CN101906419A - 可用于高效制备诱导性多能干细胞的小分子化合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞生物学与再生医学领域，涉及一种可用于制备诱导性多能干细胞的小分子化合物，其为针对干细胞特异性表达基因设计的可诱导目标基因特异、高效上调表达的小片段RNA序列，将其转染进入受试细胞，使受试细胞内相应的目标基因表达水平升高，可使受试细胞经历细胞重编程的过程形成诱导性多能干细胞。

Description

可用于高效制备诱导性多能干细胞的小分子化合物和方法

技术领域

本发明属于细胞生物学与再生医学领域。本发明涉及一种可用于制备诱导性多能干细胞的小分子化合物，还提供了一种制备诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

基于干细胞的再生医学为生命科学和医学的发展开辟了一个崭新的、广阔的领域。研究者认为干细胞(再生医学)研究有潜力通过修复特定的组织或尘长器官，改变人类对疾病的应对方法。干细胞再生医学在治疗神经退行性疾病、恶性肿瘤、糖尿病、肝硬化、脑萎缩、脊髓损伤等目前尚无良好治疗方案的疾病方面具有广泛的应用前景。

但是目前的干细胞研究中仍然存在重要的技术障碍，其中最重要的是干细胞的来源和制备。因为涉及到社会伦理问题，干细胞来源受到关注。干细胞分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性多能干细胞。其中 ，胚胎干细胞和成体干细胞是天然存在的，而诱导性多能干细胞是由体细胞经过人为的基因表达调控和细胞重编程(cell reprogramming)等过程转化而来的。胚胎干细胞的功能强大，但来源有限且受到伦理学限制；成体干细胞来源和功能有限。诱导性多能干细胞是由人体细胞转化而来，来源广泛，不受限制，无伦理学问题，其功能与胚胎干细胞接近，因此是最具发展前景的干细胞制备技术。诱导性多能干细胞的出现和制备技术获得2008年十大科技创新之首。但该技术目前仍然存在致命缺陷。目前制备诱导性多能干细胞是通过病毒裁体或质粒向体细胞转移外源性干细胞特异性基因如SOX2、OCT4、KLF4、NANOG、C-MYC等。上述基因在体细胞内的表达能够使体细胞经历细胞重编程的过程而回到干细胞的状态。但是上述基因一旦通过病毒载体或质粒导入到体细胞中，其在体内的表达是不受控制的，产生的远后生物学效应同样是无法预知且不受控制的，因此其安全性受到质疑。小分子化合物的作用是暂时性的、可控制的、可预期的，因此，发展小分子化合物制备诱导性多能干细胞是今后发展需要重点解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一类具有特殊结构和功能的小分子化合物以及一种应用该类小分子化合物高效制备诱导性多能干细胞的方法。

具体的说，本发明提供一类具有特殊结构和功能的小分子化合物，其为针对干细胞特异性基因的5’非编码区，尤其是5’非编码区中启动子序列或转录起始位点(transcriptionstarting site)及其侧翼序列(flanking region)，设计、合成并筛选出来的可诱导上述目标基因特异、高效上调表达的小片段RNA序列。这些可以特异、高效诱导目标基因上调表达的小片段RNA分子具有以下结构特征：其核心序列是反向互补双链RNA序列或单链RNA序列(正义序列或反义序列)，序列长度在15-30个碱基(对)之间，序列3’末端是两个或多个连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷(dT)或其结构类似物。这样的小片段RNA分子是通过化学方法或生物学方法合成的小分子化合物，其单独或组合使用可以用于制备诱导性多能干细胞(iPScell，induced pluoripotent stem cell)。

上述小片段RNA分子经过公知的核酸化学修饰方法(如甲基化、脱氧化、硫代、卤代、LNA、PNA等)修饰后，仍具有诱导干细胞特异性基因上调表达功能，显然，该结构类似物也在本专利保护的范围内。以下为举例但并不局限于下述结构类似物，如部分或全部序列中核苷酸单体的甲基化修饰类似物、脱氧类似物(DNA分子)、硫代类似物、卤代类似物以及LNA、PNA等修饰形式的类似物等。这样的小片段RNA分子的结构类似物是通过化学方法或尘物学方法合成的小分子化合物，其单独或组合使用可以用于制备诱导性多能干细胞。

相应的，本发明还提供了一种制备诱导性多能干细胞的方法，步骤如下：

(1)合成可诱导干细胞特异性表达基因特异、高效上调表达的小分子化合物；

(2)将RNA序列转染进入受试细胞，使受试细胞内相应的目标基因表达水平升高；

(3)培养受试细胞，鉴定并挑选出诱导性多能干细胞。

在具体实施时，可使用普通细胞培养液培养受试细胞，将该类小分子化合物单独或组合使用，加入细胞培养液中，直接作用于受试细胞或经公知的细胞转染的方法或技术(如脂质体转染、电击转染、磷酸钙沉淀转染等)作用于受试细胞。在用该类小分子化合物作用于受试细胞24-48h后，使用干细胞培养液培养受试细胞。根据细胞形态、生长状态及鉴定情况，持续使用该类小分子化合物作用于受试细胞，直至受试细胞经历细胞重编程的过程而进入胚胎干细胞样的状态，即受试细胞形成诱导性多能干细胞(iPS cell)。该类小分子化合物通过细胞膜进入受试细胞后，可以使受试细胞内相应的目标基因(干细胞特异性表达基因)表达水平升高，使受试细胞经历细胞重编程的过程而进入胚胎干细胞样的状态，即受试细胞形成诱导性多能干细胞(iPS cell)。以上方法可以用来制备诱导性多能干细胞。

上述具有诱导干细胞特异性表达基因上调表达功能的小片段RNA分子或其结构类似物与下列物质的组合应用能够进一步提高制备诱导性多能干细胞的效率。这些物质包括组蛋白去乙酰基酶抑制剂和DNA甲基化转移酶抑制剂等。以下为举例但并不局限于下列物质，组蛋白去乙酰基酶抑制剂，如苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate，SPB)，丙戊酸(valproic acid，VPA)，曲古抑菌素A(trichostatin A TSA)等；DNA甲基化转移酶抑制剂，如5氮杂脱氧胞苷(5-azacytidine，5-aza-C)，5甲硫脱氧腺苷(5’-deoxy-5’-(methylthio)adenosine，dMTA)等。

目前已知的干细胞特异性基因包括SOX2、OCT4、KLF4、NANOG、C-MYC等，如本领域技术人员所知，根据本发明的技术构思和基本原理，可针对这些基因按前述方法设计小分子化合物，也可针对其他的新的干细胞特异性基因进行小分子化合物的设计。显然，这些化合物均应在本发明的保护范围内。

本发明所提供的一类具有特殊结构和功能的小分子化合物以及一种应用该类小分子化合物制备诱导性多能干细胞的方法，解决了目前其它方法所制备产尘的诱导性多能干细胞的安全性问题。目前其它方法制备诱导性多能干细胞是通过使用病毒载体或质粒向体细胞转移外源性干细胞特异性基因如SOX2、OCT4、KLF4、NANOG、C-MYC等，上述基因一旦通过病毒载体或质粒导入到体细胞中，其在体内的表达是不受控制的，产尘的远后尘物学效应同样是无法预知且不受控制的，这样获得的诱导性多能干细胞具有癌变的潜在可能。而本发明所提供的应用小分子化合物制备诱导性多能干细胞的方法，其对目标基因的调控作用是暂时性的、可控制的、可预期的，在向受试细胞施加小分子化合物时产尘基因调控作用，进而引发细胞的重编程过程和胚胎干细胞样转化；当受试细胞转化为诱导性多功能干细胞后，停止向受试细胞施加小分子化合物，基因调控作用也随即停止，而不会产生长久、失控的基因调控作用，细胞可停留在诱导性多功能干细胞状态或进入分化状态。因此，采用本方法产生的诱导性多功能干细胞具有更高的安全性。

附图说明

图1以cDNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中GAPDH基因表达情况。GAPDH为看家基因，在上述情况下，基因表达基本一致。

图2以cDNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中SOX2基因表达情况。SOX2基因为胚胎干细胞特异性表达的基因，在阴性对照中基本不表达，在转染了某些小分子RNA后细胞中SOX2基因表达显著增强。

图3以RNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中SOX2基因表达情况。表明提取的RNA样本中无DNA污染。

图1，2，3中，M：分子量标记，1：有脂质体的阴性对照，2：脂质体转染随机序列的阴性对照，3：转染sox2-5小分子RNA序列，4：转染sox2-8小分子RNA序列，5：转染sox2-9小分子RNA序列，6：转染sox2-10小分子RNA序列，7：转染sox2-11小分子RNA序列，8：转染sox2-12小分子RNA 序列，9：转染sox2-13小分子RNA序列，10：转染sox2-14小分子RNA序列

图4以cDNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中GAPDH基因表达情况。GAPDH为看家基因，在上述情况下，基因表达基本一致。

图5以cDNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中OCT4基因表达情况。OCT4基因为胚胎干细胞特异性表达的基因，在阴性对照中基本不表达，在转染了某些小分子RNA后细胞中OCT4基因表达显著增强。

图6以RNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中OCT4基因表达情况。表明提取的RNA样本中无DNA污染。

图4，5，6中，M：分子量标记，1：有脂质体的阴性对照，2：脂质体转染随机序列的阴性对照，3：转染OCT4-5小分子RNA序列，4：转染OCT4-8小分子RNA序列，5：转染OCT4-9小分子RNA序列，6：转染OCT4-10小分子RNA序列，7：转染OCT4-11小分子RNA序列，8：转染OCT4-12小分子RNA序列，9：转染OCT4-13小分子RNA序列

图7以cDNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中GAPDH基因表达情况。GAPDH为看家基因，在上述情况下，基因表达基本一致。

图8以cDNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中KLF4基因表达情况。KLF4基因为胚胎干细胞特异性表达的基因，在阴性对照中基本不表达，在转染了某些小分子RNA后细胞中KLF4基因表达显著增强。

图9以RNA为模板，用RT-PCR方法检测阴性对照与转染小分子RNA后细胞中KLF4基因表达情况。表明提取的RNA样本中无DNA污染。

图7，8，9中，M：分子量标记，1：有脂质体的阴性对照，2：脂质体转染随机序列的阴性对照，3：转染KLF4-5小分子RNA序列，4：转染KLF4-8小分子RNA序列，5：转染KLF4-9小分子RNA序列，6：转染KLF4-10小分子RNA序列，7：转染KLF4-11小分子RNA序列，8：转染KLF4-12小分子RNA序列，9：转染KLF4-13小分子RNA序列

具体实施方式

为了进一步说明本发明提供的一种用小分子化合物高效制备诱导性多能干细胞的方法，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，其他研究人员在权利要求范围内所作出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

实施例1.诱导SOX2基因上调表达的小分子RNA的设计、合成和筛选

1诱导SOX2基因上调表达的小分子RNA的设计、合成

根据SOX2基因5’端非编码区中的启动子序列或转录起始位点及其侧翼序列，设计如下双链RNA序列。序列长度在18-25bp之间，序列3’端是两个连续的dT。

2细胞培养与加药处理

所用细胞为BJ细胞，用DMEM+15％FBS，L-谷氨酰胺，青链霉素培养于5％CO2，37℃细胞培养箱中。冻存的BJ细胞复苏后，传代2次至细胞状态稳定。将BJ细胞接种于6孔板(1X105细胞/孔)。培养20-24h至细胞完全贴壁且状态稳定。双链RNA转染终浓度为100nM，采用Vega转染试剂盒并按照操作指南进行。双链RNA与转染试剂作用于细胞10h，将培养液换成正常培养液培养细胞14h。双链RNA转染3次。收集细胞。

3RNA提取与RT-PCR

提取RNA。用Invitrogen反转录试剂盒反转录成cDNA。用PCR试剂盒按照说明书操作，检测SOX2基因在双链RNA作用后基因表达变化。以看家基因GAPDH基因表达作为对照。所用RT-PCR引物序列如下：Sox2 RTF：CAC AACTCG GAG ATC AGC AAG C，Sox2 RTR：AACTGT CCA TGC GCTGGTTCAC。GAPDH RTF：GCA TCC TGC ACCACCACC TG，GAPDHRTR：GCCTGG TTCACG ACG TTC TT。PCR循环条件为：预变性：94℃/5min；30个循环：94℃/30sec，60℃/30sec，72℃/30sec；延伸：72℃/5min。

4琼脂糖凝胶电泳及图像半定量分析

PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果经凝胶成像仪成像并用定量分析软件进行半定量分析。检测结果如图1，图2，图3所示。

实施例2.诱导OCT4基因上调表达的小分子RNA的设计、合成和筛选

1诱导OCT4基因上调表达的小分子RNA的设计、合成

根据OCT4基因5’端非编码区中的启动子序列或转录起始位点及其侧翼序列，设计如下双链RNA序列。序列长度在18-25bp之间，序列3’端是两个连续的dT。

2细胞培养与加药处理

所用细胞为BJ细胞，用DMEM+15％FBS，L-谷氨酰胺，青链霉素培养于5％CO2，37℃细胞培养箱中。冻存的BJ细胞复苏后，传代2次至细胞状态稳定。将BJ细胞接种于6孔板(1X105细胞/孔)。培养20-24h至细胞完全贴壁且状态稳定。双链RNA转染终浓度为100nM，采用Vega转染试剂盒并按照操作指南进行。双链RNA与转染试剂作用于细胞10h，将培养液换成正常培养液培养细胞14h。双链RNA转染3次。收集细胞。

3RNA提取与RT-PCR

提取RNA。用Invitrogen反转录试剂盒反转录成cDNA。用PCR试剂盒按照说明书操作，检测OCT4基因在双链RNA作用后基因表达变化。以看家基因GAPDH基因表达作为对照。所用RT-PCR引物序列如下：OCT4 RTF：CAG AAG GGC AAG CGA TCA AGC，OCT4 RTR：CCCAGA GTG GTG ACG GAG AC。GAPDH RTF：GCA TCC TGC ACC ACC ACC TG，GAPDHRTR：GCC TGG TTC ACG ACG TTC TT。PCR循环条件为：预变性：94℃/5min；30个循环：94℃/30sec，60℃/30sec，72℃/30sec；延伸：72℃/5min。

4琼脂糖凝胶电泳及图像半定量分析

PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果经凝胶成像仪成像并用定量分析软件进行半定量分析。检测结果如图4，图5，图6所示。

实施例3.诱导KLF4基因上调表达的小分子RNA的设计、合成和筛选

1诱导KLF4基因上调表达的小分子RNA的设计、合成

根据KLF4基因5’端非编码区中的启动子序列或转录起始位点及其侧翼序列，设计如下双链RNA序列。序列长度在18-25bp之间，序列3’端是两个连续的dT。

2细胞培养与加药处理

所用细胞为BJ细胞，用DMEM+15％FBS，L-谷氨酰胺，青链霉素培养于5％CO2，37℃细胞培养箱中。冻存的BJ细胞复苏后，传代2次至细胞状态稳定。将BJ细胞接种于6孔板(1X105细胞/孔)。培养20-24h至细胞完全贴壁且状态稳定。双链RNA转染终浓度为100nM，采用Vega转染试剂盒并按照操作指南进行。双链RNA与转染试剂作用于细胞10h，将培养液换成正常培养液培养细胞14h。双链RNA转染3次。收集细胞。

3RNA提取与RT-PCR

提取RNA。用Invitrogen反转录试剂盒反转录成cDNA。用PCR试剂盒按照说明书操作，检测KLF4基因在双链RNA作用后基因表达变化。以看家基因GAPDH基因表达作为对照。所用RT-PCR引物序列如下：KLF4 RTF：CAT CAG CGT CAG CAA AGG CAG C，KLF4 RTR：CTT GGT AAT GGA GCG GCG GGA C。GAPDH RTF：GCA TCC TGC ACC ACC ACC TG，GAPDH RTR：GCC TGG TTC ACG ACG TTC TT。PCR循环条件为：预变性：94℃/5min；30个循环：94℃/30sec，60℃/30sec，72℃/30sec；延伸：72℃/5min。

4琼脂糖凝胶电泳及图像半定量分析

PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果经凝胶成像仪成像并用定量分析软件进行半定量分析。检测结果如图7，图8，图9所示。

实施例4.用小分子RNA制备诱导性多能干细胞

1细胞培养

人BJ细胞，在成纤维细胞培养液(DMEM加15％FBS，L-谷氨酰胺，青链霉素)中培养。诱导性多能干细胞(iPS)在人胚胎干细胞(ES)培养液中培养。

2诱导性多能干细胞的制备

在转染小分子双链RNA前一天，将BJ细胞用成纤维细胞培养液接种于6孔板(1-2×105细胞/孔)中。转染小分子双链RNA，在转染小分子双链RNA一天后，将细胞培养液换成人胚胎干细胞培养液。

在转染小分子双链RNA处理细胞一个月后，根据胚胎干细胞样集落形态学特征鉴定并挑选诱导性多能干细胞。

结果表明，BJ细胞经小分子双链RNA转染后，SOX2，OCT4，KLF4等基因表达显著增强，有胚胎干细胞样集落形成，产生了诱导性多能干细胞。

实施例5.用小分子RNA与组蛋白去乙酰基酶抑制剂VPA共同作用制备诱导性多能干细胞

1细胞培养

人BJ细胞，在成纤维细胞培养液(DMEM加15％FBS，L-谷氨酰胺，青链霉素)中培养。诱导性多能干细胞(iPS)在人胚胎干细胞(ES)培养液中培养。

2诱导性多能干细胞的制备

在转染小分子双链RNA前一天，将BJ细胞用成纤维细胞培养液接种于6孔板(1-2×105细胞/孔)中。转染小分子双链RNA，在转染小分子双链RNA一天后，将细胞培养液换成人胚胎干细胞培养液。在转染后第一天用0.5mM VPA处理细胞并持续2周。

在转染小分子双链RNA处理细胞一个月后，根据胚胎干细胞样集落形态学特征鉴定并挑选诱导性多能干细胞。

结果表明，BJ细胞经小分子双链RNA转染后，SOX2，OCT4，KLF4等基因表达显著增强，有胚胎干细胞样集落形成，产生了诱导性多能干细胞。

实施例6.用甲基化修饰小分子RNA制备诱导性多能干细胞

1按照实施例1、实施例2、实施例3中序列合成甲基化修饰的小分子RNA。

2细胞培养

人BJ细胞，在成纤维细胞培养液(DMEM加15％FBS，L-谷氨酰胺，青链霉素)中培养。

诱导性多能干细胞(iPS)在人胚胎干细胞(ES)培养液中培养。

3诱导性多能干细胞的制备

在转染小分子双链RNA前一天，将BJ细胞用成纤维细胞培养液接种于6孔板(1-2×105细胞/孔)中。转染甲基化修饰的小分子双链RNA。在转染甲基化修饰的小分子双链RNA一天后，将细胞培养液换成人胚胎干细胞培养液。

在转染甲基化修饰的小分子双链RNA处理细胞一个月后，根据胚胎干细胞样集落形态学特征鉴定并挑选诱导性多能干细胞。

结果表明，BJ细胞经小分子双链RNA转染后，SOX2，OCT4，KLF4等基因表达显著增强，有胚胎干细胞样集落形成，产生了诱导性多能干细胞。

Claims (9)

1.一类可用于制备诱导性多能干细胞的小分子化合物，其特征在于，其为针对干细胞特异性表达基因的5’非编码区序列设计、合成并筛选出来的可诱导上述目标基因特异、高效上调表达的小片段RNA序列，其核心序列是反向互补双链RNA序列或单链RNA序列，序列长度在15-30个碱基或碱基对之间，序列3’末端是两个或多个连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷或其结构类似物。

2.根据权利要求1所述的小分子化合物，其特征在于其为根据碱基互补配对的原则与干细胞特异性表达基因的5’非编码区序列相同或互补的任一RNA序列。

3.根据权利要求1所述的小分子化合物，其特征在于所述干细胞特异性表达基因为SOX2、OCT4、KLF4、NANOG或C-MYC基因。

4.根据权利要求1所述的小分子化合物，其特征在于，RNA分子经过化学修饰。

5.根据权利要求4所述的小分子化合物，其特征在于，对RNA分子全部序列中核苷酸单体进行甲基化、脱氧、硫代、卤代、LNA或PNA等方式的修饰。

6.根据权利要求4所述的小分子化合物，其特征在于，对RNA分子部分序列中核苷酸单体进行甲基化、脱氧、硫代、卤代、LNA或PNA等方式的修饰。

7.权利要求1至6所述任一小分子化合物或其组合在制备诱导性多能干细胞中的应用。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于在制备诱导性多能干细胞时，与组蛋白去乙酰基酶抑制剂或DNA甲基化转移酶抑制剂合用。

9.一种制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于如下步骤：

(1)合成可诱导干细胞特异性表达基因特异、高效上调表达的小分子化合物；

(2)将小分子化合物转染进入受试细胞，使受试细胞内相应的目标基因表达水平升高；

(3)培养受试细胞，鉴定并挑选出诱导性多能干细胞。

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