no todos, los virus de la misma cepa, sin tener en cuenta su origen. La segunda y más importante razón es que la conservación de la secuencia indica una presión selectiva fuerte contra el cambio. La presión selectiva debería esperarse que mantenga estas regiones objetivo sin cambio, mientras si estas cambian puede suprimir la actividad viral de las moléculas siARN .

Ejemplo 3 Generación de Esperma que Contiene siARN para el Virus de Glosopeda Una línea de esperma de un vertebrado no humano se general al incubar el esperma con un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada del virus de glosopeda en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor bajo condiciones que provocan que el constructo se tome en las células. Los ejemplos no limitantes incluyen usar lipofectina o un mecanismo similar, cloruro de calcio, o protamina. En una alternativa, el constructo se integra establemente en el genoma de la célula hospedera usando tecnología REMI .

Ejemplo 4 Generación de Esperma que Contiene siAR? para el Virus de Influenza Aviar Se genera una línea de esperma de un vertebrado no humano al incubar el esperma con un constructo que contiene una secuencia que codifica un siAR? a una región conservada del virus de la influenza aviar en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor bajo condiciones que provocan que el constructo se tome en las células. Los ejemplos no limitantes incluyen el uso de lipofectina o un mecanismo similar, cloruro de calcio, o protamina. En una alternativa, el constructo se integra establemente en el genoma de la célula hospedera usando tecnología REMI . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una célula reproductora de un vertebrado no humano que contiene un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada de un genoma viral, caracterizada porque la secuencia se liga operablemente a un promotor.
2. 2. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el constructo comprende secuencias que codifican múltiples siARN al genoma viral .
3. 3. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula contiene constructos múltiples que contienen una secuencia que codifica múltiples siARN a regiones conservadas del genoma viral, en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor .
4. 4. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 1, o la reivindicación 2, o la reivindicación 3, caracterizada porque el vertebrado es un mamífero no humano .
5. 5. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el virus es Virus de Glosopeda (FMDV) .
6. 6. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la secuencia conservada se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO : 3.
7. 7. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 1, o la reivindicación 2, o la reivindicación 3, caracterizada porque el vertebrado es de una especie aviar.
8. 8. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el virus es virus de influenza aviar.
9. 9. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia conservada se selecciona del grupo que consiste de las secuencias en las Figuras 1-16.
10. 10. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el virus es Virus de enfermedad de Marek (MDV) .
11. 11. La célula reproductora de conformidad con la reivindicación 1, o la reivindicación 2, o la reivindicación 3, o la reivindicación 4, o la reivindicación 5, o la reivindicación 6, o la reivindicación 7, o la reivindicación 8, o la reivindicación 9, o la reivindicación 10, caracterizada porque la célula reproductora es esperma.
12. 12. Un vertebrado no humano que es resistente a una enfermedad viral, caracterizado porque la mayoría de las células en el vertebrado comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada del genoma del virus que causa la enfermedad, en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor.
13. 13. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el constructo comprende secuencias que codifican múltiples siARN a regiones conservadas del genoma viral.
14. 14. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la célula contiene constructos múltiples que contienen una secuencia que codifica múltiples siARN a regiones conservadas del genoma viral.
15. 15. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 12, o la reivindicación 13, o la reivindicación 14, caracterizado porque el vertebrado es un mamífero no humano.
16. 16. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la enfermedad viral es FMDV.
17. 17. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia conservada se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO : 3.
18. 18. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 12, o la reivindicación 13, o la reivindicación 14, caracterizado porque el vertebrado es de una especie aviar.
19. 19. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el virus es virus de influenza aviar.
20. 20. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia conservada se selecciona del grupo que consiste de las secuencias en las Figuras 1-16.
21. 21. El vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el virus es MDV.
22. 22. Un método para generar una célula reproductora de un vertebrado no humano en donde la célula reproductora es de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende incubar la célula reproductora con un constructo que comprende una secuencia que codifica un siARN a una región conservada o un genoma viral en donde la secuencia se liga operablemente a un promotor bajo condiciones que provocan que el constructo se tome en la célula.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el constructo se integra en el genoma de la célula hospedera.
24. 24. Un método para generar un vertebrado no humano de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende (a) incubar la célula reproductora de conformidad con la reivindicación l, o la reivindicación 2, o la reivindicación 3, o la reivindicación 4, o la reivindicación 5, o la reivindicación 6, o la reivindicación 7, o la reivindicación 8, o la reivindicación 9, o la reivindicación 10, o la reivindicación 11 bajo condiciones que formen una célula diploide; e (b) incubar la célula diploide de (a) bajo condiciones que formen un vertebrado no humano .