CN102131526B - 载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种疱疹病毒载体，其包含编码针对靶序列的微小RNA的修饰的基因组序列。所述疱疹病毒载体可以用作或用于疫苗以预防和/或治疗疾病。

Description

载体
技术领域
本发明涉及疱疹病毒载体。具体而言，其涉及包含能够编码针对靶序列的微小RNA(miRNA)的经修饰的基因序列的疱疹病毒载体。
背景技术
在发达国家及发展中国家，由现存的和新出现的病毒引起的传染病都对人和动物的健康造成重大威胁。尽管通过使用疫苗和抗病毒药物实现了某种程度的控制，但是这样的方法仅对这些病毒中的一小部分有效。医学和分子生物学上的新进展揭示出新的方法和技术，这些方法和技术可以用在对抗传染病中。作为真核生物中一种在进化上保守且为序列特异性的基因沉默机制(Fire，A.等(1998)Nature 391，806-11)，RNA干扰(RNAi)的发现为将RNAi开发成为一种针对病原体(如病毒)的有力治疗工具铺平了道路。
RNA干扰(RNAi)是一种自然发生的细胞的基因抑制机制，其在植物和动物中都能发挥作用。保守的RNAi途径涉及将双链RNA(dsRNA)双链体加工为21-23个核苷酸(nt)的分子，称作小干扰RNA(siRNA)，以发动基因抑制(Hannon，(2002)RNA interference.Nature 418，244-51)。在哺乳动物体系中，对长dsRNA的细胞加工可以诱发干扰素(IFN)介导的抗病毒防御机制，其最终导致非特异性的翻译停止和凋亡(Stark等，(1998)Annu Rev Biochem 67，227-64，Williams，(1997)Biochem Soc Trans 25，509-13)。然而，可以通过直接转染长度高达30个核苷酸(nt)的在体外合成的siRNA来避开这种非特异性的细胞活性(Elbashir等，(2001)Nature 411，494-8)。由于这个发现，用于表达短发夹RNA(shRNA)分子的基于DNA的载体的开发取得了快速的进展，该短发夹RNA分子在细胞内得到加工以产生活性siRNA分子(Brummelkamp等，(2002)Science 296，550-3，Yu等，(2002)Proc Natl Acad Sci U S A 99，6047-52)。这样的shRNA表达载体通常以一小类RNA聚合酶III(pol III)启动子(如U6和7SK)的启动子为特征。在人类基因组中描绘了总共五组分开的U6启动子(Domitrovich&Kunkel，Nucleic Acids Res 31，2344-52(2003)，每个基因座显示出差异性的转录活性，这是一个在鸡(Kudo&Sutou(2005)J Reprod Dev 51，411-7，Wise等，(2007)Anim Biotechnol 18，153-62)和牛(Lambeth等，(2006)Anim Genet 37，369-72)中也观察到的发现。
尽管在哺乳动物细胞中最初证实的RNAi显示出对细胞转录物的抑制，但是最近已经证明siRNA和shRNA二者都在体外和体内抑制多种病毒的复制。例如，已经描述了通过RNAi有效抑制人的病原体如丙型肝炎病毒(Randall&Rice，(2004)Virus Res 102，19-25)、人免疫缺陷病毒-1(Coburn&Cullen，(2002)J Virol 76，9225-31)和甲型流感(Ge等，(2003)Proc Natl Acad Sci U S A100，2718-23)，以及家畜病毒如口蹄疫病毒(Chen等，(2004)J Virol 78，6900-7，Liu等，(2005)Virology 336，51-9)。也已经报道了RNAi用于抑制几种疱疹病毒的复制的用途，包括鼠疱疹病毒68(Jia&Sun，(2003)J Virol 77，3301-6)、EB病毒(Chang等，(2004)Gen Virol 85，1371-9)、HSV-1(Bhuyan等，(2004)JVirol 78，10276-81)、疱疹病毒-6B(Yoon等，(2004)J Biochem Mol Biol 37，383-5)、人巨细胞病毒(Wiebusch等，(2004)J Gen Virol 85，179-84)、卡波西肉瘤相关性疱疹病毒(Godfrey等，(2005)Blood 105，2510-8)、鸭疱疹病毒(Mallanna等，(2006)Virus Res 115，192-7)和HSV-2(Palliser等，(2006)Nature439，89-94)。
这些研究涉及引入合成的siRNA，或者遗传转移能够在人细胞中产生siRNA或shRNA的DNA表达盒。尽管这种方法可以使用培养物中的细胞就RNAi机制提供有价值的信息，但是其难以在体内达到同样的效果。存在与在目标细胞类型中表达所述siRNA并实现充分的和可持续的表达水平的困难。
尽管RNAi的特异和有效的本质潜在地是一种非常强力的治疗手段，但是可持续的长期靶基因敲低(knockdown)仍然是RNAi广泛的治疗性使用的障碍。通过使用使用重组病毒载体(例如，腺病毒、腺伴随病毒(AAV)和慢病毒)递送siRNA可以克服这些问题中的一些。然而，对于这些载体中的一些的安全性和因siRNA较高的表达水平而产生的RNAi途径的过饱和的顾虑还有待解决(Aagard and Rossi(2007)Adv.Drug Delivery Reviews 59，75-86)。
因此，需要一种改进的RNAi递送机制，提供RNAi在体内可持续的长期表达水平。
发明内容
本发明人已经发现可以修饰疱疹病毒的内源miRNA簇(例如，马立克病病毒(MDV))以表达针对靶基因的miRNA。由于疱疹病毒miRNA在整个疱疹病毒生命周期中高度表达，所以经修饰的miRNA的稳定高水平表达也能够实现。
在第一方面，本发明提供一种疱疹病毒载体，其包含编码针对靶序列的微小RNA(miRNA)的经修饰的基因组序列。
所述经修饰的miRNA可以为治疗性miRNA，并且所述载体可用于预防和/或治疗疾病。
所述miRNA可以针对来自传染性病原体(例如病毒)的靶序列。所述miRNA能够沉默来自所述传染性病原体的基因的表达，例如，其可以抑制传染性病原体的复制或传染性病原体造成的感染。
所述传染性病原体可以为疱疹病毒。由于疱疹病毒载体基于疱疹病毒，很有可能与传染性病原体遵循相同的感染途径并达到相同的组织。其所具有的优势是所述miRNA会在体内的正确位置处产生。
如果所述疱疹病毒载体编码针对来自病原性疱疹病毒(所述载体基于这种疱疹病毒)的靶序列的miRNA，存在额外的优点在于所述载体可以起到传统疫苗的作用，例如，减毒活疫苗，其刺激针对传染性病原体的免疫应答。
如果传染性病原体内的靶序列，或者与其具有高同一性程度的序列出现在疱疹病毒载体中，那么其可以优选修饰疱疹病毒载体使得所述miRNA不使载体自身沉默。
本发明的第一方面的疱疹病毒载体可以基于马立克病病毒(MDV)。本发明人已经证明在MDV-1中存在13个miRNA(Yao等(2008)J Virol 82：4007-15)而在MDV-2中存在17个miRNA(Yao等(2007)J.Virol 81：7164-70)，其中大部分成簇表达。例如，所述疱疹病毒载体可以包含经修饰的miR-M7序列。
本发明的第一方面的载体能够表达多个经修饰的miRNA。例如，所述载体可以包含多个经修饰的基因组序列，其每一个编码一经修饰的微小RNA。所述miRNA可以针对相同的靶基因或不同的靶基因中的靶序列。如果miRNA直接针对多个靶基因，那么它们可以是在相同的靶病原体内的基因。
在病毒(例如马立克病病毒(MDV))中，多个miRNA表达为多顺反子式miRNA转录物，促进多个经修饰的miRNA的共表达。
多个miRNA的表达特别有利于针对有逃逸倾向的病毒病原体，例如HIV。靶序列中较小的序列变化，有时候甚至为单点突变，也可以足以克服RNAi-介导的抑制，原因是RNAi精密的底物特异性。因此，如果突变发生在靶序列中，那么HIV能够避开RNAi的抑制。这种风险通过多个miRNA的同时表达大大降低，因为逃逸将理论上地涉及所有靶序列的突变。
在第二方面，本发明提供一种用于产生根据本发明的第一方面的载体的方法，其包括在编码形成pri-miRNA的茎环结构的茎的链的序列中引入一个或多个突变的步骤，所述pri-miRNA由疱疹病毒载体基因组编码。
在期望的miRNA编码序列的创建涉及多个点突变的情况下，用外源序列替代所述mi-RNA序列可能更简单。
为了确保使pre-miRNA充分地被切丁酶(dicer)切割，可以对突变进行设计从而使经修饰的pre-miRNA保留天然pre-miRNA的结构特征。
本发明第二方面的方法可以包括下列步骤：
(i)扩增疱疹病毒的基因组miRNA；
(ii)miRNA的突变；
(iii)通过BAC诱变生成突变体克隆以产生疱疹病毒载体，所述疱疹病毒载体包含经修饰的基因组序列，其能够编码针对靶序列的微小RNA(miRNA)。
在第三方面，本发明提供包含根据本发明的第一方面的疱疹病毒载体的疫苗。
本发明的载体或疫苗可以用于防止和/或治疗疾病。所述疾病可以为病毒病。例如，所述疾病可以选自下组：HIV、肝炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、马立克病、禽流感、传染性囊病、鸡贫血、新城疫、传染性支气管炎、呼肠病毒感染、传染性喉气管炎和禽痘。
或者，所述靶序列可以为任何宿主基因，其表达可以通过依赖于疱疹病毒的嗜性(tropism)以细胞类型特异性方式表达针对所述基因的经修饰的miRNA的疱疹病毒来特异性地沉默。例如，亲神经疱疹病毒(如HSV-1)能够用于沉默神经学病症中涉及的基因，或者能够使特定基因沉默的表达经修饰的miRNA的疱疹病毒能够在例如癌症的状况中用作治疗性疫苗。
附图说明
图1显示由不同疱疹病毒编码的miRNA的细节和名称。
图1A显示使用MFOLD算法预测的MDV-1 pre-miRNA的二级结构。成熟miRNA链以红色表示。
图2显示MDV-1 miRNA的基因组定位。该示意图显示在此报告图谱中鉴定的MDV-1 miRNAs在何处(小箭头)。显示TRL和IRL区在独特的长区两侧，而TRS和IRS区在独特的短区两侧。指明了包含在所述miRNA基因座中的MDV ORF的基因组位置和取向。
图3显示MDV-1 miR-6-7-8-10簇的核苷酸序列。以颜色显示各miRNA的miRNA链的序列。
图4为列出用于修饰作为针对萤光素酶基因的siRNA的MDV-1 miR-M7序列的策略的示意图。所有红色序列为天然miRNA序列，黑色序列为萤光素酶shRNA序列，而蓝色序列为互补链并且仅是为了呈现。
图4A显示使用MDV miR-6和miR-7基因座shRNA沉默萤光素酶报告基因。
图5为在经修饰的MDV-1 miRNA簇中经修饰的miRNA结构的示意图，其中miR-M8、miR-M6和miR-M7已经过修饰。
图6显示Northern印迹分析，其显示了由MDV-1编码的miRNA的表达。
图7显示Northern印迹分析，其显示了由MDV-2编码的miRNA的表达。
图8显示Northern印迹分析，其显示了由MDV的HVT菌株编码的miRNA的表达。
图9显示测量在经MDV转化的细胞中ICP4、Meq和miR-4、miR-8和miR-12转录物水平的定量RT-PCR。
发明详述
疱疹病毒载体
术语“载体”用于指示能够向靶细胞递送感兴趣的核苷酸NOI的疱疹病毒。在本发明的上下文中，所述NOI为miRNA，或者能够产生miRNA。
所述NOI可以为，例如，能够编码pre-miRNA、priMRNA序列、pre-miRNA序列或成熟miRNA的基因组序列。
所述疱疹病毒载体可以从疱疹病毒递送，所述疱疹病毒例如，MDV、HVT、HSV-1、HSV-2、VZV、EBV或CMV(见下文)。
在载体“基于”特定疱疹病毒的情况下，其指示所述载体可以从所述野生型病毒递送，但是可以经修饰，例如以降低其毒力。所述载体可以，例如，经过减毒(attenuated)(见下文)和/或修饰以提高其免疫原性或将其靶向特定组织。
所述表达经修饰的miRNA的疱疹病毒可以依赖于疱疹病毒的嗜性以细胞类型特异性方式沉默靶基因的表达。这意味着可以选择疱疹病毒(基于其细胞嗜性)以沉默感兴趣的特定细胞中靶基因的表达。
表1显示编码miRNA的疱疹病毒和它们的细胞嗜性。
表1
RNAi
存在两大类的小RNA，其为RNAi的特征：(i)第一类为小干扰RNA(siRN4)，其为21-23个碱基完全配对的双链体，该双链体同与信使RNA转录物的区域进行完美碱基配对的相互作用，通过RNA-诱导性沉默复合物(RISC)引起该区域的特异性降解(Rana，T.M.(2007)Nat Rev Mol Cell Biol 8，23-36)。使用siRNA沉默特定基因和病毒的技术和应用正在稳步进行，并且一些实验也在进行中(Aagaard，L.&Rossi，J.J.(2007)Adv Drug Deliv Rev 59，75-86；deFougerolles等(2007)Nat Rev Drug Discov 6，443-53)。这些通常由来自短发夹RNA(shRNA)表达载体的聚合酶III启动子(例如，U6、H1等)诱导。(ii)第二类为21-23个碱基的双链体的微小RNA(miRN4)，其碱基配对通常不完全，通过RISC在靶定转录物的3’非翻译区(UTR)内形成部分双链体，导致对翻译的抑制。在不同的物种中鉴定了几种miRNA(Griffiths-Jones等(2008)NucleicAcids Res 36，D154-8)。这些被认为与来自聚合酶II启动子的蛋白质编码基因类似地得到表达和调节，即首先作为长的初级转录物(pri-miRNA)(Lagos-Quintana，M.等(2002)Curr Biol 12，735-9)。所述pri-miRNA由核Drosha-DGCR8复合体切割以产生pre-miRNA，其在细胞质中被进一步加工成成熟的miRNA双链体。许多这些miRNA的表达受限于特定细胞谱系和发育阶段，且最近的数据提示它们在多种状况和疾病(包括癌症)中对基因调节显示显著的影响(Skaftnesmo等(2007)Curr Pharm Biotechnol 8，320-5)。
miRNA
最先发现的病毒编码的miRNA是在EBV基因组中制备的(Pfeffer，S.等(2004)Science 304，734-6)。自此之后，鉴定了几种病毒编码miRNA(Pfeffer，S.等(2005)Nat Methods 2，269-76；Cullen，B.R.(2006)Nat Genet 38 Suppl，S25-30；Nair，V.&Zavolan，M.(2006)Trends Microbiol 14，169-75)，其中疱疹病毒几乎占到miRBase中病毒编码的miRNA的全部(124/127)。本发明人已经报告鉴定了马立克病病毒(MDV)、α疱疹病毒(属于的疱疹病毒科(familyHerpesviridae)Mardivirus属)的几种新miRNA。这些包括MDV-1中的13种miRNA(Yao，Y.等(2008)J Virol 82，4007-15)、MDV-2中的17种(Yao，Y.等(2007)J Virol 81，7164-70)和HVT中的11种(未发表)。大多数的这些miRNA作为簇表达，并且这些miRNA的基因组结构在图1中给出。这些miRNA中的大多数在受感染的细胞/组织中以非常高的水平表达，如Northern印迹(图6、7和8)和qPCR分析(图9)所示。
本发明人已经发现可以修饰疱疹病毒miRNA簇中内源基因在miRNA编码序列从而其表达经修饰的miRNA。这种经修饰的miRNA可与感兴趣的靶序列互补。
因此，在第一方面，本发明提供包含编码针对靶序列的微小RNA(miRNA)的经修饰的基因组序列的疱疹病毒载体。
术语“修饰的/经修饰的”用于表示包含一个或多个突变的基因组miRNA编码序列，使得其产生不同于未经突变的基因组序列本会产生的miRNA序列的经修饰的miRNA。所述基因组miRNA编码序列为内源性的，意思是其序列在修饰前天然存在于疱疹病毒基因组中。
基因组miRNA编码序列中的所述“修饰”(即突变)是在编码形成茎环结构的茎的两条链中进行的。应该在每条链的编码序列中造成对称的突变，从而在pri-miRNA中产生正确的茎环结构。
由本发明的载体产生的miRNA通常长度为20～25，例如，21～23个碱基对。
靶序列
所述靶序列可以是部分的靶基因。
在疾病为传染病的情况下，所述靶序列或靶基因可以为来自传染性病原体的靶序列或靶基因。
或者，所述靶序列或靶基因可以为表达希望得到降低或沉默的宿主基因。例如，较合意的是沉默与在变态反应或自身免疫疾病过程中产生的病原性免疫应答相关的特定基因的表达。此外，在癌症中，其可以沉默涉及异常细胞增殖的基因的表达。
疱疹病毒表达针对宿主基因的miRNA作为它们正常生物学的部分。在本发明的上下文中，在miRNA针对来自宿主基因的靶序列的情况下，所述宿主基因不同于通常所述特定miRNA沉默的基因。所述miRNA经过修饰以靶向选定的宿主基因，其通常不被该miRNA沉默。
可选地，靶序列或靶基因可以为动物模型中的感兴趣的基因。以这种方式，该技术可以用于调查使宿主基因沉默的效果，从而提供关于该基因的功能的信息。在小鼠模型中，鼠疱疹病毒MHV-68和MCMV可以用于该用途中，因为它们靶向淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞和内皮细胞，并且在这些细胞中表达高水平的miRNA。
所述靶序列为miRNA结合的序列。所述靶序列可以为RNA，特别是信使RNA(mRNA)。
在所述靶序列来自传染性病原体的情况下，所述靶序列或靶基因可以为基本序列(essential sequence)，即没有它们时所述传染性病原体无法执行基本功能，例如复制或感染宿主。如果基本靶序列的表达(即，转录或翻译)受到阻断，那么所述病原体不可存活。在MDV中，研究已经表明gB包膜糖蛋白对于MDV的复制是关键的(Schumacher等，2000)，并且可能涉及病毒传播。另一具有吸引力的候选为复制基因UL29，因为其是编码单链DNA结合蛋白的高度保守的基因，其已经证实为用于针对HSV-2进行的RNAi的优异候选者(Palliser等，2006)。
所述载体可以表达多个miRNA，每个均针对不同的靶序列。所述靶序列可以为在相同的靶基因内的或在不同的靶基因内的不同序列。在针对相同的靶基因表达两个或更多个miRNA的情况下，它们可以具有导致使靶基因沉默增强的“累加效应”。
术语“针对”指的是特异性识别靶序列的miRNA。所述miRNA具有与靶序列互补的核苷酸序列。所述miRNA通常会与靶序列100％互补。然而，与源自长dsRNA前体的siRNA不同的是，认为miRNA能够容忍一定程度的不完全碱基配对。因此，所述miRNA可以具有3个、2个或优选1个与靶序列的错配。
所述miRNA可以使靶序列或靶基因的表达沉默。将表达的miRNA并入RNA-诱导性沉默复合物(RISC)中，在该复合物中其与靶序列配对。在所述靶序列或靶基因为mRNA的情况下，所述RISC随后可以引起转录后基因沉默，其中特异碱基配对通过argonaute(RISC复合物的催化性部分)引起靶序列的降解。与这方面相关，所述靶序列可以在mRNA的3’UTR内。
或者所述RISC复合物可以替代性地或额外地通过引起基因的外遗传变化影响靶序列的转录(因此所述靶序列可为DNA序列)，例如组蛋白修饰和DNA甲基化，其影响基因转录的程度。
术语“沉默的”表示与不存在miRNA时会见到的表达相比，靶序列或靶基因的表达部分或全部降低。可以使靶基因的表达沉默，例如，至少50、60、70、80、90或95％。
一旦鉴定了靶基因，就可以使用本领域已知的技术鉴定候选miRNA序列，例如使用来自Eurogenetec的siRNA设计平台。
本发明的载体的一个优点在于所述miRNA是以与内源miRNA序列相同的方式由疱疹病毒载体基因组产生的，并且随后能够使用天然疱疹病毒基因座的调节机制沉默所述靶基因。
在天然的miRNA成熟途径中，初级miRNA(pri-miRNA)从其基因组位置转录并且由微处理器(microprocessor)复合物(包含Drosha和DGCR8)切割。所得的pre-miRNA通过转运蛋白5主动运输至细胞质，在细胞质中所述pre-miRNA经历通过切丁酶及其辅因子(PACT和TAR RNA结合蛋白TBRP)进行的进一步加工成为成熟miRNA。所述成熟miRNA随后装载到RISC复合物上。
应该设计对miRNA编码序列的修饰以保留得到Drosha、DGCR8、转运蛋白5、切丁酶及其辅助因子或RISC复合物有效识别所需的任何序列和结构特征。例如，为了确保pre-miRNA被切丁酶充分切割，故意错配可以包含在编码碱基配对的茎的两条链的序列中，其可以经修饰以模拟天然pre-miRNA的结构特征。
在本发明的上下文中，“天然”pri-miRNA、pre-miRNA或miRNA序列为在没有任何修饰的情况下会由疱疹病毒产生的序列。
疫苗
本发明还涉及疫苗。疫苗是一种用于对疾病建立免疫性的抗原性制备物。
疱疹病毒载体自身当施用给受试者时会诱导免疫应答。这种免疫应答在治疗或预防疾病中也可能是有价值的。例如，在疾病是传染病的情况下，免疫应答可能还帮助控制或消除病原体造成的感染。
本发明的第一方面的疱疹病毒载体可以基于已经作为疫苗使用的疱疹病毒。
其可以基于减毒的疱疹病毒，即已经在降低其毒力的条件下培养过的疱疹病毒。
病毒可借由通过外来宿主进行的病毒的传代来减毒，如通过组织培养或通过胚胎化的卵或活的动物进行的传代。在这些方法中，将初始病毒群体应用于外来宿主。对于感染新宿主的能力增加的任何突变体都有选择压力。这种突变体通常在原始宿主中会具有较低的毒力，但保持原始病毒诱导免疫应答的能力，使其成为引人注目的疫苗候选者。
已经发现疱疹病毒的miRNA簇在减毒的疫苗株中是保守的。
减毒活疫苗广泛用于针对许多病毒感染的免疫接种，特别是在兽医学中，如针对马立克病(见下文)。
在活疫苗接种中也可以使用不引起目标疾病的微生物，但其引起对目标疾病的保护性免疫应答的产生。Jenner在1796年的经典观察结果，即暴露于牛痘提供了针对天花的保护，就是以这种免疫应答类型为基础的。
在马立克病中，火鸡的疱疹病毒(HVT)可用于诱导会针对马立克病病毒(MDV)提供保护的免疫应答。
本发明的基于疱疹病毒的疫苗会诱导抗-载体免疫应答。在载体是以靶传染性病原体为基础或与其高度相似的情况下，这种抗-载体免疫应答可能与针对所述传染性病原体的保护直接相关。
在靶传染性病原体是与疱疹病毒载体不同的情况下(例如在所述传染性病原体是不同类型的病毒，或者甚至是非病毒病原体的情况下)，抗-载体免疫应答的非-适应性部分对病原体清除仍然是有用的。
对已建成的疫苗的修饰
病毒疫苗可以基于在疾病的治疗和/或预防中已经提出的或正在使用的已建成的(established)活疫苗。
已建成的活疫苗包括MMR疫苗，其为三种减毒活病毒的混合物，用于针对麻疹、腮腺炎和风疹的免疫。
用于治疗疱疹病毒感染的已建成的疫苗包括VarivaxTM，一种针对水痘的水痘病毒活疫苗，和用针对MD的MDV的活减毒株进行接种。活的疱疹病毒疫苗针对马疱疹病毒感染的使用已经取得了一定的成功(Patel等，(2003)Vet.Microbiology 20；92(1-2)：1-17)。
MD疫苗
在20世纪70年代，MD控制主要通过用火鸡的疱疹病毒(HVT，血清型3)进行接种来完成。这在20世纪80年代在某种程度上由血清型2疫苗的开发所取代，如SB-1和301B/1。最近，开发了血清型1疫苗，如减毒的HPRS-16和CVI988(Rispens疫苗)株。Rispens疫苗(产生自具有低致癌性的天然分离株)已经得到广泛应用，特别是由于已经发现其针对MDV病毒的强毒力株非常有效。
就本发明而言，基于原始HVT疫苗的疫苗具有一些优点。例如，与血清型1和2的病毒株不同，HVT能够在无细胞体系中产生。而且，由于HVT基因组与MDV基因组显示出相对较低程度的序列同一性(约70％)，靶向MDV基因组上位点的miRNA序列很有可能不会显著影响基于HVT的病毒疫苗的复制。
另一方面，血清型1病毒株，如Rispens疫苗诱导更有效的免疫应答，特别是针对高毒力的MDV株。本发明基于已建成的MD疫苗的抗-MD病毒具有如下优点，即其将抗-MD免疫应答的诱导作用与通过RNAi对MDV复制的抑制作用相结合。为了最大化前一作用，理想的是使用血清型1疫苗。
尽管血清型1疫苗如Rispens与HVT相比与MDV有更高的序列同一性程度，其仍然可能设计表达miRNA分子的疫苗，所述分子阻断MD的复制，而不是疫苗的。例如，一旦选择了在MDV基因上的靶序列，在疫苗基因组中的相应的序列可以进行突变以减少与MDV基因的同一性程度。这使miRNA序列不太会可能识别疫苗基因组序列。定向诱变可用于改变与靶序列具有高同一性程度的疫苗基因组的任何部分中的碱基。
为了避免对疫苗自身有任何影响的突变，可以引入沉默突变以改变DNA序列，但不影响翻译出的蛋白质的氨基酸序列。这样的突变是可能的，因为遗传密码有简并性。
疾病
本发明的经修饰的疱疹病毒载体可以用于治疗和/或预防疾病。
这里所用的‘治疗’是指为了改善、治愈或减少疾病的症状，或减少或停止疾病的进展而对患病的受试者进行的处理。
术语‘预防’意指避免、延缓、阻止或妨碍疾病的传染。例如，本发明的疫苗可以用于预防受试者中的自身免疫疾病或变态反应。
所述疾病可以是传染病，如传染性病毒病。哺乳动物受试者(如人)的传染性病毒病，包括，但不限于，AIDS、水痘(varicella)、感冒、登革热、单纯疱疹、带状疱疹(herpes roster)、流感、麻疹、传染性单核细胞增多症(腺热)、腮腺炎、Noro病毒(norovirus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病、风疹、SARS、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗河病和黄热病。
鸟类受试者(如鸡)的传染病包括，但不限于：禽流感、传染性囊病、鸡贫血、新城疫、传染性支气管炎、呼肠病毒感染、传染性喉气管炎、禽痘。
具体而言，所述疾病可由疱疹病毒引起。
疱疹病毒科包括已知八种不同的引起人类疾病的病毒，如下表所示：
在动物病毒学中，最重要的疱疹病毒可以总结如下：
●α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)
○单纯病毒属(Simplexvirus)
■牛疱疹病毒2引起牛的乳头炎和伪皱皮病。
■猕猴疱疹病毒1，也称作疱疹B病毒，引起猕猴的单纯疱疹样疾病。
■Ateline疱疹病毒1，蜘蛛猴疱疹病毒。
○水痘病毒属(Varicellovirus)
■牛疱疹病毒1在牛中引起牛的传染性的鼻气管炎、阴道炎，龟头包皮炎和流产。
■牛疱疹病毒5引起牛的脑炎。
■山羊疱疹病毒1引起山羊的结膜炎和呼吸疾病。
■猪疱疹病毒1引起伪狂犬病。
■马疱疹病毒1马的流产。
■马疱疹病毒3引起马的性交疹。
■马疱疹病毒4引起马的鼻肺炎。
■犬疱疹病毒1引起小狗的严重出血性疾病。
■猫疱疹病毒1在猫中引起猫的病毒性鼻气管炎和角膜炎。
■鸭疱疹病毒1引起鸭瘟(duck plague)。
○Mardivirus属
■原鸡属疱疹病毒2引起马立克病。
■原鸡属疱疹病毒3(GaHV-3或MDV-2)
■火鸡的疱疹病毒(HVT)
○Iltovirus属
■原鸡属疱疹病毒1引起鸟的传染性喉气管炎。
●β疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae)
○猪疱疹病毒2引起猪包含体鼻炎
●γ疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)
○Rhadino病毒属(Rhadinovirus)
■狷羚疱疹病毒1引起牛的恶性卡他热。
■牛疱疹病毒4
■马疱疹病毒2引起马的巨细胞病毒感染。
■马疱疹病毒5
或者，所述疾病可以为变态反应、自身免疫疾病、神经学病症、高血压或癌症。
基于潜在的疱疹病毒miRNA的应用列于下表2中：
受试者
所述受试者可以是哺乳动物受试者，如人。
或者，所述受试者可以是禽类受试者，例如家禽受试者，特别是鸡。
该技术也可以运用在模式动物中，如疾病的小鼠模型。
施用
递送系统的选择可根据处理的受试者的数量及种类。本发明的方法和药物组合物可用于治疗人或动物受试者。通常，医师会决定实际剂量，其对于单独的受试者会使最合适的并且其根据特定受试者的年龄、体重和相应而变化。
哺乳动物受试者
哺乳动物受试者中的施用(递送)途径可包括但不限于以下的一种或多种：口服(例如作为片剂，胶囊，或作为摄入性溶液)；局部的；粘膜(例如鼻腔喷雾或吸入式气溶胶)；经鼻；胃肠外(例如通过可注射形式)；胃肠；脊柱内；腹膜内；肌肉内；静脉内；子宫内；眼球内；皮内；颅内；气管内药；瘤内；阴道内；脑室内；脑内；皮下；眼(包括玻璃体内及前房)；经皮；直肠；口腔；阴道；硬膜外；舌下或系统性的。
施用的组合物可以任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药学载体、赋形剂或稀释剂的选择可以参考预期的施用途径和标准药学实践来选择。所述药物组合物可以包含任何合适的一种或多种粘合剂、一种或多种润滑剂、一种或多种助悬剂、一种或多种涂覆剂、一种或多种增溶剂和其它本领域已知的载体物质作为所述载体、赋形剂或稀释剂，或在所述载体、赋形剂或稀释剂之外包含它们。
疫苗通常胃肠外地、通过注射(例如，皮下或肌肉内)施用给哺乳动物受试者。
对于胃肠外施用，所述组合物最好以无菌水溶液的形式使用，该水溶液可以包含其它物质，例如足够的盐或单糖以使所述溶液与血液等渗。
禽受试者
对于数量较多的鸟类，个体施用系统可能是不实际的，所以通过喷雾施用或经由饲料或饮用水施用可能更合适。
对于数量较少的鸟类，可以单独处理每只鸟，其通常导致更均匀的剂量。单独施用方法包括滴眼液施用、鼻内施用和胃肠外递送。
根据不同的递送体系，存在不同的组合物/配制物要求。作为一个例子，本发明的组合物可以配制成通过口服途径(例如，在饮用水或饲料，或者通过喷雾应用)、通过粘膜途径、或胃肠外地递送，其中将所述组合物配制成可注射的形式，用于递送，通过，例如，静脉内、肌肉内或皮下途径。
所述组合物可以配制用于卵内或孵化后递送。
术语“卵内”指的是进入包含有生命的、发育中的胚的鸟蛋中。
术语“在卵内施用”或“卵内施用”指的是将疫苗施用至包含有生命的、发育中的胚的鸟蛋中，其通过任何穿透蛋壳并引入疫苗的手段进行。这样的施用手段包括，但不限于注射疫苗。
各种卵内施用方法在本领域内已知。注射方法可以包括如下步骤：使用适当的针在卵较大的一端在卵壳上制造一个孔以使蛋的气室暴露，插入与注射器连接的针并穿过气室的膜，然后将疫苗注射入卵。注射的位置可以在卵或胚的任何区域内。优选地，通过卵较大端的中心轴向地进行向膜内的注射。
可以使用自动卵注射系统。这种系统在本领域内已知(参见，例如，美国专利号4,681,063、4,040,388、4,469,047和4,593,646)。
用于鸟类的孵化后接种系统包括喷雾应用和通过饲料或饮用水施用。
对于喷雾应用，可以使用特别的盒(cabinet)。鸡可以在孵化处接种，因为喷雾器使得均匀分配成为可能。为装有100只鸡的每个盒递送一定量的喷雾(如20m1)。鸡“用嘴梳理”以清洁并干燥它们的羽毛并摄取疫苗。与疫苗混合的红色染料得到它们的注意并刺激它们用嘴梳理，并且也指示那些鸡盒已经接种。
通过饲料/饮用水的施用不如喷雾均匀，因为鸟的摄取之间存在差异。还存在可能的污染问题。然而，这种类型的施用对于更老的鸟是可行的(即，当孵化处应用不可行时)。
在将组合物通过胃肠粘膜以粘膜方式递送的情况下，应该能够在通过胃肠道传送的过程中保持稳定；例如，应该对蛋白水解性降解有抗性，对酸性pH稳定并对胆汁的去污作用有抗性。
方法
在第二方面，本发明提供一种根据本发明的第一方面产生载体的方法，包括在编码疱疹病毒序列的基因组miRNA中引入一个或多个突变的步骤。
为了使pri-miRNA形成茎环结构，可以在编码形成茎环结构的茎的链的序列中制造对称的突变。
该突变可以是添加、取代或缺失。单个突变即点突变可以例如通过定向诱变产生。在另一方面，如果需要制造多个突变以取得需要的序列，在外源序列中进行切除和连接可能更简单。
术语“外源/外来”表示miRNA编码序列与内源序列不同，且其产生一种不同的、异源的miRNA。
取代各个链编码序列的外源序列可包括故意错配以使经修饰的pre-miRNA模拟天然pre-miRNA的结构特征。
在一个实施方式中，本发明的方法包括如下：
(i)疱疹病毒miRNA序列的扩增；
(ii)miRNA的突变；
(iii)包含编码经修饰的miRNA的基因组序列的突变疱疹病毒载体的生成。
突变细胞株可以通过本领域已知的方法产生，如BAC诱变。
现在将通过实施例的方法进一步描述本发明，所述实施例意在提供用于帮助本领域普通技术人员实施本发明，而非意在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-对MDV1-miR-M8-13-6-7-10簇的修饰
1型马立克病病毒(MDV-1)编码簇集在所述病毒基因组的MEQ和LAT区中的13个miRNA(Yao等(2008)J.Virol 82：4007-4015)。所有13个MDVpre-miRNA的预测的二级结构显示在图1中。各个miRNA的基因组定位显示在图2中。这些包括定位在‘a-样(a-like)’序列和LAT的大内含子内的ICP4之间的MDV1-miR-M8-13-6-7-10簇。在由该簇编码的五种miRNA中，miR-M13和miR-M10以非常低的水平表达。带有miRNA序列的所述簇的完整序列显示在图3中。
簇区通过PCR扩增并克隆入载体内以有助于操作。将MDV-1 miR-M7微小RNA突变以将其修饰成如图4中所示的萤光素酶siRNA。对miR-M6也进行相似诱变。
实施例2-报道基因的沉默
MDV的突变克隆通过BAC诱变生成，并测试了所述经修饰的miRNA对萤光素酶表达的沉默效果。独立地对miR-M6重复了相似的流程。运用这种经修饰的miR-M7和miR-M6的初步结果证明了miR-7-hRluc-22和miR6-hRluc19构建体有沉默萤光素酶报告基因的功能。
方法
在miR-7基因座含萤光素酶shRNA的用于萤光素酶测定法的构建体
合成的miR-LAT序列的特征为两个BsmBI限制位点，在DNA两条相对链上各有一个，以允许插入退火的DNA寡核苷酸用于替代miR-6。为了替代miR-7，将两个AarI限制位点(也在DNA两条相对链上)用于插入退火的DNA寡核苷酸。将所述shRNA构建体克隆入pEGFP载体以驱动由pCMV启动子启动的表达。
简言之，用AarI消化miR-LAT-HPC载体，凝胶纯化并与编码花虫萤光素酶shRNA的经退火的互补DNA寡核苷酸一起用于连接反应(见下文)。对所有重组质粒进行DNA测序以确证萤光素酶的插入。
pN1-miR-LAT-HPC miR-7基因座
BamHI AarI
AACGCTCCAAG TGGCAGGTGCGGATCCGCACCTGCATTTG GGGGA
TTGCGAGGTTC  CTCT ACCGTCCACGCCTAGGCGTGGACGTCCCCT
AarI
用于生成萤光素酶shRNA的寡核苷酸
5′-GAGAAC GTTGATGAAGGAGTCCAGCTCG TCTCTCCTACCAGCAAC CGAACTGGACTACTTCATGAAC GTT-3′
5′-CAAAAAC GTTCATGAAGTAGTCCAGTTCG GTTGCTGGTAGGAGAGA CGAGCTGGACTCCTTCATCAAC GT-3′
注意：寡核苷酸中带下划线的序列代表插入AarI位点所需的突出端。
DNA转染和萤光素酶的测定
将品系0鸡胚成纤维细胞(CEF)-衍生型DF-1细胞系培养在补充有10％胎牛血清(FCS)和1％丙酮酸钠的DMEM培养基中。在24孔板中用Lipofectamine 2000(Invitrogen)根据制造商的方案将萤光素酶报道基因转染至DF-1细胞中。简单地说，在转染前在24孔板中接种(1.1x105个细胞/孔)并保持24小时，并用500ng psiCHECKTM-2载体(Promega)共转染500ng shRNA表达构建体(和突变对照载体)。用双萤光素酶报道测定系统(Promega)利用Lucy 1发光计(Anthos Labtec)连续测定萤火虫与花虫萤光素酶活性。在全部实例中，在psiCHECKTM-2载体中组成型表达的萤火虫萤光素酶活性充当转染效率的标准化对照。
以上说明书中提及的所有出版物通过提述并入本文。在不被里本发明的范围和宗旨的前提下，对本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体优选的实施方案对本发明进行了描述，但应该理解的是要求保护的发明不应过分地局限于这些特定的实施方式。事实上，对于为了实施发明而加以描述的实施方式的多种修改形式对于使用流式细胞术进行细胞研究或相关领域的技术人员是显而易见的，意图将这些修改形式也包括在所附权利要求的范围之内。

Claims (14)

1.一种疱疹病毒载体，其中对内源miRNA簇进行了修饰，如此使得所述载体编码针对靶基因的经修饰的微小RNA(miRNA)，所述靶基因不同于由所述未修饰的miRNA所沉默的基因。
2.根据权利要求1的疱疹病毒载体，其中所述miRNA针对来自宿主基因的靶序列。
3.根据权利要求1的疱疹病毒载体，其中所述miRNA针对来自传染性病原体的靶序列。
4.根据权利要求3的疱疹病毒载体，其中所述传染性病原体为病毒。
5.根据权利要求4的疱疹病毒载体，其中所述传染性病原体为疱疹病毒。
6.根据权利要求5的疱疹病毒载体，其基于病原性疱疹病毒。
7.根据权利要求6的疱疹病毒载体，其编码针对来自病原性疱疹病毒的靶序列的miRNA，所述载体基于该疱疹病毒。
8.根据权利要求7的疱疹病毒载体，其中载体基因组的靶序列编码部分是经修饰的，如此使得其自身不被miRNA沉默。
9.根据权利要求1-8中任一项的疱疹病毒载体，其基于马立克病病毒。
10.根据权利要求1的疱疹病毒载体，其能够表达多个经修饰的miRNA。
11.产生根据权利要求1-10中任一项的载体的方法，其包括在编码形成pri-miRNA的茎环结构的茎的链的序列中引入一个或多个突变的步骤，所述pri-miRNA由疱疹病毒载体基因组编码。
12.根据权利要求11的方法，其包括用外源序列替代内源链编码序列的步骤，以产生经修饰的miRNA。
13.根据权利要求12的方法，其中所述外源序列包括故意错配从而使所述经修饰的miRNA模仿天然miRNA的结构特征。
14.根据权利要求11-13中任一项的方法，其包括如下步骤：
(i)扩增疱疹病毒的miRNA序列；
(ii)miRNA的突变；
(iii)通过BAC诱变生成疱疹病毒的突变体克隆以产生包含经修饰的基因组序列的疱疹病毒载体，其能够编码针对靶序列的微小RNA(miRNA)。
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